ES2412380T3 - Procedimiento para la identificación de compuestos novedosos que interaccionan con enzimas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de: a) proporcionar dos alícuotas que comprende cada una al menos una célula que contiene la enzima, b) incubar una alícuota con un compuesto dado diferente de los ligandos, c) recoger las células, d) lisar las células, e) poner en contacto los lisados celulares en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dosligandos de enzimas de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en un soporte sólido encondiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro, f) eluir la enzima o las enzimas, y g) caracterizar la enzima eluida o las enzimas eluidas por espectrometría de masas cuantitativa.

Description

Procedimiento para la identificación de compuestos novedosos que interaccionan con enzimas

La presente invención se refiere a procedimientos para la caracterización de enzimas usando ligandos de enzimas unidos a soportes sólidos.

La meta del descubrimiento de fármacos es desarrollar medicinas efectivas y seguras. Con el fin de lograr esta meta, la investigación farmacéutica tiene como objetivo identificar preferentemente fármacos de moléculas pequeñas dirigidos a dianas de fármacos que se sabe que son causantes de la enfermedad de interés.

Tradicionalmente, la mayoría de los fármacos de moléculas pequeñas están dirigidos contra proteínas receptoras (receptores de membrana celular tales como receptores acoplados a proteínas G (GPCR) o receptores de hormonas nucleares), canales iónicos y enzimas. De los enzimas, son de interés particular por ejemplo proteasas, fosfodiesterasas y cinasas (revisión: Drews, 2000, "Drug discovery: a historical perspective", Science 287, 1960-1964).

Las proteasas se consideran como dianas de fármacos tratables como se demuestra por la gestión efectiva de SIDA con inhibidores de proteasas del VIH o por el uso de inhibidores de enzima conversora de angiotensina para tratar hipertensión. Para el tratamiento de cáncer están en desarrollo inhibidores de proteasas dirigidas contra metaloproteinasas de matriz y caspasas (Docherty y cols., 2003, "Proteases as drug targets", Biochemical Society Symposia 70, 147-161).

Las fosfodiesterasas (PDE) comprenden una familia de enzimas que catalizan la hidrólisis de AMPc o GMPc y están implicadas en diversas enfermedades. El inhibidor de PDE5 sildenafil (Viagra) proporciona un tratamiento efectivo para la disfunción eréctil. Actualmente los inhibidores de PDE4 (por ejemplo cilomast y roflumast) están en pruebas clínicas como productos terapéuticos anti-inflamatorios. Un desafío mayor en este campo es el desarrollo de inhibidores específicos de isotipo PDE con el fin de evitar reactividad cruzada que es responsable de efectos secundarios (Card y cols., 2004, "Structural basis for the activity of drugs that inhibit phosphodiesterases", Structure 12, 2233-2247).

Las cinasas catalizan la fosforilación de proteínas, lípidos, azúcares, nucleósidos y otros metabolitos celulares y desempeñan papeles clave en todos los aspectos de la fisiología de células eucariotas.

La fosforilación de proteínas es una modificación postraduccional común de proteínas y afecta la estructura de proteínas y funciona de numerosas maneras.

Una clase de cinasas que ha llegado a ser un foco reciente de descubrimiento de fármacos comprende las proteína cinasas debido a que estarán mostrando jugar papeles importantes en la iniciación y progresión de tumores por desregulación de rutas de transducción de señales en cáncer de pulmón; sobreexpresión del receptor de ErbB2/Her-2 en cáncer de mama; proteínas de fusión BCR-ABL en leucemia; revisión: Blume-Jensen y Hunter, 2001, "Oncogenic kinase signaling", Nature 411, 355-365).

El complemento de proteína cinasas codificadas en el genoma humano comprende 518 miembros de familia (quinoma) que pueden agruparse en varias subfamilias de acuerdo con la similitud de secuencias (revisión: Manning y cols., 2002, The Protein Kinase Complement of the Human Genome, Science 298, 1912-1934). En cualquier célula o tejido dado solo se expresa un subgrupo de quinoma. Las cinasas transfieren grupos fosfato desde ATP hasta moléculas sustrato e influencian por lo tanto la estabilidad, la actividad y la función de sus dianas. El bolsillo de unión a ATP de diferentes cinasas es estructuralmente similar y por lo tanto se considera difícil desarrollar inhibidores competitivos de ATP selectivos.

La familia de cinasas es una familia de enzimas muy grande (comparada con otras clases de enzimas relevantes como objetivos de fármacos, por ejemplo fosfodiesterasas) proporcionando múltiples oportunidades para descubrimiento de fármacos pero también retos únicos (familia de gran tamaño; similitud estructural de los bolsillos de unión a ATP, concentración de ATP intracelular alta) (revisión: Cohen, P., 2002, Protein kinases -the major drug targets of the twenty-first century? Nature Reviews Drug Discovery, volumen 1, 309-315).

Otra clase de cinasas de interés son las cinasas de lípidos. Las cinasas de lípidos catalizan la transferencia de grupos gamma-fosfatos a partir de nucleósido trifosfatos a sustratos lipídicos.

Se sabe que las cinasas de lípidos tales como los miembros de la familia de las fosfoinosítidos 3-cinasas (PI3K) son moduladores de la respuesta celular a factores de crecimiento, hormonas y neurotransmisores y están implicados en cáncer, diabetes y otras enfermedades (Fruman y cols., 1998. Phosphoinositide kinases. Annual Review Biochemistry 67, 481-507; Cantley, L.C., 2002, Science 296, 1655-1657).

Un prerrequisto para la identificación de compuestos que interaccionan con proteínas, por ejemplo enzimas, es la provisión de preparaciones de proteínas que contienen tantas proteínas como sea posible de una clase en una gran pureza. Especialmente, la provisión de muchas proteínas de una clase (por ejemplo cinasas) es importante dado que esto permite el rastreo de compuestos potencialmente interesantes farmacéuticamente contra muchos miembros de la

familia de las proteínas (así llamado identificación por acierto). Otros usos factibles de tales preparaciones de proteínas incluyen la realización de pruebas de compuestos químicamente optimizados (optimización de compuestos), la determinación de la selectividad de un compuesto dado (revelación del perfil completo de selectividad) así como la confirmación del modo de acción de un compuesto dado.

En la técnica, se han propuesto varias estrategias para valorar este tema.

Una aproximación para enriquecer las proteínas de unión a ATP tales como cinasas y otras proteínas de unión a nucleótidos a partir de extractos celulares se basa en ATP inmovilizado como reactivo de afinidad, es decir en el uso de un ligando que une potencialmente todas las enzimas de unión a ATP. En este caso el ATP está inmovilizado covalentemente acoplando el grupo gamma-fosfato por un engarce a una resina (Graves y cols., 2002, Molecular Pharmacology 62, N.º: 6, 1364-1372; documento US 5536822). Este enfoque se amplió adicionalmente para acoplar compuestos simples de bibliotecas de compuestos combinatorias (documento WO00/63694).

Una desventaja del ATP inmovilizado es que la afinidad por cinasas es más bien baja conduciendo a captura de cinasas ineficaz o a elución rápida debido a velocidades de disociación altas. Otra desventaja es que las cinasas no se capturan preferencialmente, sino que también se capturan otras clases de proteínas de unión a ATP que pueden expresarse a niveles mucho más altos en la célula. Las proteínas de unión a ATP más abundantes pueden causar captura ineficaz debido a competición o pueden conducir a problemas durante el análisis por espectrometría de masas de las proteínas unidas si la profundidad analítica no es suficiente.

Otro enfoque descrito en la técnica es el uso de ligandos específicos para una enzima individual, a saber inhibidores de cinasas de afinidad alta e inhibidores de cinasas altamente selectivos o derivados cercanos (por ejemplo fármacos optimizados). Estos se usan para enriquecer cinasas a partir de lisados celulares y el mismo compuesto no modificado se usa para elución específica con el fin de identificar el objetivo u objetivos de fármacos celulares (Godl y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 15434-15439; documento WO 2004/013633). Esta aproximación es solamente exitosa si la relación estructura-función (SAR) no se destruye por la modificación química del fármaco pero falla si la SAR se altera. Además, es difícil identificar objetivos que median efectos secundarios indeseados debido a que la SAR de la diana de fármaco relacionado puede ser diferente y la última SAR usualmente no se conoce.

El rastreo intensivo de una biblioteca de química combinatoria de purinas 2,6,9-trisustituidas ha conducido a la identificación de un inhibidor de CDK potente y selectivo llamado purvalanol (Knockaert y cols., 2002, Oncogene, vol. 21, 6413-6424). Aquí, los extractos celulares se rastrearon en busca de proteínas que interactuasen con purlavanol por cromatografía de afinidad en presencia de compuestos inmovilizados.

Se describe adicionalmente en la técnica la identificación de proteínas objetivo novedosas de la ruta de señalización de GMP cíclica llevando a cabo ensayos de unión de competición en lisados de tejido en los que el ligando GMPc inmovilizado está incubado con extractos celulares en la ausencia y presencia de cantidades en exceso de ligandos libres (Kim y Park, 2003, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, volumen 36, 299-304).

Otra estrategia es la expresión in vitro de enzimas de una clase dada, por ejemplo cinasas. Fabian y colegas (Fabian y cols., 2005, Nature Biotechnology 23 (3), 329-336; documento WO 03084981) describen un procedimiento de realización de perfiles de cinasas que no recurre a cinasas endógenas contenidas en lisados celulares sino que usa cinasas que se presentan en el bacteriófago T7. Las cinasas (o dominios de cinasas) usadas en este ensayo son proteínas de fusión que se marcan con el fin de permitir expresión, purificación y detección. En el ensayo de unión de competición estas cinasas marcadas con fago están unidas a un inhibidor de cinasas inmovilizado, tratadas con un compuesto de prueba no inmovilizado y las cinasas marcadas unidas se cuantifican por PCR usando el ADN de fago como una plantilla. Una desventaja de este procedimiento es que las cinasas necesitan clonarse y solamente una fracción de las cinasas marcadas con fago están plegadas en el estado nativo correcto. Además, tales preparaciones de proteínas no reflejan en absoluto la situación natural en una célula.

Otra aproximación usa sondas dirigidas a sitio activo (así llamadas sondas basadas en actividad) que forman enlaces covalentes con enzimas diana. Este procedimiento se usa para realizar un perfil de la expresión de serina hidrolasas con sondas altamente selectivas (Liu y cols., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 14694-14699, WO 01/77668) y se expande adicionalmente a otras familias enzimáticas usando sondas más promiscuas que consisten en bibliotecas de sondas de ésteres de sulfonato fluorescente basadas en actividad no dirigida marcadas con rodamina y marcadas con biotina (Adam y cols., 2002, Nature Biotechnology 20, 805-809, documento WO 01/77684, documento WO 03/047509). Sin embargo, permanece sin aclarar qué propiedades estructurales y/o catalíticas están compartidas por estas enzimas marcadas con sulfonato. Otra limitación es la dificultad para distinguir interacciones específicas con enzimas e interacciones no específicas causadas por la reactividad intrínseca de las sondas.

Finalmente, se intentó enriquecer las proteínas biofosforiladas en tirosinas con anticuerpos específicos de tirosina (Blogoev y cols., 2004, Nature Biotechnology 9, 1139-1145). Blogoev y colegas describen un procedimiento que se puede usar para estudiar el efecto de compuestos tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF) en rutas de transducción de señales dependientes de fosfotirosina. Después de la lisis de las células estimuladas con EGF las proteínas que contienen fosfotirosina están enriquecidas por inmunoprecipitación con anticuerpos dirigidos contra fosfotirosina. En la segunda etapa estas proteínas enriquecidas se analizan e identifican por análisis espectrométrico

de masas. Un limitación principal de esta aproximación es que solamente pueden capturarse proteínas fosforiladas con tirosina.

En vista de esto, hay una necesidad de procedimientos mejorados para la caracterización de aquellas enzimas de una clase dada que se expresan en una célula. Además, hay una necesidad de procedimientos mejorados para la identificación de enzimas que son compañeras de unión de un compuesto dado.

La presente invención satisface estas necesidades. En el contexto de la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que el uso de un ligando de enzima de amplio espectro inmovilizada en un soporte sólido permite el aislamiento efectivo de enzimas fuera de una preparación proteica, preferentemente un lisado celular. Después de este aislamiento, se pueden aplicar los procedimientos efectivos bien para la caracterización de la enzima unida al ligando enzimático de amplio espectro o para la identificación de interacciones de enzima y compuesto. La enzima se identifica preferentemente por espectrometría de masas. Por lo tanto, la presente invención proporciona procedimientos efectivos bien para la caracterización de las enzimas o bien para la identificación de los compañeros de unión de un compuesto dado.

En un primer aspecto, la presente invención describe un procedimiento para la caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una preparación proteica que contiene la enzima, preferentemente recolectando al menos una célula que contiene la enzima y lisando la célula,

b) poner en contacto la preparación proteica en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos un ligando de enzima de amplio espectro en un soporte sólido, en condiciones que permiten la unión de la enzima a dicho ligando de enzima de amplio espectro,

c) eluir la enzima y

d) caracterizar la enzima eluida por espectrometría de masas.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas que comprenden cada una al menos una célula que contiene la enzima,

b) incubar una alícuota con un compuesto dado diferente de los ligandos,

c) recolectar las células,

d) lisar las células,

e) poner en contacto los lisados celulares en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos ligandos de enzimas de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en un soporte sólido en condiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro,

f) eluir la enzima o las enzimas y

g) caracterizar la enzima eluida o las enzimas eluidas por espectrometría de masas cuantitativa.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, la invención proporciona un procedimiento para la caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de:

a) proporcionar dos alícuotas de una preparación proteica que contiene la enzima, preferentemente recogiendo al menos una célula que contiene la enzima y lisando la célula,

b) poner en contacto una alícuota en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos ligandos de enzimas de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en soporte sólido en condiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro,

c) poner en contacto la otra alícuota en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos ligandos enzimáticos de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en un soporte sólido en condiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro y con un compuesto dado diferente de los ligandos,

d) eluir la enzima o las enzimas y

e) caracterizar la enzima eluida o las enzimas eluidas por espectrometría de masas cuantitativa,

en el que una detección reducida de la enzima en la alícuota incubada con el compuesto indica que la enzima es una diana directa del compuesto.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se describe un procedimiento para la caracterización de un complejo compuesto-enzima, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una preparación que contiene la enzima, preferentemente recogiendo al menos una célula que contiene la enzima y lisando la célula,

b) poner en contacto la preparación proteica en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos un ligando de enzima de amplio espectro inmovilizado en un soporte sólido en condiciones que permiten la unión de la enzima a dicho ligando de enzima de amplio espectro,

c) poner en contacto las enzimas unidas con un compuesto para liberar al menos una enzima unida y

d) caracterizar la enzima liberada o las enzimas liberadas por espectrometría de masas, o

e) eluir la enzima o las enzimas a partir del ligando y caracterizar la enzima o las enzimas por espectrometría de masas, identificando de este modo uno o más compañeros de unión del compuesto.

Los enfoques como se mencionan anteriormente, especialmente el procedimiento de acuerdo con el 4º aspecto, tienen las siguientes ventajas:

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No es necesaria ninguna expresión de enzimas in vitro, sino que se usan enzimas endógenas a partir de lisados celulares.

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Sorprendentemente, se encontró que los ligandos de cinasa de especificidad amplia capturan cinasas muy eficientemente.

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Los compuestos de prueba no necesitan unirse ni inmovilizarse (procedimiento de ensayo libre de etiquetas).

La unión competitiva o la elución competitiva son posibles con cualquier compuesto de interés (no modificado, no inmovilizado).

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No se necesita ningún sustrato enzimático (como en ensayos enzimáticos bioquímicos).

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Es posible caracterizar el efecto in vivo del compuesto en una ruta de transducción de señales (véase 2º aspecto).

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Es posible la identificación de dianas directas e indirectas.

A lo largo de la invención, el término "enzima" incluye también cada proteína o péptido en la célula que es capaz de unir un ligando tal como vehículos, canales iónicos y proteínas que interaccionan con enzimas tales como proteínas adaptadoras, que contienen dominios de interacción peptídica (por ejemplo dominios SH2, SH3 y PDZ).

Preferentemente, sin embargo, el término "enzima" se interpreta en su modo usual como que es un biocatalizador en una célula.

A lo largo de la invención, el término "ligando enzimático de espectro amplio" se refiere a un ligando que es capaz de unir algunas, pero no todas las enzimas presentes en una preparación proteica.

La presente invención preferentemente se refiere a procedimientos para la caracterización de enzimas o para la identificación de compañeros de unión a un compuesto dado, en el que la enzima o los compañeros de unión están incluidos en un lisado celular. Sin embargo, los procedimientos de la presente invención se pueden llevar a cabo también con cualquier preparación proteica como un material de partida, en la medida en que la(s) proteína(s) está(n) solubilizada(s) en la preparación. Los ejemplos incluyen una mezcla líquida de varias proteínas, un lisado celular parcial que no contiene todas las proteínas presentes en la célula original o una combinación de diversos lisados celulares.

Los lisados celulares parciales se pueden obtener aislando primero orgánulos celulares (por ejemplo núcleo, mitocondrias, ribosomas, aparato de Golgi, etc.) y después se pueden preparar preparaciones de proteínas derivadas de estos orgánulos. Se conocen en la técnica procedimientos para el aislamiento de orgánulos celulares (Capítulo 4.2 Purification of Organelles from Mammalian Cells en "Current Protocols in Protein Science", editores: John. E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8).

Además, las muestras proteicas se pueden preparar por fraccionamiento de extractos celulares enriqueciendo de este modo tipos específicos de proteínas tales como proteínas citoplásmicas o proteínas de membrana (Capítulo 4.3 Subcellular Fractionation of Tissue Culture Cells en "Current Protocols in Protein Science", editores: John. E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield; Wiley, ISBN: 0-471-14098-8).

Además se pueden usar las preparaciones proteicas a partir de fluidos corporales (por ejemplo sangre, fluido cerebroespinal, fluido peritoneal y orina).

A lo largo de la invención, el término "soporte sólido" se refiere a cada soporte insoluble que es capaz de inmovilizar

dicho ligando enzimático de amplio espectro en su superficie.

El procedimiento de la invención de acuerdo con el segundo aspecto comprende las etapas de una provisión de dos alícuotas comprendiendo cada una al menos una célula que contiene la enzima e incubando una alícuota con un compuesto dado. En una realización preferida, la al menos una célula es parte del sistema de cultivos celulares que se divide en al menos dos alícuotas. Una alícuota de células se incuba también con el compuesto dado. Se conocen en la técnica procedimientos para la incubación de sistemas de cultivo celular con compuestos (Giuliano y cols., 2004, "High-content screening with siRNA optimizes a cell biological approach to drug discovery: defining the role of p53 activation in the cellular response to anticancer drugs". Journal of Biomolecular Screening 9 (7), 557-568).

Sin embargo, se incluye también dentro de la presente invención que al menos una célula de cada alícuota es parte de un sistema in vivo, por ejemplo un sistema de ratón o un sistema de vertebrado inferior.

Por ejemplo se pueden usar los lisados de embriones completos derivados de fases de desarrollo definidas o de fases adultas de organismos modelo tales como C. elegans. Además, los órganos completos tales como corazón diseccionado de ratones pueden ser la fuente de preparaciones proteicas. Estos órganos pueden perfundirse también in vitro y así tratarse con el compuesto de prueba o con el fármaco de interés.

Todos los procedimientos de la presente invención incluyen al menos en una realización preferida las etapas de recoger al menos una célula que contiene la enzima y de lisar la célula.

En una realización preferida, la célula es parte de un sistema de cultivo celular y los procedimientos para la recogida de una célula aparte de un sistema de cultivo celular se conocen en la técnica (bibliografía supra).

La elección de la célula dependerá principalmente de la clase de enzimas supuesta a analizarse, dado ello ha de asegurarse que la clase de enzima está presente de forma principal en la célula de elección. Con el fin de determinar si una célula dada es un sistema de partida adecuado para los procedimientos de la invención, procedimientos tales como prueba de bandas de Western, procedimientos de detección de ácidos nucleicos basados en PCR, prueba de bandas de Northern y procedimientos de microensayos de ADN ("chips de ADN") podrían ser adecuados con el fin de determinar si una clase dada de enzimas está presente en la célula.

La elección de la célula estará influenciada por el propósito del estudio. Si el objetivo in vivo para un fármaco dado necesita identificarse después se seleccionarán células o tejidos en los que ocurre el efecto terapéutico deseado (por ejemplo tejido de cáncer de mama para fármacos anticáncer). Por contraste, para la dilucidación de las dianas proteicas que median efectos secundarios indeseados se analizarán la célula o el tejido en los que el efecto secundario se observa (por ejemplo tejido cerebral para efectos secundarios del SNC).

Además, se prevé en la presente invención que la célula que contiene la enzima se pueda obtener a partir de un organismo, por ejemplo por biopsia. Los procedimientos correspondientes se conocen en la técnica. Por ejemplo, una biopsia es un procedimiento diagnóstico usado para obtener una cantidad pequeña de tejido, que puede examinarse después microscópicamente o con procedimientos bioquímicos. Las biopsias son importantes para diagnosticar, clasificar y manipular una enfermedad, pero también para evaluar y someter a seguimiento el tratamiento con fármacos. Las biopsias de cáncer de mama se preformaron anteriormente como procedimientos quirúrgicos, pero hoy en día se prefieren biopsias de aguja (Oyama y cols., 2004, Breast Cancer 11 (4), 339-342).

Los procedimientos de la invención descritos permiten realizar un perfil de las muestras de tejido para la presencia de las clases de enzimas. Por ejemplo, las enzimas mutadas causantes de la enfermedad se pueden identificar (por ejemplo mutaciones puntuales que activan cinasas oncogénicas). Además, pueden dilucidarse las enzimas mutadas que surgen durante el tratamiento y son responsables de la resistencia al tratamiento (por ejemplo las mutaciones de receptor EGF que causan resistencia a fármacos anticáncer).

La biopsia de hígado se usa por ejemplo para diagnosticar la causa de enfermedad hepática crónica que da como resultado un hígado agrandado o un hígado anormal causado por actividades enzimáticas hepáticas elevadas (Rocken y cols., 2001, Liver 21 (6), 391-396).

Está abarcado dentro de la presente invención que por la recogida de al menos una célula se lleva a cabo la lisis simultáneamente). Sin embargo, se prefiere igualmente que la célula se recoja primero y se lise aparte después.

Los procedimientos para la lisis de las células se conocen en la técnica (Karwa y Mitra: Sample preparation for the extraction, isolation, and purification of Nuclei Acids; capítulo 8 en "Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry", Wiley 2003, Editor: Somenath Mitra, ISBN de texto impreso: 0471328456; ISBN en Internet: 0471457817). La lisis de diferentes tipos de células y tejidos se puede lograr por homogeneizadores (por ejemplo homogenizador de Potter), desintegradores ultrasónicos, lisis enzimática, detergentes (por ejemplo NP-40, Tritón X-100, CHAPS, SDS), choque osmótico, congelación y descongelación, o por una combinación de estos procedimientos.

Además, todos los procedimientos de la invención contienen la etapa de poner en contacto la preparación celular o el lisado celular en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos ligandos enzimáticos de amplio espectro diferentes inmovilizados en un soporte sólido en condiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos

enzimáticos de amplio espectro.

El contacto en condiciones fisiológicas esenciales tiene la ventaja de que las interacciones entre el ligando, la preparación celular (es decir la enzima a caracterizarse) y opcionalmente el compuesto reflejan tanto como es posible las condiciones naturales. "Condiciones esencialmente fisiológicas" son inter alia aquellas condiciones que están presentes en el material de muestra no procesado, original. Incluyen la concentración de proteínas fisiológica, el pH, la concentración salina, la capacidad tamponante y las modificaciones postraduccionales de las proteínas implicadas. El término "condiciones fisiológicas esenciales" no requiere condiciones idénticas a aquellas en el organismo vivo original, a partir del que se deriva la muestra, sino esencialmente condiciones similares a las de las células o condiciones cercanas a las condiciones celulares. La persona experta en la técnica se dará cuenta, por supuesto, de que pueden surgir ciertas restricciones debido al diseño experimental que conducirán eventualmente a condiciones menos similares a las de las células. Por ejemplo, la disrupción eventualmente necesaria de las paredes celulares o de las membranas celulares cuando se toma y se procesa una muestra a partir de un organismo vivo requiere condiciones que no son idénticas a las condiciones fisiológicas halladas en el organismo. Variaciones adecuadas de condiciones fisiológicas para poner en práctica los procedimientos de la invención serán patentes para aquellos expertos en la técnica y están abarcadas `por el término "condiciones fisiológicas esenciales" como se usa en el presente documento. En resumen, se entenderá que el término "condiciones esencialmente fisiológicas" se refiere a afecciones cercanas a condiciones fisiológicas, como por ejemplo se encuentran en las células naturales, pero no requieren necesariamente que estas condiciones sean idénticas.

Preferentemente, "condiciones esencialmente fisiológicas" pueden comprender NaCl o KCl 50-200 mM , pH 6,5-8,5, 20-45 ºC y catión divalente 0,001-10 mM (por ejemplo Mg++, Ca++); más preferentemente aproximadamente NaCl o KCl 150 M, pH 7,2 a 7,6, catión divalente 5 mM y a menudo incluyen proteína no específica al 0,01-1,0 por ciento (por ejemplo BSA). Un detergente no iónico (Tween, NP-40, Tritón-X100) puede estar presente a menudo usualmente a aproximadamente 0,001 al 2 %, típicamente 0,05-0,2 % (volumen/volumen). Para guía general, pueden ser aplicables las siguientes condiciones acuosas tamponadas: NaCl 10-250 mM, Tris HCl 5-50 mM, pH 5-8, con adición opcional de catión/cationes y/o quelantes metálicos y/o detergentes no iónicos.

Preferentemente, "condiciones esencialmente fisiológicas" quieren decir un pH desde 6,5 a 7,5, preferentemente desde 7,0 hasta 7,5, y/o una concentración de tampón desde 10 hasta 50 mM, preferentemente desde 25 hasta 50 mM, y/o una concentración de sales monovalentes (por ejemplo Na o K) desde 120 hasta 170 mM, preferentemente 150 mM. Las sales divalentes (por ejemplo Mg o Ca) pueden estar presentes adicionalmente a una concentración desde 1 hasta 5 mM, preferentemente 1 a 2 mM, en los que más preferentemente el tampón está seleccionado del grupo que consiste en Tris-HCl o HEPES.

En el contexto de la presente invención, el término "en condiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro" incluye todas las condiciones en las que tal unión es posible. Esto incluye la posibilidad de tener el soporte sólido en una fase inmovilizada y de verter el lisado en ella. En otra realización preferida, se incluye también que el soporte sólido esté en una forma particulada y se mezcle con el lisado celular.

En una realización preferida, la unión entre ligando y enzima es una unión no covalente, reversible, por ejemplo por medio de puentes salinos, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas o una combinación de los mismos.

Adicionalmente, los procedimientos de la invención incluyen la etapa de eluir la enzima o enzimas a partir de los ligandos inmovilizados en el soporte sólido.

Tales procedimientos se conocen principalmente en la técnica y dependen de la naturaleza de la interacción enzimática de ligando. Principalmente, cambiar la fuerza iónica, el valor de pH, la temperatura o incubación con detergentes son procedimientos adecuados para disociar las enzimas objetivo a partir del ligando inmovilizado. La aplicación de un tampón de elución puede disociar compañeros de unión por extremos de valor de pH (pH alto o bajo; por ejemplo bajando pH usando citrato 0,1 M, pH 2-3), cambio de fuerza iónica (por ejemplo concentración salina alta usando NaI, KI, MgCl2, o KCl), agentes reductores de polaridad que alteran interacciones hidrófobas (por ejemplo dioxano o etilenglicol), o agentes desnaturalizantes (sales caotrópicas o detergentes caotrópicos tales como dodecilsulfato de sodio, SDS; revisión: Subramanian A., 2002, Immunoaffinity chromatography. Mol. Biotechnol. 20 (1), 41-47).

Con estos procedimientos más bien no específicos la mayoría de todas las proteínas unidas se liberarán y después necesitarán ser analizadas por espectrometría de masas (o alternativamente por detección con anticuerpos, véase más adelante).

El procedimiento de acuerdo con el 4º aspecto incluye adicionalmente la etapa de poner en contacto las enzimas unidas con un compuesto para liberar al menos una enzima unida. Esta puesta en contacto tiene lugar también preferentemente en condiciones esencialmente fisiológicas.

Una ventaja de usar un compuesto de interés para elución en vez de los reactivos no específicos descritos anteriormente es que no todas las proteínas unidas se liberan sino solamente una subfracción, preferentemente la clase de enzimas de interés. Consecuentemente se necesitan menos proteínas para identificarse por espectrometría de masas dando como resultado análisis más rápido y mayor profundidad analítica (sensibilidad) para la clase de

enzimas de interés.

La persona experta apreciará que entre las etapas individuales de los procedimientos de la invención, pueden ser necesarias etapas de lavado. Tal lavado es parte del conocimiento de la persona experta en la técnica. El lavado sirve para retirar componentes no unidos del lisado celular del soporte sólido. Se pueden minimizar interacciones de unión no específicas (por ejemplo iónicas simples) añadiendo niveles bajos de detergente o por ajustes moderados a concentraciones salinas en el tampón de lavado.

Después de la elución o puesta en contacto, en algunos casos el soporte sólido tiene preferentemente que separarse del material liberado. Los procedimientos individuales para esto dependen de la naturaleza del soporte sólido y se conocen en la técnica. Si el material de soporte está contenido dentro de una columna el material liberado puede recogerse como flujo de movimiento continuo de columna. En caso de que el material de soporte se mezcle con los componentes del lisado (así llamado procedimiento en régimen estacionario) puede ser necesaria una etapa de separación adicional tal como centrifugación suave y el material liberado se recoge como sobrenadante. Alternativamente se pueden usar perlas magnéticas como soporte sólido de tal forma que las perlas se puedan eliminar de la muestra usando un dispositivo magnético.

De acuerdo con la presente invención, la enzima o enzimas eluida(s) o compañeros de unión coeluidos (véase más adelante) así como las enzimas liberadas de acuerdo con el procedimiento del cuarto aspecto están caracterizadas preferentemente por espectrometría de masas. Alternativamente, a lo largo de la invención también es posible llevar a cabo esta caracterización con anticuerpos específicos dirigidos contra la enzima respectiva o contra el compañero de unión coeluido.

La identificación de proteínas con análisis espectrométrico de masas (espectrometría de masas) se conocen en la técnica (Shevchenko y cols., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858, (Mann y cols., 2001, Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry, Annual Review of Biochemistry 70, 437-473) y se ilustran adicionalmente en la sección de ejemplos.

Como una alternativa al análisis de espectrometría de masas, la enzima o enzimas eluida(s) (incluyendo compañeros de unión coeluidos, por ejemplo subunidades enzimáticas o proteínas de armazón), se pueden detectar usando anticuerpos específicos dirigidos contra una proteína de interés.

Además, en otra realización preferida, una vez la identidad de la enzima o enzimas eluida(s) se ha establecido por análisis de espectrometría de masas, cada enzima de interés puede detectarse con anticuerpos específicos dirigidos contra esta enzima.

Los ensayos basados en anticuerpos adecuados incluyen pero no se limitan a pruebas de bandas de Western, ensayos de ELISA, ensayos de ELISA en sándwich y disposiciones de anticuerpos o una combinación de los mismos. El establecimiento de tales ensayos se conocen en la técnica (capítulo 11, Immunology, páginas 11-1 a 11-30 en: Short Protocols in Molecular Biology. Cuarta Edición, editado por F.M. Ausubel y cols., Wiley, Nueva York, 1999).

Se pueden llevar a cabo ensayos múltiples usando varios anticuerpos en paralelo, por ejemplo dirigido contra muchos miembros de una familia de enzimas (Pelch y cols., Kinetworks Protein Kinase Multiblot analysis, capítulo 8, páginas 99-112 en: Cancer Cell Signalling. Methods and Protocols. Editor: David M. Terrian. Humana Press, Totowa, EE.UU., 2002).

Estos ensayos pueden configurarse no solamente en cierto modo para detectar y cuantificar una enzima de interés, sino también para analizar patrones de modificación postraduccional tales como fosforilación. Por ejemplo, el estado de activación de una cinasa se puede determinar probando su estado de fosforilación con anticuerpos anti-fosfotirosina, anti-fosfoserina o anti-fosfotreonina específicos. Se conoce en la técnica como seleccionar y usar tales antifosfo-anticuerpos (Zhang y cols., 2002, Journal of Biological Chemistry 277, 43648-43658).

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de la invención de acuerdo con el 2º aspecto, caracterizando la enzima, se determina si la administración del compuesto da como resultado un estado de expresión

o activación diferencial de la enzima. Por lo tanto, por administración del compuesto, bien se puede cambiar la expresión de la enzima o bien se puede cambiar el estado de activación de la enzima.

En este contexto, un cambio en la expresión de la enzima puede preferentemente querer decir que se produce en la célula bien más o bien menos enzima.

Por cambio del estado de activación, se quiere decir preferentemente que bien la enzima es más activa después de la administración del compuesto o bien es menos activa después de la administración del compuesto. Ello puede significar también que la afinidad de la enzima por el ligando inmovilizado se incrementa o decrece (por ejemplo cambio del estado de activación de una cinasa por fosforilación por medio de una cinasa corriente arriba; o unión del compuesto a un extremo regulador alostérico de la enzima y de este modo alteración del bolsillo de unión a ATP de una enzima de unión a ATP).

En el procedimiento de acuerdo con el primer aspecto, la preparación proteica se incuba, preferentemente en

condiciones esencialmente fisiológicas, con un compuesto según se define más adelante. En consecuencia, solamente las enzimas no unidas al compuesto están subsiguientemente unidas al ligando, eluidas y caracterizadas.

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento de acuerdo con el tercer aspecto de la invención, en la etapa c) la alícuota se pone en contacto, preferentemente en condiciones esencialmente fisiológicas, con el compuesto antes de la incubación con el ligando. En consecuencia, solamente las enzimas no unidas al compuesto están subsiguientemente unidas al ligando, eluidas y caracterizadas.

En una realización preferida del procedimiento de la invención de acuerdo con el tercer aspecto, una detección reducida de la enzima en la alícuota incubada con el compuesto indica que la enzima es un objetivo directo del compuesto. Esto resulta del hecho de que en la etapa c) de este procedimiento de la invención, el compuesto compite con el ligando para la unión de la enzima. Si se puede detectar menos enzima en la alícuota incubada con el compuesto, esto quiere decir preferentemente que el compuesto ha competido con el inhibidor para la interacción con la enzima y es, por lo tanto, un objetivo directo de la enzima y viceversa.

En el procedimiento de acuerdo con el cuarto aspecto, se prefiere que este procedimiento se lleve a cabo como un rastreo de rendimiento medio o alto. Tales ensayos se conocen por la persona experta en la técnica (Mallari y cols., 2003, A generic high-throughput screeing assay for kinases: protein kinase A as an example, Journal of Biomolecular Screeing 8, 198-204; Rodems y cols., 2002, A FRET-based assay platform for ultra-high density screening of protein kinases and phosphatases, Assay and Drug Development Technologies 1 (1PT1), 9-19).

Es esencial para los procedimientos de acuerdo con el segundo, el tercero y el cuarto aspecto de la invención la provisión de un compuesto que se supone que interactúa con la enzima. Principalmente, de acuerdo con la presente invención, un compuesto tal puede ser cada molécula que sea capaz de interaccionar con las enzimas. Preferentemente, el compuesto tiene un efecto en la enzima, por ejemplo un efecto estimulador o inhibidor.

Preferentemente, dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en compuestos químicos sintéticos o que se dan en la naturaleza o fármacos orgánicos sintéticos, más preferentemente moléculas pequeñas, fármacos orgánicos

o compuestos de moléculas pequeñas naturales. Preferentemente, dicho compuesto se identifica partiendo de una biblioteca que contiene tales compuestos. Después, en el curso de la presente invención, se rastrea una biblioteca tal.

Tales moléculas pequeñas no son preferentemente proteínas o ácidos nucleicos. Preferentemente, las moléculas pequeñas muestran un peso molecular de menos de 5000 Da, más preferido menos de 2000 Da, incluso más preferido menos de 1000 Da y lo más preferido menos de 500 Da.

Una "biblioteca" de acuerdo con la presente invención se refiere a una (mayoritariamente grande) colección de entidades químicas diferentes (numerosas) que se proporcionan en una manera clasificada que permite tanto un análisis funcional rápido (rastreo) de las diferentes entidades individuales, como proporcionar al mismo tiempo una identificación rápida de las entidades individuales que forman la biblioteca. Ejemplos son colecciones de tubos o pocillos en superficies que contienen compuestos químicos que se pueden añadir en reacciones con uno o más compañeros de interacción potencialmente definidos en una manera de alto rendimiento. Después de la identificación de una interacción "positiva" de ambos compañeros, el compuesto respectivo puede identificarse rápidamente debido a la construcción de la biblioteca. Bibliotecas de orígenes naturales y sintéticos se pueden bien adquirir o bien diseñar por el trabajador experto.

Ejemplos de la construcción de bibliotecas se proporcionan en, por ejemplo, Breinbauer R, Manger M, Scheck M, Waldmann H. Natural product guided compound library development. Curr Med Chem. diciembre de 2002; 9 (23): 2129-45, en las que se describen productos naturales que son puntos de partida para el diseño de bibliotecas combinatorias, ya que tienen un registro demostrado de relevancia biológica. Este papel especial de productos naturales en química medicinal y biología química se puede interpretar a la luz de nuevos conocimientos sobre la arquitectura de dominios de proteínas obtenidos por biología estructural y bioinformática. Con el fin de cumplir los requerimientos específicos del bolsillo de unión individual dentro de una familia de dominios puede ser necesario optimizar la estructura del producto natural por variación química. Se dice que la química en fase sólida llega a ser una herramienta eficaz para este procedimiento de optimización y se destacan avances recientes en este campo en este artículo de revisión. Otras referencias relacionadas incluyen Edwards PJ, Morrell AI. Solid-phase compound library synthesis in drug design and development. Curr Opin Drug Discov Devel. julio de 2002; 5 (4): 594-605.; Merlot C, Domine D, Church DJ. Fragment analysis in small molecule discovery. Curr Opin Drug Discov Devel. mayo de 2002; 5 (3): 391-9, revisión; Goodnow RA Jr. Current practices in generation of small molecule new leads. J Cell Biochem Supl. 2001; Supl. 37: 13-21; que describe que los procedimientos de descubrimiento de fármacos actuales en muchas compañías farmacéuticas requieren colecciones grandes y crecientes de estructuras principales de alta calidad para usar en ensayos de rastreo de alto rendimiento. Las colecciones de moléculas pequeñas con diversas estructuras y propiedades "similares a fármacos" se han adquirido, en el pasado por varios medios: por archivo de esfuerzos de optimización principales internos anteriores, por adquisición a partir de proveedores de compuestos y por unión de colecciones separadas tras fusión de compañías. Aunque se describe química de alto rendimiento/química combinatoria como que es un componente importante en el procedimiento de generación principal nueva, la selección de diseños de biblioteca para síntesis y el diseño subsiguiente de miembros de biblioteca ha evolucionado a un nuevo nivel de desafío e importancia. Los beneficios potenciales de diseños de bibliotecas de compuestos de moléculas

pequeñas múltiples contra dianas biológicas múltiples ofrecen oportunidad sustancial para descubrir estructuras principales nuevas.

Los compuestos de prueba que pueden eluir enzimas objetivo a partir de los ligandos inmovilizados (4º aspecto de la invención) pueden ponerse a prueba en ensayos enzimáticos convencionales. En lo siguiente, se describirán ensayos ejemplares que se pueden usar para caracterizar adicionalmente estos compuestos. No se desea que la descripción de estos ensayos limite el ámbito de la presente invención.

Ensayo de proteasas

Puede llevarse a cabo un ensayo de proteasas ejemplar poniendo en contacto una proteasa con un sustrato peptídico con flúor (por ejemplo EDANS) y cromóforos desactivadores (por ejemplo DABCYL) en condiciones apropiadas y detectar el incremento de la fluorescencia después de escisión.

El sustrato contiene también un donante fluorescente, cerca de un extremo del péptido y un grupo aceptor , cerca del otro extremo. La fluorescencia de este tipo de sustrato se desactiva inicialmente por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia intramolecular (FRET) entre el donante y el aceptor. Cuando la proteasa escinde los sustratos los productos se liberan a partir de desactivación y la fluorescencia del donante llega a estar aparte. El incremento de la señal de fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de sustrato hidrolizada (Taliani, M. y cols., 1996, Methods 240: 60-7).

Ensayo de fosfodiesterasa

Un lisado celular de células leucocitarias humanas (U937) se puede preparar en un tampón adecuado y sirve como fuente de la enzima PDE. Después de 20 minutos de incubación a 25 ºC con [3H]AMPc como sustrato en tampón de incubación (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl2 5 mM) la [3H]Adenosina se cuantifica (Cortijo y cols., 1993, British Journal of Pharmacology 108, 562-568).

Ensayo de actividad enzimática in vitro para proteína cinasas

Brevemente, un sustrato peptídico marcado con fluoresceína puede incubarse con la tirosina cinasa (por ejemplo Lck), ATP y un anticuerpo antifosfotirosina. Según transcurre la reacción, el péptido fosforilado se une al anticuerpo anti-fosforotirosina, dando como resultado un incremento en la señal de polarización. Los compuestos que inhiben la cinasa dan como resultado una señal de polarización baja.

Alternativamente, el ensayo puede configurarse en un formato indirecto modificado. Se usa un fosfopéptido fluorescente como un trazador para formación de complejos con el anticuerpo anti-fosfo-tirosina proporcionando una señal de polimerización alta. Cuando el sustrato no marcado está fosforilado por la cinasa, el producto compite con el péptido fosforilado fluorescente por el anticuerpo. El péptido fluorescente se libera después del anticuerpo en solución resultante en un péptido señal de polarización. Tanto el ensayo directo como el indirecto se pueden usar para identificar inhibidores de actividad proteína tirosina cinasa (Seethala, 2000, Methods 22, 61-70; Seethala y Menzel, 1997, Anal. Biochem. 253, 210-218; Seethala y Menzel, 1998, Anal. Biochem. 255, 257-262).

Este ensayo de polarización de fluorescencia se puede adaptar para el uso con proteína serina/treonina cinasas reemplazando el anticuerpo antifosfotirosina con un anticuerpo antifosfoserina o antifosfotreonina (Turek y cols., 2000, Anal. Biochem. 299, 45-53, PMID 11726183; Wu y cols., 2000, J. Biomol. Screen. 5, 23-30, PMID 10841597).

Los compuestos identificados en el procedimiento de acuerdo con el 4º aspecto de la presente invención pueden optimizarse adicionalmente (optimización principal). Esta optimización subsiguiente de tales compuestos se acelera a menudo debido a la información de relación de estructura-actividad (SAR) codificada es estas bibliotecas de generación principales. La optimización principal se facilita a menudo debido a la fácil aplicabilidad de procedimientos de química de alto rendimiento (HTC) para proseguir síntesis.

Preferentemente, la optimización principal está respaldada con un procedimiento de acuerdo con el 2º, 3º o 4º aspecto de la presente invención, más preferentemente con un procedimiento de acuerdo con el 4º aspecto. Los resultados de estos procedimientos pueden proporcionar guía a químicos medicinales o a otra persona experta en la técnica de como optimizar compuestos adicionalmente con respecto a por ejemplo selectividad.

Un uso de una biblioteca tal se describe en, por ejemplo, Wakeling AE, Barker AJ, Davies DH, Brown DS, Green LR, Cartlidge SA, Woodburn JR. Specific inhibition of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase by 4-anilinoquinazolines. Breast Cancer Res Treat. 1996; 38 (1): 67-73.

La enzima que puede caracterizarse de acuerdo con la presente invención, se selecciona preferentemente del grupo que consiste en una cinasa, una fosfatasa, una proteasa, una fosfodiesterasa, una hidrogenasa, una deshidrogenasa, una ligasa, una isomerasa, una transferasa, una acetilasa, una deacetilasa, una GTPasa, una polimerasa, una nucleasa y una helicasa.

Preferentemente, la proteína es una cinasa y más preferentemente una proteína cinasa. Igualmente preferido, la proteína es una cinasa de lípidos.

Como ya se indica anteriormente, es esencial para la presente invención que el ligando sea un ligando de amplio espectro que sea capaz de unir diversas, pero no todas las enzimas de una clase dada de enzimas. Preferentemente, el ligando se une al 10 al 50 %, más preferentemente al 30 al 50 % de las enzimas de una clase de enzimas dada.

Preferentemente, el ligando es un inhibidor de la enzima.

En una realización más preferida, la enzima es una cinasa y el ligando es un inhibidor de cinasas.

Preferentemente, este inhibidor de cinasas está seleccionado del grupo que consiste en Bisindolilmaleimida VIII, Purvalanol B, CZC00007324 (PD173955 enlazable), CZC00008004.

Ligandos adicionales incluyen ligando indol 91, ligando quinazolina 32 y una estaurosporina modificada (véanse Ejemplos 5 a 7).

La estructura de ligando indol 91 ((3-amino-propil)-amida del ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico) se da en la Figura 3. Este compuesto es una molécula estructural similar al inhibidor de cinasa Sutent (SU11248; Sun y cols., 2003. J. Med. Chem. 46, 1116-1119). El ligando indol 91 puede estar acoplado covalentemente a un material de soporte sólido adecuado por medio del grupo amino primario y se usa para el aislamiento de proteínas de unión. La síntesis del ligando indol 91 se describe en el Ejemplo 1. De acuerdo con la invención, la expresión "ligando indol 91" también incluye compuestos que comprenden el núcleo idéntico pero que tienen otro engarce, preferentemente acoplado al grupo NH que no es parte de las estructuras cíclicas, para enlace al soporte sólido. Típicamente los engarces tienen armazón de 8, 9 o 10 átomos. Los engarces contienen bien un grupo carboxi-activo o bien un grupo amino-activo.

De acuerdo con una realización adicionalmente preferida, la caracterización del enzima se lleva a cabo caracterizando compañeros de unión co-eluidos de la enzima, subunidades de la enzima o modificaciones postraduccionales de la enzima.

La base de esta realización preferida es que debido al uso de condiciones esencialmente fisiológicas durante la unión entre el ligando y la enzima, es preferentemente posible preservar la condición natural de la enzima que incluye la existencia de patrones de unión, subunidades enzimáticas o modificaciones postraduccionales. Con la ayuda de la espectrometría de masas (EM) es posible no solo identificar la enzima, sino también los compañeros de unión no eluidos, las subunidades enzimáticas o dichas modificaciones postraduccionales.

De acuerdo con una realización preferida adicionalmente de la presente invención, la caracterización por espectrometría de masas (EM) se lleva a cabo por la identificación de péptidos proteotípicos de la enzima o del compañero de unión de la enzima. El concepto de péptidos proteotípicos se describe en detalle en la sección de ejemplo. La idea es que la enzima eluida o el compañero de unión se digieran con proteasas y los péptidos resultantes se determinen por EM. Como un resultado, las frecuencias peptídicas para péptidos de la misma proteína fuente difieren en un gran grado, llamándose los péptidos más frecuentemente observados que contribuyen "típicamente" a la identificación de esta proteína "péptidos proteotípicos". Por lo tanto, un péptido proteotípico como se usa en la presente invención es un péptido experimentalmente bien observable que identifica únicamente una proteína específica o una isoforma proteica.

De acuerdo con una realización preferida, la caracterización se llevó a cabo comparando los péptidos proteotípicos obtenidos para la enzima y el compañero de unión con péptidos proteotípicos obtenidos. A partir de entonces, cuando se usan fragmentos preparados por digestión de proteasas para la identificación de una proteína en EM, usualmente se observan los mismos péptidos proteotípicos para una enzima dada, es posible comparar los péptidos proteotípicos obtenidos para una muestra dada con los péptidos proteotípicos ya conocidos para enzimas de una clase dada de enzimas e identificar por lo tanto la enzima que está presente en la muestra.

El análisis de espectrometría de masas se lleva a cabo de una manera cuantitativa, por ejemplo usando tecnología iTRAQ (marcas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) o cICAT (etiquetas de afinidad codificadas por isótopos escindibles) (Wu y cols., 2006. J. Proteome Res. 5, 651-658).

De acuerdo con una realización adicionalmente preferida, el soporte solido está seleccionado del grupo que consiste en agarosa, agarosa modificada, perlas de sefarosa (por ejemplo sefarosa activada con NHS), látex, celulosa y partículas ferrimagnéticas o ferromagnéticas.

El ligando de enzima de amplio espectro puede acoplarse al soporte sólido bien covalentemente o bien no covalentemente. La unión no covalente incluye unión por medio de ligandos de afinidad a biotina que se unen a matrices de estreptavidina.

Preferentemente, el ligando de amplio espectro está acoplado covalentemente al soporte sólido.

Antes del acoplamiento, las matrices pueden contener grupos activos tales como NHS, carbodiimida etc. para permitir la reacción de acoplamiento con compuestos. Los compuestos pueden acoplarse al soporte sólido por acoplamiento directo (por ejemplo usando grupos funcionales tales como grupos amino-, sulfhidril-, carboxil-, hidroxil-, aldehído-y

cetona) y por acoplamiento indirecto (por ejemplo por medio de biotina, estando la biotina covalentemente unida al compuesto y unión no covalente de biotina a estreptavidina que está unida a soporte sólido directamente).

El enlace al material de soporte sólido puede implicar engarces escindibles y no escindibles. La escisión puede lograrse por escisión enzimática o por tratamiento con procedimientos químicos adecuados.

Las interfases de unión preferentes para unir el compuesto de interés al soporte sólido son engarces con un armazón de átomos de carbono. Típicamente los engarces tienen armazón de 8, 9 o 10 átomos. Los engarces contienen, dependiendo del compuesto a acoplarse, bien un grupo carboxi-activo o bien un grupo amino-activo.

Se logra cobertura más completa de una clase de enzimas usando combinaciones de ligandos de amplio espectro.

Preferentemente, se usan 2 a 10 ligandos diferentes, más preferido 2 a 6 ligandos diferentes, incluso más preferido 2 a 4 ligandos diferentes. Lo más preferido, se usan 3 o 4 ligandos diferentes.

Los al menos dos o todos los ligandos diferentes están presentes en un soporte sólido.

Se prefiere que el espectro que cada ligando individual pueda unir sea diferente de tal manera que se pueda lograr la máxima cobertura de la clase de enzimas.

Preferentemente, cada ligando se une al 10 al 50 %, más preferentemente al 30 al 50 % de las enzimas de una clase de enzimas dada.

De acuerdo con una realización individual preferida, caracterizando la enzima o el complejo enzimático compuesto, se determina la identidad de todos o varios de los miembros de una clase enzimática en la célula. Esto se debe al hecho de que incubando el ligando con el lisado celular, potencialmente todas las enzimas que son capaces de unir al ligando se aíslan y posteriormente se caracterizan. Dependiendo del perfil de expresión de las enzimas, el ligando es capaz de unir a todos o algunos de los miembros de una clase enzimática, que puede así identificarse. En el caso de las cinasas, los procedimientos de la presente invención permiten a la persona experta identificar y caracterizar la quinoma expresada en una célula dada.

El compuesto es diferente del ligando.

La invención describe adicionalmente un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica, que comprende las etapas de:

a) identificar un complejo de compuesto enzimático de acuerdo con el procedimiento del cuarto aspecto de la presente invención, y

b) formular el compuesto para una composición farmacéutica.

Por lo tanto, la invención describe un procedimiento para la preparación de composiciones farmacéuticas, que pueden administrarse a un sujeto en una cantidad eficaz. En un aspecto preferido, el agente terapéutico se purifica sustancialmente. El sujeto a tratarse es preferentemente un animal incluyendo, pero no limitado a animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc. y es preferentemente un mamífero y más preferentemente un ser humano. El sujeto puede ser un mamífero no humano.

En general, las composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal de EE.UU. o recogido en farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales y más particularmente, en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el producto terapéutico. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, incluyendo pero no limitados a aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía oral. La solución salina y la dextrosa acuosa son vehículos preferidos cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Para soluciones inyectables se emplean preferentemente soluciones salinas y soluciones de dextrosa acuosa y glicerol como vehículos líquidos. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada desecada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición puede contener también cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación mantenida y similares. Se puede formular la composición en forma de supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándar tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Las composiciones de este tipo contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del

compuesto terapéutico, preferentemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo con el fin de proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debería ser adecuada para el modo de administración.

La composición puede estar formulada, de acuerdo con procedimientos de rutina, como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Donde sea necesario, la composición puede incluir también un agente de solubilización y una anestesia local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se proporcionan bien por separado o bien mezclados juntos en formas de dosificación unitaria, por ejemplo, en forma de polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un contenedor sellado herméticamente, tal como una ampolla o bolsita indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición ha de administrarse por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contenga solución salina o agua estéril de grado farmacéutico. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril o solución salina para inyección de tal manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

Los productos terapéuticos pueden formularse como formas salinas o neutras. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos carboxilo libres tales como aquellas derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., aquellas formadas con grupos amina libres tales como aquellas derivadas de isopropilamina, trietilamina, 2-(etilamino)etanol, histidina, procaína, etc. y aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio e hidróxidos férricos, etc..

La cantidad del agente terapéutico que será eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección y puede determinarse por técnicas clínicas estándar. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis exacta a emplearse en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o trastorno y debería decidirse de acuerdo con la opinión del médico y las circunstancias de cada paciente. No obstante, los intervalos de dosificación adecuados para administración intravenosa son, en general, de aproximadamente 20-500 microgramos de compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los intervalos de dosificación adecuados para administración intranasal son, en general, de aproximadamente 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Se pueden extrapolar dosis eficaces a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelo animal. En general, los supositorios pueden contener ingrediente activo en el intervalo del 0,5 % al 10 % en peso; las formulaciones orales contienen preferentemente ingrediente activo al 10 % al 95 %.

Se conocen y pueden usarse diversos sistemas de administración para administrar un agente terapéutico, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas y microcápsulas; uso de células recombinantes capaces de expresar el agente terapéutico, uso de endocitosis mediada por receptor (por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432); construcción de un ácido nucleico terapéutico como parte de un retroviral u otro vector, etc. Los procedimientos de introducción incluyen pero no están limitados a vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos pueden administrarse por cualquier vía adecuada, por ejemplo por infusión o infección en bolo, por absorción a través recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas en el sistema nervioso central por medio de cualquier vía adecuada, incluidas la inyección intraventricular e intratecal; se puede facilitar la inyección intraventricular por medio de un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito de Ommaya. También se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, por medio del uso de un inhalador o nebulizador y la formulación con un agente de aerosol.

Puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas localmente al área en necesidad de tratamiento. Esto puede lograse, por ejemplo y no a modo de limitación, por infusión local durante una operación quirúrgica, aplicación tópica, por ejemplo junto con un vendaje después de una operación quirúrgica, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o edema o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, que incluye membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. En una realización, la administración puede ser inyección directa al sitio (o primer sitio) de un tumor maligno o tejido neoplásico o pre-neoplásico.

El agente terapéutico se puede administrar en una vesícula, en particular un liposoma (Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat y cols., 1989, en: Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler, eds., Liss, Nueva York, páginas 353-365; López-Berestein, ibid., páginas 317-327; véase generalmente ibid.)

El agente terapéutico se puede administrar por medio de un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede usar una bomba (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201-240; Buchwald y cols., 1980, Surgery 88: 507-516; Saudek y cols., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574-579. En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos (Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise, eds., CRC Press, Boca Ratón, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball, eds., Wiley, Nueva York, 1984; Ranger y Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; Levy y cols., 1985, Science

228: 190-192; During y cols., 1989, Ann. Neurol. 25: 351-356; Howard y cols., 1989, J. Neurosurg. 71: 858-863. En aún otra realización, se puede situar un sistema de liberación controlada en proximidad de la diana terapéutica, es decir, el cerebro, requiriendo así solamente una fracción de dosis sistémica (por ejemplo, Goodson, 1984, en: Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, páginas 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión por Langer (1990, Science 249: 1527-1533).

El procedimiento puede comprender adicionalmente la etapa de modular la afinidad de unión del compuesto al enzima. Esto puede lograrse por procedimientos conocidos por la persona experta en la técnica, por ejemplo por una modificación química de diversos residuos del compuesto y análisis subsiguientes de la afinidad de unión del compuesto a la enzima.

La invención describe adicionalmente el uso de al menos un ligando de enzimas de amplio espectro inmovilizado en un soporte sólido para la caracterización de al menos una enzima o de un complejo compuesto-enzima. Con respecto a este uso, se aplican todas las realizaciones cono se describen anteriormente para los procedimientos de la invención.

La invención está ilustrada adicionalmente por las siguientes figuras y ejemplos, lo que no se considera que sea limitante para el alcance de la protección conferida por las reivindicaciones de la presente solicitud.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Estructuras de ligandos de Kinobeads. La fuente y las vías de síntesis de los ligandos se describen en el Ejemplo 1.

Figura 1a: Ligando de Kinobeads 1 (bisindolilmaleimida VIII).

Figura 1b: Ligando de Kinobeads 2 (purvalanol B).

Figura 1c: Ligando de Kinobeads 3 (CZC00007324, (7-(4-aminometil-fenilamino)3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona)).

Figura 1d: Ligando de Kinobeads 4 (CZC00008004, 2-(4'-aminometilfenilamina)-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenil-amina).

Figura 2: Signaloquinoma (véase Ejemplo 2).

Esta figura muestra una comparación de exposiciones consecutivas de fármacos usando Kinobeads (círculo central) e inmunoprecipitaciones convencionales con perlas de anticuerpos antifosfotirosinas (círculo derecho). En los experimentos de Kinobeads se identificaron un total de 626 proteínas, de estas 100 son cinasas. En el experimento de inmunoprecipitación (IP) se identificaron un total de 503 proteínas, 12 de estas eran cinasas. Las cinasas identificadas con ambos experimentos (cinasas comunes) se enumeran en el área que se superpone. El resultado muestra que con las Kinobeads se identificaron significativamente más cinasas (100 cinasas) comparado con las perlas de anticuerpos anti-fosfotirosinas (12 cinasas).

Figura 3: Estructuras de los ligandos de Kinobeads 5, 6 y 7. Las vías de síntesis de los ligandos se describen en los Ejemplos 5, 6 y 7.

Figura 3a: Estructura del ligando de Kinobeads 5 (ligando indol 91).

Figura 3b: Estructura del ligando de Kinobeads 6 (ligando quinazolina 32).

Figura 3c: Estructura del ligando de Kinobeads 7 (estaurosporina modificada).

Figura 4: Perfil de afinidad de proteína cuantitativo (PAP).

La figura muestra competición en lisado con compuesto de prueba Bis VIII y detección de proteínas con análisis de bandas de Western. El experimento expuesto de forma consecutiva se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 8 con muestras de lisado de células Jurkat que contienen 10 mg de proteína. Lisado de entrada (carril L; 50 μg de proteína) y eluatos de SDS de Kinobeads (carriles 1 a 7) se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida, se transfirieron a una membrana y se sondearon con anticuerpos. Figura 4A: La prueba de bandas de Western se sondeó primero con un anticuerpo dirigido contra GSK3beta. Anticuerpos de detección secundarios marcados con peroxidasa se usaron para detección quimioluminiscente. Como un control de carga se sondea una banda con un anticuerpo anti-ITK. Carril

L: 50 μg de lisado de Jurkat; carril 1: Bis VIII 6,0 μM; carril 2: Bis VIII 2,0 μM; carril 3: Bis VIII 0,67 μM; carril 4: Bis VIII 0,22 μM; carril 5: Bis VIII 0,074 μM; carril 6: Bis VIII 0,025 μM; carril 7: DMSO al 0,5 % (control de disolvente).

Figura 4B: Competición dependiente de concentración de unión de GSK3 beta a Kinobeads por Bis VIII. Las bandas de GSK3 beta en la prueba de bandas de Western mostradas en la Figura 2A se cuantificaron y se representaron frente a la concentración de Bis VIII añadida al lisado.

Figura 5: Perfil de afinidad de proteína cuantitativo para cinasas.

Los resultados del experimento de perfil de afinidad del Ejemplo 8 se muestran para cuatro cinasas. Los valores de

intensidad relativa (IR) se representan frente a concentración de compuesto (Bis VIII). El valor de IR50 representa la concentración de compuesto a la que la intensidad relativa de la señal de EM para una cinasa dada es el 50 % comparada con el control de DMSO.

Figura 5A: Curva para glucógeno sintasa cinasa 3 alfa (GSKa; IR50 = 72,7 nM).

Figura 5B: Curva para glucógeno sintasa cinasa 3 beta (GSKb; IR50 = 95 nM).

Figura 5C: Curva para proteína cinasa C alfa (PKCa; IR50 = 12,2 nM).

Figura 5D: Curva para proteína cinasa C beta (PKCb; IR50 = 21,5 nM).

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de Kinobeads

Este ejemplo ilustra la preparación de Kinobeads con 4 ligandos diferentes. Estas Kinobeads se usaron más tarde en el Ejemplo 2 y en el Ejemplo 3.

Los ligandos de captura de amplio espectro se inmovilizaron covalentemente en un soporte sólido por enlace covalente usando grupos funcionales adecuados (por ejemplo grupos amino o carboxilo). Los compuestos que no contienen un grupo funcional adecuado se modificaron con el fin de introducir un grupo tal. Los procedimientos químicos necesarios se conocen en la bibliografía de la química medicinal y se ilustran más adelante.

1. Selección y síntesis de ligandos

Los siguientes cuatro ligandos de especificidad amplia (ligandos de Kinobeads 1 a 4; Figura 1) se acoplaron covalentemente a perlas en reacciones aparte según se describe más adelante y después se mezclaron y usaron los cuatro tipos de perlas para los experimentos expuestos consecutivamente de fármacos.

Ligando de Kinobeads 1: Bisindolilmaleimida VIII-acetato (Fórmula química: C24H22N4O2 CH3COOH; P.M.: 398,5; número CAS 138516-31-1; Alexis Biochemicals, AXXORA Deutschland GmbH, Grünberg; Cat-ALX-270-056).

Ligando de Kinobeads 2: Purvalanol B (composición química: C20H25ClN6O3; P.M.: 441,92; número CAS 212844-54-7; Tocris Biochemicals Cat-1581, BIOTREND Chemikalien GmbH Köln, Alemania).

Ligando de Kinobeads 3: CZC00007324; (7-(4-aminometil-fenilamino)-3-(2,6-diclorofenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona).

Síntesis de ligando de Kinobeads 1:7-(4-aminometil-fenilamino)-3-(2,6-diclorofenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona

Las primeras siete etapas de la síntesis de CZC00007324 se llevan a cabo según se describe en Klutchko, S.R. y cols., 1998, Journal of Medicinal Chemistry 41, 3276-3292. Las etapas que quedan se llevaron a cabo como se describe a continuación.

Etapas 1-7: 6-(2,6-diclorofenil)-2-metanosulfonil-8-metil-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona se sintetizó a partir de éster de 4-cloro-2-metilsulfanil-5-pirimidinacarboxilato de etilo siguiendo el procedimiento en J. Med. Chem. 1998, 41, 3276-3292.

Etapa 8: Éster terc-butílico del ácido {4-[3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidro-[1,6]naftiridin-7-ilamino]bencil}-carbámico

6-(2,6-diclorofenil)-2-metanosulfonil-8-metil-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona (0,100 g, 0,2 mmol) y 3-(N-Boc-metilamino)anilina (0,421 g, 2,0 mmol) se mezclaron como sólidos y se calentaron a 140 ºC durante 30 minutos. La mezcla de reacción en bruto se disolvió en diclorometano y se lavó con HCl 2 N (ac.) x 2. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró. El producto en bruto se recristalizó a partir del acetato de etilo caliente proporcionando éster terc-butílico del ácido {4-[3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidro-[1,6]naftiridin-7-ilamino]bencil}-carbámico como un sólido amarillo (0,031 g-al 25 %). RMN de 1H (DMSO-d6) δ 10,18 (s, 1H); 8,83 (s, 1H); 7,76 (d, 2H); 7,58 (d, 2H); 7,46 (dd, 1H); 7,32 (ta, 1H); 7,23 (d, 2H); 4,10 (d, 2H); 3,66 (s, 3H); 1,40 (s, 9H). CLEM: procedimiento A, TR = 5,60 minutos.

Etapa 9: 7-(4-aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona

Se disolvió éster terc-butílico del ácido {4-[3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-2-oxo-1,2-dihidro-[1,6]naftiridin-7-ilamino]bencil}-carbámico (0,026 g, 0,05 mmol) en metanol (3 ml) y se añadió ácido clorhídrico (4 N en dioxano, 1,2 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas cuando HPLC no mostró que quedase ningún material de partida. Se retiró el disolvente al vacío. El residuo se disolvió en agua y la solución se basificó en carbonato de sodio (sat., ac.). El precipitado resultante se recogió y se secó proporcionando 7-(4-aminometil-fenilamino)-3-(2,6-dicloro-fenil)-1-metil-1H-[1,6]naftiridin-2-ona

(0,021 g-al 100 %) como un sólido amarillo. RMN de 1H (DMSO-d6) δ 10,20 (da, 1H); 8,83 (d, 1H); 7,90 (d, 1H); 7,76 (d, 1H); 7,72 (d, 1H); 7,60 (dd, 2H); 7,47 (ddd, 1H); 7,33 (d, 1H); 7,24 (d, 1H); 4,07 (d, 2H); 3,66 (s, 3H). LCMS: procedimiento A, TR = 4,44 minutos, [MH+ = 426].

Ligando de Kinobeads 4: CZC00008004. 2-(4'-aminometilfenilamina)-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenil-amina. Fórmula química C17H16N5F. P.M.: 309,34. Esto es un análogo de CZC00004919.

Síntesis de CZC00008004-(2-(4'-aminometilfenilamina)-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenil-amina

Etapa 1: 2,4-dicloro-5-fluoro-pirimidina

Se añadió oxicloruro de fósforo (2 ml) a 5-fluorouracilo (1 g, 7,688 mmol) seguido por pentacloruro de fósforo (3,28 g, 15,76 mmol), la mezcla se calentó y se agitó a 110 ºC durante 5 horas y después se dejó enfriar. El oxicloruro de fósforo se hidrolizó lentamente en una mezcla de baño de hielo/agua (10 ml). La mezcla acuosa se extrajo con éter dietílico (3 x 10 ml). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con bicarbonato de sodio saturado (10 ml) seguido por cloruro de sodio saturado (10 ml), se secaron con sulfato de magnesio anhidro y después se filtraron. El disolvente se retiró por evaporación a 46.662,7 pascales (350 mm de Hg) dejando un aceite viscoso que cristaliza proporcionando el compuesto del título (1,22 g-al 95 %). El compuesto se usó sin análisis adicional en la etapa siguiente.

Etapa 2: (2-cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenilamina

A una solución de 2,4-dicloro-5-fluoro-pirimidina (0,550 g, 3,30 mmol) en dimetilformamida (13 ml) se añadió anilina (0,301 ml, 3,30 mmol) y N-etildiisopropilamina (0,602 ml, 3,63 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla se desactivó con acetato de etilo (20 ml) y se lavó con cloruro de amonio saturado (20 ml) y la fase orgánica se retiró. La fase acuosa se lavó con acetato de etilo (20 ml) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (20 ml), cloruro de sodio saturado (10 ml) y se secaron con sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se evaporó por evaporación y el sólido resultante se sometió a cromatografía en columna (sílice, acetato de etilo (0 al 20 %/éter de petróleo) proporcionando el compuesto del título (0,532 g-al 72 %). CLEM: procedimiento A, TR = 4,67 minutos, [MH+ = 224].

Etapa 3: Éster terc-butílico del [4-(5-fluoro-4-fenilamino-pirimidin-2-ilamino)-bencil]-carbámico

Se mezclaron conjuntamente (2-cloro-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenilamina (0,087 g, 0,39 mmol) y 4[N-Boc-aminometil]anilina (0,087g, 0,39 mmol). Se añadió una barra agitadora y el matraz se situó en un baño de aceite a 110 ºC durante 20 minutos. La mezcla se enfrió, el residuo se disolvió en 3 ml de diclorometano/metanol (99:5) y se cargó en un cartucho de cromatografía en matraz y se purificó usando acetato de etilo (20 al 60 %) en éter de petróleo dando el compuesto deseado como un sólido amarillo (0,051 g-al 32 %). RMN de 1H (CDCl3-d6) δ 7,85 (d, 1H); 7,50 (dd, 2H); 7,39 (d, 2H); 7,27 (t, 2H); 7,12-7,00 (m, 3H); 6,81 (s, 1H); 6,66 (s, 1H); 4,67 (s, 1H), 4,17 (d, 2H), 1,36 (s, 9H). CLEM: procedimiento B, TR = 9,20 minutos, [MH+ = 410].

Etapa 4: (2-(4'-aminometilfenilamina)-5-fluoro-pirimidin-4-il)-fenil-anilina

A una solución de éster terc-butílico del ácido [4-(5-fluoro-4-fenilamino-pirimidin-2-ilamino)-bencil]-carbámico (0,055 g, 0,134 mmol) en metanol (5 ml) HCl (4N en dioxano) (2 ml) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se retiró el disolvente por evaporación. Se añadió agua (5 ml) y el pH de la solución se elevó a 8 por adición de bicarbonato de sodio. El precipitado resultante se filtró y se secó proporcionando el compuesto del título (0,035 g-al 84 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,90 (d, 1H); 7,70 (dd, 2H); 7,55 (dd, 2H); 7,35 (t, 2H); 7,20 (d, 2H); 7,10 (t, 1H); 3,80 (s, 2H). CLEM: procedimiento B, TR = 5,022 minutos, [MH+ = 310].

Todas las reacciones se llevaron a cabo en atmósfera inerte. Se obtuvieron espectros de RMN en un dpx400 de Bruker. CLEM se llevó a cabo en un Agilent 1100 usando un Zorbax SBC-18, columna 4,6 mm x 150 mm x 5 μ. El flujo en columna fue 1 ml/minuto y los disolventes usados fueron agua y acetonitrilo (TFA al 0,1 %) con un volumen de inyección de 10 ul. Las longitudes de onda fueron de 254 y 210 nm. A continuación se describen los procedimientos.

Tabla 1: Procedimientos analíticos

Procedimiento

Nombre de Procedimiento de Acceso Fácil Nombre de Procedimiento de ChemStation Caudal Disolvente Tiempo deejecución

A

Analítica positiva de 7 minutos ANL_POS7.M 1ml/minuto MeCN al 5-95 % durante 0-2,5 minutos MeCN al 95 % durante 2,5-6 minutos 7 minutos

B

Analítica positiva iónica ANAL_POS.M 1ml/minuto MeCN al 5-95 % durante 0-11minutos MeCN al 95 % durante 11-13 minutos 15 minutos

Tabla 2: Abreviaturas usadas en protocolos de química

ac.

acuoso

d

doblete

DMSO

dimetilsulfóxido

g

gramo

HCl

Ácido clorhídrico

HPLC

Cromatografía líquida de alta presión

CLEM

Cromatografía de líquidos-espectrometría de masas

m

multiplete

min

minuto

mmol

milimol

N

Normal

RMN

resonancia magnética nuclear

c

cuadruplete

TR

Tiempo de retención

s

singlete

sat

saturado

t

triplete

2. Inmovilización de ligandos que contienen grupos amina

Se equilibró sefarosa 4 activada por NHS de Flujo Rápido (Amersham Biosciences, 17-0906-01) con DMSO anhidro

5 (dimetilsulfóxido, Fluka, 41648, H2O <= 0,005 %). Se situó 1 ml de perlas sedimentadas en un tubo Falcon de 15 ml, se añadió solución de compuesto de reserva (usualmente 100 mM en DMF o DMSO) (concentración final 0,2-2 μmol/ml de perlas) así como 15 μl de trietilamina (SIGMA, T-0886, puro al 99 %). Las perlas se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador de extremo a extremo (Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.) durante 16-20 horas. La eficacia de acoplamiento se determinó por HPLC. Los grupos NHS no reaccionados se bloquearon en

10 incubación con aminoetanol a temperatura ambiente en el agitador de extremo a extremo durante toda una noche. Se almacenaron perlas lavadas en isopropanol o se usaron inmediatamente para reacciones de unión.

3. Inmovilización de ligandos que contienen grupos carboxilo

Los compuestos se acoplaron en condiciones básicas a perlas de NHS-sefarosa invertidas (química de PyBroP) como se resume más adelante.

15 Lavado de perlas

Etapa 1: Usar 1 ml (volumen sedimentado) de perlas de NHS-sefarosa para una reacción de acoplamiento estándar (NHS-sefarosa activada 4 por NHS de Flujo Rápido proporcionada en isopropanol, Amersham Biosciences, 17-0906-01).

Etapa 2: Lavar las perlas 3 veces con 10 ml de DMSO y una vez con 10 ml de DMSO anhidro (dimetilsulfóxido, Fluka,

20 41648, H2O <= 0,005 %); etapas de centrifugación: 1 min, 1.200 rpm, temperatura ambiente; descartar sobrenadante en desechos de disolventes no halógenos.

Etapa 3: Después de la última etapa de lavado las perlas se resuspenden en un volumen de DMSO anhidro.

Inversión de las perlas NHS

Esta etapa se diseña para 1 ml de perlas, ajustar de acuerdo con ello para otros volúmenes de perlas. Las perlas NHS 25 tienen una capacidad de 20 μmol/ml. Por lo tanto, las perlas invertidas al 20 % tendrían una capacidad de 4 μmol/ml.

Elaborar una mezcla de proporción 4:1 de aminoetanol y etilendiamina, después añadir trietilamina a la mezcla. (200 μmol totales) (10 x capacidad de 1 ml de perlas NHS).

1: 9,66 μl de aminoetanol 16,56 M (2-aminoetanol, Aldrich, 11.016-7) (total 160 μmol).

2: 2,68 μl etilendiamina 14,92 M (Fluka, 03350) (40 μmol totales).

3: 15 μl trietilamina 7,2 M (TEA) (SIGMA, T-0886, puro al 99 %). La mezcla se dividirá en dos fases, pero todo va bien.

Añadir mezcla a perlas NHS lavadas/resuspendidas e incubar 16 horas (durante toda una noche) a temperatura ambiente en el agitador de extremo a extremo.

Acoplamiento de PyProB. Este procedimiento no requiere una etapa de preactivación, la activación y el acoplamiento tienen lugar in situ.

1.

Disolver PyBroP (hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio; suministrador: NOVABIOCHEM) en dimetilformamida libre de agua (DMF) a una concentración final de 100 mM (46,62 mg/ml), la solución se puede usar durante hasta un día.

2.

Disolver 35 μl de diisopropiletilamina (DIEA) en 1 ml de DMF libre de agua, concentración final 200 mM.

3.

Lavar 1 ml de perlas invertidas 3 veces con 15 ml de DMSO. Etapa de centrifugación: 1 minuto a 1.200 rpm a temperatura ambiente. Descartar sobrenadante.

4.

Lavar perlas invertidas 3 veces con 15 ml de DMF libre de agua. Etapa de centrifugación 1 minuto, 1.200 rpm a temperatura ambiente. Descartar sobrenadante.

5.

Suspender perlas de sefarosa invertidas en 1 ml de DMF libre de agua.

6.

Añadir 100 μl de solución de diisopropiletilamina (DIEA).

7.

Añadir compuesto (1 mmol/ml de perlas de sefarosa invertidas; corresponde a 10 μl de compuesto 100 mM/ml de perlas de sefarosa) de solución de DMF en la cantidad requerida a las perlas.

8.

Mezclar hasta que se obtiene una suspensión homogénea.

9.

Centrifugar 1 minuto a 1200 rpm a temperatura ambiente, retirar 20 μl de sobrenadante y diluir en 30 μl de metanol (MeOH) para el valor de partida para análisis de HPLC.

10.

Añadir 100 μl de solución PyBroP a la suspensión y mezclar de nuevo.

11.

Incubar durante toda una noche en el mezclador de extremo a extremo a temperatura ambiente.

12.

Centrifugar 1 minuto a 1200 rpm a temperatura ambiente, retirar 20 μl de sobrenadante y diluir en 30 μl de metanol (MeOH) para el valor asociado para análisis de HPLC.

Bloqueo de las perlas

1.

Bloquear las perlas añadiendo 100 μl de NHS-acetato 100 mM (véase más adelante como elaborar reactivo bloqueante).

2.

Incubar durante toda una noche a temperatura ambiente en el agitador de extremo a extremo. Reactivo bloqueante (ácido acético activado NHS):

1.

Preparar soluciones 200 mM de DCCD y NHS en acetonitrilo (~ 5 ml de cada una).

2.

Mezclar volúmenes iguales de NHS 200 mM y DCCD en un vial de cristal transparente de 20 ml.

3.

Por 1 ml de volumen total de mezcla de NHS/DCCD, añadir 11,4 μl de ácido acético 17,49 M (exceso molar 2x) (Merck, 1.00063.1000).

4.

Mezclar cuidadosamente. Se formará un precipitado después de aproximadamente 2 minutos (derivado de cristales de urea).

5.

Dejar reposar la reacción a temperatura ambiente al menos durante toda una noche antes de usar adicionalmente.

Lavado de perlas

1. Lavar las perlas 2 veces con 14 ml de DMSO (por ejemplo FLUKA, 34869 o equivalente), después con 2 x 14 ml de isopropanol (Merck, 1.00983.1000, pro-análisis). Etapas de centrífuga: 1 minuto a 1200 rpm a temperatura ambiente.

Retirar sobrenadante entre lavados.

2. Resuspender las perlas con 1 ml de isopropanol haciendo una suspensión al 50 % para almacenamiento a -20 ºC o usar inmediatamente uniendo reacciones con lisados celulares.

Tabla 3: Abreviaturas usadas en protocolos de acoplamiento

DCCD

Diciclohexilcarbodiimida

DIEA

Disopropiletilamina

DMSO

Dimetilsulfóxido

DMF

Dimetilformamida

NHS

N-hidroxisuccinimida

PyBroP

Hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio

TEA

Trietilamina

Ejemplo 2: Signaloquinoma

Este ejemplo ilustra el tratamiento de células con compuestos (véase particularmente el segundo aspecto de la invención). Las células HeLa se trataron con factor de crecimiento epidérmico (EGF), se preparó un lisado celular y se analizó usando Kinobeads (protocolo experimental en sección 2.1) y espectrometría de masas. La preparación de Kinobeads se describe en el Ejemplo 1.

En paralelo el lisado celular se sometió a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-fosfotirosina (protocolo experimental en sección 2.2) y se analizó por espectrometría de masas.

El resultado (Figura 2) muestra que las Kinobeads identifican significativamente más cinasas (Tabla 8) comparadas con el procedimiento de inmunoprecipitación (Tabla 6).

1. Preparación de la muestra biológica (lisado celular) 1.1 Cultivo celular y tratamiento de células

Cultivo celular. Las células HeLa (American Type Culture Collection-N.º: CCL-2) se cultivaron en medio MEM (sin L-arginina y sin L-glutamina; Promocell C-75280), suero fetal bobino dializado al 10 % (Gibco, 26400-044), aminoácidos no esenciales 100x al 1 % (Cambrex, BE13-114E), piruvato de sodio 1 mM (Gibco, 11360-039), L-glutamina 2 mM (Gibco, 25030-032), L-arginina 12C o 13C a 40 mg/l (12C Arginina-Sigma, A6969) (13C Arginina-Cambridge Isotope Laboratories Inc., CLM-2265) a 37 ºC, CO2 al 5 %.

Propagación celular. Después de que las células han alcanzado confluencia en una placa de 15 cm, las células se dividieron 1 a 10 para crecimiento adicional. Las células se dividieron retirando primero los medios sobrenadantes, lavando después brevemente las células con 15 ml de tampón de PBS (Gibco, 14190-094). Después de la retirada del PBS, las células se desprendieron de la placa añadiendo 2 ml de solución de tripsina-EDTA (Gibco, 25300-054) por placa de 15 cm e incubando la placa durante 10 minutos a 37 ºC. Después del desprendimiento de las células, se añadieron 8 ml de medio de cultivo MEM (véase anteriormente) por placa de 15 cm. Se puso 1 ml de esta solución en placas de 15 cm recién preparadas y se añadieron medios de MEM de 24 ml (véase anteriormente). Las placas se incubaron de nuevo en CO2 al 5 % a 37 ºC hasta que las células fueron confluyentes (3-4 días).

Tratamiento con EGF de células. Un día antes del tratamiento de las células con Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF), el medio de cultivo celular se retiró por aspiración y se añadieron 20 ml de medio MEM recién preparado (véase anteriormente) salvo porque el medio estaba suplementado con Suero Fetal Bovino (FBS) al 0,1 % en lugar de con FBS al 10 %. Las células se incubaron en este medio de inanición durante toda una noche a 37 ºC, en CO2 al 5 %. Después de la inanición de las células, se añadieron 3 μl de EGF humano recombinante 1 mg/ml (Biomol, 50349-1) a cada placa de 15 cm (concentración de EGF final = 150 ng/ml de medio). Las placas se incubaron a 37 ºC, en CO2 al 5 % durante 10 minutos antes de recoger.

Recogida de células. Las células se recogieron por vertido aparte del medio que contiene EGF, lavado de cada placa de 15 cm una vez con 10 ml de tampón de PBS enfriado en hielo y raspando la placa con una espátula de goma con el fin de desprender las células. Las células se transfirieron dentro de tubos Falcon de 50 ml (Becton Dickinson, 352070) y se centrifugaron durante 10 minutos a 1500 rpm en un Heraeus Multifuge 3SR. El sobrenadante se aspiró y el sedimento de células se resuspendió en 50 ml de tampón de PBS enfriado en hielo. Después de centrifugación y de aspiración del sobrenadante los sedimentos celulares se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se

almacenaron después a -80 ºC.

1.2 Preparación de lisados celulares

El lisado celular de HeLa se preparó por disrupción mecánica en solución tampón en condiciones suaves que mantienen la estructura y función de las proteínas.

Se llevaron a cabo las siguientes etapas:

•

Descongelar el tejido rápidamente a temperatura ambiente o a 37 ºC, después transferir tejido a una botella de vidrio que contiene el tampón de lisis 1x (uso de un vial lo suficientemente grande para usarse con homogeneizador Polytron PT 3100)

•

Lisar el órgano/tejido con 4 pulsos de 10 segundos a 5000-7000 rpm a 4 ºC en la cámara fría

•

Transferir el homogenado en tubos Falcon de 50 ml pre-enfriados

•

Incubar homogenado en hielo durante 30 minutos

•

Centrifugar células durante 10 minutos a 6.000 g a 4 ºC (6.000 rpm en Sorvall SLA600, preenfriada)

•

Transferir sobrenadante a un tubo de UZ-policarbonato (Beckmann, 355654)

•

Centrifugar sobrenadante durante 1 hora a 145.000 g a 4 ºC (40.000 rpm en Ti50.2, pre-enfriado)

•

Guardar sobrenadante (retirar y descartar la mayoría de la fase lipídica si es posible), transferir sobrenadante dentro de una botella de vidrio y almacenar en hielo

•

Determinar concentración de proteínas por ensayo de Bradford (BioRad). Concentraciones de proteínas típicas están en el intervalo de 5-10 mg/ml.

•

Preparar alícuotas en tubos Falcon de 15 a 50 ml

•

Congelar alícuotas en nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 ºC Preparación de 100 ml de tampón de lisis 1x con NP40 al 0,8 %:

Combinar las siguientes soluciones de reactivos y añadir agua destilada hasta un volumen final de 100 ml: 20 ml de tampón de lisis 5x (véase más adelante), 100 μl de DTT 1 M, 5 ml de NaF 0,5 M, 4 ml de NP40 al 20 %, 4 comprimidos libres de EGTA completos (cóctel inhibidor de proteasas, Roche Diagnostics, 1 873 580), añadir agua destilada hasta 100 ml.

Tabla 4: Preparación de tampón de lisis 5x

Sustancia:

Solución madre Concentración final en tampón de lisis 1x Añadir para tampón delisis 115x

Tris/HCl pH 7,5

1 M 50 mM 250 ml

Glicerol

87 % 5 % 288 ml

MgCl2

1 M 1,5 mM 7,5 ml

NaCl

5 M 150 mM 150 ml

Na3VO4

100 mM 1 mM 50 ml

Estas soluciones se obtuvieron a partir de los siguientes suministradores:

Tris 1 M/HCl pH 7,5: Sigma, T-2663; glicerol al 87 %: Merck, n.º de cat.: 04091.2500; MgCl2 1 M: Sigma, M-1028; NaCl 5 M: Sigma, S-5150. El tampón de lisis concentrado 5x se filtró a través de un filtro de 0,22 μm y se almacenó en alícuotas de 40 ml a -80 ºC.

Preparación de soluciones de reserva usadas en este protocolo: Preparación de una solución de reserva de Na3VO4 100 mM:

Disolver 9,2 g de Na3VO4 en 400 ml de agua destilada.

1) Ajustar el pH a 10,0 usando bien NaOH 1 N o bien HCl 1 N. El pH de partida de la solución de ortovanadato de sodio puede variar con lote. A pH 10,0 la solución será amarilla. 2) Hervir la solución hasta que se vuelve incolora (aproximadamente 10 minutos). 3) Enfriar a temperatura ambiente. 4) Reajustar el pH a 10,0 y repetir etapas 2 y 3 hasta que la solución permanezca incolora y el pH se estabilice a 10,0. 5) Ajustar el volumen a 500 ml con agua destilada. 6) Congelar alícuotas a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

Preparación de solución de reserva de NaF 500 mM:

Disolver 21,0 g de NaF (Sigma, S7920) en 500 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ºC.

Preparación de solución de NP40 al 20 %:

Pesar 40,0 g de NP40 (Sigma, Igepal-CA630, número de catálogo: 13021). Añadir agua destilada hasta 200 g. Mezclar completamente y almacenar solución a temperatura ambiente.

Preparación de solución de DTT 1 M:

Disolver 7,7 g de DTT (Biomol, número de catálogo: 04010) en 50 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de filtro de 0,22 μm y congelar alícuotas de 400 μl a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

2. Reacciones de unión 2.1 Puesta en contacto de las "Kinobeads" (ligandos capturadores inmovilizados) con el lisado celular

Las Kinobeads (ligandos capturadores inmovilizados) se pusieron en contacto con el lisado celular preparado a partir de células HeLa en condiciones que permiten la unión de las proteínas en el lisado a los ligandos. Las condiciones de unión estaban cerca de las fisiológicas eligiendo condiciones tampón adecuadas que conservan la función de las proteínas. Después de retirar proteínas no capturadas a través de un procedimiento de lavado suave las proteínas unidas se pusieron en contacto con un compuesto de prueba que condujo a la elución de las proteínas.

2.1.1 Preparación de tampones de DP Tabla 5: Preparación de tampón 5x-DP

Sustancia:

Solución madre Concentración final en tampón de lisis 1x Añadir por 1 l tampón delisis 5x

Tris/HCl a pH 7,5

1 M 50 mM 250 ml

Glicerol

87 % 5 % 288 ml

MgCl2

1 M 1,5 mM 7,5 ml

NaCl

5 M 150 mM 150 ml

Na3VO4

100 mM 1 mM 50 ml

El tampón de DP 5x se filtró a través de filtro de 0,22 μm y se almacenó en alícuotas de 40 ml a -80 ºC. Estas soluciones se obtuvieron a partir de los siguientes suministradores: Tris 1,0 M/HCl a pH 7,5 (Sigma, T-2663), glicerol al 87 % (Merck, número de catálogo: 04091.2500); MgCl2 1,0 M (Sigma, M-1028); NaCl 5,0 M (Sigma, S-5150).

Se prepararon los siguientes tampones de DP 1x:

•

Tampón DP 1x (para equilibrio de perlas)

•

Tampón de DP 1x/NP40 al 0,4 % (para equilibrio de perlas y primera etapa de lavado de perlas)

•

Tampón de DP 1x/NP40 al 0,2 % (para la segunda etapa de lavado de perlas y para elución de compuesto)

•

Tampón de DP 1x/inhibidores de proteasa (para primera etapa de dilución de lisado); añadir un comprimido inhibidor de proteasa por tampón de lisis de 25 ml (comprimido libre de EDTA, cóctel inhibidor de proteasa, Roche

Diagnostics, 1 873 580)

• Tampón de DP 1x/NP40 al 0,4 %/inhibidores de proteasa (para la segunda etapa de dilución de lisado) Ejemplo para preparación de tampón de DP 1x/NP40 al 0,4 % (100 ml):

Combinar las siguientes soluciones y reactivos y añadir agua destilada hasta un volumen final de 100 ml: 20 ml de tampón DP 5x, 5 ml de NaF 0,5 M, 2 ml de NP40 al 20 %, 100 μl de DTT 1 M y añadir agua destilada hasta 100 ml. Todos los tampones contienen concentración final de DTT 1 mM.

2.1.2 Lavado y equilibrio de perlas

Las Kinobeads (Ejemplo 1) se prepararon para la reacción de unión lavando con un tampón adecuado y por equilibrio en el tampón.

Se llevaron a cabo las siguientes etapas:

1.

Usar tubos Falcon de 15 ml para todas las etapas de lavado.

2.

Usar 100 μl de KinoBeads por experimento (volumen de perlas sedimentadas): cantidades iguales de mezcla (25 ml) de cada tipo de perla acoplado con los siguientes 4 ligandos (densidad de acoplamiento de 1 μmol/ml): Bis VIII (CZC00001056), Purvalanol B (CZC00007097), derivado de PD173955 (CZC00007324) y CZC00008004.

3.

Lavar perlas dos veces con 3 ml de DP 1x y una vez con 3 ml de tampón DP 1x/NP40 al 0,4 %. Durante cada etapa de lavado invertir tubos 3-5 veces, centrifugar 2 minutos a 1200 rpm a 4 ºC en una centrífuga Heraeus. Los sobrenadantes son sobrenadantes aspirados y descartados.

Después de la última etapa de lavado preparar una suspensión 1:1 (volumen/volumen) con tampón de DP 1x/NP40 al 0,4 %.

2.1.3 Preparación de lisado celular diluido

El lisado celular según se describe en la sección (1.2) se preparó para la reacción de unión por dilución en un tampón adecuado y limpiando por medio de una etapa de centrifugación. Se llevaron a cabo las siguientes etapas:

1.

Usar un volumen de lisado celular correspondiente a 50 mg de proteína por experimento.

2.

Descongelar el lisado rápidamente en un baño de agua a 37 ºC, después limpiar la muestra en hielo.

3.

Diluir el lisado de la siguiente manera:

1) diluir lisado con tampón de DP 1x/inhibidores de proteasa reduciendo concentración de detergente desde NP-40 al 0,8 % hasta NP-40 al 0,4 %.

2) diluir lisado adicionalmente con tampón 1x DP/NP40 al 0,4 %/inhibidores de proteasa alcanzando una concentración de proteína final de 5 mg/ml.

4.

Transferir lisado diluido dentro de tubo UZ-policarbonato (Beckmann, 355654).

5.

Limpiar lisado diluido por ultracentrifugación (20 minutos, 4 ºC, 100.000 g, rotor T150.2, ultracentrífuga pre-enfriada).

6.

Guardar sobrenadante y mantenerlo en hielo.

2.1.4 Reacción de unión y lavado

Las perlas lavadas y equilibradas de la sección (2.1.2) se pusieron en contacto con el lisado celular diluido a partir de la etapa (2.1.3) con el fin de permitir unión de proteínas a los ligandos. Se retiraron proteínas no específicamente unidas por lavado suave con el fin de reducir la unión precedente.

1.

Combinar lisado aclarado diluido con 100 μl de KinoBeads lavadas en tubos Falcon de 15 ml o de 50 ml.

2.

Incubar durante 2 horas a 4 ºC, rotar en ROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) en cámara fría.

3.

Después de incubación centrifugar durante 3 minutos a 1.200 rpm en una centrífuga Heraeus o equivalente a 4 ºC.

4.

Retirar sobrenadante cuidadosamente sin perder las perlas.

5.

Transferir las perlas a columnas Mobicol con filtro de 90 μm (MoBiTec, Goettingen, n.º de catálogo: M1002-90).

6.

Lavar perlas con 10 ml de tampón de DP 1x/NP-40 al 0,4 % y los 5 ml del tampón de DP 1x/NP-40 al 0,2 %.

7.

Dejar que el tampón de lavado corra a través de la columna completamente antes de proceder con la etapa siguiente.

8.

Situar la columna en tubo Eppendorf y centrifugarlos durante 1 minuto a 800 rpm a 4 ºC. Cerrar columnas con tapa inferior.

2.1.5. Elución de proteínas

1.

Añadir 60 μl de tampón de muestra SDS NuPAGE 2x (Invitrogen, NP0007; diluir tampón 4x 1:1 con agua destilada antes de usar).

2.

Incubar muestras durante 30 minutos a 50 ºC.

3.

Abrir la tapa interior de columna y centrifugar columnas MobiTec 1 minuto a 2000 rpm separando eluato de perlas.

4.

Añadir 1/10 de volumen de yodoacetamida a 200 mg/ml, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, proteger de luz.Esta reacción conduce a la alquilación de cisteínas para análisis de espectrometría de masas.

5.

Antes de cargar muestras en el gel, centrifugar muestras durante 5 minutos a 15.000 rpm con el fin de retirar precipitados.

6.

Para separación de proteínas aplicar 60 μl a gel Bis-Tris al 4-12 % de NuPAGE (Invitrogen, NP0335).

2.1.6 Preparación de soluciones de reserva usadas en este protocolo Preparación de una solución de reserva de Na3VO4 100 mM:

1.

Disolver 9,2 g de Na3VO4 en 400 ml de agua destilada.

2.

Ajustar el pH a 10,0 usando bien NaOH 1 N o bien HCl 1 N. El pH de partida de la solución de ortovanadato de sodio puede variar con lote. A pH 10,0 la solución será amarilla.

3.

Hervir la solución hasta que se vuelve incolora (aproximadamente 10 minutos).

4.

Enfriar a temperatura ambiente.

5.

Reajustar el pH a 10,0 y repetir etapas 2 y 3 hasta que la solución permanezca incolora y el pH se estabilice a 10,0.

6.

Ajustar el volumen a 500 ml con agua destilada.

7.

Congelar alícuotas a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

Preparación de una solución de reserva de NaF 500 mM:

Disolver 21,0 g de NaF (Sigma, S7920) en 500 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ºC.

Preparación de una solución de NP40 al 20 %:

Pesar 40,0 g de NP40 (Sigma, Igepal-CA630, número de catálogo: 13021). Añadir agua destilada hasta 200 g. Mezclar completamente y almacenar solución a temperatura ambiente.

Preparación de una solución de DTT 1 M:

Disolver 7,7 g de DTT (Biomol, número de catálogo: 04010) en 50 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de filtro de 0,22 μm y congelar alícuotas de 400 μl a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

Preparación de solución de reserva de yodoacetamida (200 mg/ml):

Disolver 2,0 g de yodoacetamida (Sigma, S7920) en 10 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de filtro de 0,22 μm y congelar alícuotas de 400 μl a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

2.2 Inmunoprecipitación usando perlas de anticuerpos anti-fosfotirosina 2.2.1 Tampones y perlas de anticuerpos antifosfotirosina

Todos los tampones usados en el experimento de inmunoprecipitación con anticuerpos antifosfotirosina eran idénticos a aquellos usados para el experimento de Kinobeads (véase anteriormente) salvo porque no se añadió ningún DTT y se añadieron 50 μl de ácido okadaico 1 mM (Biomol, E1-181; inhibidor de fosfatasa) de tal manera que se alcanzó una concentración final de ácido okadaico de 500 nM. Se obtuvieron perlas de anticuerpos antifosfotirosina (perlas de

agarosa con anticuerpo anti-fosfotirosina 4G10 recombinante acoplado covalentemente) a partir de Biomol (numero de catálogo: 16-199).

2.2.2 Lavado y equilibrio de perlas anti-fosfotirosina

Las perlas antifosfotirosina se prepararon para la reacción de unión lavando con un tampón adecuado y por equilibrio en un tampón.

1.

Usar tubos Falcon de 15 ml para todas las etapas de lavado.

2.

Usar 100 μl de perlas de anti-fosfotirosina por experimento.

3.

Lavar perlas dos veces con 3 ml de tampón de DP 1x (-DTT) y una vez con 3 ml de tampón DP 1x/NP40 al 0,4 % (-DTT). Durante cada etapa de lavado invertir tubos 3-5 veces, centrifugar 2 minutos a 1200 rpm a 4 ºC en una centrífuga Heraeus. Los sobrenadantes se aspiran y se descartan.

Después de la última etapa de lavado preparar una suspensión 1:1 (volumen/volumen) con tampón de DP 1x/NP40 al 0,4 %.

2.2.3 Preparación de lisado celular diluido

El lisado celular se preparó para la reacción de unión por dilución en un tampón adecuado y limpiando por medio de una etapa de centrifugación.

1.

Uso de un volumen de lisado celular correspondiente a 50 mg de proteína por experimento.

2.

Descongelar el lisado rápidamente en un baño de agua a 37 ºC, después limpiar la muestra en hielo.

3.

Diluir el lisado en la siguiente manera:

Primera etapa de dilución: diluir lisado con tampón DP 1x/inhibidores de proteasas/ácido okadaico/sin DTT reduciendo concentración de detergente desde NP-40 al 0,8 % hasta NP-40 al 0,4 %.

Segunda etapa de dilución: diluir lisado adicionalmente con tampón DP 1x/NP40 al 0,4 %/inhibidores de proteasas/ácido okadaico/sin DTT alcanzando una concentración de proteína final de 5 mg/ml.

(Nota: La segunda etapa de dilución solamente se requiere si la concentración de proteínas del lisado después de la primera etapa de dilución es más alta de 5 mg/ml).

4.

Transferir lisado diluido en tubo UZ-policarbonato (Beckmann, 355654).

5.

Limpiar lisado diluido por ultracentrifugación (20 minutos, 4 ºC, 100.000 g, rotor T150.2, ultracentrífuga pre-enfriada).

6.

Guardar sobrenadante y mantenerlo en hielo.

2.2.4 Reacción de unión y etapas de lavado

Las perlas antifosfotirosina lavadas y equilibradas se pusieron en contacto con el lisado celular diluido de la sección

2.2.3 con el fin de permitir la unión de las proteínas a las perlas antifosfotirosina. Se retiraron proteínas no específicamente unidas por lavado suave con el fin de reducir la unión precedente.

1.

Combinar lisado aclarado diluido con 100 μl de perlas anti-fosfotirosina lavadas en un tubo Falcon de 15 ml o 50 ml.

2.

Incubar durante 4 horas a 4 ºC, rotar en ROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) en la cámara fría.

3.

Después de incubación, centrifugar durante 3 minutos a 1.200 rpm en una centrífuga Heraeus o equivalente a 4 ºC.

4.

Retirar sobrenadante cuidadosamente sin perder las perlas.

5.

Transferir las perlas a una columna Mobicol con filtro de 90 μm (MoBiTec, Goettingen, n.º de catálogo: M1002-90).

6.

Lavar perlas con 10 ml de tampón de DP 1x/NP-40 al 0,4 %/sin DTT y 5 ml del tampón de DP 1x/NP-40 al 0,2 %/sin DTT.

7.

Dejar que el tampón de lavado corra a través de la columna completamente antes de proceder con la etapa siguiente.

8.

Situar la columna en tubo Eppendorf y centrifugarlos durante 1 minuto a 800 rpm a 4 ºC. Cerrar columnas con tapa inferior.

2.2.5 Elución de proteínas unidas

1.

Añadir 60 μl de tampón de muestra SDS NuPAGE 2x (Invitrogen, NP0007; diluir tampón 4x 1:1 con agua destilada antes de usar).

2.

Incubar muestras durante 30 minutos a 50 ºC.

3.

Abrir tapa inferior de columna y centrifugar columnas MobiTec 1 minuto a 2000 rpm separando el eluato de las perlas.

4.

Añadir 1/10 de volumen de yodoacetamida a 200 mg/ml, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, proteger de luz. Esta reacción conduce a la alquilación de cisteínas para análisis de espectrometría de masas.

5.

Antes de cargar muestras en el gel, centrifugar muestras durante 5 minutos a 15.000 rpm con el fin de retirar precipitados.

6.

Para separación de proteínas aplicar 60 μl a gel Bis-Tris al 4-12 % de NuPAGE (Invitrogen, NP0335).

3. Análisis espectrométrico de masas de enzimas eluidas (por ejemplo cinasas)

Descripción de péptidos proteotípicos

La digestión tríptica de una mezcla de proteína separada de SDS-PAGE genera para cada proteína numerosos fragmentos peptídicos distintos con diferentes propiedades fisicoquímicas. Estos péptidos difieren en compatibilidad con la plataforma analítica basada en espectrometría de masas usada para identificación de proteínas (ID), aquí espectrometría de masas en tándem de ionización de electropulverización de cromatografía líquida en fase reversa (RP-CL-EM/EM). Como un resultado, las frecuencias peptídicas para péptidos de la misma proteína fuente difieren en un gran grado, llamándose los péptidos más frecuentemente observados que contribuyen "típicamente" a la identificación de esta proteína péptidos "proteotípicos". Así, un "péptido proteotípico" es un péptido bien observable experimentalmente que identifica únicamente una proteína específica o una isoforma de proteína.

Ventajas de péptidos proteotípicos

El uso de péptidos proteotípicos para identificación de proteínas permite la identificación rápida y centrada y la cuantificación de múltiples proteínas objetivo conocidas centrando el procedimiento de identificación de proteínas en un rastreo para la presencia de péptidos de firma ricos en información.

Identificación experimental de péptidos proteotípicos

Una estrategia generando una lista de péptidos proteotípicos es recoger datos de identificación de péptidos empíricamente y buscar el conjunto de datos para péptidos observados comúnmente que identifican únicamente una proteína.

Para cada entrada de proteína de base de datos IPI con al menos 10 identificaciones inequívocas en el conjunto de datos CZ (ID de multipéptidos o ID de péptidos individuales verificados manualmente), se calculan las frecuencias péptídicas para los péptidos que contribuyen. Solamente se consideran los mejores apareamientos péptido-a-espectro, específicos de acuerdo con el motor de búsqueda en bases de datos Mascot™ (Matrix Science).

Para definición de los péptidos proteotípicos para una proteína específica, los péptidos se ordenan descendiendo la frecuencia peptídica y se calcula una presencia peptídica acumulativa: Este valor da para cada péptido la proporción de identificaciones donde este péptido o cualquiera de los péptidos con una frecuencia peptídica más alta estaba presente. Los péptidos proteotípicos se definen usando un corte para presencia acumulativa del 95 %, es decir al menos el 95 % de los eventos de identificación para esta proteína se basaron en al menos un péptido proteotípico.

3.1 Digestión de proteínas y preparación de muestras anteriores a análisis espectrométricos de masas

Las proteínas se concentraron, se separaron en geles NuPAGE® Novex al 4-12 % (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se tiñeron con azul de Coomassie coloidal. Los carriles del gel se cortaron sistemáticamente a través del intervalo de separación completo en < 48 láminas (bandas y regiones interbanda) y se sometieron a digestión tríptica en gel esencialmente como se describe por Shevchenko y cols., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858. Brevemente, las almohadillas de gel se destiñeron durante toda una noche en NH4HCO3 5 mM en EtOH al 50 %, se digirieron durante 4 horas con tripsina a 12,5 ng/μl en NH4HCO3 5 mM. Los péptidos se extrajeron con ácido fórmico al 1 %, se transfirieron en una segunda placa de 96 pocillos y se secaron al vacío. Los péptidos secos se resuspendieron en 10 μl de ácido fórmico al 0,1 % y se inyectaron 5 μl en el sistema LC-EM/EM para identificación de proteínas.

3.2 Adquisición de datos de espectrometría de masas

Las muestras peptídicas se inyectaron en un sistema de nano-CL (CapLC, Waters o Ultimate, Dionex) que se acopló directamente bien a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar (QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro,

Micromass o QSTAR Pulsar, Sciex) o bien a un espectrómetro de masas de atrapamiento iónico (LCQ Deca XP, LTQ, Thermo-Finnigan). Los péptidos se separan en el sistema de CL usando un gradiente de disolventes acuosos y orgánicos con un tiempo de gradiente típico de entre 15 y 45 minutos. El disolvente A era acetonitrilo al 5 % en ácido fórmico al 0,1 % y el disolvente B era acetonitrilo al 70 % en ácido fórmico al 0,1 %.

5 3.3 Identificación de proteínas

La masa de los péptidos y los datos de fragmentación generados en los experimentos de CL-EM/EM se usaron consultando una versión curada de forma interna de la base de datos de secuencia de proteínas (EBI) del Índice Internacional de Proteínas (IPI). Las proteínas se identificaron correlacionando la masa de péptidos medida y los datos de fragmentación con los mismos datos computados a partir de las entradas en la base de datos usando la

10 herramienta de software Mascot (Matrix Science; Perkins y cols., 1999, Electrophoresis 20: 3551-3567). Los criterios de búsqueda variaron dependiendo de qué espectrómetro de masas se usó para el análisis.

4. Resultados

Los resultados del experimento de Signaloquinoma se muestran en la Figura 2. Esta figura muestra una comparación de fármacos expuestos consecutivamente usando Kinobeads (círculo central) e inmunoprecipitaciones 15 convencionales con perlas de anticuerpos antifosfotirosinas (círculo derecho). En el experimento de Kinobeads se identificaron un total de 626 proteínas, de estas 100 eran cinasas. En el experimento de inmunoprecipitación (IP) se identificaron un total de 503 proteínas, 12 de estas eran cinasas. Las cinasas identificadas con ambos experimentos (cinasas comunes) se enumeran en el área que se superpone. El resultado muestra que con las Kinobeads se identificaron significativamente más cinasas (100 cinasas) comparado con las perlas de anticuerpos anti-fosfotirosinas

20 (12 cinasas).

Las cinasas identificadas para ambas aproximaciones experimentales se enumeran en las tablas siguientes. Además, las secuencias de péptidos proteotípicos para las cinasas se enumeran en tablas separadas.

Tabla 6: Las cinasas se identificaron después de inmunoprecipitación (IP). Los nombres de cinasas están de acuerdo con la nomenclatura de cinasas humanas (http://kinase.com) y Manning y cols., 2002, Science 298, 1912-1934 según

25 se especifica en el material suplementario).

Identificación cinasas

de Nombre de cinasa Puntuación Número de péptidosidentificados Péptido proteotípicoexperimental disponible eidentificado

1

DNAPK 606 20 X

2

TIF1b 202 6 X

3

p38a 343 11 X

4

CDK2 196 4 X

5

TYK2 77 3 X

6

LYN 67 2 X

7

EGFR 2463 162 X

8

FAK 1203 51 X

9

ACK 160 6

10

KHS2 65 2

Tabla 7: Secuencias peptídicas para cinasas identificadas después de inmunoprecipitación (IP, véase Tabla 6). Los nombres de cinasas están de acuerdo con la nomenclatura de cinasas humanas (http://kinase.com) y con Manning y cols., 2002, Science 298, 1912-1934 según se especifica en el material suplementario).

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

IP

CDK2 ALFPGDSEIDQLFR

IP

CDK2 IGEGTYGVVYK

IP

CDK2 FMDASALTGIPLPLIK

IP

DNAPK HGDLPDIQIK

IP

DNAPK LACDVDQVTR

IP

DNAPK AALSALESFLK

IP

DNAPK DQNILLGTTYR

IP

DNAPK FMNAVFFLLPK

IP

DNAPK VTELALTASDR

IP

DNAPK LGASLAFNNIYR

IP

DNAPK LNESTFDTQITK

IP

DNAPK QLFSSLFSGILK

IP

DNAPK NILEESLCELVAK

IP

DNAPK TVSLLDENNVSSYLSK

IP

DNAPK TVGALQVLGTEAQSSLLK

IP

EGFR VLGSGAFGTVYK

IP

EGFR IPLENLQIIR

IP

EGFR GDSFTHTPPLDPQELDILK

IP

FAK LGDFGLSR

IP

FAK FLQEALTMR

IP

FAK FFEILSPVYR

IP

FAK LLNSDLGELINK

IP

FAK TLLATVDETIPLLPASTHR

IP

HER2/ErbB2 VLGSGAFGTVYK

IP

LYN EEPIYIITEYMAK

IP

p38a LTDDHVQFLIYQILR

IP

p38a NYIQSLTQMPK

IP

p38a LTGTPPAYLINR

IP

TIF1b IVAERPGTNSTGPAPMAPPR

IP

TYK2 HGIPLEEVAK

IP

TYK2 LSDPGVGLGALSR

Tabla 8: Cinasas identificadas después de la exposición consecutiva de fármacos con Kinobeads. Los nombres de cinasas están de acuerdo con la nomenclatura de cinasas humanas (http://kinase.com) y con Manning y cols., 2002, Science 298, 1912-1934 según se especifica en el material suplementario).

Identificación de cinasa

Nombre de cinasa Puntuación Número de péptidos identificados Péptidoproteotípicoexperimentaldisponible e identificado Identificado también en IP (véase tabla 1)

1

DNAPK 6592 263 X IP

2

FRAP 356 9 X

3

ATM 113 3 X

4

ATR 91 2 X

5

CDC2 309 11 X

6

YES 1747 100 X

7

CaMK2d 1003 41 X

8

JNK1 1011 45 X

9

JNK2 317 11 X

10

CaMK2g 811 21 X

11

p38a 1145 90 X IP

12

TNK1 81 4 X

13

GSK3B 1408 81 X

14

FYN 1845 115 X

15

SRC 1780 91 X

16

Erk2 1677 200 X

17

CaMK2b 122 3 X

18

JNK3 590 26 X

19

CoaI 316 11 X

20

GSK3A 1390 117 X

21

AurA 198 8 X

22

RIPK2 634 19 X

23

CDK2 1172 50 X IP

24

ADCK1 88 4

25

CK1a 566 21 X

26

GAK 1995 61 X

27

AAK1 123 3 X

28

CDK9 379 13 X

29

CK1d 206 7 X

(continuación)

Identificación de cinasa

Nombre de cinasa Puntuación Número de péptidos identificados Péptidoproteotípicoexperimentaldisponible eidentificado Identificado también en IP (véase tabla 1)

30

Erk1 566 26 X

31

NEK9 1947 102 X

32

TYK2 222 6 X IP

33

AMPKa1 93 3 X

34

LYN 1783 67 X IP

35

AurB 287 10 X

36

CK1e 314 10 X

37

EGFR 165 3 X IP

38

EphB2 1165 43 X

39

ALK2 299 11 X

40

DDR1 759 28 X

41

TBK1 2042 72 X

42

CSK 1584 102 X

43

TEC 50 2

44

ZAK 499 16 X

45

ALK4 472 9 X

46

ADCK3 309 8 X

47

MAP2K5 795 32

48

EphB4 2237 165 X

49

ARG 2128 69 X

50

FER 2762 130 X

51

RSK2 2100 99 X

52

CK2a2 930 32 X

53

BMPR1A 676 19 X

54

TGFBR1 478 15 X

55

EphA5 114 4 X

56

BRK 107 3

57

FAK 1933 95 X IP

58

ILK 209 6 X

59

CDK5 699 27 X

60

DDR2 1073 44 X

(continuación)

Identificación de cinasa

Nombre de cinasa Puntuación Número de péptidos identificados Péptidoproteotípico experimentaldisponible eidentificado Identificado también en IP (véase tabla 1)

61

JAK1 1083 31

62

MYT1 152 5

63

PKCd 53 4

64

RSK3 2227 117 X

65

Weel 550 18 X

66

ACTR2 193 5

67

MAP3K2 383 15

68

ACTR2B 82 2

69

WeelB 550 18 X

70

ABL 1133 35 X

71

MET 503 12 X

72

BRAF 361 7

73

INSR 1807 64 X

74

KHS1 393 12

75

PAK4 448 15 X

76

PKD1 58 2

77

PKD2 58 2 X

78

IGF1R 935 28 X

79

PHKg2 519 16 X

80

CaMKK2 199 5 X

81

MAP2K2 294 6 X

82

TGFbR2 49 2

83

Fusionada 42 2

84

EphA2 2099 90 X

85

ACK 169 4 IP

86

NLK 46 2

87

CDK7 623 20 X

88

CHK2 58 2 X

89

KHS2 60 4 IP

90

MLK3 59 1 X

91

PKCe 53 4 X

(continuación)

Identificación de cinasa

Nombre de cinasa Puntuación Número de péptidos identificados Péptidoproteotípicoexperimentaldisponible eidentificado Identificado también en IP (véase tabla 1)

92

PKCh 53 4 X

93

PYK2 106 3 X

94

TA02 120 3

95

CK1g1 45 2 X

96

LIMK1 271 6

97

MAP2K1 480 14

98

HRI 52 1

99

SIK 36 1

100

Erk7 67 1

101

NEK2 145 4

102

NEK7 175 5

103

BMPR1B 179 5 X

104

MAP2K3 133 5

105

FGFR2 514 17

Tabla 9: Secuencias de péptidos proteotípicos para cinasas identificadas después de exposicionesconsecutivas de fármacos con Kinobeads (véase Tabla 8)

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

KinobeadDP

AAK1 ADIWALGCLLYK

KinobeadDP

ABL GQGESDPLDHEPAVSPLLPR

KinobeadDP

ABL WTAPESLAYNK

KinobeadDP

ABL VADFGLSR

KinobeadDP

ABL NGQGWVPSNYITPVNSLEK

KinobeadDP

ADCK3 DKLEYFEERPFAAASIGQVHLAR

KinobeadDP

ADCK3 SFTDLYIQIIR

KinobeadDP

ADCK3 VALLDFGATR

KinobeadDP

ADCK3 AVLGSSPFLSEANAER

KinobeadDP

ALK2 WFSDPTLTSLAK

KinobeadDP

ALK4 TIVLQEIIGK

KinobeadDP

ALK4 EAEIYQTVMLR

KinobeadDP

AMPKa1 IGHYILGDTLGVGTFGK

KinobeadDP

ARG AASSSSVVPYLPR

KinobeadDP

ARG ESESSPGQLSISLR

KinobeadDP

ARG GAQASSGSPALPR

KinobeadDP

ARG VLGYNQNGEWSEVR

KinobeadDP

ARG VPVLISPTLK

KinobeadDP

ARG WTAPESLAYNTFSIK

KinobeadDP

ARG VADFGLSR

KinobeadDP

ARG NGQGWVPSNYITPVNSLEK

KinobeadDP

ATM LVVNLLQLSK

KinobeadDP

ATR APLNETGEVVNEK

KinobeadDP

AurA SKQPLPSAPENNPEEELASK

KinobeadDP

AurA VEFTFPDFVTEGAR

KinobeadDP

AurB IYLILEYAPR

KinobeadDP

AurB SNVQPTAAPGQK

KinobeadDP

BMPR1A FNSDTNEVDVPLNTR

KinobeadDP

BMPR1A WNSDECLR

KinobeadDP

BMPR1A YEGSDFQCK

KinobeadDP

BMPR1A YMAPEVLDESLNK

KinobeadDP

BMPR1A ETEIYQTVLMR

KinobeadDP

BMPR1A HENILGFIAADIK

(continuación)

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

KinobeadDP

BMPR1A VFFTTEEASWFR

KinobeadDP

BMPR1A YGEVWMGK

KinobeadDP

BMPR1B ETEIYQTVLMR

KinobeadDP

BMPR1B HENILGFIAADIK

KinobeadDP

BMPR1B VFFTTEEASWFR

KinobeadDP

BMPR1B YGEVWMGK

KinobeadDP

CaMK2b LTQYIDGQGRPR

KinobeadDP

CaMK2b NLINQMLTINPAK

KinobeadDP

CaMK2b AGAYDFPSPEWDTVTPEAK

KinobeadDP

CaMK2b DLKPENLLLASK

KinobeadDP

CaMK2d FYFENALSK

KinobeadDP

CaMK2d AGAYDFPSPEWDTVTPEAK

KinobeadDP

CaMK2d DLKPENLLLASK

KinobeadDP

CaMK2g FYFENLLSK

KinobeadDP

CaMK2g LTQYIDGQGRPR

KinobeadDP

CaMK2g NLINQMLTINPAK

KinobeadDP

CaMK2g AGAYDFPSPEWDTVTPEAK

KinobeadDP

CaMK2g DLKPENLLLASK

KinobeadDP

CaMKK2 GPIEQVYQEIAILK

KinobeadDP

CaMKK2 LAYNENDNTYYAMK

KinobeadDP

CDC2 DLKPQNLLIDDKGTIK

KinobeadDP

CDC2 NLDENGLDLLSK

KinobeadDP

CDC2 SPEVLLGSAR

KinobeadDP

CDC2 IGEGTYGVVYK

KinobeadDP

CDK2 APEILLGCK

KinobeadDP

CDK2 FMDASALTGIPLPLIK

KinobeadDP

CDK2 ALFPGDSEIDQLFR

KinobeadDP

CDK2 IGEGTYGVVYK

KinobeadDP

CDK5 IGEGTYGTVFK

KinobeadDP

CDK5 SFLFQLLK

KinobeadDP

CDK7 APELLFGAR

KinobeadDP

CDK7 VPFLPGDSDLDQLTR

KinobeadDP

CDK9 GSQITQQSTNQSR

(continuación)

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

KinobeadDP

CDK9 IGQGTFGEVFK

KinobeadDP

CK1e HPQLLYESK

KinobeadDP

CK1a LFLIDFGLAK

KinobeadDP

CK1d FDDKPDYSYLR

KinobeadDP

CK1d GNLVYIIDFGLAK

KinobeadDP

CK1d TVLLLADQMISR

KinobeadDP

CK1e FDDKPDYSYLR

KinobeadDP

CK1e GNLVYIIDFGLAK

KinobeadDP

CK1e TVLLLADQMISR

KinobeadDP

CK1g1 TLFTDLFEK

KinobeadDP

CK2a1 GGPNIITLADIVKDPVSR

KinobeadDP

CK2a1 QLYQTLTDYDIR

KinobeadDP

CK2a1 TPALVFEHVNNTDFK

KinobeadDP

CK2a2 HLVSPEALDLLDKLLR

KinobeadDP

CK2a2 LIDWGLAEFYHPAQEYNVR

KinobeadDP

CK2a2 QLYQILTDFDIR

KinobeadDP

CK2a2 TPALVFEYINNTDFK

KinobeadDP

CK2a2 VLGTEELYGYLK

KinobeadDP

CSK HSNLVQLLGVIVEEK

KinobeadDP

CSK LLYPPETGLFLVR

KinobeadDP

CSK VMEGTVAAQDEFYR

KinobeadDP

DDR1 AQPFGQLTDEQVIENAGEFFR

KinobeadDP

DDR1 NCLVGENFTIK

KinobeadDP

DDR1 NLYAGDYYR

KinobeadDP

DDR1 QVYLSRPPACPQGLYELMLR

KinobeadDP

DDR1 WMAWECILMGK

KinobeadDP

DDR1 YLATLNFVHR

KinobeadDP

DDR2 DVAVEEFPR

KinobeadDP

DDR2 FMATQIASGMK

KinobeadDP

DDR2 HEPPNSSSSDVR

KinobeadDP

DDR2 IFPLRPDYQEPSR

KinobeadDP

DDR2 NLYSGDYYR

KinobeadDP

DDR2 QTYLPQPAICPDSVYK

(continuación)

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

KinobeadDP

DDR2 WMSWESILLGK

KinobeadDP

DDR2 YLSSLNFVHR

KinobeadDP

DNAPK AALSALESFLK

KinobeadDP

DNAPK DQNILLGTTYR

KinobeadDP

DNAPK FMNAVFFLLPK

KinobeadDP

DNAPK FVPLLPGNR

KinobeadDP

DNAPK GLSSLLCNFTK

KinobeadDP

DNAPK HGDLPDIQIK

KinobeadDP

DNAPK INQVFHGSCITEGNELTK

KinobeadDP

DNAPK IPALDLLIK

KinobeadDP

DNAPK LACDVDQVTR

KinobeadDP

DNAPK LAGANPAVITCDELLLGHEK

KinobeadDP

DNAPK LGASLAFNNIYR

KinobeadDP

DNAPK LGNPIVPLNIR

KinobeadDP

DNAPK LLEEALLR

KinobeadDP

DNAPK LNESTFDTQITK

KinobeadDP

DNAPK LPLISGFYK

KinobeadDP

DNAPK LPSNTLDR

KinobeadDP

DNAPK LQETLSAADR

KinobeadDP

DNAPK MSTSPEAFLALR

KinobeadDP

DNAPK NILEESLCELVAK

KinobeadDP

DNAPK NLLIFENLIDLK

KinobeadDP

DNAPK NLSSNEAISLEEIR

KinobeadDP

DNAPK QITQSALLAEAR

KinobeadDP

DNAPK QLFSSLFSGILK

KinobeadDP

DNAPK SLGPPQGEEDSVPR

KinobeadDP

DNAPK SQGCSEQVLTVLK

KinobeadDP

DNAPK TVGALQVLGTEAQSSLLK

KinobeadDP

DNAPK TVSLLDENNVSSYLSK

KinobeadDP

DNAPK VCLDIIYK

KinobeadDP

DNAPK VTELALTASDR

KinobeadDP

DNAPK VVQMLGSLGGQINK

KinobeadDP

EGFR GDSFTHTPPLDPQELDILK

(continuación)

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

KinobeadDP

EphA2 DGEFSVLQLVGMLR

KinobeadDP

EphA2 FADIVSILDK

KinobeadDP

EphA2 LPSTSGSEGVPFR

KinobeadDP

EphA2 NILVNSNLVCK

KinobeadDP

EphA2 VSDFGLSR

KinobeadDP

EphA5 WTAPEAIAFR

KinobeadDP

EphA5 VSDFGLSR

KinobeadDP

EphB2 AGAIYVFQVR

KinobeadDP

EphB2 FGQIVNTLDK

KinobeadDP

EphB2 TFPNWMENPWVK

KinobeadDP

EphB2 VDTIAADESFSQVDLGGR

KinobeadDP

EphB2 NILVNSNLVCK

KinobeadDP

EphB2 VSDFGLSR

KinobeadDP

EphB4 APSGAVLDYEVK

KinobeadDP

EphB4 FPQVVSALDK

KinobeadDP

EphB4 LNDGQFTVIQLVGMLR

KinobeadDP

EphB4 WTAPEAIAFR

KinobeadDP

EphB4 NILVNSNLVCK

KinobeadDP

EphB4 VSDFGLSR

KinobeadDP

Erk1 NYLQSLPSK

KinobeadDP

Erk1 APEIMLNSK

KinobeadDP

Erk1 YIHSANVLHR

KinobeadDP

Erk1 ICDFGLAR

KinobeadDP

Erk2 FRHENIIGINDIIR

KinobeadDP

Erk2 GQVFDVGPR

KinobeadDP

Erk2 LKELIFEETAR

KinobeadDP

Erk2 NYLLSLPHK

KinobeadDP

Erk2 VADPDHDHTGFLTEYVATR

KinobeadDP

Erk2 APEIMLNSK

KinobeadDP

Erk2 YIHSANVLHR

KinobeadDP

Erk2 ICDFGLAR

KinobeadDP

FAK FFEILSPVYR

KinobeadDP

FAK FLQEALTMR

(continuación)

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

KinobeadDP

FAK LLNSDLGELINK

KinobeadDP

FAK TLLATVDETIPLLPASTHR

KinobeadDP

FAK LGDFGLSR

KinobeadDP

FER LQDWELR

KinobeadDP

FER QEDGGVYSSSGLK

KinobeadDP

FER SGVVLLNPIPK

KinobeadDP

FER WTAPEALNYGR

KinobeadDP

FRAP GPTPAILESLISINNK

KinobeadDP

FRAP VLGLLGALDPYK

KinobeadDP

FYN EVLEQVER

KinobeadDP

FYN WTAPEAALYGR

KinobeadDP

FYN LIEDNEYTAR

KinobeadDP

FYN GSLLDFLK

KinobeadDP

FYN IADFGLAR

KinobeadDP

GAK ALVEEEITR

KinobeadDP

GAK AMLQVNPEER

KinobeadDP

GAK AVVMTPVPLFSK

KinobeadDP

GAK IAVMSFPAEGVESALK

KinobeadDP

GAK TPEIIDLYSNFPIGEK

KinobeadDP

GSK3A VIGNGSFGVVYQAR

KinobeadDP

GSK3A VTTVVATLGQGPER

KinobeadDP

GSK3A YFFYSSGEK

KinobeadDP

GSK3B LLEYTPTAR

KinobeadDP

GSK3B LYMYQLFR

KinobeadDP

GSK3B VIGNGSFGVVYQAK

KinobeadDP

GSK3B YFFYSSGEK

KinobeadDP

IGF1R AENGPGPGVLVLR

KinobeadDP

IGF1R HSHALVSLSFLK

KinobeadDP

IGF1R MYFAFNPK

KinobeadDP

IGF1R TTINNEYNYR

KinobeadDP

IF1R VAGLESLGDLFPNLTVIR

KinobeadDP

IGF1R DIYETDYYR

KinobeadDP

IGF1R IEFLNEASVMK

(continuación)

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

KinobeadDP

IGFIR IGDFGMTR

KinobeadDP

ILK MYAPAWVAPEALQK

KinobeadDP

INSR DLLGFMLFYK

KinobeadDP

INSR ELGQGSFGMVYEGNAR

KinobeadDP

INSR ESLVISGLR

KinobeadDP

INSR TIDSVTSAQELR

KinobeadDP

INSR TVNESASLR

KinobeadDP

INSR WEPYWPPDFR

KinobeadDP

INSR DIYETDYYR

KinobeadDP

INSR IEFLNEASVMK

KinobeadDP

INSR WMAPESLK

KinobeadDP

INSR IGDFGMTR

KinobeadDP

JNK1 NIIGLLNVFTPQK

KinobeadDP

JNK1 APEVILGMGYK

KinobeadDP

J-NK1 ILDFGLAR

KinobeadDP

JNK2 NIISLLNVFTPQK

KinobeadDP

JNK2 APEVILGMGYK

KinobeadDP

JNK2 ILDFGLAR

KinobeadDP

JNK3 NIISLLNVFTPQK

KinobeadDP

JNK3 APEVILGMGYK

KinobeadDP

JNK3 ILDFGLAR

KinobeadDP

LYN EEPIYIITEYMAK

KinobeadDP

LYN GSLLDFLK

KinobeadDP

LYN IADFGLAR

KinobeadDP

MAP2K2 ISELGAGNGGVVTK

KinobeadDP

MAP2K2 YPIPPPDAK

KinobeadDP

MET AFFMLDGILSK

KinobeadDP

MET DLIGFGLQVAK

KinobeadDP

MLK3 ITVQASPGLDR

KinobeadDP

NEK9 AGGGAAEQEELHYIPIR

KinobeadDP

NEK9 LGINLLGGPLGGK

KinobeadDP

NEK9 LQQENLQIFTQLQK

KinobeadDP

NEK9 SSTVTEAPIAVVTSR

(continuación)

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

KinobeadDP

NEK9 TSEVYVWGGGK

KinobeadDP

p38a LTGTPPAYLINR

KinobeadDP

p38a NYIQSLTQMPK

KinobeadDP

p38a SLEEFNDVYLVTHLMGADLNNIVK

KinobeadDP

p38a LTDDHVQFLIYQILR

KinobeadDP

p38a ILDFGLAR

KinobeadDP

PAK4 AALQLVVDPGDPR

KinobeadDP

PHKg2 LTAEQALQHPFFER

KinobeadDP

PHKg2 SLLEAVSFLHANNIVHR

KinobeadDP

PHKg2 VAVWTVLAAGR

KinobeadDP

PHKg2 LSPEQLEEVR

KinobeadDP

PYK2 EIITSILLSGR

KinobeadDP

PYK2 EVGLDLFFPK

KinobeadDP

PYK2 VLANLAHPPAE

KinobeadDP

PYK2 LGDFGLSR

KinobeadDP

RIPK2 CLIELEPVLR

KinobeadDP

RIPK2 SLPAPQDNDFLSR

KinobeadDP

RIPK2 SPSLNLLQNK

KinobeadDP

RIPK2 TQNILLDNEFHVK

KinobeadDP

RSK2 EASAVLFTITK

KinobeadDP

RSK2 LGMPQFLSPEAQSLLR

KinobeadDP

RSK2 NQSPVLEPVGR

KinobeadDP

RSK2 LYLILDFLR

KinobeadDP

RSK3 APQAPLHSVVQQLHGK

KinobeadDP

RSK3 EASFVLHTIGK

KinobeadDP

RSK3 LGMPQFLSTEAQSLLR

KinobeadDP

RSK3 LYLILDFLR

KinobeadDP

SRC AANILVGENLVCK

KinobeadDP

SRC WTAPEAALYGR

KinobeadDP

SRC LIEDNEYTAR

KinobeadDP

SRC GSLLDFLK

KinobeadDP

TBK1 EPLNTIGLIYEK

KinobeadDP

TBK1 FGSLTMDGGLR

(continuación)

EXPERIMENTO

NOMBRE DE CINASA PÉPTIDO PROTEOTÍPICO IDENTIFICADO

KinobeadDP

TBK1 IISSNQELIYEGR

KinobeadDP

TBK1 LFAIEEETTTR

KinobeadDP

TBK1 TTEENPIFVVSR

KinobeadDP

TBK1 VIGEDGQSVYK

KinobeadDP

TGFbR1 HDSATDTIDIAPNHR

KinobeadDP

TGFbR1 TIVLQESIGK

KinobeadDP

TGFbR1 TLSQLSQQEGIK

KinobeadDP

TGFbR1 VPNEEDPSLDRPFISEGTTLK

KinobeadDP

TGFBR1 EAEIYQTVMLR

KinobeadDP

TNK1 MLPEAGSLWLLK

KinobeadDP

TYK2 LGLAEGTSPFIK

KinobeadDP

Weel B IPQVLSQEFTELLK

KinobeadDP

Weel B ISSPQVEEGDSR

KinobeadDP

YES LLLNPGNQR

KinobeadDP

YES LPQLVDMAAQIADGMAYIER

KinobeadDP

YES SDVWSFGILQTELVTK

KinobeadDP

YES AANILVGENLVCK

KinobeadDP

YES EVLEQVER

KinobeadDP

YES FQIINNTEGDWWEAR

KinobeadDP

YES WTAPEAALYGR

KinobeadDP

YES LIEDNEYTAR

KinobeadDP

YES GSLLDFLK

KinobeadDP

YES IADFGLAR

KinobeadDP

ZAK CEIEATLER

KinobeadDP

ZAK GLEGLQVAWLVVEK

KinobeadDP

ZAK LTIPSSCPR

KinobeadDP

ZAK NVVIAADGVLK

Ejemplo 3: Ensayo de rastreo usando compuestos de prueba para elución de proteínas

Este ejemplo ilustra la elución competitiva de proteínas unidas a Kinobeads con compuestos de ensayo no modificados (véase en particular el cuarto aspecto de la invención). Las Kinobeads (según se describen en el Ejemplo 1) se pusieron en contacto con lisado de cerebros de ratón, las proteínas unidas se eluyeron con diversos compuestos de prueba y las proteínas liberadas se analizaron por espectrometría de masas.

1. Preparación de la muestra biológica (lisado tisular) 1.1 Preparación de lisados

Se preparó un lisado cerebral de ratones por disrupción mecánica en tampón de lisis (5 ml de tampón por cerebro de ratón) en condiciones suaves que mantienen la estructura y función de las proteínas. Se llevaron a cabo las siguientes etapas:

•

Descongelar el tejido rápidamente a temperatura ambiente o a 37 ºC, después transferir tejido a una botella de vidrio que contiene el tampón de lisis 1x (uso de un vial lo suficientemente grande para usarse con homogeneizador Polytron PT 3100)

•

Lisar el órgano/tejido con 4 pulsos de 10 segundos a 5000-7000 rpm a 4 ºC en la cámara fría

•

Transferir el homogenado en tubos Falcon de 50 ml pre-enfriados

•

Incubar homogenado en hielo durante 30 minutos

•

Centrifugar células durante 10 minutos a 6000 g a 4 ºC (6.000 rpm en Sorvall SLA600, preenfriado)

•

Transferir sobrenadante a un tubo de UZ-policarbonato (Beckmann, 355654)

•

Centrifugar sobrenadante durante 1 hora a 145.000 g a 4 ºC (40.000 rpm en Ti50.2, pre-enfriado)

•

Guardar sobrenadante (retirar y descartar la mayoría de la fase lipídica si es posible), transferir sobrenadante dentro de una botella de vidrio y almacenar en hielo

•

Determinar concentración de proteínas por ensayo de Bradford (BioRad). Concentraciones de proteínas típicas están en el intervalo de 5-10 mg/ml.

•

Preparar alícuotas en tubos Falcon de 1 a 50 ml

•

Congelar alícuotas en nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 ºC

1.2 Preparación de tampón de lisis y soluciones madre Preparación de 100 ml de tampón de lisis 1x con NP40 al 0,8 %

Combinar las siguientes soluciones de reactivos y añadir agua destilada hasta un volumen final de 100 ml: 20 ml de tampón de lisis 5x (véase más adelante), 100 μl de DTT 1 M, 5 ml de NaF 0,5 M, 4 ml de NP40 al 20 %, 4 comprimidos libres de EGTA completos (cóctel inhibidor de proteasas, Roche Diagnostics, 1 873 580), añadir agua destilada hasta 100 ml.

Tabla 10: Preparación de tampón de lisis 5x

Sustancia:

Solución madre Concentración final en tampón de lisis 1x Añadir para tampón delisis 115x

Tris/HCl pH 7,5

1 M 50 mM 250 ml

Glicerol

87 % 5 % 288 ml

MgCl2

1 M 1,5 mM 7,5 ml

NaCl

5 M 150 mM 150 ml

Na3VO4

100 mM 1 mM 50 ml

Estas soluciones se obtuvieron a partir de los siguientes suministradores:

Tris 1 M/HCl pH 7,5: Sigma, T-2663; glicerol al 87 %: Merck, n.º de cat.: 04091.2500; MgCl2 1 M: Sigma, M-1028; NaCl 5 M: Sigma, S-5150. El tampón de lisis concentrado 5x se filtró a través de un filtro de 0,22 μm y se almacenó en alícuotas de 40 ml a -80 ºC.

Preparación de soluciones madre

Preparación de una solución de reserva de Na3VO4 100 mM: Disolver 9,2 g de Na3VO4 en 400 ml de agua destilada.

1) Ajustar el pH a 10,0 usando bien NaOH 1 N o HCl 1 N. El pH de partida de la solución de ortovanadato de sodio puede variar con lote. A pH 10,0 la solución será amarilla. 2) Hervir la solución hasta que se vuelve incolora (aproximadamente 10 minutos). 3) Enfriar a temperatura ambiente. 4) Reajustar el pH a 10,0 y repetir etapas 2 y 3 hasta que la solución permanezca incolora y el pH se estabilice a 10,0. 5) Ajustar el volumen a 500 ml con agua destilada. 6) Congelar alícuotas a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

Preparación de solución de reserva de NaF 500 mM: Disolver 21,0 g de NaF (Sigma, S7920) en 500 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ºC.

Preparación de solución de NP40 al 20 %:

Pesar 40,0 g de NP40 (Sigma, Igepal-CA630, número de catálogo: 13021). Añadir agua destilada hasta 200 g. Mezclar completamente y almacenar solución a temperatura ambiente. Preparación de solución de DTT 1 M: Disolver 7,7 g de DTT (Biomol, número de catálogo: 04010) en 50 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de

filtro de 0,22 mm y congelar alícuotas de 400 μl a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

2. Puesta en contacto de las Kinobeads con el lisado celular y elución de proteínas unidas por compuestos de prueba

Las Kinobeads se pusieron en contacto con el lisado cerebral de ratones en condiciones que permiten la unión de las proteínas en el lisado a los ligandos. Las condiciones de unión estaban cerca de las fisiológicas eligiendo condiciones tampón adecuadas que conservan la función de las proteínas. Después de retirar las proteínas no capturadas por un procedimiento de lavado suave las proteínas unidas se pusieron en contacto con un compuesto de prueba para elución de proteínas.

2.1 Preparación de tampones de DP Tabla 11: Preparación de tampón 5x-DP

Sustancia:

Solución madre Concentración final en tampón de lisis 1x Añadir para tampón delisis 115x

Tris/HCl pH 7,5

1 M 50 mM 250 ml

Glicerol

87 % 5 % 288 ml

MgCl2

1 M 1,5 mM 7,5 ml

NaCl

5 M 150 mM 150 ml

Na3VO4

100 mM 1 mM 50 ml

El tampón DP 5x se filtra a través de filtro de 0,22 μm y se almacena en alícuotas de 40 ml a -80 ºC (nota: el mismo tampón se usa también para la preparación de lisados celulares totales). Estas soluciones se obtuvieron a partir de los siguientes suministradores: Tris 1,0 M/HCl pH 7,5 (Sigma, T-2663), glicerol al 87 % (Merck, número de catálogo: 04091.2500); MgCl2 1,0 M (Sigma, M-1028); Nad 5,0 M (Sigma, S-5150).

Se prepararon los siguientes tampones de DP 1x

•

Tampón DP 1x (para equilibrio de perlas)

•

Tampón de DP 1x/NP40 al 0,4 % (para equilibrio de perlas y primera etapa de lavado de perlas)

•

Tampón de DP 1x/NP40 al 0,2 % (para la segunda etapa de lavado de perlas y para elución de compuesto)

•

Tampón de DP 1x/inhibidores de proteasa (para primera etapa de dilución de lisado); añadir un comprimido inhibidor de proteasa por tampón de lisis de 25 ml (comprimido libre de EDTA, cóctel inhibidor de proteasa, Roche

Diagnostics, 1 873 580)

• Tampón de DP 1x/NP40 al 0,4 %/inhibidores de proteasa (para la segunda etapa de dilución de lisado) Ejemplo de preparación de tampón de DP 1x/NP40 al 0,4 % (100 ml)

Combinar las siguientes soluciones y reactivos y añadir agua destilada hasta un volumen final de 100 ml: 20 ml de tampón DP 5x, 5 ml de NaF 0,5 M, 2 ml de NP40 al 20 %, 100 μl de DTT al 1 M y añadir agua destilada hasta 100 ml. Todos los tampones contienen concentración final de DTT 1 mM.

2.2 Lavado y equilibrio de perlas

Las Kinobeads (Ejemplo 1) se prepararon para la reacción de unión lavando con un tampón adecuado y por equilibrio en un tampón.

1.

Usar tubos Falcon de 15 ml para todas las etapas de lavado.

2.

Usar 100 μl de KinoBeads por experimento (volumen de perlas sedimentadas): cantidades iguales de mezcla (25 ml) de cada tipo de perla acoplado con los siguientes 4 ligandos (densidad de acoplamiento de 1μmol/ml):

Bis VIII (CZC00001056), Purvalanol B (CZC00007097), derivado de PD173955 (CZC00007324) y CZC00008004.

3.

Lavar perlas dos veces con 3 ml de DP 1x y una vez con 3 ml de tampón DP 1x/NP40 al 0,4 %. Durante cada etapa de lavado invertir tubos 3-5 veces, centrifugar 2 minutos a 1200 rpm a 4 ºC en una centrífuga Heraeus. Los sobrenadantes son sobrenadantes aspirados y descartados.

Después de la última etapa de lavado preparar una suspensión 1:1 (volumen/volumen) con tampón de DP 1x/NP40 al 0,4 %.

2.3 Preparación de lisado celular diluido

El lisado cerebral de ratones se preparó para la reacción de unión por dilución en un tampón adecuado y limpiando por medio de una etapa de centrifugación.

1.

Uso de un volumen de lisado celular correspondiente a 50 mg de proteína por experimento.

2.

Descongelar el lisado rápidamente en un baño de agua a 37 ºC, después mantener la muestra en hielo.

3.

Diluir el lisado en la siguiente manera:

3) diluir lisado con tampón de DP 1x/inhibidores de proteasa reduciendo concentración de detergente desde NP-40 al 0,8 % hasta NP-40 al 0,4 %.

4) diluir lisado adicionalmente con tampón 1x DP/NP40 al 0,4 %/inhibidores de proteasa alcanzando una concentración de proteína final de 5 mg/ml.

(Nota: La segunda etapa de dilución solamente se requiere si la concentración de proteínas del lisado después de la primera etapa de dilución es más alta de 5 mg/ml).

4.

Transferir lisado diluido en tubo UZ-policarbonato (Beckmann, 355654).

5.

Limpiar lisado diluido por ultracentrifugación (20 minutos, 4 ºC, 100.000 g, rotor T150.2, ultracentrífuga pre-enfriada).

6.

Guardar sobrenadante y mantenerlo en hielo.

2.4 Reacción de unión y lavado

Las perlas lavadas y equilibradas (sección 2.2) se pusieron en contacto con el lisado celular diluido (sección 2.3) con el fin de permitir unión de las proteínas a los ligandos. Se retiraron proteínas no específicamente unidas por lavado suave con el fin de reducir la unión precedente.

1.

Combinar lisado aclarado diluido con 100 ml de KinoBeads lavadas en tubo Falcon de 15 ml o de 50 ml.

2.

Incubar durante 2 horas a 4 ºC, rotar en ROTO SHAKE GENIE (Scientific Industries, Inc.) en cámara fría.

3.

Después de incubación, centrifugar durante 3 minutos a 1.200 rpm en una centrífuga Heraeus o equivalente a 4 ºC.

4.

Retirar sobrenadante cuidadosamente sin perder las perlas.

5.

Transferir las perlas a columnas Mobicol con filtro de 90 μm (MoBiTec, Goettingen, n.º de catálogo: M1002-90).

6.

Lavar perlas con 10 ml de tampón de DP 1x/NP-40 al 0,4 % y 5 ml del tampón de DP 1x/NP-40 al 0,2 %.

7.

Dejar que el tampón de lavado corra a través de la columna completamente antes de proceder con la etapa siguiente.

8.

Situar la columna en tubo Eppendorf y centrifugarlos durante 1 minuto a 800 rpm a 4 ºC. Cerrar columnas con tapa inferior.

2.5 Elución de proteínas unidas con compuestos de prueba

Se usaron diversos compuestos de prueba (véase sección 2.7) liberando proteínas unidas siguiendo estas etapas:

1.

Resuspender perlas con proteínas unidas (sección 2.4) en tampón de DP 1x/NP-40 al 0,2 % como suspensión 1:3 (volumen/volumen).

2.

Transferir 20 μl a la suspensión 1:3 en columnas MoBiTech (equivalentes a 5 μl de perlas).

3.

Situar la columna dentro de un tubo Eppendorf y centrifugarla durante 15 segundos a 800 rpm a 4 ºC. Cerrar columnas con tapa inferior.

4.

Añadir 10 μl de tampón de elución conteniendo 1,0 mM del compuesto de prueba (son adecuados intervalos de concentración de 0,1 a 1,0 mM). Usar como un control tampón de elución que contiene DMSO al 2 % o DMF al 2 % dependiente del disolvente usado disolviendo el compuesto de prueba.

Cerrar columnas con tapa superior.

5.

Incubar durante 30 minutos a 4 ºC en un incubador de Eppendorf a 700 rpm.

6.

Abrir columna (primero arriba, después abajo), poner columna de nuevo en tubo siliconado (SafeSeal Microcentrifuge Tubes, número de catálogo: 11270, Sorenson BioScience, Inc.). Centrifugar 2 minutos a 2.000 rpm en centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente recogiendo el eluato. El volumen típico del eluato es aproximadamente 15 μl.

7.

Añadir 5 μl de tampón de muestra NuPAGE SDS 4x (Invitrogen, NP0007) conteniendo DTT 100 mM (DTT se ha añadido justo antes de usar).

8.

Incubar durante 30 minutos a 50 ºC.

9.

Añadir 1/10 de volumen de yodoacetamida a 200 mg/ml, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, proteger de luz. Esta reacción conduce a la alquilación de cisteínas para espectrometría de masas.

10.

Antes de cargar muestras en el gel, centrifugar muestras durante 5 minutos a 15.000 rpm con el fin de retirar precipitados.

11.

Para separación de proteínas aplicar 10 ml a gel Bis-Tris al 4-12 % de NuPAGE (Invitrogen, NP0335).

2.6 Preparación de soluciones de reserva usadas en este protocolo Preparación de una solución de reserva de Na3VO4 100 mM

1) Disolver 9,2 g de Na3VO4 en 400 ml de agua destilada.

2) Ajustar el pH a 10,0 usando bien NaOH 1 N o HCl 1 N. El pH de partida de la solución de ortovanadato de sodio puede variar con lote. A pH 10,0 la solución será amarilla. 3) Hervir la solución hasta que se vuelve incolora (aproximadamente 10 minutos). 4) Enfriar a temperatura ambiente. 5) Reajustar el pH a 10,0 y repetir etapas 2 y 3 hasta que la solución permanezca incolora y el pH se estabilice a 10,0. 6) Ajustar el volumen a 500 ml con agua destilada. 7) Congelar alícuotas a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

Preparación de una solución de reserva de NaF 500 mM

Disolver 21,0 g de NaF (Sigma, S7920) en 500 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ºC.

Preparación de una solución de NP40 al 20 %

Pesar 40,0 g de NP40 (Sigma, Igepal-CA630, número de catálogo: 13021). Añadir agua destilada hasta 200 g. Mezclar completamente y almacenar solución a temperatura ambiente.

Preparación de una solución de DTT 1 M

Disolver 7,7 g de DTT (Biomol, número de catálogo: 04010) en 50 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de filtro de 0,22 μm y congelar alícuotas de 400 μl a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

Preparación de solución de reserva de yodoacetamida (200 mg/ml)

Disolver 2,0 g de yodoacetamida (Sigma, S7920) en 10 ml de agua destilada. Filtrar solución a través de filtro de 0,22 μm y congelar alícuotas de 400 μl a -20 ºC. Las alícuotas pueden almacenarse durante varios meses.

2.7 Compuestos de ensayo para elución

Los compuestos de prueba enumerados más adelante se usaron para experimentos de elución después de dilución como se describe más adelante.

Preparación de reservas de compuesto de prueba:

Típicamente todos los compuestos se disuelven en DMSO al 100 % (Fluka, número de catálogo: 41647) a una concentración de 100 mM. Alternativamente, se puede usar DMF al 100 % (Fluka, número de catálogo: 40228) para aquellos compuestos que no pueden disolverse en DMSO. Los compuestos se almacenan a -20 ºC.

Dilución de compuesto de prueba para experimentos de elución:

Preparar reserva de 50 mM diluyendo la reserva 100 mM 1:1 con DMSO al 100 %. Para experimentos de elución diluir

adicionalmente el compuesto 1:50 con tampón de elución (= 1 x DP-tampón/NP40 al 0,2 %). CZC1038: Bisindolilmaleimida III (suministrador: Alexis Biochemicals; número de catálogo 270-051-M005; fórmula química-C23H20N4O2; P.M.: 384,4).

CZC7097: Purvalanol B (suministrador: Tocris Biochemicals, número de catálogo 1581; composición química C20H25ClN6O3; P.M.: 441,92; número CAS 212844-54-7). CZC00007324 (derivado PD173955; la síntesis se describe en el Ejemplo 1). CZC00008004: Este es un análogo de CZC00004919 (la síntesis se describe en el Ejemplo 1).

CZC00007098: SB202190 (suministrador: TOCRIS 1264 1A/46297; fórmula química C20H14N3OF; P.M.: 331,34). CZC00009280: Estaurosporina (suministrador: SIGMA-ALDRICH: S4400; inhibidor de cinasa de intervalo amplio; fórmula química C28H26N4O3; P.M.: 466,53).

CZC00007449: SP600125 (suministrador: Merck Biosciences número 420119, inhibidor de JNK1/2; fórmula química C14H8N2O; P.M.: 220,2).

3. Análisis espectrométrico de masas de enzimas eluidas (por ejemplo cinasas) Descripción de péptidos proteotípicos

La digestión tríptica de una mezcla de proteína separada de SDS-PAGE genera para cada proteína numerosos fragmentos peptídicos distintos con diferentes propiedades fisicoquímicas. Estos péptidos difieren en compatibilidad con la plataforma analítica basada en espectrometría de masas usada para identificación de proteínas (ID), aquí espectrometría de masas en tándem de ionización de electropulverización de cromatografía líquida en fase reversa (RP-CL-EM/EM). Como un resultado, las frecuencias peptídicas para péptidos de la misma proteína fuente difieren en un gran grado, llamándose los péptidos más frecuentemente observados que contribuyen "típicamente" a la identificación de esta proteína péptidos "proteotípicos". Así, un "péptido proteotípico" es un péptido bien observable experimentalmente que identifica únicamente una proteína específica o una isoforma de proteína.

Ventajas de péptidos proteotípicos

El uso de péptidos proteotípicos para identificación de proteínas permite la identificación rápida y centrada y la cuantificación de múltiples proteínas objetivo conocidas centrando el procedimiento de identificación de proteínas en un rastreo para la presencia de péptidos de firma ricos en información.

Identificación experimental de péptidos proteotípicos

Una estrategia generando una lista de péptidos proteotípicos es recoger datos de identificación de péptidos empíricamente y buscar el conjunto de datos para péptidos observados comúnmente que identifican únicamente una proteína.

Para cada entrada de proteína de base de datos IPI con al menos 10 identificaciones inequívocas en el conjunto de datos CZ (ID de multipéptidos o ID de péptidos individuales verificados manualmente), se calculan las frecuencias péptídicas para los péptidos que contribuyen. Solamente se consideran los mejores apareamientos péptido-a-espectro, específicos de acuerdo con el motor de búsqueda en bases de datos Mascot™ (Matrix Science).

Para definición de los péptidos proteotípicos para una proteína específica, los péptidos se ordenan descendiendo la frecuencia peptídica y se calcula una presencia peptídica acumulativa: este valor da para cada péptido la proporción de identificaciones donde este péptido o cualquiera de los péptidos con una frecuencia peptídica más alta estaba presente. Los péptidos proteotípicos se definen usando un corte para presencia acumulativa del 95 %, es decir al menos el 95 % de los eventos de identificación para esta proteína se basaron en al menos un péptido proteotípico.

3.1 Digestión de proteínas y preparación de muestras anteriores a análisis espectrométricos de masas

Las proteínas se concentraron, se separaron en geles NuPAGE® Novex al 4-12 % (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se tiñeron con azul de Coomassie coloidal. Los carriles del gel se cortaron sistemáticamente a través del intervalo de separación completo en < 48 láminas (bandas y regiones interbanda) y se sometieron a digestión tríptica en gel esencialmente como se describe por Shevchenko y cols., 1996, Analytical Chemistry 68: 850-858. Brevemente, las almohadillas de gel se destiñeron durante toda una noche en NH4HCO3 5 mM en EtOH al 50 %, se digirieron durante 4 horas con tripsina a 12,5 ng/ml en NH4HCO3 5 mM. Los péptidos se extrajeron con ácido fórmico al 1 %, se transfirieron en una segunda placa de 96 pocillos y se secaron al vacío. Los péptidos secos se resuspendieron en 10 ml de ácido fórmico al 0,1 % y se inyectaron 5 ml en el sistema LC-EM/EM para identificación de proteínas.

3.2 Adquisición de datos de espectrometría de masas

Las muestras peptídicas se inyectaron en un sistema de nano-CL (CapLC, Waters o Ultimate, Dionex) que se acopló directamente bien a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar (QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass o QSTAR Pulsar, Sciex) o bien a un espectrómetro de masas de atrapamiento iónico (LCQ Deca XP, LTQ, Thermo-Finnigan). Los péptidos se separan en el sistema de CL usando un gradiente de disolventes acuosos y orgánicos con un tiempo de gradiente típico de entre 15 y 45 minutos. El disolvente A era acetonitrilo al 5 % en ácido fórmico al 0,1% y el disolvente B era acetonitrilo al 70 % en ácido fórmico al 0,1 %.

3.3 Identificación de proteínas

La masa de los péptidos y los datos de fragmentación generados en los experimentos de CL-EM/EM se usaron consultando una versión curada de forma interna de la base de datos de secuencia de proteínas (EBI) del Índice Internacional de Proteínas (IPI). Las proteínas se identificaron correlacionando la masa de péptidos medida y los datos de fragmentación con los mismos datos computados a partir de las entradas en la base de datos usando la herramienta de software Mascot (Matrix Science; Perkins y cols., 1999, Electrophoresis 20: 3551-3567). Los criterios de búsqueda variaron dependiendo de qué espectrómetro de masas se usó para el análisis.

4. Resultados

El procedimiento permite establecer un perfil de las cinasas eluidas para cualquier compuesto de prueba dado permitiendo de este modo evaluar la selectividad del compuesto de prueba. Una limitación es que solamente las cinasas capturadas en las Kinobeads durante la primera etapa se pueden evaluar, lo que podría representar una subfracción de todas las cinasas contenidas en el lisado celular.

Ejemplo 4: Comparación de ligandos co-inmovilizados frente a ligandos acoplados por separado

El propósito de este experimento era evaluar si una mezcla de perlas conteniendo un tipo de ligando (ligandos acoplados por separado) produce resultados similares en términos de cinasas identificadas en comparación con con ligandos co-inmovilizados (acoplamiento simultáneo).

5 El resultado muestra que hay un amplio solapamiento de bases identificadas en ambos experimentos demostrando que ambos enfoques son factibles.

Se acoplaron dos ligandos bien individualmente o bien simultáneamente a perlas de sefarosa y después se usaron en los experimentos expuestos cmás adelante usando lisados de células HeLa (ligando 1: BisVIII; ligando 2: CZC00008004; detalles como en el Ejemplo 1: Preparación de Kinobeads). El acoplamiento de los compuestos

10 individualmente se llevó a cabo como se detalla en el Ejemplo 1. El acoplamiento simultáneo de los dos ligandos se llevó a cabo también como en el Ejemplo 1 salvo porque los compuestos se acoplaron sobre las mismas perlas a una concentración de 0,5 mmol/ml en vez de las perlas a 1 μmol/ml estándar. El éxito del acoplamiento de los compuestos inmovilizados individualmente o simultáneamente se controló por medio de análisis de HPLC. Las perlas se lavaron y almacenaron según se describe en el Ejemplo 1.

15 La preparación de los lisados celulares HeLa, el lavado de perlas, la puesta en contacto de las perlas con el lisado, el lavado y análisis de las proteínas liberadas por espectrometría de masas se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 2 (experimento de Signaloquinoma).

Tabla 14: Cinasas identificadas por análisis de espectrometría de masas. Comparación del experimento con dos ligandos acoplados simultáneamente (parte izquierda) frente a compuestos acoplados individualmente (perlas 20 mezcladas; parte derecha). Los nombres de cinasas están de acuerdo con la nomenclatura de cinasas humanas (http://kinase.com) y con Manning y cols., 2002, Science 298, 1912-1934 según se especifica en el material suplementario).

Acoplamiento simultáneo (premezclados Bis VIII yCZC8004)

Perlas mezcladas post-acoplamiento (Bis VIII yCZC8004)

Identificación

Cinasa Puntuación de EM Número de péptidos También en postmezcla Identificación Cinasa Puntuación de EM Número de péptidos También en premezcla

1

TBK1 1531 63 X 1 TBK1 1365 57 X

2

GSK3B 932 52 X 2 NEK9 1113 36 X

3

AurA 895 40 X 3 TNK1 921 44 X

4

TYK2 841 29 X 4 TYK2 917 34 X

5

TNK1 771 46 X 5 AurA 910 46 X

6

CDK2 741 34 X 6 GSK3A 814 47 X

7

NEK9 736 22 X 7 CaMK2g 781 38 X

8

GSK3A 707 43 X 8 GSK3B 745 33 X

9

JNK2 654 24 X 9 JAK1 731 27 X

10

JNK1 548 23 X 10 CaMK2d 641 26 X

11

CaMK2g 494 24 X 11 AurB 631 28 X

12

CaMK2d 456 21 X 12 DNAPK 610 24 X

13

AAK1 450 17 X 13 JNK2 578 23 X

14

AurB 424 15 X 14 JNK1 499 21 X

15

JAK1 187 6 X 15 CDK2 485 19 X

16

CDK9 160 6 0 16 FER 423 17 X

17

YES 108 5 X 17 AAK1 368 17 X

18

FER 106 3 X 18 TEC 159 7 0

19

MPSK1 80 3 0 19 BIKE 124 4 0

20

DNAPK 72 4 X 20 YES 108 6 X

21

ULK3 64 1 0 21 FRAP 59 3 0

Tabla 15: Cinasas y secuencias de péptidos proteotípicos identificadas en el experimento de acoplamiento simultáneo

NOMBRE DE CINASA

PÉPTIDO PROTEOTÍPICO

AAK1

APEMVNLYSGK

AURKB

IYLILEYAPR

AURKB

LPLAQVSAHPWVR

AURKB

SNVQPTAAPGQK

CAMK2D

DLKPENLLLASK

CAMK2D

FTDEYQLFEELGK

CAMK2D

GAILTTMLATR

CAMK2D

IPTGQEYAAK

CAMK2G

LTQYIDGQGRPR

CDK2

ALFPGDSEIDQLFR

CDK2

FMDASALTGIPLPLIK

CDK9

IGQGTFGEVFK

CDK9

LLVLDPAQR

CDK9

NPATTNQTEFER

GSK3A

SQEVAYTDIK

GSK3A

VIGNGSFGVVYQAR

GSK3A

VTTVVATLGQGPER

GSK3A

YFFYSSGEK

GSK3B

DIKPQNLLLDPDTAVLK

GSK3B

LYMYQLFR

GSK3B

VIGNGSFGVVYQAK

JAK1

LIMEFLPSGSLK

JAK1

LSDPGIPITVLSR

MAPK8

APEVILGMGYK

MAPK9

ILDFGLAR

MAPK9

NIISLLNVFTPQK

MAPK9

VIEQLGTPSAEFMK

NEK9

LGINLLGGPLGGK

NEK9

LNPAVTCAGK

NEK9

LQQENLQIFTQLQK

NEK9

SSTVTEAPIAVVTSR

NEK9

VLACGLNEFNK

PRKDC

INQVFHGSCITEGNELTK

(continuación)

NOMBRE DE CINASA

PÉPTIDO PROTEOTÍPICO

PRKDC

NELEIPGQYDGR

PRKDC

QLFSSLFSGILK

PRKDC

YPEETLSLMTK

STK16

APELFSVQSHCVIDER

STK16

GTLWNEIER

STK6

SKQPLPSAPENNPEEELASK

STK6

VEFTFPDFVTEGAR

TBK1

IASTLLLYQELMR

TBK1

LFAIEEETTTR

TBK1

TTEENPIFVVSR

TBK1

VIGEDGQSVYK

TNK1

AAALSGGLLSDPELQR

TNK1

VADFGLVRPLGGAR

TYK2

LGLAEGTSPFIK

TYK2

LSDPGVGLGALSR

TYK2

MVVAQQLASALSYLENK

TYK2

SLQLVMEYVPLGSLR

TYK2

SQAPDGMQSLR

ULK3

ASVENLLTEIEILK

YES 1

AANILVGENLVCK

YES 1

EVLEQVER

Tabla 16: Cinasas y secuencias de cinasas proteotípicas identificadas en el experimento de mezclas (perlas mezcladas tras acoplamiento)

NOMBRE DE CINASA

PÉPTIDO PROTEOTÍPICO

AAK1

ADIWALGCLLYK

AURKB

HFTIDDFEIGRPLGK

AURKB

IYLILEYAPR

AURKB

LPLAQVSAHPWVR

AURKB

SNVQPTAAPGQK

BMP2K

ADIWALGCLLYK

BMP2K

ITDTIGPTETSIAPR

CAMK2D

AGAYDFPSPEWDTVTPEAK

CAMK2D

FTDEYQLFEELGK

CAMK2D

FYFENALSK

(continuación)

NOMBRE DE CINASA

PÉPTIDO PROTEOTÍPICO

CAMK2D

GAILTTMLATR

CAMK2G

AGAYDFPSPEWDTVTPEAK

CAMK2G

DLKPENLLLASK

CAMK2G

FTDDYQLFEELGK

CAMK2G

LTQYIDGQGRPR

CAMK2G

NLINQMLTINPAK

CDK2

ALFPGDSEIDQLFR

CDK2

FMDASALTGIPLPLIK

FER

HSIAGIIR

FER

THAEDLNSGPLHR

FRAP1

GPTPAILESLISINNK

GSK3A

SQEVAYTDIK

GSK3A

VIGNGSFGVVYQAR

GSK3A

VTTVVATLGQGPER

GSK3A

YFFYSSGEK

GSK3B

DIKPQNLLLDPDTAVLK

GSK3B

LLEYTPTAR

GSK3B

LYMYQLFR

GSK3B

VIGNGSFGVVYQAK

GSK3B

YFFYSSGEK

JAK1

LIMEFLPSGSLK

JAK1

LSDPGIPITVLSR

MAPK8

APEVILGMGYK

MAPK8

NIIGLLNVFTPQK

MAPK9

APEVILGMGYK

MAPK9

ILDFGLAR

MAPK9

NIISLLNVFTPQK

MAPK9

VIEQLGTPSAEFMK

NEK9

AGGGAAEQEELHYIPIR

NEK9

LNPAVTCAGK

NEK9

LQQENLQIFTQLQK

NEK9

SSTVTEAPIAVVTSR

NEK9

VLACGLNEFNK

(continuación)

NOMBRE DE CINASA

PÉPTIDO PROTEOTÍPICO

PRKDC

AALSALESFLK

PRKDC

DFGLLVFVR

PRKDC

DILPCLDGYLK

PRKDC

DLLLNTMSQEEK

PRKDC

DQNILLGTTYR

PRKDC

FMNAVFFLLPK

PRKDC

FVPLLPGNR

PRKDC

GLSSLLCNFTK

PRKDC

HSSLITPLQAVAQR

PRKDC

INQVFHGSCITEGNELTK

PRKDC

LAGANPAVITCDELLLGHEK

PRKDC

LATTILQHWK

PRKDC

LSDFNDITNMLLLK

PRKDC

LYSLALHPNAFK

PRKDC

NELEIPGQYDGR

PRKDC

QCLPSLDLSCK

PRKDC

SDPGLLTNTMDVFVK

PRKDC

SIGEYDVLR

PRKDC

SLGPPQGEEDSVPR

PRKDC

VTELALTASDR

STK6

QWALEDFEIGRPLGK

STK6

SKQPLPSAPENNPEEELASK

STK6

VEFTFPDFVTEGAR

TBK1

IASTLLLYQELMR

TBK1

LFAIEEETTTR

TBK1

TTEENPIFVVSR

TBK1

VIGEDGQSVYK

TEC

ELGSGLFGVVR

TEC

GQEYLILEK

TEC

HAFGSIPEIIEYHK

TNK1

AAALSGGLLSDPELQR

TNK1

ANLWDAPPAR

TNK1

MLPEAGSLWLLK

(continuación)

NOMBRE DE CINASA

PÉPTIDO PROTEOTÍPICO

TNK1

VADFGLVRPLGGAR

TYK2

AAALSFVSLVDGYFR

TYK2

HGIPLEEVAK

TYK2

LGLAEGTSPFIK

TYK2

LSDPGVGLGALSR

TYK2

MVVAQQLASALSYLENK

TYK2

SLQLVMEYVPLGSLR

TYK2

SQAPDGMQSLR

YES1

EVLEQVER

Ejemplo 5: Síntesis de ligando de Kinobeads 5 (ligando indol 91)

Síntesis de ligando indol 91: (3-amino-propil)-amida de ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico

Etapa 1: 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona

Una solución de 5-fluoroisatina (1 g) en hidrato de hidrazina (al 55 %, 10 ml) se calentó a 110 ºC durante 30 minutos. Una vez la suspensión ha llegado a estar en solución, la reacción se calentó a 110 ºC durante 4 horas, después se enfrió a 0 ºC. El precipitado se filtró y se lavó con agua. El sólido se suspendió en agua (10 ml), el pH se disminuyó a pH 2 por adición de HCl conc. y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. El precipitado se recogió, el sólido se lavó con agua (2 x 15 ml) y se secó en el horno de vacío a 40 ºC (0,26 g, al 30 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,2 (s, 1H); 6,8-7,0 (dd, 2H); 6,6 (m, 1H); 3,2 (s, 2H). CLEM: procedimiento D, TR = 1,736 minutos, [MH+ = 152].

Etapa 2: éster terc-butílico de ácido {3-[(5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carbonil)-amino]-propil}-carbámico

A una solución de ácido 5-formil-2,4-dimetil-1H-pirazol-3-carboxílico (0,300 g, 1,79 mmol), N-(3-dimetilamino-propil)-N'-etilcarbodiimida (0,516 g, 2,69 mmol), hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (0,364 g, 2,69 mmol), trietilamina (0,502 ml, 3,56 mmol) en dimetilformamida (3 ml) se añadió N-Boc-1,3-diaminopropano (0,375 ml, 2,15 mmol). Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 15 horas. Se añadió una mezcla de salmuera (1,5 ml), agua (1,5 ml) y bicarbonato de sodio acuoso saturado (1,5 ml) y el pH de la solución se ajustó a 12 por adición de hidróxido sódico 10 N. La solución se extrajo 3 veces con una mezcla de diclorometano: metanol = 9/1). La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro. El disolvente se retiró y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (hexano: acetato de etilo (al 50 al 100 %)) produciendo el compuesto deseado como un sólido amarillo (0,30 g, al 52 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 11,90 (s, 1H); 9,50 (s, 1H); 7,50 (m, 1H); 6,90 (m, 1H); 3,20 (c, 2H); 3,00 (c, 2H); 2,30 (s, 3H)); 2,20 (s, 3H)); 1,60 (m, 2H)); 1,40 (s, 9H). CLEM: procedimiento D, TR = 2,103 minuto, [M+Na+ = 346] y [M-Boc+Na+ = 246].

Etapa 3: éster terc-butílico del ácido [3-({5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carbonil}-amino)-propil]-carbámico

Una solución de éster terc-butílico del ácido {3-[(5-formil-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carbonil)-amino]-propil}-carbámico (0,200 g, 0,62 mmol) y 5-fluoro-1,3-dihidro-indol-2-ona (0,011 g, 0,62 mmol), pirrolidina (0,003 ml) en etanol (2 ml) se calentó a 78 ºC durante 3 horas. La reacción se enfrió a 0 ºC y el precipitado resultante se filtró, se lavó con etanol frío. El producto se suspendió en etanol (4 ml) y se agitó a 72 ºC durante 30 minutos. La reacción se filtró, el precipitado se secó en un horno al vacío a 40 ºC proporcionando el compuesto deseado como un sólido (0,265 g, al 94 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,8 (s, 1H); 11,00 (s, 1H); 7,80 (m, 2H); 7,70 (m, 1H); 7,0 (m, 1H); 6,9 (m, 2H); 3,30 (c, 2H); 3,10 (c, 2H); 2,50 (dd, 6H) 1,60 (m, 2H)); 1,40 (s, 9H). CLEM: procedimiento D, TR = 2,86 minuto, [M+Na+ = 479] y [M-Boc+Na+ = 379].

Etapa 4: (3-amino-propil)-amida de ácido 5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(3Z)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrolo-3-carboxílico

Se suspendió en metanol éster terc-butílico de ácido

[3-({5-[5-fluoro-2-oxo-1,2-dihidro-indol-(32)-ilidenometil]-2,4-dimetil-1H-pirrolo-3-carbonil}-amino)-propil]-carbámico. Se añadieron 2 ml de HCl (4 N) en dioxano y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda una noche. Se retiró el disolvente produciendo el compuesto del título (0,098 g, al 91 %). RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,8 (s, 1H); 11,00 (s, 1H); 7,90-7,70 (m, 5H); 6,9 (m, 2H); 3,30 (c, 2H); 2,80 (c, 2H); 2,50 (dd, 6H) 1,80 (m, 2H). CLEM:

5 inconclusa debido a fluorescencia.

Todas las reacciones se llevaron a cabo en atmósfera inerte. Se obtuvieron espectros de RMN en un dpx400 de Bruker. CLEM se llevó a cabo en un Agilent 1100 usando una columna Zorbax SBC-18, de 4,6 mm x 150 mm-5 m o una columna pequeña: ZORBAX® SB-C18, 4,6 x 75 mm, 3,5 micrometros ("columna corta"). El flujo en columna fue 1 ml/minuto y los disolventes usados fueron agua y acetonitrilo (TFA al 0,1 %) con un volumen de inyección de 10 μl. Las

10 longitudes de onda fueron de 254 y 210 nm. A continuación se describen los procedimientos.

Tabla 17: Procedimientos analíticos

Procedimiento

Nombre de Procedimiento de Acceso Fácil Nombre de Procedimiento de ChemStation Caudal Disolvente Tiempo derecorrido

A

Analítica positiva de 7 minutos ANL_POS7.M 1 ml/minuto MeCN al 5-95 % durante 0-2,5 minutos 7 minutos

MeCN al 95 % durante 2,5-6 minutos

B

Analítica positiva iónica ANAL_POS.M 1ml/minuto MeCN al 5-95 % durante 0-11minutos MeCN al 95 % durante 11-13 minutos 15 min

C

Inyección de bucle, positiva 1 ml/minuto MeCN al 95 % 1 minuto

D

Analítica positiva iónica ANL en columna corta positiva 1 ml/minuto MeCN al 30-95 % durante 0-4,5 minutos 5 minutos

E

pH alto analítico pH alto analítico 3 ml/minuto MeCN al 5-95 % durante 0 a 8 minutos MeCN al 95 % durante 8 a 9 minutos 10 minutos

Tabla 18: Abreviaturas usadas en protocolos de química

ac.

acuoso

D

doblete

DMSO

dimetilsulfóxido

G

gramo

HCl

Ácido clorhídrico

HPLC

cromatografía líquida de alta presión

CLEM

cromatografía de líquidos-espectrometría de masas

M

multiplete

min

minuto

mmol

milimol

N

Normal

RMN

resonancia magnética nuclear

Q

cuadruplete

TR

Tiempo de retención

S

singlete

sat

saturado

T

triplete

Ejemplo 6: Síntesis de ligando de Kinobeads 6 (ligando quinazolina 32)

Síntesis de ligando quinazolina 32: 7-(4-amino)-butiloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina

Etapa 1: 7-benciloxi-4-(2-fluoro-4-bromofenil)-amino-6-metoxiquinazolina

A una solución de 7-benciloxi-4-cloro-6-metoxiquinazolina (0,250 g, 0,83 mmol) y 4-bromo-2-fluoroanilina (190 mg, 1 mmol) en isopropanol (10 ml) se añadió ácido clorhídrico (4 M en dioxano, 0,230 ml, 0,92 mmol). La mezcla se agitó a 90 ºC durante 2 horas. Se dejó que la mezcla de reacción se enfriara hasta temperatura ambiente. El sólido se filtró aparte, se lavó con isopropanol frío y éter y finalmente se secó durante toda una noche a 50 ºC, proporcionando el compuesto del título (0,297 g-al 79 %). RMN de 1H (400 MHz, CD3OD-d4) δ 8,65 (s, 1H); 7,96 (s, 1H); 7,55 (m, 5H); 7,40 (t, 3H); 7,30 (s, 1H); 5,37 (s, 2H); 4,89 (s, 1H); 4,08 (s, 1H). CLEM: procedimiento C, [M+ = 454].

Etapa 2: 7-hidroxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina

Se disolvió 7-benciloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina (297 mg, 0,654 mmol) en ácido trifluoroacético (5 ml) y la solución se agitó a reflujo durante una hora. La mezcla de reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se vertió en hielo. El sólido se filtró aparte y se tomó en metanol. La solución se basificó usando amonio acuoso (a pH 11) y se redujo al vacío. El sólido se recogió por filtración, se lavó con agua fría y éter y finalmente se secó durante toda una noche al vacío a 50 ºC, proporcionando el compuesto del título (0,165 g-al 69 %). RMN de 1H (400 MHz, CD3OD-d4) δ 8,55 (s, 1H); 7,89 (s, 1H); 7,52 (m, 3H); 7,13 (s, 1H); 4,08 (s, 3H). CLEM: procedimiento C, [M+ = 364].

Etapa 3: 7-(4-amino-ftalimida)-butiloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina

La N(-4-bromobutil)-ftalimida (0,355 g, 0,1187 mmol) se añadió en una parte a una mezcla de 7-hidroxi4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina (360 mg, 0,989 mmol) y carbonato de potasio (410 mg, 2,967 mmol) en dimetilformamida (7 ml). La mezcla de reacción se agitó a 60 ºC durante 2 horas y luego se dejó enfriar hasta temperatura ambiente. Se añadió agua (10 ml) y el precipitado se filtró aparte. El sólido se lavó con agua fría y metanol y finalmente se secó durante toda una noche a 50 ºC al vacío, proporcionando el compuesto del título (0,317 mg-al 57 %). RMN de 1H (400 MHz, CD3OD-d4) δ 9,49 (s, 1H); 8,29 (s, 1H); 7,82 (m, 4H); 7,71 (s, 1H); 7,61 (m, 1H); 7,47 (t, 1H, J = 8,3 Hz); 7,413 (m, 1H); 7,11 (s, 1H); 4,09 (m, 2H); 3,87 (s, 3H); 3,62 (m, 2H); 1,75 (s ancho, 4H). CLEM: procedimiento B, TR = 9,20 minutos, [MH+ = 410].

Etapa 4: 7-(4-amino)-butiloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina

Una suspensión de 7-(4-amino-ftalimida)-butiloxi-4-(2-fluoro-4-bromo-fenil)-amino-6-metoxiquinazolina (150 mg, 0,265 mmol) en dimetilformamida (5 ml) se trató con monohidrato de hidrazina. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días (la solubilización tuvo lugar después de cinco minutos y se observó consumo total del material de partida) y se redujo a vacío. El aceite amarillo espeso se purificó usando el procedimiento de "cogida y liberación" (cartucho SCX-2 de Isolute con procedimiento de liberación optimizado) proporcionando el compuesto del título (63 mg, al 51 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3-d6) δ 8,68 (s, 1H); 8,48 (t, 1H, J = 8,5 Hz); 7,36 (m, 1H); 7,33 (m, 1H); 7,32 (s ancho, 1H); 7,25 (s, 1H); 7,00 (s, 1H); 4,19 (m, 2H); 4,02 (s, 3H); 2,80 (m, 2H); 1,98 (m, 2H); 1,67 (m, 2H); 1,49 (s ancho, 2H). HPLC: procedimiento D, TR = 3,52 minutos.

Todas las reacciones se llevaron a cabo en atmósfera inerte. Se obtuvieron espectros de RMN en un dpx400 de Bruker. CLEM se llevó a cabo en un Agilent 1100 usando una columna Zorbax SBC-18, de 4,6 mm x 150 mm-5 μ o una columna pequeña: ZORBAX® SB-C18, 4,6 x 75 mm, 3,5 micrometros ("columna corta"). El flujo en columna fue 1 ml/minuto y los disolventes usados fueron agua y acetonitrilo (TFA al 0,1 %) con un volumen de inyección de 10 μl. Las longitudes de onda fueron de 254 y 210 nm. A continuación se describen los procedimientos.

Tabla 19: Procedimientos analíticos

Procedimiento

Nombre de Procedimiento de Acceso Fácil Nombre de Procedimiento de ChemStation Caudal Disolvente Tiempo derecorrido

A

Analítica positiva de 7 minutos ANL_POS7.M 1 ml/min MeCN al 5-95 % durante 0-2,5 minutos MeCN al 95 % durante 2,5-6 minutos 7 minutos

B

Analítica positiva iónica ANAL_POS.M 1 ml/min MeCN al 5-95 % durante 0-11 minutos MeCN al 95 % durante 11-13 minutos 15 minutos

C

Inyección de bucle, positiva 1 ml/min MeCN al 95 % 1 minutos

(continuación)

Procedimiento

Nombre de Procedimiento de Acceso Fácil Nombre de Procedimiento de ChemStation Caudal Disolvente Tiempo derecorrido

D

Analítica positiva iónica ANL en columna corta positiva 1 ml/minuto MeCN al 30-95 % durante 0-4,5 minutos 5 minutos

E

Analítica en pH alto Analítica en pH alto 3 ml/minuto MeCN al 5-95 % durante 0 a 8 minutos MeCN al 95 % durante 8 a 9 minutos 10 minutos

Tabla 20: Abreviaturas usadas en protocolos de química

ac.

acuoso

D

doblete

DMSO

dimetilsulfóxido

G

gramo

HCl

Ácido clorhídrico

HPLC

cromatografía líquida de alta presión

CLEM

cromatografía de líquidos-espectrometría de masas

M

multiplete

min

minuto

mmol

milimol

N

Normal

RMN

resonancia magnética nuclear

Q

cuadruplete

TR

tiempo de retención

s

singlete

sat

saturado

T

triplete

5 Ejemplo 7: Síntesis del ligando de Kinobeads 7 (estaurosporina modificada)

El ligando de Kinobeads 7 en base a estaurosporina se sintetizó de acuerdo con el protocolo siguiente.

Etapa 1: Modificación de estaurosporina con anhídrido del ácido diglicólico

Disolver estaurosporina (típicamente 10 mg, IRIS-Biotech, Alemania) en 1 ml de DMF libre de agua, añadir 5 μl de TEA, enfriar a 0 ºC. De esta solución, se toman 5 μl y se mezclan con 50 μl de ACN para determinación de la cantidad 10 de partida relativa usando un sistema CL-EM (AGILENT, Alemania). Para el análisis de CL-EM se diluyen 5 μl de la mezcla de reacción en 50 ml de ACN al 100 %. Después de mezclar cuidadosamente se aplican 5 μl a análisis de HPLC usando un automuestreador. Se llevó a cabo separación a una velocidad de flujo de 450 μl/minuto con ácido fórmico al 0,1 % en agua como un disolvente A y ácido fórmico al 0,1 % en ACN al 100 % como un disolvente B usando una columna C18 de 3 x 50 mm (ZORBAX-Extended C 18, AGILENT, Alemania). Se usa un gradiente desde A al 10 % 15 hasta B al 95 % en 75 minutos. Se observó absorbancia de UV a 254 nm, la masa molecular del compuesto se determinó en línea por un sistema de EM con cuadrupolo de fase individual (MSD, AGILENT, Alemania). Los datos

registrados se comprueban manualmente. El primer análisis sirve como el estándar para el cálculo de los rendimientos de los productos de reacción. El área del pico de la señal de UV se ajusta al 100 % como cantidad de partida, en base a la estaurosporina pura.

A la solución de estaurosporina fría se añadió un exceso de 10 veces de anhídrido de ácido diglicólico (Merck Alemania) en DMF. La reacción con rendimiento cerca del 100 % se terminó en 10 minutos, se comprobó por HPLC mezclando 5 ml de la mezcla de reacción con 50 μl de ACN y se analizó por CL-EM como se describe anteriormente. La masa molecular cambió desde 467,5 Da (estaurosporina no modificada) hasta 545,6 Da (estaurosporina modificada) para la molécula cargada de forma única. Si la reacción no se completó se añade otro exceso de diez veces del anhídrido de ácido glicólico y la mezcla se mantuvo durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se analiza por CL-EM como se describe anteriormente.

Después de que la reacción se completa, no se detecta ninguna estaurosporina modificada. Se añaden 5 ml de agua a la mezcla de reacción, primero desactivando el anhídrido de ácido, en segundo lugar diluyendo para extracción en fase sólida. Preparar un cartucho de extracción en fase sólida C18 de 500 mg (Phenomenex, Alemania) por activación con 10 ml de metanol y equilibrio con TFA al 0,1 % en agua. Los disolventes se hacen pasar a través del cartucho con un caudal de aproximadamente 2 a 3 ml/minuto usando una bomba de vacío de membrana. La mezcla de reacción acuosa se aplica al cartucho y se hace pasar a través de él con el mismo caudal que anteriormente. Después de que la solución ha pasado completamente por el cartucho y que la estaurosporina modificada está unida al material C18, ello se lava primero con ACN al 5 % TFA al 0,1 %, después con ACN al 10 % y finalmente con CN al 20 %, todo ello con TFA al 0,1 % en agua. La estaurosporina modificada se eluye después con ACN al 70 %, TFA al 0,1 % en agua, seguido por ACN al 80 %, TFA al 0,1 % en agua. Los eluatos se combinan y secan al vacío.

Etapa 2: Acoplamiento de la estaurosporina modificada a la diamina unida a fase sólida usando química dePyBroP

Disolver la estaurosporina modificada en DMF libre de agua y añadir a la resina de bis-(aminoetil)etilenglicol-tritilo pre-hinchada en DMF (IRIS Biotech, Alemania). La diamina unida a fase sólida se añade en exceso de 2 a 3 veces. A la suspensión añadir 10 ml de diisopropiletilamina (DIEA, FLUKA, Alemania) y un exceso de cinco veces de PyBroP por encima de la estaurosporina modificada. La reacción se llevó a cabo durante 16 horas a temperatura ambiente en mezcla permanente sobre un mezclador de extremo a extremo. Comprobar el sobrenadante para estaurosporina no modificada por HPLC usando el sistema CL-EM como se describe anteriormente. Esta etapa es no cuantitativa, solamente se mide la desaparición de la estaurosporina modificada no unida. Después de que se completa la reacción (no se puede detectar más estaurosporina modificada no unida) la resina se lava con 10 volúmenes de DMF libre de agua y dos veces con 10 volúmenes de DCM.

Etapa 3: Reacción de escisión

La resina se resuspende después en 5 volúmenes de DCM, se enfría a 0 ºC y se añade 1 ml de TFA. La resina amarilla clara anterior debería volverse ahora rojo oscura indicando la reacción. La escisión se lleva a cabo durante 20 minutos a 0 ºC y a 20 minutos a temperatura ambiente. La solución se recoge y la resina se lava dos veces con 10 volúmenes de DCM. Todos los eluatos se combinan y se secan usando un evaporador rotatorio. La película aceitosa que queda se disuelve en 0,5 ml de DMF y se añaden 5 ml de agua. La estaurosporina modificada se purifica por extracción en fase sólida según se describe anteriormente y se seca al vacío. El rendimiento se comprueba por HPLC con absorbancia de UV a 254 nm contra la solución de estaurosporina no modificada original como se describe anteriormente, en relación a la solución de la estaurosporina modificada después de disolver el producto de reacción en 1 ml de DMF. A partir de esta solución se mezclan 5μl con 50 μl de ACN y 5 μl se analizan por CL-EM. La masa molecular del producto esperado es 727,8 Da. El área de pico a 254 nm se refiere al área de pico de la estaurosporina modificada como analizada al 100 % según se describe.

La estaurosporina modificada se usa acoplando a la sefarosa activada por NHS como es usual por medio de su grupo amino. Antes de acoplar, se lava 1 ml de perlas tres veces con 12 ml de DMSO libre de agua y después se resuspenden en 1 ml de DMSO libre de agua. A esta suspensión se añaden 20 μl de TEA y se añade un equivalente de 1 μmol de la estaurosporina modificada en DMF. Directamente después de añadir y mezclar bien y de centrifugación corta durante 1 minuto a 1200 rpm, se toman 20 μl del sobrenadante y se analizan 5 μl por CL-EM. Después de 16 horas sometida a mezclado continuo en un mezclador rotatorio, la suspensión se centrifuga de nuevo y se toman 20 μl determinando la estaurosporina modificada no unida por análisis de 5 μl por CL-EM como se describe anteriormente. Usualmente está unido el 100 % de la estaurosporina modificada. Las perlas se lavan después tres veces con 12 ml de DMSO, se resuspenden de nuevo con 1 ml de DMSO y se añaden 50 μl de etanolamina (MERCK, Alemania) bloqueando los grupos activados por NHS que no han reaccionado. La reacción se lleva a cabo durante 16 horas en mezclado continuo. Después de la reacción de bloqueo, las perlas se lavaron tres cedes con 12 ml de isopropanol (MERCK, Alemania) y se almacenaron como suspensión 1:1 a 4 ºC hasta usar.

Se usaron los siguientes reactivos:

DMF: N,N-dimetilformamida (FLUKA, 40228);

TEA: Trietilamina (SIGMA-Aldrich, T0886); ACN: Acetonitrilo para HPLC (Merck, 1.00030);

TFA: Ácido trifluoroacético (FLuKA, 09653);

PyBroP: Hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio (Novabiochem, );

DCM: Diclormetano (FLUKA, 66749);

DMSO: Dimetilsulfóxido (FLUKA, 41648).

Ejemplo 8: Unión de competición en lisados y perfil de afinidad de proteína cuantitativa (PAP)

Este ejemplo ilustra la unión por competición en lisados celulares (véase particularmente el tercer aspecto de la invención). Un compuesto de prueba, bisindolilmaleimida VIII (Bis VIII, a well known kinase inhibitor; Davies y cols., 2000. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochemical Journal 351 (Pt. 1): 95-105) se añadió a un lisado celular permitiendo de este modo que el compuesto de prueba se una a las proteínas objetivo en el lisado. Después el lisado se puso en contacto con la matriz de afinidad de Kinobeads capturando las proteínas diana libres que quedan. Las proteínas unidas a la matriz de Kinobeads se eluyeron después con tampón que contiene detergente, se separaron en un gel de SDS-poliacriamida y se analizaron por inmunodetección (pruebas de bandas de Western) o detección de espectrometría de masas.

Para proteínas de análisis de bandas de Western unidas a la matriz de afinidad se eluyeron a partir de la matriz de afinidad y se separaron subsiguientemente por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de realización de pruebas de bandas. Las cinasas individuales se detectaron con anticuerpos específicos contra GSK3alfa, GSK3beta y ITK (Figura 4A). El resultado muestra que la preincubación del lisado celular con Bis VIII impide la unión de las proteínas diana GSK3alfa y GSK3beta a la matriz de Kinobeads en una manera dosodependiente. Las concentraciones crecientes del inhibidor de cinasa Bis VIII impidieron específicamente unión de GSK3 alfa y GSK3beta a las Kinobeads pero no la unión de ITK. Para GSK3beta la señal se cuantificó y se representó frente a la concentración de Bis VIII añadido al lisado celular (Figura 4B).

Para la detección cuantitativa de proteínas por proteínas de espectrometría de masas se eluyeron a partir de la matriz de afinidad y se separaron subsiguientemente por electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida. Áreas de gel adecuadas se cortaron y se sometieron a digestión proteolítica en el gel con tripsina. Se marcaron cuatro muestras de digestión con tripsina (correspondientes a tres concentraciones de Bis VIII diferentes en el lisado y un control de DMSO) con reactivos de iTRAQ y las muestras combinadas se analizaron en un análisis de espectrometría de masas de CL-EM/EM individual seguido por cuantificación de picos en el espectro de EM/EM (Ross y cols., 2004. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell. Proteomics 3 (12): 1154-1169). El resultado muestra que se detectaron diferentes niveles de proteínas individuales y se calcularon valores de intensidad relativa (Tabla 21). Se muestran curvas de unión para cinasas individuales (Figura 5). Los valores de intensidad relativa 50 (IR50) que representan la afinidad de pares de cinasa-compuesto son similares a valores de CI50 comunicados por ensayos enzimáticos de cinasas (Davies y cols., 2000. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochemical Journal 351 (Pt. 1): 95-105).

1. Cultivo celular

Se cultivaron células Jurkat (clon E6-1 de ATCC, número TIB-152) en matraces Spinner de 1 l (Integra Biosciences, n.º: 182101) en suspensión en medio RPMI 1640 (Invitrogen, n.º: 21875-034) suplementado con Suero Fetal Bovino al 10 % (Invitrogen) a una densidad entre 0,15 x 106 y 1,2 x 106 células/ml y se recogieron por centrifugación. Los sedimentos celulares se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron subsiguientemente a -80 ºC.

2. Preparación de lisados celulares

Las células Jurkat se homogeneizaron en un homogeneizador Potter S en tampón de lisis: Tris-HCl 50 mM, NP40 al 0,8 %, glicerol al 5 %, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, NaF 25 mM, vanadato de sodio 1 mM, DTT 1 mM, pH 7,5. Se añadió un comprimido libre de EDTA completo (cóctel inhibidor de proteasas, Roche Diagnostics, 1 873 580) por tampón de 25 ml. El material se sometió a homogeneización dounce 10 veces usando un POTTER S mecanizado, se transfirió a tubos Falcon de 50 ml, se incubó durante 30 minutos en hielo y se centrifugó durante 10 minutos a 20.000 g a 4 ºC (10.000 rpm en Sorvall SLA600, preenfriada). El sobrenadante se transfirió a un tubo de (UZ)-policarbonato de ultracentrífuga (Beckmann, 355654) y se centrifugó durante 1 hora a 100.000 g a 4 °C (33.500 rpm en Ti50.2, preenfriado). El sobrenadante se transfirió de nuevo a un tubo Falcon de 50 ml, la concentración de proteínas se determinó por un ensayo de Bradford (BioRad) y se prepararon muestras conteniendo 50 mg de proteína por alícuota. Las muestras se usaron inmediatamente para experimentos o se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron congelados a -80 ºC.

3. Preincubación de lisado con compuesto de prueba

Se incubaron alícuotas de lisado de Jurkat (10 mg de proteína) con diferentes concentraciones de Bis VIII durante una hora a 4 ºC (concentración final 0,025 μM, 0,074 μM, 0,22 μM, 0,67 μM, 2,0 μM y 6,0 μM de Bis VIII). Para dicho fin las soluciones de Bis VIII se prepararon en DMSO al 100 % con disolvente que corresponde a 200 veces la concentración de Bis VIII final deseada (Bis VIII de Alexis Biochemicals número de catálogo: ALX 270-056). Se añadieron cinco μl de estas soluciones a 1 ml de lisado dando como resultado las concentraciones finales indicadas. Para un experimento de control se usaron 5 μl de DMSO sin Bis VIII.

4. Captura de proteínas con Kinobeads

[290] A cada muestra de lisado preincubada se añadieron 40 ml de Kinobeads (véase ejemplo 1) y se incubaron durante una hora a 4 ºC. Durante la incubación los tubos se rotaron en un agitador de extremo a extremo (Roto Shake Genie, Scientific Industries Inc.). Las perlas se recogieron por centrifugación, se transfirieron a columnas Mobicol (MoBiTech 10055) y se lavaron con 10 ml de tampón de DP 1x conteniendo detergente NP40 al 0,4 %, seguido por un lavado con 5 ml de tampón de DP 1x con NP40 al 0,2 %. Eluyendo las proteínas unidas, se añadieron 100 μl de tampón de muestra SDS 2x, la columna se calentó durante 30 minutos a 50 ºC y el eluato se transfirió a un tubo de micrófuga por centrifugación. Las proteínas se separaron después por electroforesis de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE). La composición y la preparación de tampones se describe en el Ejemplo 2.

5. Detección de proteínas por análisis de bandas de Western

Se llevaron a cabo pruebas de bandas de Western de acuerdo con procedimientos estándar y se desarrollaron con sistema de detección de realización de pruebas de bandas de Western ECL de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences, n.º: RPN2106). Elsistema de realización de prueba de bandas de Western ECL de Amersham es un procedimiento no radiactivo emisor de luz para la detección de antígenos específicos, directa o indirectamente con anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP).

El anticuerpo anti-glucógeno sintasa cinasa 3 beta (GSK3beta) se usó en una dilución de 1:1000 (anti-GSK3ß policlonal de conejo, Stressgen Bioreagents, Victoria, Canadá, número de producto: KAP-ST002). Este anticuerpo reconoce también GSK3alfa. El anticuerpo anti-ITK se usó también a una dilución de 1:1000 (anticuerpo anti-ITK policlonal de ratón, Upstate Lake Placid, NY, número de catálogo: 06-546).

6. Detección de proteínas por espectrometría de masas 6.1 Digestión de proteína anterior a análisis espectrométrico de masas

Proteínas separadas por gel se redujeron, se alquilaron y se digirieron en gel siguiendo esencialmente el procedimiento descrito por Shevchenko y cols., 1996, Anal. Chem. 68: 850-858. Brevemente, las proteínas separadas por gel se escindieron a partir del gel usando un escalpelo limpio, se redujeron usando DTT 10 mM (en bicarbonato de amonio 5 mM, 54 ºC, 45 minutos) y se alquilaron subsiguientemente con yodoacetamida 55 mM (en bicarbonato de amonio 5 mM) a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Se digirieron proteínas reducidas y alquiladas en gel con tripsina porcina (Promega) a una concentración de proteasas de 10 ng/μl en hidrogenocarbonato de trietilamonio 5 mM (TEAB). La digestión se dejó continuar durante 4 horas a 37 ºC y la reacción se detuvo subsiguientemente usando 5 μl de ácido fórmico al 5 %.

6.2 Preparación de muestras antes de análisis por espectrometría de masas

Las almohadillas de gel se extrajeron dos veces con 20 μl de ácido fórmico al 1 % en agua y una vez con 20 μl de ácido fórmico al 0,1 %, acetonitrilo al 60 % en agua y se almacenaron con sobrenadantes de digestión acidificados. Las muestras se secaron en un vacío.

6.3 Marcado iTRAQ de extractos peptídicos

Los extractos peptídicos de muestras tratadas con concentraciones diferentes del compuesto de prueba (0,074 μM, 0,22 μM y 0,67 μM Bis VIII) y el control de disolvente (DMSO al 0,5 %) se trataron con diferentes isómeros del reactivo de marcado isobárico (kit de iTRAQ Reagents Multiplex, número de parte: 4352135, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los reactivos iTRAQ son un grupo de reactivos multiplexados, específicos de aminas, de isótopos estables que pueden etiquetar todos los péptidos hasta en cuatro muestras biológicas diferentes permitiendo la identificación simultánea y la cuantificación de péptidos. Los reactivos de iTRAQ se usaron de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Las muestras se resuspendieron en 10 μl de solución de TEAB 50 mM, pH 8,5 y se añadieron 10 μl de etanol. El reactivo iTRAQ se disolvió en 85 μl de etanol y se añadieron 10 μl de solución de reactivo a la muestra. La reacción de etiquetado se llevó a cabo a temperatura ambiente durante una hora en un agitador horizontal y se detuvo añadiendo 10 μl de ácido fórmico al 10 % en agua. Las cuatro muestras etiquetadas después se combinaron, se secaron en una centrífuga al vacío y se resuspendieron en 10 μl de ácido fórmico al 0,1 % en agua.

6.4 Adquisición de datos de espectrometría de masas

Las muestras peptídicas se inyectaron en un sistema de nano-CL (CapLC, Waters o Ultimate, Dionex) que se acopló directente bien a un TOF cuadrupolar (QTOF2, QTOF Ultima, QTOF Micro, Micromass) o bien a un espectrómetro de masas de atrapamiento iónico (LCQ Deca XP). Los péptidos se separaron en el sistema CL usando un gradiente de disolventes acuosos y orgánicos (véase más adelante). El disolvente A era acetonitrilo al 5 % en ácido fórmico al 0,5 % y el disolvente B era acetonitrilo al 70 % en ácido fórmico al 0,5 %.

Tabla 3: Péptidos que eluyen aparte del sistema de CL se secuenciaron particularmente en el espectrómetrode masas.

Tiempo (min)

% de disolvente A % de disolvente B

0

95 5

5,33

92 8

35

50 50

36

20 80

40

20 80

41

95 5

50

95 5

6.5 Identificación de proteínas

Los datos de masa peptídica y fragmentación peptídica generados en los experimentos de CL-EM/EM se usaron curando rápidamente una proteína formateada y para bases de datos de secuencia de nucleótidos mantenidas y actualizadas regularmente en el NCBI (para los NBInr, dbEST y los genomas de ser humano y de ratón) y en el 10 Instituto de Bioinformática Europeo (EBI, para las bases de datos de proteomas de ser humano, ratón, D. melanogaster y C. elegans). Las proteínas se identificaron correlacionando los datos de masa peptídica y fragmentación peptídica medidos con los mismos datos computados a a partir de las entradas en la base de datos usando la herramienta de software Mascot (Matrix Science; Perkins y cols., 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20, 3551-3567). Los

15 criterios de búsqueda variaron dependiendo de qué espectrómetro de masas se usó para el análisis.

6.6 Cuantificación de proteínas

La cuantificación de proteínas relativas se llevó a cabo usando áreas de picos de señales iónicas comunicadoras de iTRAQ esencialmente según se describe por Ross y colegas (Ross y cols., 2004. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell. Proteomics 3 (12): 1154-1169).

20 6.7 Curvas de unión y determinación de valores de IR50

Los valores de Intensidad Relativa (IR) para las cinasas identificadas se muestran en la Tabla 21. El compuesto de prueba Bis VIII se usó a tres concentraciones diferentes en el lisado celular y los valores de RI se normalizaron para el control de DMSO. Para las cinasas seleccionadas los valores de IR se representaron frente a la concentración de Bis VIII y el ajuste de la curva se llevó a cabo usando el programa Xlfit (ID Busiess Solutions Ltd.) usando un modelo de

25 equilibrio hiperbólico (Figura 5). El valor de IR50 corresponde a la concentración de compuesto de prueba (Bis VIII) a la que la intensidad relativa de la señal de EM para una cinasa dada es el 50 % comparada con el control de disolvente (DMSO).

Tabla 21: (continuación)

Proteínas identificadas por análisis de espectrometría de masas. El compuesto de prueba Bis VIII se usó a tres concentraciones diferentes en el lisado y los valores de IR resultantes se normalizaron al control de DMSO que se ajustó a 1,0. Se enumeraron los valores de intensidad relativa. El Representante se refiere al número de acceso de la base de datos del Índice de Proteínas Internacional (IPI, Instituto de Bioinformática Europeo), una compilación de secuencias de proteínas derivadas de varias bases de datos de secuencias de alta calidad (incluyendo GenBank, EMBL, SwissProt, RefSeq, Ensembl). Los nombres de cinasas están de acuerdo con la nomenclatura de cinasas humanas (http://kinase.com) y con Manning y cols., 2002, Science 298, 1912-1934 según se especifica en el material suplementario). Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4

Representante

nombre agrupamiento Nombre cinasa DMSO 0,074CM 0,02CM 0,67CM

IPI00298977.4

AAK1 AAK1 1,00 0,82 0,90 0,75

IPI00329488.4

ABL2 ARG 1,00 0,96 0,97 0,91

IPI00176642.3

AURKB AurB 1,00 0,95 1,04 0,97

CZB00000043.1

ABI1 Abl1 1,00 0,81 0,90 1,03

IPI00306217.1

BLK BLK 1,00 0,90 0,96 0,83

IPI00430291.1

CAMK2D CaMK2d 1,00 0,91 0,99 0,88

IPI00169392.3

CAMK2G CaMK2g 1,00 0,83 0,98 0,88

IPI00031681.1

CDK2 CDK2 1,00 0,89 0,85 0,65

IPI00023530.4

CDK5 CDK5 1,00 0,92 1,02 0,95

IPI00000685.1

CDK7 CDK7 1,00 1,03 1,04 0,89

IPI00013212.1

CSK CSK 1,00 0,84 0,94 0,89

IPI00183400.8

CSNK1A1 CK1a 1,00 0,97 1,04 1,02

IPI00465058.1

CSNK1G1 CK1g1 1,00 1,01 1,05 0,96

IPI00219012.2

FYN FYN 1,00 0,91 1,04 0,93

IPI00298949.1

GAK GAK 1,00 0,92 1,01 0,97

IPI00292228.1

GSK3A GSK3A 1,00 0,50 0,29 0,20

IPI00216190.1

GSK3B GSK3B 1,00 0,54 0,39 0,28

IPI00004566.1

ITK ITK 1,00 0,80 0,94 0,91

IPI00515097.1

LCK LCK 1,00 0,87 1,00 0,94

IPI00003479.1

MAPK1 Erk2 1,00 0,89 1,04 0,98

IPI00002857.1

MAPK14 p38a 1,00 0,82 0,95 0,93

IPI00024672.1

MAPK8 JNK1 1,00 0,91 1,02 0,83

IPI00024673.1

MAPK9 JNK2 1,00 0,97 1,08 1,04

IPI00012069.1

NQO1 1,00 0,84 0,99 0,87

IPI00219129.7

NQO2 1,00 0,87 0,95 0,78

IPI00410287.1

PRKAA1 AMPKa1 1,00 0,88 1,00 0,91

Muestra 1

Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4

Representante

nombre agrupamiento Nombre cinasa DMSO 0,074CM 0,02CM 0,67CM

IPI00220409.2

PRKAB1 1,00 0,91 0,94 0,79

IPI00549328.2

PRKAG1 1,00 0,78 0,79 0,68

IPI00385449.3

PRKCA PKCa 1,00 0,25 0,19 0,18

IPI00219628.1

PRKCB1 PKCb 1,00 0,29 0,23 0,17

IPI00029702.1

PTK2B PYK2 1,00 0,82 0,90 0,74

IPI00465291.3

SNF1 LK2 QIK 1,00 0,93 1,11 0,98

IPI00479211.2

SRC SRC 1,00 0,93 0,98 0,94

IPI00298940.2

STK6 AurA 1,00 0,90 1,03 0,87

IPI00293613.1

TBK1 TBK1 1,00 1,05 1,13 1,14

IPI00411818.3

ULK3 ULK3 1,00 0,95 0,97 1,15

IPI00025830.1

WEE1 Wee1 1,00 1,21 1,15 1,14

IPI00477734.1

YES1 YES 1,00 0,82 0,92 0,87

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento de caracterización de al menos una enzima, que comprende las etapas de: a) proporcionar dos alícuotas que comprende cada una al menos una célula que contiene la enzima, b) incubar una alícuota con un compuesto dado diferente de los ligandos, c) recoger las células, d) lisar las células, e) poner en contacto los lisados celulares en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos

   ligandos de enzimas de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en un soporte sólido en condiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro, f) eluir la enzima o las enzimas, y g) caracterizar la enzima eluida o las enzimas eluidas por espectrometría de masas cuantitativa.

2. 2.

   Un procedimiento de caracterización de al menos una enzima, comprendiendo las etapas de:

   a) proporcionar dos alícuotas de una preparación proteica que contiene la enzima,

   b) poner en contacto una alícuota en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos ligandos de enzimas de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en soporte sólido en condiciones que permitan la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro,

   c) poner en contacto la otra alícuota en condiciones esencialmente fisiológicas con al menos dos ligandos enzimáticos de amplio espectro diferentes, en los que los ligandos están inmovilizados en un soporte sólido en condiciones que permiten la unión del enzima a dichos ligandos enzimáticos de amplio espectro y con un compuesto dado diferente de los ligandos,

   d) eluir la enzima o las enzimas y

   e) caracterizar la enzima eluida o las enzimas eluidas por espectrometría de masas cuantitativa,

   en el que una detección reducida de la enzima en la alícuota incubada con el compuesto indica que la enzima es una diana directa del compuesto.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la provisión de una preparación proteica en la etapa a) incluye las etapas de recoger al menos una célula que contenga el enzima y lisar la célula.

4. 4.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, llevadas a cabo como un rastreo de alto rendimiento.

5. 5.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho compuesto está seleccionado del grupo que consiste en compuestos sintéticos, o fármacos sintéticos orgánicos, más preferentemente fármacos orgánicos de moléculas pequeñas y compuestos de moléculas pequeñas naturales.

6. 6.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la enzima está seleccionada del grupo que consiste en una cinasa, una fosfatasa, una proteasa, una fosfodiesterasa, una hidrogenasa, una deshidrogenasa, una ligasa, una isomerasa, una transferasa, una acetilasa, una deacetilasa, una GTPasa, una polimerasa, una nucleasa y una helicasa.

7. 7.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ligando une al 10 % al 50 %, preferentemente 30 % al 50 % de las enzimas de una clase dada de enzimas.

8. 8.

   El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando es un inhibidor.

9. 9.

   El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la enzima es una cinasa y el ligando está seleccionado del grupo que consiste en bisindolilmaleimida VIII, Purvalanol B, CZC00007324 (PD173955 enlazable) y CZC00008004.

10. 10.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la caracterización del enzima se lleva a cabo caracterizando compañeros de unión co-eluidos de la enzima, subunidades de la enzima o modificaciones postraduccionales de la enzima.

11. 11.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la caracterización se lleva a cabo por identificación de péptidos proteotípicos de la enzima o del compañero de unión de la enzima.

12. 12.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la caracterización se lleva a cabo comparando los péptidos

    proteotípicos obtenidos para la enzima y el compañero de unión con péptidos proteotípicos conocidos.

13. 13.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el soporte solido está seleccionado del grupo que consiste en agarosa, agarosa modificada, perlas de sefarosa (por ejemplo sefarosa activada con NHS), látex, celulosa y partículas ferromagnéticas o ferrimagnéticas.

    5 14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que los ligandos de enzimas de amplio espectro están acoplados covalentemente al soporte sólido.

14. 15.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que se usan 2 a 10 ligandos diferentes, preferentemente 2 a 6, más preferentemente 2 a 4.

15. 16.

    El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que mediante lacaracterización de la enzima o

    10 el complejo-enzima-compuesto se determina la identidad de todos o de partes de los miembros de una clase enzimática en una célula.
16. 17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la unión entre ligandos y enzima es una unión no covalente.
17. 18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ligando de amplio espectro es 15 capaz de unir algunas de, pero no todas, las enzimas presentes en la preparación de proteínas.

    Figura 1: Figura 2: Figura 3: Figura 4: Figura 5 (1/2): Figura 5 (2/2):