CN113930847B - 一种空间转录组位置信息编码芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种空间转录组位置信息编码芯片及其制备方法和应用，所述空间转录组位置信息编码芯片包括化学基团修饰的基片以及与化学基团相连接的至少两轮编码引物形成的引物阵列芯片。本发明的空间转录组位置信息编码芯片能够实现组织切片的全覆盖位置标记、提高空间分辨率以及降低科研成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种空间转录组位置信息编码芯片及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
近年来单细胞转录组测序技术的应用大大拓宽了人们的视野，使人们能够深入了解组织中细胞的构成的多样性和基因表达状态，然而最大的问题是细胞失去了原本在组织中的空间信息，这对于实际研究中很重要。而单细胞转录组成像可以对单个空间位置细胞的基因表达谱及转录物在细胞内的分布进行定量测量。例如，在研究细胞命运机制及细胞谱系发生空间位置的信息时，空间转录组研究对于揭示一些生物学功能尤为重要。因此发展空间转录组技术实现细胞的位置信息的保留，对于研究此类细胞状态极为重要。
基于测序的空间转录组技术在2016年率先发表在Science上。目前最常见的空间转录组技术有ST、Slide-seq、HDST。然而这些技术并没有实现组织切片的全覆盖。全覆盖组织切片基因检测对于转录图谱的三维重建提供更精确的参考。其中10X Genomics Visium芯片的每个捕获区域包含5000个被条形码标记的点，每个点的直径是55um，但是每个点之间都会有45um的距离不被覆盖在组织上，因此不能对组织切片全覆盖位置标记并且分辨率较低，此外Visium芯片价格高且不能重复利用增加了科研成本。2020年樊荣团队针对空间转录组技术进行改进，利用微流控技术实现组织切片的空间转录组学研究，即DBiT-seq，该技术在最高10um的分辨率下实现高精度检测，将编码点之间的距离缩小至10um。但是该方案仍然存在一些需要改进的地方，第一是可以将分辨率提高到亚细胞水平，第二是需要增加编码数量，实现更大区域的检测，第三是该技术依然不能实现组织切片全覆盖位置标记。
发明内容
发明目的：为了实现组织切片的全覆盖位置标记和降低科研成本，本发明提供了一种空间转录组位置信息编码芯片及其制备方法和应用，并且用于编码引物排列的凹槽模具具有可重复性，从而大大降低了芯片的制备成本。
技术方案：为了实现上述目的，本发明提供了一种空间转录组位置信息编码芯片，所述空间转录组位置信息编码芯片包括化学基团修饰的基片、以及与化学基团相连接的至少两轮编码引物形成的引物阵列芯片。
其中，所述化学基团为氨基、羧基、生物素中的一种或几种。
其中，所述两轮编码引物包括第一轮编码引物和第二轮编码引物，所述第一轮编码引物包括第一组编码引物和第二组编码引物，所述第二轮编码引物包括第三组编码引物和第四组编码引物，其中第一组编码引物的数量是N1，第二组编码引物的数量是N2，第三种编码引物的数量是N3，第四组编码引物的数量是N4，每个芯片可制备N种不同位置信息编码的引物，其中N＝(N1+N2)*(N3+N4)，N1、N2、N3、N4为大于1的自然数。
作为优选，所述两轮编码引物包括第一轮编码引物和第二轮编码引物，所述第一轮编码引物包括第一组编码引物和第二组编码引物，所述第二轮编码引物包括第三组编码引物和第四组编码引物，每一组编码引物分别可以包括48种不同编码的引物。
本发明内容还包括所述的空间转录组位置信息编码芯片的制备方法，包含以下步骤：
1)将第一组编码引物分别加入到不同的带有多个凹槽的压印模具中；
2)通过压印的方式将凹槽中的编码引物转移到带有特定修饰的基片表面，并且通过共价结合的方式固定于基片表面；
3)按照步骤1)的方式将第二组编码引物加入到另一个带有多个凹槽的压印模具中，在相同的方向上，向一侧移动一个凹槽宽度的位置上进行第二次压印与固定，以确保每一个接触面上都有不同的编码；
4)按照步骤1)～步骤3)的方式在垂直方向上进行第三组与第四组引物的压印，并且用DNA聚合酶进行引物的连接，形成全覆盖的编码引物芯片阵列。
其中，所述压印模具上凹槽的尺寸为5-100微米，所述步骤1)中压印模具的凹槽宽度与脊棱宽度相同；所述步骤1)中压印模具由具有一定弹性的材质制备而成，如PDMS等。
其中，所述第一组编码引物与第二组编码引物的5’末端含有一个化学修饰基团，能够与玻片表面的修饰分子进行共价连接；所述第三组编码引物与第四组编码引物5’末端含有能够与第一组编码引物和第二组编码引物连接的基团，或者含有一段能够与第一组编码引物及第二组编码引物3’末端部分序列互补的碱基，通过DNA聚合酶延伸的方式进行连接。
其中，所述基片材质为玻璃或者硅片。
其中，所述第一组编码引物与第二组编码引物5’末端化学基团修饰为氨基、羧基、生物素中的一种或几种。
其中，编码引物之间的连接方法是通过DNA聚合酶进行连接。
其中，所述玻璃或者硅片表面修饰的方法是氨基、醛基、羧基和/或亲和素修饰。
本发明所述的编码芯片能够定位和区分不同组织区域内基因表达情况，为疾病的发病机制和相关研究提供重要的技术手段。
本发明内容还包括所述的编码芯片在转录组测序分析中的应用。
其中，所述应用通过研究具有空间位置信息的样本，并结合单细胞技术实现单细胞水平加空间的全面无偏的转录组测序分析。
有益效果：与现有的空间转录组技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明制备的芯片能够实现组织切片全覆盖位置编码标记；
(2)本发明制备的具有凹槽的压印模具可重复利用，制备空间位置编码芯片的成本很低；
(3)本发明制备的芯片可实现高分辨率空间转录组研究，有利于准确的重建组织结构的三维转录图谱；
(4)本发明制备的芯片可实现更多的编码数量。
附图说明
图1凹槽结构示意图；
图2压印示意图；
图3编码芯片示意图；
图4基片的修饰示意图；
图5第一轮编码引物链接示意图；
图6第二轮编码引物链接示意图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，为了进一步说明本发明技术方案能够解决的问题和达到有益的效果。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，均按照文献所述或产品说明书进行的。所用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可购买的常规产品。
本发明中所有涉及的实验均在无菌的超净台中进行，避免因污染影响实验效果。
实施例1
本实例通过制备凹槽压印模具，并将编码引物通过压印的方式制备空间位置信息编码芯片。我们将该芯片应用在小鼠脑切片中进行空间转录组测序，评估该技术方案的效果。具体操作方式按照以下说明进行：
1、凹槽压印模具的制备
如图1，选择50μm宽度的凹槽压印模具，由厂家定制完成，我们使用10％的PDMS制备4组带有48个凹槽通道的压印模具。
2、基片修饰
购买的链霉亲和素为冻干粉，其纯度大于99％，活性是15.7Units，使用纯水溶解冻干粉至5-10mg/ml浓度。将链霉亲和素溶液滴至在玻片或基底上进行修饰，用于结合生物素标记的分子。参见图4的基片修饰示意图。
3、第一轮编码引物连接
首先，在第一组48通道的凹槽模具中添加48种不同编码的引物，引物由生工生物工程股份有限公司合成(表1)，并且5’端进行生物素标记，以压印的方式压印到修饰好的基片中，通过链霉亲和素-生物素结合的方式将第一组编码引物连接在基片上。其次，第二组引物也是由生工生物工程股份有限公司合成(表2)，我们将第二组48种不同编码的引物添加在第二组的48通道凹槽模具中，如图2，以第一组相同的方向平移一个凹槽的距离进行压印，并且通过链霉亲和素-生物素结合的方式将第二组编码引物连接在玻片上。参见图5第一轮编码引物链接示意图。
表1 第一组编码引物序列
表2 第二组编码引物序列
4、第二轮编码引物链接
第三组和第四组引物是由生工生物工程股份有限公司合成(表3和表4)，我们以第一轮编码引物链接方式在垂直方向上进行第三组与第四组引物的压印，其中第三组和第四组48通道中的编码引物与第一组和第二组是不一致的，并且第三组和第四组编码引物通过使用10μl的PrimeSTAR Max DNA聚合酶(TaKaRa购买)与第一组引物及第二组引物的3’末端引物序列互补，如图3，形成全覆盖的编码引物芯片阵列。因此该芯片上共有9216个编码位点。参见图6第二轮编码引物链接示意图。
表3 第三组编码引物序列
表4 第四组编码引物序列
5、小鼠脑切片制备
在实验开始之前，将手术器械、培养皿及0.9％的生理盐水灭菌处理，通过1X PBS(pH＝7.4)灌流的方法进行取脑，使用OCT包埋，并在液氮下速冻。然后在冰冻切片机上进行切片，脑切片厚度为10um。我们将切好的冰冻切片贴于制备的芯片上，然后进行后续的实验。
6、组织切片染色与成像
(1)滴加1ml无水乙醇在步骤5中的芯片上，并确保所有组织都被覆盖，在室温下固定1min；
(2)将芯片倾斜，去除无水乙醇溶液，然后将玻片浸入装有95％的乙醇溶液中，浸泡30s；
(3)将芯片在70％的乙醇溶液中浸泡30s；
(4)用滤纸将玻片外缘的液体出去干净，小心不要碰到含有组织的区域；
(4)吸取1ml的1％的甲酚紫溶液滴加在玻片上，确保覆盖所有的组织，室温孵育5min，其中1％的甲酚紫溶液是由70％的乙醇溶液配置的；
(5)将芯片分别在70％、90％和100％的乙醇溶液中各浸泡30s进行脱水；
(6)将芯片在室温下放置1-2min，直到晾干，然后进行显微成像，进行组织定位。
7、细胞裂解和RNA片段化
步骤6结束后，在芯片上加入以下试剂(表5)同时进行细胞裂解和RNA片段化，包含4μl的Triton X-100细胞裂解液、3μl的5X First-Strand Buffer、4.0μl的10mM dNTP和4μl的25mM MgCl2。用塑料密封盖住阵列。在80℃条件下反应5min，然后立即放在冰上2min。
表5 片段化反应体系
8、逆转录和模板转换
在步骤7反应结束后，在玻片上滴加逆转录混合物体系(表6)，其中包含2μl的10uMTSO、2μl Maxima H Minus Reverse Transcriptase(200U/μl)、1μl 100mM DTT、1μl RNaseInhibitor(40U/μl)和4.0μl 5M Betaine。逆转录反应条件是：42℃，90min；10循环(50℃，2min；42℃，2min)；85℃，5min。
表6 逆转录和模板转换体系
9、混合建库
步骤8反应结束后，我们将所有位点合成的cDNA链整体从玻片上进行切除，并在离心机中旋转玻片收集cDNA链至200μl PCR管中进行后续实验。
10、PCR预扩增
将步骤9中cDNA链收集后进行PCR预扩增，目的是为了增加cDNA产量，使用25μlKAPA HiFi HotStart Ready Mix、1μl 5μM的IS PCR–Oligo(引物由生工生物工程股份有限公司合成：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC-3’)和1μl 5μM的IS PCR–TSO(引物由生工生物工程股份有限公司合成：5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)进行PCR扩增反应(表7)，反应条件是：98℃，3min；25循环(98℃，20s；67℃，15s；72℃，3min)；72℃，5min。
表7 预扩增体系
11、PCR产物纯化
用0.7x的Ampure XP磁珠对步骤10中的PCR产物进行纯化：
(1)提前将DNA磁珠在室温下平衡，然后加35μl磁珠，用移液枪吹打10次混匀，在室温下放置8min；
(2)将磁珠混合液放置磁力架上，放置5min至澄清；
(3)去除上清液，用200μl 80％的乙醇清洗2次，每次清洗30s，弃乙醇，使磁珠干燥；
(4)加入25μl的无酶水溶解，用移液枪吹打10次混匀，静置2min；
(5)放置磁力架上澄清，吸取23ul至新的PCR管中，用于下一步实验。
12、接头连接
在步骤11中的反应产物中加入1μl 5μM P5端通用引物(引物序列来源于Illumina官网并由生工生物工程股份有限公司合成：5′-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TACACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATCT-3′)、1μl 5μM P7端测序引物(引物序列来源于Illumina官网并由生工生物工程股份有限公司合成：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3′)和25μl KAPA HiFi HotStart ReadyMix进行反应(表8)，在98℃，45s；23循环(98℃，15s；60℃，30s；72℃，10s)；72℃，1min的条件下进行PCR扩增。
表8 接头连接反应体系
13、cDNA文库纯化
用0.6x的Ampure XP磁珠对步骤12中的PCR产物进行纯化：
(1)提前将DNA磁珠在室温下平衡，然后加30μl磁珠，用移液枪吹打10次混匀，在室温下放置8min；
(2)将磁珠混合液放置磁力架上，放置5min至澄清；
(3)去除上清液，用200μl 80％的乙醇清洗2次，每次清洗30s，弃乙醇，使磁珠干燥；
(4)加入10μl的无酶水溶解，用移液枪吹打10次混匀，静置2min；
(5)放置磁力架上澄清，吸取18μl至新的PCR管中，用于测序。
14、结果与分析
Illumina平台测序所得的原始下机序列(Raw Reads)，通过去除低质量序列、去接头污染等过程完成数据处理得到的高质量的序列(Clean Reads)。使用fastq-multx拆分工具，根据不同位点的编码信息对Clean Reads数据拆分。然后使用Hisat2软件将CleanReads数据与参考基因组进行比对，以评估每个位点检测到的基因数。表9显示了其中9个位点的测序结果，结果显示，在每个位点上均能检测到5000左右个基因。
表9 建库测序结果
以上结果表明，本发明的空间转录组位置信息编码芯片制备方法可应用于空间转录组研究，并能得到稳定的结果。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种空间转录组位置信息编码芯片及其制备方法和应用
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcccgcggt tggatc 46
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttataac cggatc 46
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggacttg gggatc 46
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaagtcca aggatc 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatccact gggatc 46
<210> 6
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<212> DNA
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<400> 6
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgcttgtc aggatc 46
<210> 7
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<400> 7
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<210> 8
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgacctga aggatc 46
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctctac tggatc 46
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcctctcgt cggatc 46
<210> 13
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcccaagtc tggatc 46
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttggact cggatc 46
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<212> DNA
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggcttaa gggatc 46
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaataca gggatc 46
<210> 18
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<212> DNA
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<400> 18
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccggcgtg aggatc 46
<210> 19
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<212> DNA
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<210> 21
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<212> DNA
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<400> 21
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggtacct tggatc 46
<210> 22
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<212> DNA
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<400> 22
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaacgttc cggatc 46
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgcagaat tggatc 46
<210> 24
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<212> DNA
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatgaggc cggatc 46
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcactaaga tggatc 46
<210> 26
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<212> DNA
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<400> 26
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgtcggag cggatc 46
<210> 27
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<212> DNA
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccttggta tggatc 46
<210> 28
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctccaacg cggatc 46
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcccgtgaa gggatc 46
<210> 30
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<212> DNA
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<400> 30
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<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggcattc tggatc 46
<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaatgcct cggatc 46
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaccgag gggatc 46
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<212> DNA
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atccgttaga aggatc 46
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcagcctca tggatc 46
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgattctg cggatc 46
<210> 37
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctcgtagt gggatc 46
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcctacgac aggatc 46
<210> 39
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagtgg tggatc 46
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<400> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatatgga tggatc 46
<210> 42
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<212> DNA
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgcgcaag cggatc 46
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaagatac tggatc 46
<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcggagcgt cggatc 46
<210> 45
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcatggcat gggatc 46
<210> 46
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgcaatgc aggatc 46
<210> 47
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcgttccaa tggatc 46
<210> 48
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcaccttgg cggatc 46
Claims (4)
1.一种空间转录组位置信息编码芯片的制备方法，所述空间转录组位置信息编码芯片包括化学基团修饰的基片、以及与化学基团相连接的至少两轮编码引物形成的引物阵列芯片，所述两轮编码引物包括第一轮编码引物和第二轮编码引物，所述第一轮编码引物包括第一组编码引物和第二组编码引物，所述第二轮编码引物包括第三组编码引物和第四组编码引物，其中第一组编码引物的数量是N1，第二组编码引物的数量是N2，第三组编码引物的数量是N3，第四组编码引物的数量是N4，每个芯片可制备N种不同位置信息编码的引物，其中N=（N1+N2）*（N3+N4），N1、N2、N3、N4为大于1的自然数；其特征在于，所述制备方法包含以下步骤：
1）将第一组编码引物分别加入到不同的带有多个凹槽的压印模具中；
2）通过压印的方式将凹槽中的编码引物转移到带有特定修饰的基片表面，并且通过共价结合的方式固定于基片表面；
3）按照步骤1）的方式将第二组编码引物加入到另一个带有多个凹槽的压印模具中，在相同的方向上，向一侧移动一个凹槽宽度的位置上进行第二次压印与固定，以确保每一个接触面上都有不同的编码；
4）按照步骤1）~步骤3）的方式在垂直方向上进行第三组与第四组引物的压印，并且用DNA聚合酶进行引物的连接，形成全覆盖的编码引物芯片阵列；
所述第一组编码引物与第二组编码引物的5’末端含有一个化学修饰基团，能够与玻片表面的修饰分子进行共价连接；所述第三组编码引物与第四组编码引物5’末端含有能够与第一组编码引物和第二组编码引物连接的基团，或者含有一段能够与第一组编码引物及第二组编码引物3’末端部分序列互补的碱基，通过DNA聚合酶延伸的方式进行连接。
2.根据权利要求1所述的空间转录组位置信息编码芯片的制备方法，其特征在于，所述压印模具上凹槽的尺寸为5-100微米。
3.根据权利要求1所述的空间转录组位置信息编码芯片的制备方法，其特征在于，所述基片材质为玻璃或者硅片。
4.根据权利要求1所述的空间转录组位置信息编码芯片的制备方法，其特征在于，所述第一组编码引物与第二组编码引物5’末端化学基团修饰为氨基、羧基、生物素中的一种或几种。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101586149A (zh) * | 2008-06-24 | 2009-11-25 | 山东省医药生物技术研究中心 | 寡核苷酸芯片及其应用 |
| CN103781918A (zh) * | 2011-04-13 | 2014-05-07 | 空间转录公司 | 用于组织样本中核酸的局部或空间检测的方法和产品 |
| CN111051526A (zh) * | 2017-05-23 | 2020-04-21 | 生捷科技控股公司 | 用于实施生物分子空间分布分析的方法 |
| CN112143784A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-29 | 生物岛实验室 | 空间组学测序、单细胞表观转录组学测序及定位标识方法 |
| KR20210039289A (ko) * | 2019-10-01 | 2021-04-09 | ㈜컨투어젠 | 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보를 유지한 채 추출하는 방법 및 장치, 이를 이용한 위치정보를 포함하는 유전체 분석 방법 |
| CN113270142A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-17 | 东南大学 | 一种基于瞬态编码的空间转录组测序解码方法 |
| CN113439124A (zh) * | 2018-12-10 | 2021-09-24 | 10X基因组学有限公司 | 使用主/复制阵列进行空间检测的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA3152756A1 (en) * | 2019-09-30 | 2021-04-08 | Rong Fan | Deterministic barcoding for spatial omics sequencing |
-
2021
- 2021-09-26 CN CN202111132170.1A patent/CN113930847B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101586149A (zh) * | 2008-06-24 | 2009-11-25 | 山东省医药生物技术研究中心 | 寡核苷酸芯片及其应用 |
| CN103781918A (zh) * | 2011-04-13 | 2014-05-07 | 空间转录公司 | 用于组织样本中核酸的局部或空间检测的方法和产品 |
| CN111051526A (zh) * | 2017-05-23 | 2020-04-21 | 生捷科技控股公司 | 用于实施生物分子空间分布分析的方法 |
| CN113439124A (zh) * | 2018-12-10 | 2021-09-24 | 10X基因组学有限公司 | 使用主/复制阵列进行空间检测的方法 |
| KR20210039289A (ko) * | 2019-10-01 | 2021-04-09 | ㈜컨투어젠 | 핵산을 포함하는 시료의 핵산을 2차원의 위치 정보를 유지한 채 추출하는 방법 및 장치, 이를 이용한 위치정보를 포함하는 유전체 분석 방법 |
| CN112143784A (zh) * | 2020-09-29 | 2020-12-29 | 生物岛实验室 | 空间组学测序、单细胞表观转录组学测序及定位标识方法 |
| CN113270142A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-17 | 东南大学 | 一种基于瞬态编码的空间转录组测序解码方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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