JP2003530365A - プロテオミック分析 - Google Patents

プロテオミック分析

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞または溶解物としてプロテオームを分析する方法を提供する。分析は、活性型のタンパク質、特に酵素および受容体に対して特異性を有するプローブの使用に基づく。プローブは異なる方法によって同定できる。本発明によって、リード分子の同定のため、かつそれらの生物学的標的の並行した同定のために使用される化合物ライブラリーを作成およびスクリーニングする方法を提供する。1つまたは複数の結合部分に対する特異的な官能性および／または基を追加することによって、反応性の官能性が、特定のタンパク質およびタンパク質のクラスに対する結合親和性および特異性を得る。活性に基づくプローブまたはABPとして本明細書で言及する、候補化合物のこのようなライブラリーは、1つまたは複数の所望の生物学的活性または標的タンパク質についてスクリーニングするために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野 本発明の分野は、プロテオームの一部の分析である。
【０００２】 発明の背景 ヒトを含む高等生物のゲノム配列の決定は、現在、達成可能な目標である。し
かし、この分析は、ゲノムによってコードされる情報の局面の1つを表すにすぎ
ない。遺伝子は規則正しい、適時の様態で発現し、かつさらに、正確な空間およ
び時間的発現パターンを示す。したがって、生物学を説明し、かつ疾病を理解す
るのに、ゲノム配列の知見は不十分である。
【０００３】 より重要なことは、遺伝子はmRNAに転写され、その後タンパク質に翻訳される
。活性を示し、そして細胞の活動を行うのは、タンパク質すなわち遺伝子産物で
ある。ポスト・ゲノム時代が急速に近づいていることに伴って、タンパク質の分
析のための新たな戦略が開発されつつある。大部分の従来のアプローチは、タン
パク質レベルでの変動を記録することに焦点を当てている。これらのアプローチ
は、一般に、「プロテオミクス」と呼ばれる。一般に、プロテオミクスは、複雑
な生物学的混合物から得られるタンパク質の広範なプロファイルの存在量を測定
することを求める。最も一般的な態様では、プロテオミクスは、二次元SDS-PAGE
により、試料内のタンパク質を分離することを含む。その後、これらのゲルの個
別のタンパク質のスポットパターンは、2つの比較試料中での、特定のタンパク
質の相対的な量に関する指標を得るために比較されうる。そのアプローチは、ス
ポットを排除し、そしてそれらをペプチドマスフィンガープリンティングにかけ
ることによって、個々のタンパク質スポットの分子同一性を測定することまでに
さえ拡張されうる。さらに最近では、質量分析法により複合混合物を直接的に分
析することによって電気泳動段階を排除し、かつプロテオミクスを行う方法が記
述されている。例えば、この技術で最近記述された方法は、タンパク質混合物と
反応して、非特異的であるか、または非指向性様態での混合物が、タンパク質の
定量的分析のみを提供するという点で多くのタンパク質を標識できる化学的に反
応性のあるプローブを提供する(Aebersold、PCT/US99/19415参照)。そのような
方法によって、個々に反応性があって、かつ結合して化学的プローブになり得る
タンパク質内に、多くの化学的に反応性のあるアミノ酸残基があることが開示さ
れる。それにより、タンパク質結合体は続いて定量化されて、タンパク質存在量
の指標を生じうる。同様に、ウェル（Wells）ら(PCT/US99/14267；PCT/US98/217
59)は、標的分子での活性部位に結合することなく、生物学上の標的分子に結合
する小さな有機分子リガンドを同定する方法を記述している。これらの方法には
、試料内の活性および不活性タンパク質を選択的に検出することは記述されてい
ない。
【０００４】 存在量と対照的に、タンパク質活性を測定する方法を考案する必要性は、酵素
と称される、タンパク質の重要な下位集団によって最もよく示される。多くの種
の酵素は、ゲノムによってコードされる。酵素は、血液凝固、炎症、血管形成、
神経形成、ペプチドホルモンプロセシングおよびTリンパ球介在性細胞毒性を含
む、ほとんど全ての生物学的過程の鍵である。数種のヒト疾患は、酵素の機能不
全に関連している。これらは出血障害、気腫、関節炎、および癌を含むが、それ
らに限定されない。
【０００５】 上記のような最近のプロテオミックアプローチでは、酵素の量についての情報
を理論上、提供しうるが、これらの方法では酵素活性については知りえない。こ
れは、酵素の活性、および他のタンパク質でさえ、後期翻訳修飾によってしばし
ば制御されるので重要な制限である。重要なことに、活性部位はタンパク質の全
表面の少量しか示さない。この活性部位の化学的特性および反応性は、部位の局
所環境によって左右され、そのアミノ酸組成および三次元構造によって決まる。
酵素の活性部位の形状および／または露出は、多くの生物学的事象によって調節
されうる。多くの場合に、酵素の活性部位は天然の阻害物質によって被覆されう
る。または、アロステリック補因子の作用によって、活性部位はより活性に適し
た形状になりうる。
【０００６】 多くの場合に、化合物のライブラリーは、所望の生物学的効果を示す化合物を
同定するためにスクリーニングされる。いったんこのような化合物(「リード」)
が同定されると、医薬品として使用できるように反復過程を用いて、それらの化
学的および生物学的特性を改良する。この反復過程における重要な段階は、リー
ド化合物によって阻害される生物学的標的分子の同定である。生物学的標的分子
の同定を知れば、リード化合物の構造に基づいて別の化合物の増強効力について
試験する簡素化された高処理量アッセイ法を考案することによって、開発過程を
合理化することができる。さらに、生物学的標的の正体を知ることは不可欠であ
り、その結果、動物およびヒトの試行での効果について、このような化合物の試
験を目的とした研究を解釈することができる。
【０００７】 全開発過程に固有の困難の1つは、リード化合物について、生物学的標的分子
を同定することがしばしば困難なことである。例えば、細胞分裂を遮断するリー
ドを同定するスクリーニングを確立しうる。成功すれば、このようなスクリーニ
ングは、いずれも細胞分裂を遮断するさまざまな能力を備えた多数のリードを同
定する。細胞分裂は、膨大な生化学的経路および数百のタンパク質に関する複雑
な過程である。したがって、リード化合物は、これらのタンパク質のいずれか1
つに結合し、かつ阻害することもある。
【０００８】 生物学的標的分子が、このようなスクリーニングから同定されるリード化合物
にとってどのような存在であるかを判断する簡単な方法はない。また、複数のリ
ード化合物が、同じかまたは異なる生物学的標的分子のどちらと相互作用するか
どうかを、知る方法もない。その結果、生物学的標的分子の同定は、面倒で時間
がかかり、高価な従来の分画および精製戦略に依存する。さらに、生物学的標的
分子の同一性の知識、およびそれの正確な生化学的活性の理解なしには、生物学
的標的分子の精製をそれらの段階を通して追跡するアッセイ法を考案できない可
能性がある。結果として、現在のアプローチを用いて、このような生物学的標的
分子を同定することは不可能であることが多い。
【０００９】 発明の概要 複数の活性タンパク質、およびそのようなプロテオームタンパク質の活性に対
する作用物質の効果に関して、プロテオームの活性を測定する、プロテオームの
一部を同定するシステムが提供される。そのシステムは、活性タンパク質との反
応に有用なプローブ、活性タンパク質と反応するプローブを同定する方法、およ
びプローブが反応したタンパク質を同定する方法を含む。プローブは、プローブ
の一部としてその反応性が標的活性タンパク質に限定される反応性部分、プロー
ブの結合を配列決定するリガンド、および標的タンパク質、ならびに選択的に、
放出および分析可能な「活性に基づくプローブ」(「ABP」)と称される標識子(id
entifier)からなる。
【００１０】 このシステムは、タンパク質立体配座について特定の親和性を示す基を同定す
る段階、生物系の状態に関連した生物学的な関心対象のプロテオーム中の標的タ
ンパク質を同定する段階、標的タンパク質の基に結合するプローブを生成する段
階、タンパク質の基についてプロテオミックプロファイルを分析する段階、かつ
生じたデータを分析する段階を含む。このシステムは、候補化合物の生物活性プ
ロファイルについてスクリーニングするためにも使用されうる。
【００１１】 発明の詳細な説明 本発明によって、特定のタンパク質または関連タンパク質の基についてプロテ
オームを分析し、プロテオーム中のこのようなタンパク質に対する作用物質の効
果を測定するシステムが提供される。そのシステムは、アッセイで使用するプロ
ーブを同定する方法、プローブ、そのプローブをプロテオミック混合物と反応さ
せる方法、およびプロテオームの標的構成要素とプロテオームの部分の活性に対
する作用物質の効果とを、少なくとも半定量的に測定するアッセイから得られた
データを分析する方法とからなる。プロテオームをスクリーニングして、特定の
親和性を示す構成要素を同定するための組み合わせライブラリーのキットであっ
て、プロテオームをスクリーニングするために、タンパク質またはタンパク質の
関連基ごとに異なるプローブからなるキットも提供する。タンパク質の任意の関
連基に関するプローブを発見するためのシステムの一部として、官能基の一部と
しての共通の反応官能性を有し、かつ通常は、受容体が利用可能であるリガンド
、またはリガンドを添加するために、相互官能性と反応する化学的に反応性の官
能性に、官能基を連結させる、共通のリンカーを有する、組み合わせライブラリ
ーが使用される。活性なプロテオームでの結果は、不活性プロテオームで繰り返
して、活性なタンパク質と比較した、総標的タンパク質の活性の程度を測定する
。官能基の特性によって、リンカーの一部または官能基の一部は、可変成分を包
含しうる。
【００１２】 システムは、プローブの特異性、および分析されるべき関連タンパク質の基ま
たは複数の基における多様性によって、特定の関連タンパク質または関連タンパ
ク質の基に特異的なプローブを使用し、プローブの1つまたは混合物を合わせる
。反応混合物は、プローブが、活性な標的タンパク質と実質的に優先的に反応す
る条件を提供する。「活性な」とは、タンパク質が未変性の立体配座にあり、そ
れが、例えば基質および補因子と酵素、リガンドと受容体などのように、通常相
互作用する実体と、相互作用できることを意味する。リガンドを使用することに
より、標的結合プローブを、リガンドによって分離し、異なるプロトコルを用い
て、基としてまたは個々に培地に存在する、標的タンパク質の量を測定する。選
択的に、分離されたタンパク質は、プローブが結合する特異的タンパク質を同定
するためにさらに分析されうる。
【００１３】 まず、本発明のコンビナトリアルの局面を記述する。個々の構成要素が、対応
してタグ付けされるか、または標識されうる、複数の活性に基づくプローブ(ABP
)を含むコンビナトリアル化学的ライブラリーが提供される。本発明の方法は、
生物活性のある化合物を同定するために、かつタンパク質の混合物中の標的タン
パク質を同定するために、ABP含有ライブラリーを使用する。本発明のABPは、ク
ラス選択性であり、活性に基づくことが認識されると考えられる。したがって、
本発明は、迅速な標的同定および単離を可能にする。(いずれも、その全体が参
照として本明細書に組み入れられる、2000年4月10日に出願された米国特許出願
第60/195,954号、および2000年6月20日に出願された米国特許出願第60/212,891
号を参照。)
【００１４】 本発明のコンビナトリアル化学ライブラリーは、酵素が、活性部位での共通の
官能性、リガンドの1つのファミリーに結合する対立遺伝子タンパク質などを共
有する、アイソザイムおよび関連酵素全体に存在する選択的阻害パターンの発見
を含む、生物学的アッセイ法のアレイ間のライブラリーにおける化合物の評価を
通して、新たなリード構造を発見するためのスクリーニング手段として有用であ
る。したがって、ライブラリーは、医薬品発見のための手段として有用であり、
すなわちそれは、多様な生物学的標的に対してライブラリーをスクリーニングす
ることによって新規リード化合物を発見する手段であり、かつ関連化合物の大き
なファミリーでの構造-活性関係の開発のための手段としても有用である。プロ
テオームと反応させた後の組み合わせライブラリーは、ライブラリーおよび標的
タンパク質の構成要素間の複合体の組成を提供する。このような組成は、プロテ
オミック混合物から標的タンパク質を分離するための抗体を産生したり、同じか
または異なるプローブなどを用いた他の分析で形成された、結合体の量を測定す
るための標準として、質量分析およびデータバンクを用いた標的タンパク質の消
化および同定などに有用である。
【００１５】 本発明の方法では、親和性標識または標的タンパク質に指向されたタンパク質
反応性試薬、複合混合物からの活性タンパク質の選択的検出および連続単離を可
能にするABPを使用する。単離タンパク質は、例えば混合物中での酵素的活性、
タンパク質複合体形成、タンパク質-核酸相互作用などのタンパク質機能を持つ
ことを特徴とする。単離タンパク質は、質量分析(MS)技術によって選択的に特徴
付けられる。特に、単離タンパク質の配列は、縦列MS(MSn)技術を用いて決定す
ることができ、配列データベース検索技術を使用して、配列決定されたペプチド
の元となるタンパク質を同定することができる。ABPは、例えば、単離タンパク
質同位体または原子(各種の原子量元素)の示差標識を与え、それによって、質量
分析法で、様々な試料中の活性タンパク質の相対的量を定量測定することが容易
になる。
【００１６】 「組み合わせライブラリー」は、化合物の集合であって、その集合を含む化合
物は、1つまたは複数の型のサブユニットから構成される。ライブラリーは、少
なくとも2個の構成要素、まれには約5個未満の構成要素、通常、少なくとも約10
個の構成要素、しばしば、約50個以上の構成要素を有し、通常約1,000個未満の
構成要素、より一般的には約500個未満の構成要素を有する。サブユニットは、
合成化合物、天然に存在する化合物、例えばアミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質
および炭化水素、ならびにその合成類似体のような、多様な化学的部分を含む天
然または人工的部分から選択することができ、それは、非常に多様な化合物とし
て市販されており容易に入手できる。組み合わせライブラリーの化合物は、化合
物を構成する1つまたは複数のサブユニットを修飾した回数、順序、型または複
数の型に関して、1つまたは複数の点で異なる。または、組み合わせライブラリ
ーは、他の分子の存在やコア分子組織が組織化される方法の差異の結果としての
立体配置、サイズおよび負荷分布により変化する、「コア分子組織」の集合に該
当しうる。化合物の集合は、系統的な方法で生じさせる。上記の1つまたは複数
の方法で、互いに異なるサブユニットの集団を系統的に生じさせる方法は、いず
れも組み合わせライブラリーである。
【００１７】 本出願で使用する用語を理解するために、多数の包括的用語を、その属内に入
る例を用いて説明する。
【００１８】 「化学基」とは、原子または原子の集団であり、アルキル、アルケニル、アル
キニル、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリールを含む複素
環、アミド、チオアミド、エステル、アミン、エーテル、チオエーテル、ハロ、
イミン、シアノ、ニトロ、カルボキシ、ケト、アルデヒド、およびそれらの組合
せを含む有機化学基であるが、それらに限定されない。
【００１９】 「アルキル」は、脂肪族で飽和された直鎖または分岐炭化水素構造およびその
組合せを含むことを意味する。「低級アルキル」には、1個〜8個の炭素原子を有
するアルキル基を意味する。低級アルキル基の例としては、メチル、エチル、プ
ロピル、イソプロピル、ブチル、s-およびt-ブチル、ペンチル、ヘキシル、オク
チルなどが含まれる。好ましいアルキル基は、C20またはそれ以下のもの、特にC10 またはそれより低いものである。
【００２０】 「シクロアルキル」は、3個〜8個の炭素原子を有する環状炭化水素基を含む。
低級シクロアルキル基の例には、c-プロピル、c-ブチル、c-ペンチル、ノルボル
ニル、デカリンなどが含まれ、脂肪性飽和または不飽和でありうる。
【００２１】 「アルケニル」は、直鎖状または分岐状立体配置のC2-C8不飽和炭化水素およ
びその組合せを含む。アルケニル基の例には、ビニル、アリル、イソプロペニル
、ペンテニル、ヘキセニル、1-プロペニル、2-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル
、2,4-ヘキサジエニルなどが含まれる。
【００２２】 「アルキニル」としては、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む、線状ま
たは分岐立体配置のC2-C8不飽和炭化水素およびその組合せを含む。アルキニル
基には、エチン、プロピン、ブチン、ペンチン、3-メチル-1-ブチン、3,3-ジメ
チル-1-ブチンなど含まれる。
【００２３】 「アルコキシ」は、直鎖、分岐、環状立体配置の1個〜8個の炭素原子およびそ
の組合せを有する基を示す。例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イ
ソプロポキシ、シクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシなどが含まれる。
【００２４】 「アシルアミノ」は、直鎖、分岐、環状立体配置の1個〜8個の炭素原子または
その組合せを有するアシルアミノ基を示す。例としては、アセチルアミノ、ブチ
ルアミノ、シクロヘキシルアノイルアミノなどが含まれる。
【００２５】 「ヒドロカルビルアミノ」は、水素および窒素が結合した炭素からなる部分に
該当し、各ヒドロカルビル基は約1個〜8個の炭素原子からなり、最高4個、通常3
個のヒドロカルビル基がある。「ヒドロカルビル」とは、水素および炭素からの
みなる分子の任意の分子またはコアを意味する。
【００２６】 「ハロゲン」は、F、Cl、BrおよびIを含む。
【００２７】 「ハロフェニル」は、1個〜5個のハロゲン原子で置換されたフェニルを意味す
る。例としては、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、および2,4,
6-トリクロロフェニルが含まれる。
【００２８】 「アリール」および「ヘテロアリール」は、5員もしくは6員芳香環またはO、N
もしくはSから選択される、0個〜3個のヘテロ原子を含む芳香族複素環；O、N、
またはSから選択される0個〜3個のヘテロ原子を含む二環の9員もしくは10員芳香
環または芳香族複素環システム；またはO、NもしくはSから選択される0個〜3個
のヘテロ原子を含む、三環の13員もしくは14員芳香環システムまたは芳香族複素
環システムを意味し、その環はそれぞれ、1個〜3個の低級アルキル、置換アルキ
ル、置換アルキニル、＝O、-NO2、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、OCH(COO
H)2、シアノ、-NZZ、アシルアミノ、フェニル、ベンジル、フェノキシ、ベンジ
ルオキシ、ヘテロアリール、またはヘテロアリールオキシで選択的に置換される
；該フェニル、ベンジル、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリール、およ
びヘテロアリールオキシの各々は、低級アルキル、アルケニル、アルキニル、ハ
ロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、フェニル、ベンジル、ベンジルオキ
シ、カルボキサミド、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、-NO2または-NZZ
(式中、Zは独立に、H、低級アルキル、またはシクロアルキルであり、-ZZは、融
合して窒素を有する環状リングを形成しうる)から選択される1〜3個の置換基で
選択的に置換される。
【００２９】 芳香族6員〜14員の炭素環には、例えばベンゼン、ナフタレン、インダン、テ
トラリン、およびフルオレンが含まれ、5〜10員の芳香族複素環には、例えば、
イミダゾール、ピリジン、インドール、チオフェン、ベンゾピラノン、チアゾー
ル、フラン、ベンズイミダゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、ピ
リミジン、ピラジン、テトラゾールおよびピラゾールが含まれる。
【００３０】 「アリールアルキル」は、アリール環に付着したアルキル残渣を意味する。例
は、ベンジル、フェネチルなどである。
【００３１】 「ヘテロアリールアルキル」には、ヘテロアリール環に付着したアルキル残渣
を意味する。例としては、例えばピリジニルメチル、ピリミジニルエチルなどが
含まれる。
【００３２】 「ヘテロシクロアルキル」は、1〜2のメチレン(CH2)基が、O、NZ'(式中、ZはH
またはアルキルである)、Sなどのようなヘテロ原子で置換される、シクロアルキ
ルを意味する；ただし2つのヘテロ原子が存在する場合に窒素を除き、少なくと
も1個の炭素原子によって分離されなければならない。ヘテロシクロアルキルに
は、テトラヒドロフラニル、ピペリジン、ジオキサニルなどが含まれる。
【００３３】 「アルキルカルボニル」は、-C(O)R''(式中、R''はアルキルである)を意味す
る。
【００３４】 「置換」アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、またはヘテロ
シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、また
はヘテロシクロアルキル(ただし、ここで各C原子上の3個までのH原子は、ハロゲ
ン、ヒドロキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシ、カルボキサ
ミド、シアノ、カルボニル、-NO2、-NZZで置換される)；アルキルチオ、スルホ
キシド、スルホン、アシルアミノ、アミジノ、フェニル、ベンジル、ヘテロアリ
ール、フェノキシ、ベンジルオキシ、ヘテロアリールオキシ、または置換フェニ
ル、ベンジル、ヘテロアリール、フェノキシ、ベンジルオキシ、またはヘテロア
リールオキシを意味する。
【００３５】 「Aa」は、天然に存在するか、または合成のアミノ酸を表し、ラセミ体および
全ての光学異性体を含むことが意図される。Aaのアミノ酸側鎖には、例えばメチ
ル(アラニン)、ヒドロキシメチル(セリン)、フェニルメチル(フェニルアラニン)
、チオメチル(システイン)、カルボキシエチル(グルタミン酸)などが含まれる。
一級および二級アミノ酸には、アラニン、アスパラギン、N-β-t-トリチル-アス
パラギン、アスパラギン酸、アスパラギン酸-β-t-ブチルエステル、アルギニン
、Na-Mtr-アルギニン、システイン、S-トリチル-システイン、グルタミン酸、グ
ルタミン酸-γ-t-ブチルエステル、グルタミン、Nγ-トリチル-グルタミン、グ
リシン、ヒスチジン、Nt-トリチル-ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジ
ン、Nc-Boc-リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、O-t-
ブチル-セリン、トレオニン、トリプトファン、Nw-Boc-トリプトファン、チロシ
ン、バリン、サルコシン、L-アラニン、クロロ-L-アラニン、2-アミノイソ酪酸
、2-(メチルアミノ)イソ酪酸、D,L-3-アミノイソ酪酸、(R)-(-)-2アミノイソ酪
酸、(S)-(＋)-2-アミノイソ酪酸、D-ロイシン、L-ロイシン、D-ノルバリン、L-
ノルバリン、L-2-アミノ-4-ペンテン酸、D-イソロイシン、L-イソロイシン、D-
ノルロイシン、2,3-ジアミノプロピオン酸、L-ノルロイシン、D,L-2-アミノカプ
リル酸、β-アラニン、D、L-3-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、4-(メチルアミノ)酪
酸、5-アミノ吉草酸、5-アミノカプロン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノカプ
リル酸、11-アミノデカン酸、12-アミノドデカン酸、カルボキシメトキシアミン
、D-セリン、D-ホモセリン、L-ホモセリン、D-アロトレオニン、L-アロトレオニ
ン、D-トレオニン、L-トレオニン、D,L-4-アミノ-3-ヒドロキシ酪酸、D,L-3-ヒ
ドロキシノルバリン、(3S,4S)-(-)-スタチン、5-ヒドロキシ-D,L-リジン、1-ア
ミノ-1-シクロプロパンカルボン酸、1-アミノ-1-シクロペンタンカルボン酸、1-
アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸、5-アミノ-1,3-シクロヘキサジエン-1-カ
ルボン酸、2-アミノ-2-ノルボルナンカルボン酸、(S)-(-)-2-アゼチジンカルボ
ン酸、シス-4-ヒドロキシ-D-プロリン、シス-4-ヒドロキシ-L-プロリン、トラン
ス-4-ヒドロキシ-L-プロリン、3,4-デヒドロ-D,L-プロリン、3,4-デヒドロ-L-プ
ロリン、D-ピペコリン酸、L-ピペコリン酸、ニペコチン酸、イソニペコチン酸、
ミモシン、2,3-ジアミノプロピオン酸、D,L-2,4-ジアミノ酪酸、(S)-(＋)-ジア
ミノ酪酸、D-オルニチン、L-オルニチン、2-メチルオルニチン、N-イプシロン-
メチル-L-リジン、N-メチル-D-アスパラギン酸、D,L-2-メチルグルタミン酸、D,
L-2-アミノアジピン酸、D-2-アミノアジピン酸、L-2-アミノアジピン酸、(＋/-)
-3-アミノアジピン酸、D-システイン、D-ペニシラミン、L-ペニシラミン、D,L-
ホモシステイン、S-メチル-L-システイン、L-メチオニン、D-エチオニン、L-エ
チオニン、S-カルボキシメチル-L-システイン、(S)-(＋)-2-フェニルグリシン、
(R)-(-)-2-フェニルグリシン、N-フェニルグリシン、N-(4-ヒドロキシフェニル)
グリシン、D-フェニルアラニン、(S)-(-)インドリン-2-カルボン酸、α-メチルD
,L-フェニルアラニン、α-メチル-D,L-フェニルアラニン、D-ホモフェニルアラ
ニン、L-ホモフェニルアラニン、D,L-2-フルオロフェニルグリシン、D,L-2-フル
オロフェニルアラニン、D,L-3-フルオロフェニルアラニン、D,L-4-フルオロフェ
ニルアラニン、D,L-4-クロロフェニルアラニン、L-4-クロロフェニルアラニン、
4-ブロモ-D,L-フェニルアラニン、4-ヨード-D-フェニルアラニン、3,3',5-トリ
ヨード-L-チロニン、(＋)3,3',5-トリヨード-L-チロニン、D-チロニン、L-チロ
ニン、D,L-チロシン、D-4-ヒドロキシフェニルグリシン、D-チロシン、L-チロシ
ン、O-メチル-L-チロシン、3-フルオロ-D,L-チロシン、3-ヨード-L-チロシン、3
-ニトロ-L-チロシン、3,5-ジヨード-L-チロシン、D,L-ドーパ、L-ドーパ、2,4,5
-トリヒドロキシフェニル-D,L-アラニン、3-アミノ-L-チロシン、4-アミノ-D-フ
ェニルアラニン、4-アミノ-L-フェニルアラニン、4-アミノ-D,L-フェニルアラニ
ン、4-ニトロ-L-フェニルアラニン、4-ニトロ-D,L-フェニルアラニン、3,5-ジニ
トロ-L-チロシン、D,L-α-メチルチロシン、L-α-メチルチロシン、(-)-3-(3,4-
ジヒドロキシフェニル)-2-メチル-L-アラニン、D,L-スレオ-3-フェニルセリン、
トランス-4-アミノメチル)シクロヘキサンカルボン酸、4-(アミノメチル)安息香
酸、D,L-3-アミノ酪酸、3-アミノシクロヘキサンカルボン酸、シス-2-アミノ-1-
シクロヘキサンカルボン酸、γ-アミノ-β-(p-クロロフェニル)酪酸(バクロフェ
ン)、D,L-3-アミノフェニルプロピオン酸、3-アミノ-3-(4-クロロフェニル)プロ
ピオン酸、3-アミノ-3-(2-ニトロフェニル)プロピオン酸、および3-アミノ-4,4,
4-トリフルオロ酪酸が含まれると意図される。
【００３６】 「アルキルアリール基」は、アリール基(上述したとおり)に共有結合で結合し
たアルキル(上述したとおり)を意味する。
【００３７】 「炭素環アリール基」は、芳香環上の環原子が全て、炭素原子である基である
。炭素原子は選択的に置換される。
【００３８】 「複素環アリール基」は、芳香環中の環原子として1個〜3個のヘテロ原子を有
し、環原子の残りが炭素原子である基である。適切なヘテロ原子には、酸素、硫
黄、および窒素が含まれ、全て選択的に置換される、フラニル、チエニル、ピリ
ジル、ピロリル、N-低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリ
ルなどが含まれる。
【００３９】 「アミド」は、-C(O)-NH-(式中Zは、アルキル、アリール、アルキルアリール
または水素のいずれかである)を意味する。
【００４０】 「チオアミド」は、-C(S)-NH-Z(式中Zは、アルキル、アリール、アルキルアリ
ールまたは水素のいずれかである)を意味する。
【００４１】 「エステル」は、-C(O)-OZ'(式中Z'は、アルキル、アリール、またはアルキル
アリールのいずれかである)を意味する。
【００４２】 「アミン」は、-N(Z'')Z'''(式中Z''およびZ'''が、両方とも水素でないなら
ば、Z''およびZ'''は、独立に水素、アルキル、アリール、またはアルキルアリ
ールのいずれかである)を意味する。
【００４３】 「エーテル」は、Z-O-Z(式中Zは、アルキル、アリール、またはアルキルアリ
ールのいずれかである)を意味する。
【００４４】 「チオエーテル」は、Z-S-Z(式中、Zは、アルキル、アリール、またはアルキ
ルアリールのいずれかである)を意味する。
【００４５】 「環状分子」は、環を形成する少なくとも1つの化学的部分を有する分子であ
る。環は、3つ以上の原子を含有しうる。分子は、2つ以上の環状部分を含んでよ
く、環状部分は、同じであっても、または異なっていてもよい。
【００４６】 「線状分子」は、環構造を含まない。しかし、分子は直鎖または分岐鎖であり
うる。
【００４７】 タンパク質の「活性部位」は、酵素分子または表面膜受容体などの、タンパク
質の表面上の特定領域を指し、そこに基質または相互リガンドなどの結合分子が
結合して、リガンドに変化が生じる。例えばリガンド結合の結果として、タンパ
ク質との基質または複合体の形成である。受容体については、立体配置は変化す
る可能性があり、タンパク質はリン酸化もしくは脱リン酸化または他の加工を受
けやすくなりうる。大部分については、活性部位は、基質および／または補因子
が結合し、基質および補因子が触媒反応を受け、2つのタンパク質が複合体を形
成する酵素の(複数の)部位であって、例えばGタンパク質が表面膜受容体に結合
し、2つのクリングル構造が結合する部位、転写因子が他のタンパク質に結合す
る部位、タンパク質が特異的核酸配列に結合する部位などである。膜受容体の場
合には、活性部位は、リガンドが結合してシグナルの伝達をさせる、膜の外側の
部位である。
【００４８】 本発明の「活性に基づくプローブ」または「ABP」は、標的タンパク質に非競
合的または実質的に不可逆に結合して標的タンパク質の作用を阻害する、多機能
性分子である化合物試薬である。ABPは、少なくとも反応性の官能性およびリガ
ンドを包含し、タンパク質の関連基に親和性を示す。それにより、ABPは標的タ
ンパク質に結合してそのタンパク質を実質的に不活性化し、リガンドは検出およ
び／または単離を可能にする。
【００４９】 標的タンパク質に対するABPの親和性に関して、ABPが標的タンパク質に共有結
合で結合する場合、オフ速度がないため、標的タンパク質を有するABPのオン速
度に関心が向けられる。複数のABPの総量よりも標的タンパク質の化学量論的な
量を少なくし、ABPの各々についての結合体の相対量を測定することによって、A
BP間の相対的オン速度を測定することができる。このようにして、標的タンパク
質に対するABPそれぞれの、相対的活性を測定することができ、それは本発明の
目的として、結合親和性ではなくとも、標的タンパク質に対するABPの親和性が
考慮されうる。
【００５０】 本発明は、酵素やファミリーなど任意のタンパク質を認識するABPを想定する
が、本明細書に記述する典型的なタンパク質の標的には、オキシドレダクターゼ
、ヒドロラーゼ、リガーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、およびリアー
ゼの基に含まれる酵素、ならびにセリンヒドロラーゼ、メタロ-ヒドロラーゼ、
デヒドロゲナーゼ、例えばアルコールおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼのよう
な、酵素または酵素基と、ヌクレオチドトリホスフェート(NT)-依存性酵素が含
まれる。他のタンパク質には、転写因子、クリングル構造を含むタンパク質、核
酸を結合するタンパク質、Gタンパク質結合受容体、cAMP結合タンパク質などの
ような、互いに、または核酸に結合するタンパク質が含まれる。本発明のABPの
構造を以下に詳細に述べる。
【００５１】 本発明の「活性タンパク質」は、その正常な野生型の立体配置、例えば不活性
状態と対照的に、触媒的に活性な状態にあるタンパク質、例えば酵素を意味する
。活性状態は、そのタンパク質を正常に機能させる。不活性状態は、変性、共有
結合または非共有結合のいずれかによる阻害剤結合、突然変異、二次加工、例え
ばリン酸化または脱リン酸化などの結果でありうる。本明細書に記述したタンパ
ク質または酵素の機能状態は、同じタンパク質または酵素の存在量のレベルと異
なりうる。活性部位は、例えば酵素の触媒部位、補因子結合部位、受容体のその
リガンドに対する結合部位、およびタンパク質複合体の結合部位のような、生物
学的活性を示す利用可能な野生型の形態である。多くの場合、このような部位の
利用可能性のレベルを知ることに関心が向けられる。興味の的は特に酵素であり
、他のタンパク質には、受容体、転写因子、Gタンパク質などが含まれる。
【００５２】 本システムは、中でも、新たな医薬品の開発および新たな医薬品標的の同定に
有用である。本発明の1つの態様は、多数の医薬品候補分子を迅速に生成および
開発するために特に有用である。本発明は、それらの化学的構造または組成が大
きく変化しうるか、または化学的構造もしくは組成の副次的態様が変化しうる多
数の分子を組織的に合成するために有用である。本発明は、多数の医薬品候補を
任意に生成し、その後、最も医療的に見込みのある候補を最適化するためにも有
用である。本発明の組み合わせライブラリーは、診断的に有用な化合物について
もスクリーニングされうる。診断的に有用であるというのは、化合物が、ヒトま
たは動物において特定の疾患が存在するかどうかを示すために使用される可能性
があることを意味する。
【００５３】 本発明の組み合わせライブラリーは、生物学的システム、通常、細胞システム
の生物学的状態に影響を及ぼしうる類似体を含む薬理学的に活性な化合物につい
てスクリーニングされうる。生物学的システムは、細胞および／またはウイルス
を含む生物学的供給源の使用に依存する。薬理学的に活性とは、化合物が、細胞
受容体、免疫応答の開始、休止もしくは調節、心臓機能、神経系機能または任意
の他の臓器もしくは臓器系の調節によるシグナル伝達のような生理学的過程を含
めて、酵素などのタンパク質の機能に影響しうることを意味する。薬理学的に活
性な化合物は、細菌、ウイルス、真菌、または他の病原菌の活性を刺激または阻
害もしうる。薬理学的に活性な化合物は、疾患の影響を調節することができ、す
なわち、癌、糖尿病、アテローム硬化症、高血圧、パーキンソン病、その他の疾
病状態を予防するか、または重症度を軽減するか、または治療をする。薬理学的
活性についてのスクリーニングは、分析されるべき機能または活性によっては、
当技術分野において公知のアッセイ法によって行われうる。薬理学的に活性な化
合物として示された化合物は、当技術分野において公知の方法によって治療投与
のために配合されうる。組み合わせライブラリーの個々の構成要素が、「タグ付
き分子」(「タグ」または「標識」)でコードされうる方法が文献に報告されてい
る。例えば、米国特許第5,721,099号および第6,001,579号を参照。したがって、
樹脂ビーズ上で合成された単独の分子構造は、例えば、同様にビーズに結合され
た一連の、他の容易に検出可能な分子によって、固有に定義される。タグを置き
かえずに、生物学的スクリーニング中で「活性」としてこの化合物の同定した後
、タグを放出し、分析して、「ヒット」の同一性を推定する過程によって、個々
のビーズを処理して、それらのライブラリー構成要素を放出する。ライブラリー
の多様性を最大にするために、タグの導入に使用する化学的性質が、広範な官能
性に対して耐性であることが重大である。それにより、タグ付け分子の導入は、
所望しないライブラリー構造の合成につながらず、代わりに、ライブラリーを構
築するために使用する化学的性質を制限する。同様に、タグがライブラリー構成
要素より先に除去されれば、タグ除去のための条件が失われたり、設計分子と何
らかの反応をおこすことはない。
【００５４】 本発明のコンビナトリアル合成が行われる材料は、固形支持体、ビーズ、また
は樹脂と称される。これらの用語は、セルロースビーズ、多孔-ガラスビーズ、
シリカゲル、ジビニルベンゼンで選択的に架橋され、ポリエチレングリコールで
選択的にグラフト化され、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、またはハロ基で選
択的に官能化されたポリスチレンビーズ、グラフト化コポリビーズ、ポリアクリ
ルアミド・ビーズ、ラテックス・ビーズ、N,N'-ビス-アクリロイルエチレンジア
ミンで選択的に架橋されたジメチルアクリルアミド・ビーズ、疎水性重合体で被
覆されたガラス製粒子などのような、ビーズ、ペレット、ディスク、繊維、ゲル
、または粒子で、例えば堅牢または半堅牢な表面を有する材料；および低分子量
非架橋ポリスチレンのような溶解性支持体を含むことが意図される。
【００５５】 「生物学的状態」は、mRNAプロファイル、タンパク質プロファイル、タンパク
質およびmRNAの総および／または活性な空間分布プロファイル、細胞の成熟性、
表面膜タンパク質の集団、複合体の量および空間的分布、存在するリガンドの量
、結合または未結合の脂質集団、グリコシル化、メチル化、アシル化、リン酸化
、ユビキノン化、ファネシル化などのタンパク質の加工、細胞集団を区別する差
異のものを含むことが意図される。
【００５６】 本明細書に記述した化合物のいくつかは、1つまたは複数の不斉中心を含み、
それにより絶対的立体化学の点で、(R)-もしくは(S)-として、またはアミノ酸の
(D)-もしくは(L)-として定義されうる、エナンチオマー、ジアステレオマー、お
よび他の立体異性形態を生じうる。本発明は、全てのこのような可能性のあるジ
アステレオマー、ならびにそれらのラセミおよび光学的に純粋な形態を包含する
ことが意図される。光学的に活性な(R)-および(S)-、または(D)-および(L)-異性
体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を用いて生成されうるか、または従来
の技術を用いて解離されうる。本明細書に記述した化合物は、オレフィン性結合
または立体的不斉の他の中心を含み、特に指示されない限り、EおよびZ立体異性
体の両方を包含することが意図される。同様に、全ての互変異性体型も含まれる
ことが意図される。
【００５７】 活性に基づくプローブ(ABP)は、1つまたは複数の標的タンパク質の、活性部位
との特異的反応のために提供され、標的タンパク質が1つまたは複数の活性構成
要素の存在を検出し、かつ定量するための、タンパク質、特に酵素のクラスの構
成要素であることを特徴とする。ABPは、その環境が様々の標的タンパク質との
様々の反応性を与えるために、ABPの各々で変化する共通の求電子剤を有する。
プローブは、4つの一般的領域に分けられうる：(1)タンパク質の活性部位に特異
的に、共有結合で結合する官能基(F)；(2)ABPと活性タンパク質(X)の結合体を引
き離し、検出するための標識またはリガンド(以降、包括的に「リガンド」と称
される)3)FとLの間のリンカーL；ならびに4)リンカー領域および／または官能基
と、またはその一部に会合されうる結合部分または親和性標識(R)。リンカーは
、1つの部分を別のものに連結するために使用される、結合または化学的基であ
り、2つの他の化学的部分の間の基を提供する二価架橋としての役割を果す。結
合または親和性部分は、反応性の官能基に結合されるか、または側鎖としてまた
はリンカーの鎖中でリンカーに会合される単独原子でありうる化学的基を指す、
タンパク質標的のための増強された結合親和性を与える。リガンドは、標的活性
タンパク質との官能基の反応過程で保持されるように、リガンドに強力に結合さ
れる任意の他の部分と組合せて、ABPを検出および／または捕捉するのに使用さ
れうる分子を指す。ABPは、相互の官能性、例えばホウ酸とvic-ジオール(ビシナ
ルジオール)、アルデヒドとケトンのように反応する、タンパク質には見られな
い、化学的に反応性の官能性を包含しうる。これらの反応性の官能性は、標的タ
ンパク質との反応の後、リガンドに結合させるために使用されうる。本明細書に
記述されるいくつかの態様では、ABPは切断され、リガンドを欠く可能性がある
が、しかし官能基、F、リンカー、LおよびR基(結合部分)を常に有するが、リガ
ンドやXをもたない(図1参照)。
【００５８】 ABPは、活性部位について親和性を示し、それは特定の活性部位に特異的であ
りうるか、または複数の関連タンパク質によって一般に共有されうる。親和性は
、官能基、リンカーもしくは結合部分またはその組合せから生じうる。医薬品発
見については、単一の標的についての特異性に関心が向けられる一方で、プロテ
オーム分析については、通常、関連する複数の標的に対する結合に関心が向けら
れる。
【００５９】 本発明のABPで使用されるFの例は、アルキル化剤、アシル化剤、ケトン、アル
デヒド、スルホネートまたはリン酸化剤を含む。特定のFの例は、フルオロホス
ホニル、フルオロホスホリル、フルオロスルホニル、α-ハロケトンまたはアル
デヒド、またはそれらのケタールまたはアセタール、α-ハロアシル、ニトリル
、スルホン化アルキルまたはアリルチオール、ヨードアセチルアミン基、マレイ
ミド、スルホニルハロゲン化物およびエステル、イソシアネート、イソチオシア
ネート、テトラフルオロフェニルエステル、N-ヒドロキシスクシニミジルエステ
ル、酸ハロゲン化物、酸無水物、不飽和カルボニル、アルキン、ヒドロキサメー
ト、α-ハロメチルヒドロキサメート、アジリジン、エポキシド、またはアルセ
ネートおよびそれらのオキシドを含むが、これらに限定されない。スルホニル基
は、スルホネート、スルフェート、スルフィネート、スルファメートなどを含む
が、事実上、2つの酸素原子に結合した硫黄基を有するいかなる反応性官能基を
も含む。エポキシドは、脂肪族、アラルキル、脂環式およびスピロエポキシドを
含むことができ、後者は、メタロプロテアーゼに特異的であるフマジリンによっ
て例示される。
【００６０】 本発明のABPは、以下の式： R＊(F-L)-X (式中、記号は先に定義されたとおりであり、星印は、RがFまたはLに含まれても
よく、XがLに結合していることを意図し、さらに詳細には、 式中、 Xは、生成物の形成の前に存在するリガンドであるか、または反応性の官能基
に加えられて該リガンドを提供し、該リガンドは、該ライブラリーの該構成要素
の各々について同じ化学的構造を有し； Lは、ライブラリーの構成要素の各々で同じである結合または連結基であり； Fは、タンパク質構成要素の活性部位で反応性のある官能基であり、その官能
基は、ライブラリーの構成要素の各々で同じ反応性官能基を含み； Rは、ライブラリーの構成要素の各々で異なる1kDalより小さい基であり； ＊は、RがFまたはLの一部であることを意図する） によって示すことができ、ここで、ライブラリーの構成要素が、該タンパク質構
成要素とで異なるオン速度を有する。例えば、Xがビオチンまたは任意のリガン
ドであり、Lが異なる組成および長さの任意のリンカーであり、Fがスルホネート
であり、Rがピリジル基である場合、R基がメチルである同じABPと比較して別個
のタンパク質プロファイルが観察される(図2)。したがって、スルホニル基に結
合されたときのRを変えることによって、異なる結合プロファイルが得られ、そ
の結果、特異性を探すことができ、それによりRの構造に基づいた薬物を設計す
ることに至るか、またはプロテオーム分析についての関連標的タンパク質に対す
る結合を探すことができる。
【００６１】 方法の例は、タンパク質の活性に影響を及ぼす化学的化合物を同定するために
組み合わせライブラリーを提供するように変更される脱離基を有する、反応性官
能基を使用することである。方法は、活性タンパク質と反応性のある複数の異な
る官能基(F-R)を包含し、例えば、スルホネートエステルが、アルキルのような
任意の基、ピリジル、置換ピリジル、イミダゾール、ピロール、チオフェン、フ
ラン、アゾール、オキサゾール、アジリジンなどのようなこのような複素環、ア
リール、置換アリール、アミノ酸またはペプチジル、オリゴヌクレオチドまたは
炭化水素基としてRを有しうることを特徴とするコンビナトリアル化学的ライブ
ラリーを生物学的試料に接触させる段階ならびに；生物学的試料中の生物学的活
性に対する効果(例えば、細胞増殖の阻害または酵素活性の阻害)を検出する段階
を包含する。本明細書に記述されるとおりライブラリーをスクリーニングするこ
とによって同定されたABPを獲得し、タンパク質のためのABPの特異性を確認する
ことができる。例えば、図3に例示されるとおり、スルホネートのライブラリー
から同定される個々のABPを取り出し、MALDIマッピングによって、実験区分で示
される標的酵素、すなわちアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ADH)を同定することが
できる。Xを欠くABP、または標識(例えば、ビオチン)は、同定された特異的ABP
によって、ADH活性の阻害を確認するために利用される。スルホネートABPとADH
の間の結合をさらに特徴づけるために、例えば、ADH活性の阻害の検出のための
アッセイに変性剤を含めることができる。例えば、図7で、グルタチオン(GSHま
たはglut)、ジチオトレイトール(DTT)、またはα-メルカプトエタノール(BME)を
含む多様な遊離チオールの添加は、ABP/ADHの結合を消さず、ABPと新たに同定さ
れたADHの間の結合についてのさらなる情報を提供する。他のタンパク質エフェ
クター、チオール、金属、キレート化剤(例えば、EDTA)、ATP、カルシウムなど
は、ABPとタンパク質標的間の反応に添加されると、さらなる特徴付けを提供す
ることができる。
【００６２】 リガンド部分は、標的タンパク質とプローブの結合体の捕捉を可能にする。リ
ガンドは、遊離リガンドもしくはそのリガンドの誘導体でありうる置換リガンド
を添加することにより、または溶媒(例えば、溶媒型またはpH)もしくは温度条件
を変化させることにより、捕捉試薬から置換されうるか、またはリンカーは化学
的に、酵素的に、熱的に、もしくは光化学的に開裂されて、単離材料を放出する
ことができ(以下リンカー部分の検討参照)。
【００６３】 リガンド(標識を含む)、Xの例は、ビオチン、デイミノビオチン、デチオビオ
チン、1,2-ジヒドロキシエタン、1,2-ジヒドロキシシクロヘキサンなどのような
ビシナルジオール、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、グルタチ
オン、2,4-ジントロベンゼン、フェニルアルセネート、ssDNA、dsDNA、ポリペプ
チドのペプチド、金属キレート、多糖、ローダミンもしくはフルオレセイン、ま
たは抗体が生成されうる任意のハプテンを含むが、これらに限定されない。リガ
ンドおよびそれらの捕捉試薬の例は、デチオビオチンまたはアビジン/ストレプ
トアビジン・ファミリーのタンパク質に結合し、例えばストレプトアビジン-ア
ガロース、オリゴマー性アビジン-アガロース、またはモノマー性-アビジン-ア
ガロースの形態で使用されうる、デイミノビオチンを含む構造的に修飾されたビ
オチンベースの試薬；1,2-ジヒドロキシエタン(HO-CH2-CH2-OH)、および環状ア
ルカンのものを含む他の1,2-ジヒドロキシアルカンのような1,2-ジオール、例え
ばアルキルまたはアリール基を介して、アガロースのような固形支持体材料に付
着されうるフェニル-B(OH)2またはヘキシル-B(Oエチル)2のような、アルキルま
たはアリールホウ酸またはホウ酸エステルに結合する1,2-ジヒドロキシシクロヘ
キサン；マルトース結合タンパク質に(ならびに任意の他の糖/糖結合タンパク質
対に、またはさらに一般的には、上で検討された特性を示すリガンド/リガンド
結合タンパク質対に)結合するマルトース；ハプテンが、ハプテンを認識する抗
ハプテン抗体に結合する、例えば、ジニトロフェニル基が、抗ジニトロフェニル
-IgGに結合する任意の抗体についての、ジニトロフェニル基のようなハプテン；
遷移金属に結合するリガンド、例えば、オリゴマー性ヒスチジンは、Ni(II)に結
合し、遷移金属捕捉試薬は、ニトリロトリ酢酸-キレート化Ni(II)またはイミノ
ジ酢酸キレート化Ni(II)のような樹脂結合キレート化遷移金属の形態で使用され
うる；グルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合するグルタチオンを含むが、
これらに限定されない。
【００６４】 一般に、上記で検討された適合性条件に適合する親和性存在量のために一般に
使用される任意の親和性標識捕捉試薬は、本発明の方法で使用されうる。ビオチ
ンおよびビオチンベースの親和性タグは、本明細書に特に示される。特に興味深
いのは、ビオチンを用いるか、または10％〜20％有機溶媒を含む希釈酸のような
、ESI-MS分析と適合できる溶媒条件下でアビジンまたはストレプトアビジン(ス
トレプト/アビジン)カラムから溶出する、デイミノビオチンまたはデチオビオチ
ンのような構造的に修飾されたビオチンである。デイミノビオチンでタグ付けさ
れた化合物は、約pH4より下で、溶媒中に溶出することが予想される。
【００６５】 連結基は、潜在的に結合でありうる一方で、結合以外であることが好ましい。
リンカーは、例えば、熱、化学または光化学的反応により開裂される開裂可能な
リンカーでありうる。合成法しだいで、支持体からの放出により、連結基が生成
物に官能性残基を生じうるので、標識および官能基のためのリンカーの選択は合
成法の一部である。ビーズからの脱離の後に、生成物をさらに修飾することは可
能であるが、通常困難である。合成法を設計する際に、連結基のための付着点と
して生成物に保持されるべき官能基を使用しうる。または、生成物の特性上可能
である場合、金属ハロゲン化物または酸を用いて、連結官能基、例えばアリール
チオエーテルまたはシリルを除去する開裂または脱離方法を使用しうる。多くの
場合に、合成法は連結のための官能化部位を含みうるので、連結基を選択する上
官能基を利用することができる。いくつかの例では、生成物を支持体に連結させ
る部位に異なる官能基を有することが望ましい可能性があり、それは様々の形態
の連結を用いることを必要とし、その形態は、例えば光の照射および酸加水分解
を、同時発生的にまたは連続的に行われうる、同じ脱離法または異なる脱離法に
適合しなければならない。R基の選択の場合と同様に、リンカーの選択は、ABPの
特異性を改変することが示された。例えば、本明細書で実施例(図1も参照)に記
述されるFPビオチンのためのリンカー、およびPEGを包含するリンカーは、異な
る特異性を示し、異なるタンパク質プロファイル(図6参照)を提供する。したが
って、当業者は特定のタンパク質またはタンパク質クラスに関してABPの別の特
異性を提供するために、ABPのリンカー部分を選択できる。
【００６６】 リンカー中の光開裂性基は、1-(2-ニトロフェニル)エチル基を含むことができ
る。熱的に不安定なリンカーは、核酸の2つの相補鎖、ペプチド核酸の相補鎖を
伴う核酸の鎖、または加熱により解離する2つの相補ペプチド核酸鎖から形成さ
れる、二本鎖二重鎖を含むことができる。開裂可能なリンカーは、ジスルフィド
結合、ジアリールメチルまたはトリメチルアリールメチル基を含む酸または塩基
の不安定な基、シリルエーテル、カルバメート、オキシエステル、チオノエステ
ル、チオノエステルおよびα-フッ素化アミドおよびエステルを有するものをも
含む。酵素的に開裂可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性アミドもしくはエス
テル、β-ラクタマーゼ感受性β-ラクタム類似体、およびヌクレアーゼで開裂可
能か、またはクリコシダーゼで開裂可能であるリンカーを含むことができる。
【００６７】 連結基は、中でも、エーテル、ポリエーテル、ジアミン、エーテルジアミン、
ポリエーテルジアミン、アミド、ポリアミド、ポリチオエーテル、ジスルフィド
、シリルエーテル、アルキルもしくはアルケニル鎖(直鎖もしくは分岐であり、
一部が環状でありうる)アリール、ジアリールまたはアルキル-アリール基を含む
。通常、アミノ酸およびオリゴペプチドは、好ましくない一方で、使用される場
合は、2個〜3個の炭素原子のアミノ酸、すなわちグリシンおよびアラニンを通常
使用する。リンカー中のアリール基は、1つまたは複数のヘテロ原子(例えば、N
、OもしくはS原子)を含み得る。連結も、置換ベンジルエーテル、エステル、ア
セタールまたはケタール、ジオールなどを包含する(有用な官能基のリストおよ
び開裂の様態について、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,78
9,172号参照)。結合以外である場合、リンカーは、約1個〜60個の原子、通常1個
〜30個までの原子を有し、その原子は、C、N、O、S、Pなど、特にC、NおよびOを
包含し、一般に約1個〜12個の炭素原子および約0個〜8個、通常0個〜6個のヘテ
ロ原子を有する。原子は、特に指示されない限り、基中の原子の数に言及する上
で、水素を除く。
【００６８】 リンカーおよび／またはリガンドは、例えば、リンカー中の1つまたは複数の
原子を安定な同位体と置換することにより、同位体的に標識されうる。例えば、1 Hを2Hで置換することができ、または12Cを13Cで置換することもできる。または
、HをFで置換するように、1つの原子を別のものに置換し、異なる質量を与える
ために不飽和化または他の公知の手段を使用しうる。リガンドもしくは連結基が
異なる同位体分布を示しうる一方で、本発明の目的のために、それらは、リガン
ドまたは連結基中の原子の原子数およびそれらの組織が同じである場合、同じ化
学的組成のものであると考えられる。したがって、1つの局面において、本発明
の方法は、異なる試料で、または異なる条件に供された試料で(例えば、薬物の
存在および非存在下で)、タンパク質の量の質量分光法によって、定量分析を容
易にするリガンドおよび／またはリンカーの標識化を考慮している。さらに、標
識またはリンカーは、非放射性同位体的に、例えば発光体により、標識されうる
。1つの局面において、標識により電磁シグナルが産生される。
【００６９】 参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第00/11208号に記述され
る方法および組成物は、目的の発明で使用されうる。この出願では、親和性をタ
グ付けられ、実質的に化学的に同一であり、および示差的に同位体で標識された
プローブを使用し、ここで結合体またはその断片は、質量分光法によって同定さ
れる。そのプローブが反応したタンパク質の各々についての種々の同位体プロー
ブの比は、個々のタンパク質の相対量を規定する。
【００７０】 リンカーは、アルキレンが2個〜3個の炭素原子からなるアルキレンオキシおよ
びポリアルキレンオキシ基、メチレンおよびポリメチレン、ポリアミド、ポリエ
ステルなどを含む、個々のモノマーが一般に1個〜6個、さらに通常1〜4個の炭素
原子からなるそれらの官能基によって、広範に異なることができる。オリゴマー
は、一般に約1個〜10個、さらに通常1個〜8個のモノマー単位を有する。モノマ
ー単位は、アミノ酸、天然に存在する、ならびに合成の両方のオリゴヌクレオチ
ド、天然に存在する、および合成の両方の縮合重合体モノマー単位およびその組
合せでありうる。リンカー領域における改変は、標的タンパク質またはタンパク
質のクラス(例えば、酵素)についてのABPの特異性を改変させることが示された
。
【００７１】 プローブのコンビナトリアル生成は、タンパク質の活性部位についての情報を
提供する、標的タンパク質および／またはプローブに特異的なプローブを見出す
ことが意図されるので、これらのプローブは通常、同定可能であるように修飾さ
れる。さらに、プローブの同定可能な部分が、標的タンパク質から放出されうる
、標的タンパク質と少なくとも一部のプローブ間の、開裂可能な部位が存在しう
る。いったんプローブが、例えば質量分析法、蛍光測定法、電気化学的になど、
またはその組合せによって同定されると、それにより、単一のプローブは同じプ
ロテオーム混合物と共に使用されうる。この段階で、次にタンパク質標的は利用
できる場合、免疫アッセイ法、配列決定、質量分析法などを用いて、従来の方法
によって測定されうる。親和性標識は、その後標的タンパク質に特異的な薬物の
設計の基礎を提供する。
【００７２】 本明細書に記述されるABP化合物に関して、FACS選別および細胞ローンアッセ
イ法のようなスクリーニングアッセイ法が使用されうる。リガンドXが評価前に
脱離された場合、その固形支持体に対するその関係は、例えば、標準96ウエルプ
レートの格子内の配置によって、または細胞のローンでの活性の配置によって維
持されうる。化合物が固形支持体に付着された状態で試験されるか、脱離された
状態で試験されるかに関わらず、生物活性により結合した固形支持体に付着され
たタグは、活性化合物の構造上または合成の経歴を示すために解読されうる(例
えば、Ohlmeyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90、10922〜10926、1993を参照)
。スクリーニング手段としてのこのようなライブラリーの有用性は、バーバム(B
urbaum)ら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA、92、6027〜6031、1995)によって説明され
、彼らは例えば、カルボン酸アンヒドラーゼ阻害に関するコード化組み合わせラ
イブラリーのアッセイ法を記載している。特定のアッセイ法における化合物で、
所与のスクリーニングに活性であることが見出されるものがない場合でさえ、こ
のような活性の欠如は、しばしば、有用な構造活性情報を提供する。
【００７３】 1つの態様において、本発明は2つの異なる組成、無傷のABPおよびリガンドを
欠く切断型ABPを使用する。図1参照。ほとんどの場合に、組合せには、生物活性
についてスクリーニングされる組み合わせライブラリーを使用する。リガンドを
含有する大部分の無傷のABPについて、無傷の細胞への導入を達成することは困
難である。エレクトロポレーション、透過剤などを用いて細胞の状態を変化させ
、アッセイを妨げた。ビオチンのような都合のよいリガンドを使用するためには
、2つのライブラリー、無傷のABPおよびリガンドを欠く切断型ABPを製造する。
その後、細胞膜の重大な破壊を伴わずに、切断型ABPを細胞に導入させる条件下
で、切断型ABPを導入する。アポトーシス、増殖、表面膜タンパク質における変
化、細胞受容体についてリガンドに応答する無能力などのような表現型における
任意の変化は、測定されうる。表現型における変化が関心対象である場合、その
後、細胞は溶解され、その溶解物は無傷のABPで処理され得た。さらに、活性溶
解物に結合され、不活性化溶解物で結合されなかったタンパク質のみを比較およ
び選択するために、不活性化溶解物を使用する。ABPが結合されるタンパク質は
、明細書でおよび実験区分で検討された手段で、特性決定することができる。ま
たは、細胞を修飾せずに細胞へのABPの輸送についての条件を確立し、その応答
を変化させるか、もしくは親油性リガンドを選択するか、もしくはABPが、透過
性を与える別の化合物により連行される条件を提供しうる。この方法で、細胞の
特徴における望ましくない変化を伴わずに、ABPが細胞に導入されるライブラリ
ーのスクリーニングを可能にする条件を決定しうる。これらのアプローチは、標
的タンパク質に対する特異的結合についての薬物設計における前駆体として、役
割を果しうるABPの決定を可能にする一方で、同時に標的タンパク質の活性を修
飾する表現型に対する効果を決定する。もちろん、組み合わせライブラリーの特
性およびサイズによって、1つまたは複数のライブラリーが使用されうる。
【００７４】 上に記述された方法は、細胞の環境が、タンパク質とのABPの反応に影響を及
ぼすかどうかを決定する際に応用できる。溶解物中で反応するタンパク質が、細
胞中でも反応したかどうかを同定するために、切断型ABPを伴う放射活性標識を
使用しうる。または、溶解物中で得られるタンパク質-ABP結合体に対するモノク
ローナル抗体を調製し、類似体タンパク質を切断型ABPで処理された細胞から取
り出すために使用しうる。切断型ABPが、類似のABPと同じタンパク質に結合した
ことを確立することによって、ABPの特異的親和性が、溶解物で観察されるのと
同じ細胞間活性または親和性を提供することを確立する。
【００７５】 最終的に、当業者は、SDS-PAGEまたはウエスタンブロット分析を含む標準方法
によって、さらに詳細に生物学的標的を同定しうる。例示的な実施例として、以
下のプロトコルは試料中の生物学的標的を同定するために使用されうる。ABPと
タンパク質試料(0.5〜2.5mL、0.5〜1.0mg/mL)のインキュベーションの後、試料
をトリスまたはリン酸緩衝液中で2.5mLに希釈し、PD-10サイズ排除カラムに通し
て、過剰の未反応ABPを除去する。タンパク質を、3.5mLの緩衝液中のカラムから
収集し、SDS(最終濃度0.5％)で処理し、10分間、80℃で加熱する。その後、試料
を、2.5×に希釈し、室温で、1〜4時間、100μLのアビジンアガロースビーズ(シ
グマ)でインキュベートする。その後、ビーズを少量の緩衝液で洗浄して、未結
合タンパク質を除去し、ABP標識タンパク質を90℃で、5分間加熱することによっ
て、100μLの標準SDS-PAGE充填緩衝液で溶出させる。溶出タンパク質をSDS-PAGE
ゲルにかけ、ABP標識タンパク質を、染色および／またはアビジンブロッティン
グによって同定し、ゲルから切除し、トリプシンで消化し、生じたペプチド混合
物を、MALDIおよび／または電気噴霧質量分析法によって特性決定する。質量分
析情報は、ABP標識タンパク質を同定するためにデータベース検索で使用される
。
【００７６】 一旦、コンビナトリアルまたは他の手段でプローブを確立すれば、一般にプロ
ーブは、活性タンパク質についてプロテオームを分析するために使用されうる。
プローブは単独タンパク質、より通常ではタンパク質の関連基に特異的でありう
る。タンパク質の関連基によって、タンパク質は、同じ基に属し、かつ同じ反応
、例えば加水分解、リン酸化、酸化などを触媒する酵素が有するのと同じ活性を
実施し、1つまたは複数の以下の特徴を有すると意図される：活性部位における
同じ官能基；リガンドに結合する官能基の同じ空間配向；類似の空間構造および
立体配座；類似の分子量；同じもしくは類似の補因子または複合化タンパク質；
および類似の機能。活性タンパク質と不活性タンパク質との間の差異を増すため
に、特別な化学的に反応性の基が使用される。
【００７７】 「化学的に反応性の基」は、タンパク質の一般に利用可能な官能基、例えばア
ミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、およびチオールと有効に反応しないが、表面に
特定の立体配座で存在する官能基と反応する反応性の官能基を含む部分である。
いくつかの状況では、反応性の官能基は、活性および不活性なタンパク質の間を
区別するのに役立つ。他の状況では、化学的に反応性の基の形態は、標的タンパ
ク質の特定の形態に結合し、それにより、緩徐反応性の官能基もしくは活性化を
必要とする官能基と共に、優勢な反応は活性部位に存在する。例えば、ジアゾケ
トン、アリールアジド、プソラレン、アリールケトン、アリールメチルハロゲン
化物などのような光活性可能な基を使用することができ、そのいずれかは、標的
タンパク質に非選択的に結合しうる一方で、プローブは、活性部位に結合される
。スルホン、カルボニルもしくはニトロ基のような電子求引基に付着されるオレ
フィンおよびアセチレンは、スルフヒドリル基に結合するために使用されうる。
【００７８】 検出可能な標識は、分子量、酸化的還元、電位、電磁特性、結合特性などにお
ける差異により、他の類似の分子から容易に区別されうる、通常マイクロモルよ
り少なく、好ましくはナノモルより少ない低濃度で検出可能な基である。検出可
能な標識は、ビオチンのようなハプテン、もしくは蛍光剤、もしくは活性タンパ
ク質以外の相補的受容体に非共有結合する能力のあるオリゴヌクレオチドであり
うる；質量タグは、安定な異性体；放射性異性体；金属キレートもしくは生物学
的試料に通常には見られないヘテロ原子を有する他の基；0.1より大きな量子収
量を好ましくは示す、蛍光基または化学発光基；タンパク質中に一般に存在する
低い酸化もしくは還元電位を示す電子活性基；補酵素、有機金属触媒、光増感剤
、もしくは電子伝達剤のような触媒；酵素アクチベーターもしくは阻害剤もしく
は補酵素のような、触媒活性に影響を及ぼす基を含む。
【００７９】 検出可能な標識は、質量分光計、電磁照射の検出、触媒活性の測定、電位差滴
定、サイクリック電圧計などによって直接的に検出されうる。または、標識は受
容体に結合し、それにより結合体を受容体に結合させるそれらの能力によって検
出されうる。受容体への複合体の結合は、結合が表面に対してである場合、偏光
解析装置、超音波分光計、表面プラズモン共鳴、エバネッセント波分光計などの
ような任意の標準法によって、もしくは受容体が、標識を担持でき、かつ選択的
に二次標識を担持しうる、活性タンパク質に対する抗体が使用されうるELISA、F
RET、SPA、RIAのような免疫アッセイによって、検出されうる。検出可能な標識
は、HPLC、キャピラリーまたはゲル電気泳動、クロマトグラフィー、免疫吸着な
どのような分離法の使用によって検出することもできる。これらの方法で、結合
体は、各構成要素が特異的に活性のタンパク質についての抗体である、抗体アレ
イのような特異的結合物質のアレイの構成要素に結合されうる。
【００８０】 本発明の1つの局面は、試料の一部を、試料中のタンパク質を不活性化する条
件下におく。明らかに、ABPを用いた研究から得られる情報は、不活性化条件で
処理された試料の一部でのタンパク質結合体のレベルを、活性な野生型もしくは
未処理タンパク質を含む試料の一部を比較する場合に好ましい。活性な野生型タ
ンパク質は、適切な場合、結合および他の機能を行う能力のあるそれらの天然の
立体配座を示すタンパク質を意図する。他の機能には、酵素活性、改変されるべ
き能力、例えばリン酸化もしくは脱リン酸化、アシル化など、補因子または他の
タンパク質に対する結合、生物学的活性のために必要である機能が含まれる。活
性および不活性部分の各々における、タンパク質プロファイルの間の差異は、試
料中の活性タンパク質、例えば酵素を同定するために、検出される。不活性化条
件には、通常はタンパク質を変性させることによる、不活性化のための化学的も
しくは物理的手段が含まれる。例えば、化学的手段には、有機溶媒、刺激性の洗
剤のような変性剤、例えばSDS、カオトロピック剤など、尿素、塩化グアニジニ
ウムもしくはイソシアネートなど、および他の変性剤が含まれる。物理的手段に
は、熱、凍結、電磁照射、せん断、乾燥、放電などが含まれる。活性に影響を及
ぼす、活性部位もしくはアロステリック部位に結合する不活性化剤は、共有結合
で、もしくは非共有結合で結合してもよく、非共有結合が好ましい。好ましい態
様では、加熱によりタンパク質が沈殿して、ABPとの反応にそのタンパク質を利
用できなくなる場合に、他の剤が好まれるが、試料中のタンパク質は加熱によっ
て不活性化される。
【００８１】 本発明の方法によって分析されうる試料には、細胞溶解物、ミクロソーム画分
、細胞画分、組織、オルガネラなどのような生物学的試料が含まれ、生物学的流
体には、尿、痰、唾液、血液、脳脊髄液、涙、射精液、血清、胸膜液、腹水液、
便、または生検試料が含まれる。
【００８２】 試料が不純である場合(例えば、血漿、血清、便、射精液、痰、唾液、脳脊髄
液、もしくは血液もしくはパラフィンに包埋された試料)、本発明の方法を使用
する前に処理して、関心対象の成分の混入除去することが多い。手順には、例え
ば、濾過、抽出、遠心分離、親和性隔絶などが含まれる。プローブが無傷もしく
は易透化の細胞膜を容易に通過しない場合、または溶解物が望ましい場合には、
体液、組織または試料の動物細胞膜中に含まれる細胞を溶解させ、かつそこに含
まれるタンパク質を露出させるのに、さらに適切な場合、試料中のミクロソーム
、脂質、炭化水素および核酸のような他の凝集物または分子から、タンパク質を
部分的に分離するために、細胞は効果的な試薬で処理される。試料からタンパク
質を精製または部分的に精製する方法は、当技術分野において十分に公知である
(例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Sambrookら、「分子クローニ
ング：実験マニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)、Cold S
pring Harbor Press、1989)。
【００８３】 試料は、様々の供給源に由来する可能性があり、様々の目的のために使用され
る。多くの場合、ABPは、活性酵素についてタンパク質試料を分析するために使
用される。これは、試料の総タンパク質に対する活性を決定するための、比較的
純粋な酵素試料を包含する。試料は、単独の細胞もしくは細胞の混合物、新生物
試料もしくは臓器、例えば心臓、肺、食道、腎臓、脳、血液などから得られる組
織のような、単独細胞型または細胞型の混合物を含む、他の生検もしくは組織、
疾患に罹った組織もしくは健全な組織などでありうる。細胞は、原核生物または
真核生物、脊髄動物または非脊髄動物、特に哺乳類およびさらに特に、ヒトであ
りうる。細胞もしくは組織、もしくはその溶解物は、クロマトグラフィー、遠心
分離、蛍光活性化細胞選別、希釈、透析、濃縮などを用いた分画化を含む多様な
方法で作成されうる。試料は、通常、標的酵素の活性を保つために処理され、そ
の結果、処理の方法は、穏やかで、周囲温度もしくは低温、特に37℃より低温で
使用され、有機溶媒、もしくは高濃度の塩のような他の変性条件は回避される。
【００８４】 通常、プロテオームが分析される。プロテオームにより、生物学的試料供給源
から得られる少なくとも約20％、通常少なくとも約40％、さらに通常少なくとも
約75％、一般に90％またはそれ以上の総タンパク質、およびそれを含む総タンパ
ク質が意図される。したがって、プロテオームは、無傷の細胞、溶解物、ミクロ
ソーム画分、オルガネラ、部分的に抽出された溶解物、生物学的流動体などに存
在しうる。プロテオームは、一般に少なくとも約20個の異なるタンパク質、通常
少なくとも約50個の異なるタンパク質、そしてほとんどの場合には、100個の異
なるタンパク質またはそれ以上のタンパク質の混合物である。事実上、プロテオ
ームは、天然の供給源から得られるタンパク質の複合体混合物であり、通常、プ
ロテオームプロファイルを分析するために使用されるABPについての標的タンパ
ク質である10個、通常20個、もしくはそれ以上のタンパク質を有するポテンシャ
ルを示すことに関与する。試料は関心対象の標的タンパク質の代表例である。
【００８５】 一般に、試料は少なくとも約0.05mgのタンパク質、通常少なくとも約1mgのタ
ンパク質を有し、10mgのタンパク質もしくはそれより多くを、都合よくは約0.1
〜10mg/mlの範囲での濃度で有しうる。試料は、所望の場合、適切な緩衝液濃度
およびpHに調節されうる。それにより、1つまたは複数のABPが添加され、各々は
、約0.001mMから20mMの範囲内の濃度にある。一般に、実質的に完了に到達する
ための反応時間、一般に約1〜60分間、約20〜40℃の範囲の温度で反応をインキ
ュベートした後、反応はクエンチされる。試料は、使用される試薬しだいで、現
在、様々な方法で分析されうる。
【００８６】 本発明の1つの態様では、方法により、生物学的流動体、細胞もしくは組織で
の特異的活性タンパク質の定量的測定が規定される。標的同定は、様々の細胞お
よび組織での総タンパク質活性プロファイルを決定するために使用されうる。同
じ全般的方法は、タンパク質との反応について異なる特異性を示すABPもしくはA
BPのライブラリーを使用することによって、タンパク質の活性状態の全プロテオ
ーム的な定性的および定量的分析を達成するために広げられうる。本発明の方法
および試薬は、複合混合物中で活性な、存在量が低い活性タンパク質を同定する
ために使用されてよく、膜もしくは細胞表面タンパク質のような特定の基もしく
はタンパク質のクラス、もしくはオルガネラに含まれるタンパク質、小細胞画分
、もしくは免疫沈降物のような生化学的画分を選択的に分析するために使用され
うる。さらに、これらの方法は、異なる細胞状態にある発現タンパク質における
差異を分析するために使用されうる。例えば、本明細書における方法および試薬
は、癌のような疾患状態、特にプロファイルを示す、1つまたは複数の活性タン
パク質の存在または欠如の検出のための診断アッセイで使用されうる。ABPは、
通常少なくとも5個、さらに通常少なくとも約10個の異なる標的タンパク質を結
合する、単独のABPであり得るか、もしくは同じ数または少ないタンパク質に結
合するABPの混合物であり得、関連または非関連タンパク質に結合しうる。通常
、混合物はプロファイルが複数の標的タンパク質を含み、個々のまたは群の関連
タンパク質を包含する、約2〜20個、さらに通常2〜15個の異なるABPを有する。
通常、少なくとも10個の異なるタンパク質、さらに通常少なくとも約15個の異な
るタンパク質に対する結合の能力があり、タンパク質の数は、20個以上であって
よく、少なくとも1個のABPは、少なくとも約5個の異なる標的タンパク質に対す
る結合の能力がある。
【００８７】 本発明のABPは、同じかもしくは異なる種から得られるクラスの構成要素を単
離および同定するために使用されうる。中性ABP(そのクラスが、少なくとも約15
個の構成要素、さらに通常少なくとも約20個の構成要素を示し、通常少なくとも
10個の構成要素に結合できる場合、単独の種のクラスの構成要素の半分を超える
中で、明らかには区別しない)について、結合する構成要素の生理学的試料にお
ける利用可能な結合活性を決定することができ、新たな構成要素を単離でき、そ
のような阻害が、関心対象であるそのクラスの構成要素の活性を阻害しうる。親
和性標識の場合には、標的タンパク質のタンパク質組成における利用可能な活性
を決定することができ、タンパク質組成の特性での標的タンパク質およびそのク
ラスの他の構成要素、例えば細胞もしくは溶解物の間の活性を区別し得て、種々
の刺激に応答して、組織、細胞もしくは溶解物についてのタンパク質活性プロフ
ァイルを得ることができ、標的タンパク質に対するそれらの結合親和性について
化合物のスクリーニング、例えば薬物スクリーニングをしうる(酵素が標的タン
パク質の特定の例示であり、酵素のクラスが一次標的であることを理解するべき
である。その程度まで、酵素は標的タンパク質のクラスの規範であり、以下例を
示し、標的を限定しないものとみなす)。
【００８８】 この方法で、プローブを、標的クラスのタンパク質の検索、単離および同定、
診断および開発中の療法で使用することができ、組み合わせライブラリーが標的
タンパク質の標的部位について親和性を示す標的化合物を設計する。
【００８９】 酵素については、調節、細胞活性、外部刺激に対する応答などにおけるそれら
の役割のため、活性でない酵素を含みうる総酵素と異なるように、組成、例えば
細胞における酵素活性を決定することができ、どのように酵素活性が細胞の状態
における刺激および／または変化に関連して変化するかを決定できることについ
て、特に関心が持たれる。酵素もしくは他のタンパク質の活性型との反応には、
標的酵素属に少なくとも相対的に特異的である官能基を使用することが望ましい
。相対的に特異的とは、その属での標的酵素以外のタンパク質の、20％未満、通
常10％未満は、官能基と反応することを意味する。等しく重要なのは、選択的に
は官能基が、望ましくは25％未満で、野生型活性部位以外で、特に不活性タンパ
ク質と反応しないことである。本出願に記述される方法は、活性部位の活性依存
性標識からこの非活性部位標識を区別するために使用される。
【００９０】 多くの酵素属について、官能基は、他の属の酵素、特に非酵素的タンパク質お
よび異なる反応性部位を有する酵素と明らかには反応しないことが知られている
。官能基が、不活性標的酵素と反応しないことも望ましい。不活性状態には、1)
例えばタンパク質の開裂を必要とするプロ酵素；2)内在性阻害剤によって結合さ
れた酵素(共有または非共有のいずれかで)；3)活性状態への変換のための不活性
状態での酵素(例えば、別のタンパク質の結合、コンビナトリアル変化、リン酸
化/還元/酸化/メチル化/アシル化(例えば、ギ酸または酢酸)による共有結合修飾
を必要とする酵素)；4)変性酵素；5)突然変異体酵素；6)可逆性または不可逆性
のいずれかの外因性阻害剤によって結合された酵素；および7)活性について補因
子を必要とする酵素が含まれる。目的の酵素は、通常、酵素反応の触媒に関与し
た活性部位の構成メンバーとして、セリン、スレオニン、システイン、ヒスチジ
ン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸の内の少なくと
も1つを有する。これらのアミノ酸の1つまたは複数の官能基は、ABPの標的であ
りうる。不活性酵素が不活性化される手段は、活性および不活性状態の間のABP
の結合における差異を強調するために選択される。しかし、目的の方法を実行す
る過程で、外因性不活性化剤が、タンパク質試料に添加され、対照に比べた試料
の標的タンパク質活性プロファイルに対するこの処理の効果(試料中には外因性
不活性化剤が存在しない)が測定され、この阻害剤により標的タンパク質(すなわ
ち、不活性化された)の形態、量および同一性に関する知識が得られる。
【００９１】 酵素は、一般に、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ
、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼを含む6種の主要クラス内に入る。本
明細書に例示される特定の態様では、対象の酵素基は、ヒドロラーゼのクラスを
含む。そのクラスの1つの属は、セリンヒドロラーゼであり、それは、プロテア
ーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシンのような亜属、アセチルコリンエステ
ラーゼ、チオエステラーゼのようなエステラーゼ、FAAHおよびアシルペプチドヒ
ドロラーゼのようなアミダーゼ、リパーゼ、レシチン：コレステロールアシルト
ランスフェラーゼのようなトランスアシラーゼを含む。別の亜属は、カスパーゼ
、カテプシンおよびパルミトイルアセチルトランスフェラーゼのようなシステイ
ンヒドロラーゼである。別の亜属は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(「MMP
」)、例えばMMP1-13、膜型メタロプロテイナーゼ、アミノペプチダーゼおよびAD
AMアリシンを含むメタロヒドロラーゼである。さらに、アルカリホスファターゼ
、酸ホスファターゼ、タンパク質チロシンホスファターゼ、およびセリン/トレ
オニンホスファターゼのようなホスファターゼである。さらに含まれるのは、GT
PアーゼおよびATPアーゼである。ヒドロラーゼ以外には、チロシンキナーゼ、例
えばsrc、ablおよびlck、セリン/トレオニンキナーゼ、例えばMAPキナーゼ、MAP
Kキナーゼ、CAMキナーゼ、タンパク質キナーゼCおよびカゼインキナーゼのよう
な酵素を含むキナーゼである。さらに、関心対象は、シトクロームP450sのよう
なオキドレダクターゼ、アミノオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、AL
DH1、ALDH2、ALDH3のようなアルデヒドデヒドロゲナーゼ、デサチュラーゼなど
である。関心対象の他のタンパク質には、HLA抗原のような受容体、ホルモン受
容体、Gタンパク質結合受容体、イオンチャンネル、転写因子、タンパク質阻害
剤などが含まれる。
【００９２】 ABPが結合する酵素および／または部位は、例えば親和性マトリックスを用い
て酵素を単離すること、質量分析法によってそれを特性決定すること、酵素を単
離および配列決定すること、もしくは酵素をタンパク質分解的に断片化し、その
画分を特異的酵素についてのプロファイルとして測定すること、電気泳動分離お
よびウエスタンブロッティング、もしくは酵素に特異的な標識抗体を使用した免
疫アッセイのような多様な従来の方法で同定されうる。結合が決定される条件は
、一般に、緩衝液濃度が一般に約50〜200mMの範囲にあり、各活性酵素の濃度が
一般に約0.01pg(ピコグラム)/mlから0.1mg(ミリグラム)/mlまでである緩衝溶液
を用いて、穏やかな条件、好都合には周囲条件である。酵素結合に十分な時間の
後、非特異的に結合した酵素は、洗い流され得る。結合親和性のレベルを決定す
るために、塩濃度、有機溶媒、温度などを上昇させることによって、ストリンジ
ェンシーを増す条件を使用することを望みうる。様々のレベルの親和性での配列
の比較により、親和性配列を容易に最適化させうる。この方法で、1つまたは複
数の親和性部分のライブラリーが開発され、ABPの他の構成要素と結合して使用
されうる。親和性部分のレパートリーを有することによって、特定の環境で最も
少ない量のバックグランドを与える特異的親和性部分が選択されうる。例えば、
1つの親和性部分は、同じ属の他の酵素の特定のバックグランドにおける標的酵
素にとって、好ましいかもしれない。
【００９３】 ABPと活性タンパク質の間の結合体は、多数の異なる方法によって検出および
分析されうる。ウエスタンブロッティング分析の場合、従来の条件が使用され、
反応停止は、従来の反応停止媒体、例えば2×SDS-PAGE充填緩衝液(還元)で行わ
れ、80℃で5分〜10分間、加熱した後、SDS-PAGEゲル(8％〜14％アクリルアミド)
にかけうる。電気ブロッティングにより、ゲルからニトロセルロース紙にタンパ
ク質を移行させた後、ブロットを、1)15分〜60分間、TBS-Tween中3％無脂肪ドラ
イミルクでブロックし；2)結合体形成のために十分な時間(1時間〜2時間)の間、
アビジン-酵素結合体、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ(リガンドまたは様々
のリガンドについての他の受容体酵素結合体として、ビオチンを使用)でインキ
ュベートし；3)TBS-Tweenで洗浄して、非特異的に結合した受容体酵素結合体を
除去し；4)検出可能なシグナルを産生するために適切な酵素基質で処理し；5)標
的に結合したABPのブロット上の部位を検出する。種々のタンパク質試料の中で
特異に発現した酵素活性の定量化は、Alfa Imager 2000(AlphaInnotech)を用い
た膜密度測定法によって実施する。または、Lumi-Imager(Roche)のような化学発
光検出システムを用いてブロットを分析してもよい。
【００９４】 他の分析技術には、リガンドによる表面への結合体の結合が含まれる。標識と
結合された、1つまたは群の酵素に特異的な結合化モノクローナル抗体が添加さ
れ、その抗体が、表面に結合する任意の標的酵素に結合する。それにより、酵素
の存在および量は、標識によって測定されうるが、ここで標識は、蛍光標識もし
くは酵素標識であり、酵素産生物は、検出可能なシグナル、例えば蛍光を発する
。他の技術には、受容体から結合体を放出すること、蛍光受容体を添加すること
、そして酵素を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用することが含まれ
る。
【００９５】 最小の活性または部分的活性も測定が可能である。これは粗試料に見られるタ
ンパク質活性のビオチン(もしくは受容体に結合する他の化合物)シグナルを、十
分にビオチニル化されたタンパク質標準によって産生したものと比較することに
よって、行うことができる。例えば、精製活性セリンヒドロラーゼを選び、適切
なABPとを完了まで結合させる。その結果さらなる酵素活性は生じない。それに
より、この結合酵素を使用して、同じABPと結合された粗プロテオームをも含む
ゲルブロット上でのシグナルの標準曲線を作成する。そのシグナル強度が、例え
ば10ngの標準酵素のシグナル強度と適合する粗プロテオーム中でのタンパク質活
性は、プロテオーム中の10ngの活性酵素を最小限表すと考えられる。速度論およ
びプローブ濃度依存性アッセイを行うことによって、酵素が部分的にのみ活性で
ある平均の部分活性をさらに測定することができる。
【００９６】 試料中に存在する所定のファミリーの活性タンパク質を、定量的に比較する2
つの試料については、以下の方法が使用できる。各試料の一部を、その部分の活
性タンパク質を不活性化するように処理する。次いで、活性および不活性試料の
タンパク質部分を、同じABPの同位変異体(例えば、1つの変異体は、5〜10個の水
素(軽プローブ)を含み、不活性部分に使用され、二次変異体は、重水素(重プロ
ーブ)で置換されたこれらの5〜10個の水素を有し、活性部分に使用される)で処
理する。十分な反応時間の後、各試料の不活性および活性部分は、それらの個々
のABPから(例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーによって)分離され、合わせて
混合試料を形成し、この混合試料は、プロテアーゼ(例えば、トリプシン)で消化
されて、ペプチドの混合物を作成する。これらのペプチドは、その後、親和性支
持体で処理されて、ABP(例えば、アビジンは、プローブのタグがビオチンである
場合に親和性支持体である)と共有結合でタグ付けされたペプチドを選択的に単
離する。その後、単離されたペプチドは、液体クロマトグラフィー処置(例えばH
PLC)によって、選択的に分離され、質量分析法により特徴づけられる。活性タン
パク質を表すABPタグ付きペプチドは、軽プローブよりも大幅に過剰な量が重プ
ローブに結合された(例えば、質量イオン存在量で少なくとも3倍)ものとして定
義される。これらのペプチドの分子配列を、縦列質量分析法によって測定し、AB
P標識付のペプチドが誘導される、活性タンパク質の同一性を得ることができる
。この第一の手順により、試料中に存在し、かつ活性である所定のタンパク質フ
ァミリーの構成要素を決定する。活性試料の2つのタンパク質部分は、次いで、
重プローブおよび軽プローブで処理され、上記のとおり加工される。活性タンパ
ク質活性のレベルは、個々のペプチドの重プローブおよび軽プローブ結合型に対
応する、質量イオン存在量を比で示すことによって、2つの試料から定量的に比
較される。第一の手順による測定で活性タンパク質を表すペプチドのみが、この
方法で比較される。同時に2つ以上の試料を分析するには、同じ方法も使用でき
るが、活性に基づくプローブの固有の同位変異体が、追加される各試料ごとに必
要となる。
【００９７】 ABPとして特に興味深いものは、ビオチン連結フルオロホスホネートのような
標識フルオロホスホネートである。
【００９８】 大部分について、化合物は、以下の式の範囲内である： X-L-R-(O)m-P(O)(OT)-F (式中、 F、PおよびOは、フルオロ、ホスホおよびオキシの通常の意味を示し； Xは、リガンド(検出可能な標識を含む)であり； Lは、連結基であり； Rは、少なくとも2個の炭素原子、通常少なくとも4個であり、16個以下の炭素
原子、通常約12個以下の炭素原子の脂肪族基であり、通常直鎖アルキレンまたは
アルキレンオキシ(ここでアルキレン基は、2個〜3個の炭素原子からなる)であり
、飽和または不飽和であり、通常不飽和の2以下の部位を有し； mは、0または1であり；かつ Tは、1個〜6個、通常1個〜3個の炭素原子からなる)。
【００９９】 大部分で、リガンドは、ビオチンまたはその誘導体、例えばデイミノビオチン
またはジチオビオチンであり、検出可能な標識は、蛍光化合物、例えばフルオレ
セイン、ローダミン、テキサスレッドなどでありうる。
【０１００】 さらに興味深い化合物は、以下の式の範囲内である： X-L-SO2-R (式中、 Xは、リガンド(検出可能な標識を含む)であり； Lは、連結基であり； Rは、置換もしくは非置換のアリールもしくは1個〜2個の窒素原子を有する5個
〜12個の炭素原子の複素環基であり、ここで置換基は、ハロ、ニトロ、シアノ、
オキシ、チオ、アミノなどでありうる) いくつかの例では、1個〜20個、通常1個〜12個の炭素原子のアルキルおよび置換
アルキルを使用することもできる。
【０１０１】 特に目的興味深いものは、連結基が、ジカルボキサミド-α、α-アルキレンを
包含し、特に天然にカルボキシル基を含むビオチン(その誘導体を含む)が使用さ
れる化合物である。アルキレンは、一般に、約2個〜6個の炭素原子からなり、長
さは、望ましくは、その個々の受容体に対するリガンドの結合およびスルホネー
トの反応の妨害に関係しない。
【０１０２】 リガンドは、セリンヒドロラーゼに対する対象化合物の結合に干渉しない、任
意のリガンドであってよく、比較的少量で、約1kDalより少なく、しばしば約500
Dalより小さいことが多く、適切な受容体を有し、合成により入手しやすい。ビ
オチン、デチオビオチン、デイミノビオチン、ジゴキシン、2,4-ジニトロフェニ
ル、およびそれの誘導体、フルオレセインのような多くの一般的なリガンドがあ
る。これらのリガンドは、ビオチンおよびデチオ-またはデイミノビオチンにつ
いては、ストレプト/アビジンのような強力に結合する天然の受容体を有し、列
挙された残りのリガンドについては抗体を有する。いくつかの場合は、本発明の
阻害剤に結合したセリンヒドロラーゼを、受容体から放出することが望ましい。
有用な対は、ビオチンに置換されうるデチオビオチンまたはデイミノビオチンで
ある。
【０１０３】 対象化合物は、α,ω-(ハロもしくは偽ハロ)アルケンを用いて製造されうる。
ここでハロもしくは偽ハロ基は、トリアルキルホスフィットに置換され、続いて
オレフィンはカルボキシもしくはアルデヒドへ選択的に酸化される。活性化カル
ボキシ、例えばN-スクシンイミジルエステルもしくはカルボジイミド無水物は、
アミノ基で終結する連結基に結合する、リガンドもしくは検出可能な標識と反応
させアミドを形成することができる。アルデヒドは、イミンもしくはシッフ塩基
を形成することによって、もしくは還元的アミノ化によってアミンに結合させ、
アルキル化アミンを形成しうる。リガンド以外に、対象化合物は、30個未満の炭
素原子、通常25個未満の炭素原子を有する。リガンドもしくは検出可能な標識を
アルキルフルオロリン酸基、一般にアミド、オキシ、チオ、ウレア、チオウレア
など天然の官能基に繋げる鎖には1以上の官能基があってよく、かつ好ましい。
【０１０４】 対象化合物は、セリンヒドロラーゼのセリンヒドロキシルに結合される場合、
生じる阻害された酵素は、以下の式を有する可能性がある： X-L-R-(O)m-P(O)(OT)-SH (式中、記号は全て、ホスフェートに対する活性部位のセリン基に結合されたセ
リンヒドロラーゼであるSH以外は、以前に定義されたものである。)
【０１０５】 公知のセリンヒドロラーゼには、脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)、カリクレ
イン、アシルペプチドヒドロラーゼ、プロステート特異的抗原、コリンエステラ
ーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、ホスホリパーゼ
、シグナルペプチダーゼ、アミダーゼ特性酵素(amidase signature enzyme)、プ
ラスミノーゲンアクチベーター、プロホルモン・コンバターゼ、グランザイム、
セプラーゼ、ジペプチジルおよびトリペプチジル・ペプチダーゼが挙げられ、通
常、哺乳類供給源、特にヒトに由来するが、他の供給源、植物、鳥類、無脊椎動
物、真菌などを含む原核生物および真核生物の両方から由来しうる。
【０１０６】 対象阻害剤は、多様な方法で使用されうる。1つの用途は、生理学的試料の酵
素(例えばセリンヒドロラーゼ)の活性を測定することである。試料は、血液、細
胞、組織もしくは他の目的とする生理学的試料でありうる。ある状況では、1つ
のセリンヒドロラーゼを有することが予測される試料をモニターしてもよい。こ
こではセリンヒドロラーゼタンパク質の遺伝子操作の場合と同様、合成の効率が
関心の対象となりうる。組織もしくは細胞の場合に、細胞は、ホモジナイザー、
混錬装置、ペレット、遠心装置もしくは他の都合のよい装置を用いて、従来の条
件に従って溶解されうる。生じる溶解細胞組成物は、遠心分離してもよく、上清
は、タンパク質含量について調節される。リガンドの特性によって、上清画分は
、天然に存在するリガンドおよび／または受容体を含まない可能性がある。上清
は、適宜、さらに処理され、緩衝液を添加し、さらに希釈し、クロマトグラフィ
ーなどにより分画しうる。分画された場合、個々の画分は、アッセイに使用され
る。
【０１０７】 特に、特定のまたは関連する酵素群を阻害するための、酵素不全を含む適応症
に関連した治療剤として使用されるべき候補化合物は、1つまたは複数の関連酵
素を用いて反応混合物を作成し、阻害の速度における影響を監視することによっ
て監視されうる。1つまたは複数の対象化合物および候補化合物を添加し、その
後、適量を単離し、酵素活性について適量を分析するか、もしくは結合酵素を単
離し、結合セリンヒドロラーゼを分析することによって、阻害の速度を監視する
。
【０１０８】 試料は、一般に、約0.1〜5μg/ml、さらに通常0.5〜2μg/mlのタンパク質を有
するように調節され、それを上回る量は不要である。試料は、トリス、HEPES、
ホスフェートなどの従来の緩衝液に添加することもできる。所望のpHを示す化学
的生物学的に不活性な緩衝液のほとんどを使用できる。セリンヒドロラーゼに対
するABPは、フルオロリン酸化合物であり、それは、乾式混合されるか、もしく
は好ましくはアッセイの条件下で化学的、生物学的に不活性である水混和性極性
有機溶液として混合される。エタノール、DMSO、DMFなどが使用されうる。通常
、過剰のABPは、公知の場合は実際の酵素濃度、または総タンパクに基づいて概
算された酵素に基づいて、一般には少なくとも約2倍過剰に、通常、少なくとも
約5倍過剰に使用され、実質的に全ての利用可能な標的酵素が反応したことを確
実にする。混合物は、慣例的に、約10分以上、通常約1時間以下インキュベート
される。反応は、その後、任意の都合のよい消失剤を用い、特に高温で終息させ
ることができる。生じた変性組成物は、その後、例えばキャピラリー電気泳動(
微量流動装置)、ゲル電気泳動、HPLC、質量分析法(MALDI)、ウエスタンブロッテ
ィングなどを用いて分析してもよく、ここで画分は、リガンドなどによって観察
されうる。電気化学的および化学発光も使用されうるが、リガンドは、検出可能
なシグナル、通常蛍光を発するか、リガンドは、標識受容体と反応し、かつリガ
ンド-受容体結合体として検出されうる。受容体は、着色もしくは蛍光産物を生
じる酵素と結合されうる。この目的のために知られる多くの酵素があり、例示的
な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、G6PDH、MDH
、アルカリ性ホスファターゼ、リソザイムなどが含まれる。多くの場合に、市販
の基質を検出用に使用できる。
【０１０９】 示されるとおり、目的の化合物に結合したタンパク質は、電気泳動もしくは独
立の画分を与える他の技術によって分離されうる。異なる画分の量が、シグナル
を定量化することによって時間と共にどのように変化するかを知るために時間的
経過を見ることができる。関心のある酵素構成要素の各々の1つまたは複数のエ
ピトープに特異的な抗体を使用することによって、関連酵素の群の特異的構成要
素をも測定することができる。タンパク質を別々のバンドに分離した後、その電
気泳動バンドは、標識抗体と反応させうるが、その標識は対象化合物の標識とは
異なり、異なる波長での蛍光、蛍光と比較した電気化学検出(シグナル)、化学発
光など、区別のつくシグナルを生じる。
【０１１０】 特に興味深いことは、1つまたは複数のプローブとの標的タンパク質、例えば1
つのファミリーのタンパク質のプロテオームとの反応速度に関し、候補化合物に
より阻害の反応速度実験を行うことである。それにより、選択された時間で、結
合体形成の量が、なお変化し続ける条件を選択することができる。その結果、結
合体の量は、候補化合物の提供する量で変化する。このようにして、標的タンパ
ク質が、候補化合物で飽和されうる、候補化合物の結合親和性を得ることができ
る。結合体形成量が、候補化合物の量に関連する条件下で、候補化合物を、一定
量のプロテオームおよびプローブ(類)と所定の濃度で合わせる。選択される条件
は、可能な限り生理学的に近いものであるか、または候補化合物の存在下での、
異なる標的タンパク質の結合体との反応の間に広範な区別を提供する他の条件を
選択してもよい。温度、pH、添加剤などのような変化は、候補化合物の生物活性
に与えるそれらの影響について評価することができる。タンパク質混合物に存在
する、候補化合物のタンパク質への無差別な結合を避ける条件を選択しうる。候
補化合物の反応性が最小化され、その後、候補化合物の活性を高める適切なパラ
メーターを変化させる条件が、選択されうる。候補化合物の様々な濃度で、プロ
ーブの反応速度を測定することにより、標的タンパク質の各々に関する候補化合
物のK1が測定されうる。
【０１１１】 反応混合物からアリコートをとり、時間と共に反応を追跡し、そのアリコート
をクエンチすることによって、さらなる反応が起らないようにすることができる
。または、全ての反応がクエンチされる特定の時間を選択することができる。ク
エンチは、加熱、プローブと反応する反応性試薬、試薬からのタンパク質の分離
、反応を終結させるよう別の条件を変更することなどにより、実施できる。各標
的タンパク質に対する結合体の量が、次に測定される。検出可能なシグナルを示
すプローブを使用し、個々に標的タンパク質を単離し、例えば、個々の標的タン
パク質に特異的な抗血清もしくはモノクローナル抗体を使用することにより、候
補化合物の少なくとも2つの異なる濃度で、標的タンパク質の各々についての結
合体の量を測定することができる。候補化合物の様々な濃度での複数の測定によ
り、候補化合物の濃度での変動と共に、標的タンパク質の各々についての結合体
形成における変動をグラフ化しうる。これは、複数のタンパク質、特にタンパク
質ファミリーの関連タンパク質に対する、候補化合物の阻害効果における変動の
三次元分析を提供する。この方法で、わずかな反応速度論的測定で、複数の標的
タンパク質に対し、都合よくは、溶解物のような複合体プロテオームの存在下で
候補化合物の阻害活性のプロファイルを得る。分析は、候補化合物の阻害効果を
示すのみならず、阻害効果に対する他のタンパク質の効果をも示す。このように
して、候補化合物の各濃度について、複雑な環境下で複数の標的タンパク質の各
々についての結果を得る。抗体チップを有することにより、所定の領域での標的
タンパク質のための抗体の各々について、反応停止させた反応混合物を、チップ
と接触させ、検出可能なリガンドにより各部位で結合体の量を測定することがで
きる。
【０１１２】 タンパク質標的の特性に関する情報、プローブが1つまたは複数の異なる組の
条件下で、所定の標的およびプローブ濃度で結合する程度、結合プロファイルで
の作用物質の効果、および結合する異なる構造の比較は、全てデータプロセッサ
ーに付与されて、データの分析および比較ができる。したがって、プローブの1
つまたは群を用いたプロテオーム・プロファイルにおける変化を評価する上での
目的システム、もしくはプローブ結合における作用物質の効果は、生理学的活性
を示す公知化合物および目的の方法によってスクリーニングされた、候補化合物
との比較のために開発されたデータプロセッサーおよびデータバングで分析され
うる。アッセイの結果は、新たな化合物を設計し、現存の化合物を修飾し、細胞
のプロテオームプロファイルにおける薬剤の効果を推定するための基礎としての
役割を果し得る。
【０１１３】 所望の情報によって、様々なデータバンクが使用される。医薬品の開発に関連
したデータバンクは、標的タンパク質ならびに他の関連タンパク質のABPプロフ
ァイルにおける候補化合物の効果を包含する。さらに、データバンクとしては、
ABPプロファイルでの異なる化合物の構造および組成における多様性の効果が含
まれる。さらに、データバンクには、標的タンパク質に対する結合に影響を及ぼ
す化合物についての非関連タンパク質との共通の交差反応性が含まれる。
【０１１４】 開発された情報は、データプロセシングを用いて、多様な方法で使用されうる
。組み合わせライブラリーは、標的タンパク質の活性部位に結合する医薬品の設
計を可能にする。どの構造における多様性が、ABPの結合親和性を増強または減
少させるかを決定することにより、活性親和性基の空間配座を定義し、親和性を
減じる修飾を同定するアルゴリズムを使用しうる。この情報をデータプロセッサ
ーに導入すれば、活性部位に適合する空間配座が示され、表面上の変化分布を定
義するためにも使用することができる。1つまたは複数の最適化された立体配座
および変化分布は、その後、プローブの親和性部分として使用され、親和性が測
定されうる。最適化プローブは、個々に、もしくは競合様式で使用されて、活性
部位について相対的親和性を決定しうる。この情報は、その後、データプロセッ
サーによって分析され得て、それにより所望の構造はさらに精密にされる。この
ようにして、医薬品は最適な結合親和性について迅速に設計されうる。
【０１１５】 プロテオームを分析する上でプローブを用いて開発された情報は、細胞の状態
に関連して組織化されうる。活性関連酵素の分布は、特に細胞の状態に関係があ
り、その結果、それにABPが結合する活性タンパク質の各々の量のプロファイル
を得る。情報は、細胞の状態とタンパク質プロファイルとの間の比較に有用であ
り、ここで状態は他の手段によって確立される。データバンクは、その後、プロ
ファイルを、疾患状態の治療の基礎に関連させる役割を果たす。癌が具体例であ
る。癌がいかに攻撃的であるか、転移するのはどの段階であるか、癌がどのよう
に様々な治療、例えばホルモン治療、化学療法、放射線療法などに反応するかを
知るのは大変興味深い。タンパク質プロファイルと細胞状態の間に相互関係があ
れば、タンパク質が疾患経路に直接的に関与することが示されない場合でさえ、
タンパク質プロファイルを得ることによって、細胞の状態の迅速な測定が可能に
なる。さらに、タンパク質プロファイルにおける変化を監視することによって、
疾患の経過を追跡しうる。プロファイルに関する情報は、タンパク質プロファイ
ル、状態および成果のデータバンクを有するデータプロセッサーに採り入れられ
る。プロファイルの現存のバンクとプロファイルを比較すること、特に時間およ
び治療と、プロファイルにおける変化を比較することにより、治療の効率を評価
して、成果のいっそう確かな評価を達成することができる。
【０１１６】 システムを使用する上で、タンパク質の様々な関連群から1つまたは複数のプ
ロファイルを測定するための上記方法を使用して、初期結果または生データを得
る。タンパク質の関連群へのABPの結合に基づいて、各個々の標的タンパク質の
量および、選択的に、標的タンパク質に結合した関連群中でのタンパク質の総量
を得て、相対的存在量を提供することができる。個々の量および総量を得る場合
、各標的タンパク質についての相対的存在量を得ることができ、それが、関連タ
ンパク質の全ての群で一貫している効果を減じ、個々のタンパク質について観察
された値に影響する。次に、この情報をプログラムされたデータプロセッサーで
処理することができ、データプロセッサーは、測定のための目的に関連する情報
でプログラム化することができる。標的タンパク質の絶対量および／または相対
的存在量を、標準が修正される他の実験で得られた結果と比較するプログラムを
使用する。標準は、標的タンパク質および／または相対的存在量に対する公知の
薬剤の効果、2つの細胞型、例えば正常なもしくは新生物の、分化および非分化
の2つの異なる分化細胞、たとえばT細胞とB細胞、Th1とTh2、筋芽細胞と繊維芽
細胞、遺伝的に改変された細胞と野生型細胞などの間の差異を含むことができる
。したがって、標準は同じもしくは類似の試料における、単一の試験または複数
の同じ試験から得られる結果であってもよいし、または測定目的に関連した編集
データの複合体であってもよい。
【０１１７】 種々の方法およびアルゴリズムが、結果を分析し、その結果を解釈に有用な形
態で表すために使用されてきた。アイゼン(Eisen)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(
1998)95、14863〜14868(参照として本明細書に具体的に組み入れられる)は、結
果のグラフ表示と共に、標準統計的アルゴリズムを用いるクラスター分析の使用
を記載している。n個の属の任意の組に関して、全ての要素を1本の樹に組立てる
樹状図を使用することによって、全ての対の遺伝子について類似のスコアを含む
、上部の対角類似性マトリックスを記述された計量を使用して算出する。マトリ
ックスを走査して、最高値を同定する(遺伝子の最も類似の対を表す)。これらの
2つの遺伝子を結合して節を作成し、結合要素についての観察を平均化すること(
欠損した値は省略し、2つの結合要素を、それらが含む遺伝子の数によって重み
付けする)によって、その節について遺伝子発現プロファイルを算出する。類似
性マトリックスは、2つの結合要素を置換するこの新たな節で更新し、この過程
を、一つの要素のみが残るまで、n-1回繰り返す。このアルゴリズムのソフトウ
エア態様は、http：//rana.stanford.edu/clusteringにおいて、本発明者らから
得ることができる。
【０１１８】 順序付けは、遺伝子の重み付け、たとえば平均発現レベル、最大誘導の時間、
または染色体の位置に基づき、より低い平均重みの要素を最終的な順序の中で先
に配置した。表示は図形的に表し、変化のない遺伝子を黒く着色し、赤が強さを
増すにつれ対数がより正になり、緑が強さを増すにつれ対数がより負になるよう
に表した。
【０１１９】 結果を分析し、データを報告するさらなる方法については、米国特許第6,114,
114号および第6,132,969号を参照のこと。これらの技術は、種々のABPとの結合
のレベルの比較、候補薬物もしくは他の試薬の存在下での結合体形成のプロファ
イルにおける変動、および結合体プロファイルと疾患指示との間の関係を規定す
る上で、本システムに容易に適合させることができる。
【０１２０】 以下の非限定的な実施例を参照することにより、本発明をさらに詳細に記載す
る。
【０１２１】 実験 実施例 以下の実施例は、ビオチン標識すなわちタグを含むフルオロホスホネートに基
づくABPについての例示的な合成スキームを提供する。この「FPビオチン」ABPは
、決して制限するものではなく、単なる例示である。当業者は本明細書に記載さ
れたような他のABPを設計する標準的な方法を用いることができる。
【０１２２】 実施例1 化合物1は、図8におけるフローチャートに図示されたとおりの出発物質、テト
ラエチレンオキシ(3,6,9-オキサ-1,11-ジオールウンデカン)である。
【０１２３】 化合物2 DMF(8.0mL)中の1(3.9g、20.0ミリモル、3.0等量)の溶液をTBDMSCl(1.0g、6.64
ミリモル、1.0等量)およびイミダゾール(0.9g、13.3ミリモル、2.0等量)を用い
て処理してから、この反応混合液を12時間、室温で攪拌した。続いて該反応混合
液を飽和NaHCO3水溶液を用いて反応停止し、酢酸エチル(200mL)と水(200mL)との
間で分割した。有機層を乾燥(Na2SO4)するとともに洗浄し、減圧下で濃縮した。
クロマトグラフィー(SiO2、5×15cm、50〜100％の酢酸エチル-ヘキサン)により
無色のオイルとして2(1.1g、理論的には2.0g、55%)が得られた。1H NMR(CDCl3、
400MHz)δ3.8-3.5(m、16H、CH2OR)、0.88(s、9H、CH3C)、0.0(s、6H、CH3Si)。
【０１２４】 化合物3 ベンゼン(15mL、0.13M)中の2(0.61g、2.0ミリモル、1.0等量)の溶液をPPh3(2.
6g、10.0ミリモル、5等量)、I2(2.3g、9.0ミリモル、4.5等量)、およびイミダゾ
ール(0.7g、10.3ミリモル、5.2等量)で連続的に処理し、この反応混合液を30分
間、室温で攪拌すると、黄色-オレンジ色の異種溶液を生成した。該反応混合液
の可溶性部分を除去し、不溶性部分を酢酸エチルを用いて数回洗浄した。続いて
合わせた反応液と洗浄液を酢酸エチル(200mL)と飽和Na2S2O3水溶液(200mL)との
間で分割した。有機層をH2O(100mL)とNaClの飽和水溶液(100mL)を用いて連続的
に洗浄し、乾燥(Na2SO4)してから減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2
、5×15cm、5〜25％の酢酸エチル-ヘキサン)により無色のオイルとして3(0.54g
、理論的には0.82g、66%)が得られた。
【０１２５】 化合物4 トリエチルホスファイト(1.2mL、7.0ミリモル、5.4等量)を3(0.53g、1.29ミリ
モル、1.0等量)に添加し、この混合液を150℃で1時間攪拌した。反応混合液を室
温に冷却し、フラッシュクロマトグラフィー(SiO2、5×15cm、100％酢酸エチル)
に直接かけることによって無色のオイルとして4(0.43g、理論的には0.54g、80％
)が得られた。
【０１２６】 化合物5 CH2Cl2(2.8mL、0.18M)中の化合物4(0.21g、0.5ミリモル、1.0等量)の溶液を、
HF-ピリジン(0.084mL、〜0.84ミリモル、〜1.7等量)を用いて処理した。この反
応液を25℃で30分間攪拌し、続いて酢酸エチル(100mL)と水(100mL)との間で分割
した。有機層を乾燥(Na2SO4)してから減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(S
iO2、2×8cm、3〜10％のCH3OH-CH2Cl2)により透明オイルとして5(0.050g、理論
的には0.28g、32.5%)が得られた。
【０１２７】 化合物6 DMF(0.28mL、0.34M)中の5(0.030g、0.096ミリモル、1.0等量)の溶液を、N,N-
ジスクシンイミジルカーボネート(0.058g、0.22ミリモル、2.2等量)およびトリ
エチルアミン(0.035μL、0.25ミリモル、2.5等量)を用いて連続的に処理した。
この反応混合液を室温で12時間攪拌し、続いてCH2Cl2(100mL)とH2O(100mL)との
間で分割した。有機層をNaCl飽和水溶液(100mL)を用いて洗浄し、乾燥(Na2SO4)
してから減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2、2×8cm、1〜10％のCH3O
H-CH2Cl2)により無色のオイルとして5(0.035g、理論的には0.043g、81％)が得ら
れた。
【０１２８】 化合物7 CH2Cl2(0.14mL、0.40M)中の6(0.020g、0.044ミリモル、1.0等量)の溶液を0℃
に冷却し、塩化オキサリル(0.082mL、CH2Cl2中2M、0.164mM、3.7等量)を用いて
処理した。この反応混合液を室温にまで暖め、18時間攪拌した。続いて該反応混
合液を窒素ガス気流下で濃縮し、残った残渣をH2O(0.1mL)で5分間処理した。H2O
を窒素ガス気流下で蒸発させ、残った残渣を真空乾燥することによって、7(0.01
5mg、0.019mgの理論値、80％)が透明オイル/膜として得られた。
【０１２９】 化合物8 CH2Cl2(0.22mL、0.075M)中の7(0.007g、0.016ミリモル、1.0等量)の溶液を、-
78℃にした(ジエチルアミノ)三フッ化硫黄(DAST、0.007mL、0.048ミリモル、3.0
等量)を用いて処理し、この反応混合液を10分間攪拌した。続いてこの反応混合
液を酢酸エチル(100mL)とH2O(100mL)の間で分画し、有機層をNaClの飽和水溶液(
100mL)を用いて洗浄し、乾燥(Na2SO4)を行ってから減圧下で濃縮した。クロマト
グラフィー(SiO2、パスツールピペット、100％の酢酸エチル)により、透明オイ
ルとして8(0.003g、理論的には0.007g、42%)が得られた。
【０１３０】 EP-peg-ビオチン(9) DMF(0.1mL、0.07M)中の8(0.003g、0.007ミリモル、1.0等量)の溶液を5-(ビオ
チンアミド)-ペンチルアミン(Pierce、0.0035g、0.011ミリモル、1.5等量)に添
加し、反応混合液を4時間攪拌した。溶媒を窒素ガス気流下で蒸発させ、残って
いる残渣をジエチルエーテルと酢酸エチルで連続的に洗浄し、最小体積のクロロ
ホルムに溶解してからきれいなガラス容器に移し替え、溶媒を蒸発させた。この
段階を二回以上繰り返すことによって、所望のビオチン化生成物を過剰の試薬と
副産物から除去し、白色膜として9(0.0017g、0.0045gの理論値、38％)が得られ
た。
【０１３１】 1-[(p-トルエンスルホニル)オキシ]-10-ウンデセン(2) ピリジン(14.0mL、177ミリモル、15等量)中の1(2.0g、11.8ミリモル、1.0等量
)の溶液を0℃に冷却し、pTsCl(4.5g、23.6ミリモル、2.0等量)を用いて処理した
。この反応混合液を0℃で10時間維持し、続いて酢酸エチル(200mL)と水(200mL)
との間で分割した。有機層を10％のHCl水溶液(2×200mL)、NaCl飽和水溶液(200m
L)を用いて洗浄し、乾燥(Na2SO4)を行ってから減圧下で濃縮した。クロマトグラ
フィー(SiO2、5×15cm、2％の酢酸エチル-ヘキサン)により無色オイルとして2(3
.6g、理論的には3.8g、94%)が得られた。
【０１３２】 実施例2 FPビオチンの調製 FPビオチンは、リュー（Liu）ら(Proc. Natl. Acad. Sci. 96(26) 14694、199
9)によって記載されたように、また米国特許第60/195,954号および第60/212,891
号において記載されているように調製した。なおこれらの文献の全体が参照文献
として本明細書に組み入れられる。1-ヨード-10-ウンデセン(3)。アセトン(21mL
、0.5M)中の2(3.4g、10.5ミリモル、1.0等量)の溶液をNaI(3.2g、21ミリモル、2
.0等量)を用いて処理し、反応混合液を2時間還流して攪拌することによって黄色
-オレンジ色の溶液が生成した。続いて該反応混合液を酢酸エチル(200mL)と水(2
00mL)の間で分画した。有機層をNa2S2O3飽和水溶液(100mL)とNaCl飽和水溶液(10
0mL)を用いて連続的に洗浄し、乾燥(Na2SO4)を行ってから減圧下で濃縮した。ク
ロマトグラフィー(SiO2、5×15cm、1〜2％の酢酸エチル-ヘキサン)により無色オ
イルとして3(2.3g、理論的には2.9g、78%)が得られた。
【０１３３】 1-[ビス(エトキシ)ホスフィニル]-10-ウンデセン(4) トリエチルホスファイト(12.2mL、71ミリモル、10等量)を3(2.0g、7.1ミリモ
ル、10等量)に添加し、この混合液を還流して15時間攪拌した。過剰のトリエチ
ルホスファイトを蒸留して除去し、残った残渣をフラッシュクロマトグラフィー
(SiO2、5×15cm、25〜50％の酢酸エチル-ヘキサン勾配溶出)にかけることによっ
て4(1.30g、理論的には2.1g、62％)が無色のオイルとして得られた。
【０１３４】 1-(エトキシヒドロキシホスフィニル)-10-ウンデセン(5) CH2Cl2(4.0mL、0.3M)中の化合物4(0.31g、1.07ミリモル、1.0等量)の溶液に、
臭化トリメチルシリル(TMSBr、0.17mL、1.28ミリモル、1.2等量)を滴下して処理
した。この反応液を25℃で1時間攪拌し、5mLの5％[w/v]KHSO4で反応停止してか
ら5分間激しく攪拌した。続いてこの反応混合液を酢酸エチル(100mL)と水(100mL
)の間で分画し、オレンジ色の層をNaCl飽和水溶液(200mL)で洗浄してから乾燥(N
a2SO4)し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2、2×8cm、1％のNH4OH
水溶液を含む12〜20％のCH3OH-CHCl3)を行うことで透明オイルとして5(0.10g、
理論的には0.28g、36.2％、残っている塊のほとんどは出発物質として除去した)
が得られた。
【０１３５】 10-(エトキシヒドロキシホスフィニル)-デカン酸(6) CCl4-CH3CN-H2O(1.0mL-1.0mL-1.5mL、全量は3.5mL、0.11M)からなる二相溶液
中の化合物5(0.10g、0.38ミリモル、1.0等量)を、過ヨウ素酸ナトリウム(0.31g
、1.56ミリモル、4.1等量)と三塩化ルテニウム水和物(0.002g、0.009ミリモル、
0.22等量)で連続的に処理した。この反応混合液を25℃で2時間攪拌し、続いてCH
2Cl2(50mL)と1NのHCl水溶液(50mL)との間で分割した。有機層をNaCl飽和水溶液(
25mL)を用いて洗浄し、乾燥(Na2SO4)を行ってから減圧下で濃縮した。得られた
残渣をジエチルエーテル、40mL中に再懸濁し、セライトパッドを通して濾過して
から減圧下で濃縮することによって、6(0.09g、理論的には0.11g、83%)が無色の
半固体として得られた。
【０１３６】 FPビオチン、すなわち10-(フルオロエトキシホスフィニル)-N-(ビオチンアミド
ペンチル)-デカンアミド(7) CH2Cl2(0.4mL、0.06M)中の6(0.007g、0.025ミリモル、4.0等量)の溶液を、(ジ
エチルアミノ)三フッ化硫黄(DAST、0.021mL、0.10ミリモル、4.0等量)を滴下し
て処理し、25℃にしてから5分間攪拌した。続いてこの反応混合液を、反応液の2
分の1容量のN-ヒドロキシスクシンイミド(0.05g、0.25ミリモル、10等量)を含む
ジメチルホルムアミドを用いて処理し、さらに10分間、25℃で攪拌した。次にこ
の反応混合液を酢酸エチル(50mL)と水(50mL)の間で分画し、オレンジ色の層をNa
Cl飽和水溶液(200mL)で洗浄してから乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮することで1
0-(フルオロエトキシホスホニル)-N-(ヒドロキシスクシニル)-デカンアミド(未
精製の1H NMRによって判断されているように)が得られた。さらに精製すること
なくこの化合物は、MeOH(0.02mL)中の5-(ビオチンアミド)-ペンチルアミン(Pier
ce、0.0021g、0.062ミリモル、1.0等量)で処理し、10分間攪拌した。この溶媒を
窒素ガス気流下で蒸発させ、残っている残渣をジエチルエーテルと酢酸エチルで
連続的に洗浄し、最小量のクロロホルム中に溶解してからきれいなガラス容器に
移し替え、それから溶媒を蒸発させた。この段階を一度以上繰り返すことによっ
て望ましいビオチン化生成物を過剰の試薬と副産物から除去すると、白色膜とし
て7(0.011g、理論値0.0038g、29％)が得られた。
【０１３７】 FPビオチンとの反応のための組織試料の調製 ラットの組織をトリス緩衝液(50mM、トリス-HCl緩衝液、pH8.0、0.32Mのスク
ロースを含む)中でダウンス(Dounce)でホモジネートした。組織抽出物を1,100×
g(5分間)、22,000×g(30分間)、および105,000×g(60分間)で連続的に遠心分離
した。最終的な上清(サイトソル画分)を1mgのタンパク質/mLに調整し、それから
10分の1容量のアビジン-アガロース(Sigma)とともに4℃で30分間インキュベート
することで内因性のアビジン結合性タンパク質を枯渇させる。アビジンビーズを
ペレット化するために短時間遠心(10,000×gで2分間)させた後、得られた上清を
除去してから下記に記載されているようにFPビオチンで処理した。
【０１３８】 タンパク質試料とFPビオチンとの反応 別記して示さない限り、タンパク質試料とFPビオチン間の反応は以下のように
行なった。すなわち、CHCl3中のFPビオチン(0.4ナノモル)をガラス容器に添加し
、溶媒を窒素ガス気流下で蒸発させた。エタノール(7.5μL)をこの容器に入れ、
その直後にトリス緩衝液中の1μg/μLのタンパク質ストック、192.5μLを添加し
てから反応混合液を30分間、25℃でインキュベートした(FPビオチンの最終濃度
は2μMであった)。この反応混合液は、標準2×SDS-PAGE添加液(還元性)の一等量
容量を添加し、試料を5分間、80℃で加熱することによって反応停止した。より
長い時間(1時間)、または高濃度のFPビオチン(20μM)を用いて行なわれた反応は
、標識されているほとんどのタンパク質で強度の有意な増加を生じさせなかった
が、このことは大部分のタンパク質が報告された条件下で完遂するまで反応した
ことを示した。しかしながら高濃度のFPビオチンを用いた反応は、有意なレベル
の非特異的標識を示し始めた(予加熱した試料と加熱しなかった試料の両方にお
いてFPビオチンと反応した新規のタンパク質バンドの出現として定義された)。
【０１３９】 SDS-PAGE-ウエスタンブロット法によるFPビオチン反応性タンパク質の検出 反応停止したFPビオチン反応液をSDS-PAGE(10μgタンパク質/ゲルレーン)上で
流し、続いてニトロセルロース膜上に電気ブロットして転写した後、それを1％
のトウィーン(TBS-トウィーン)と3％(w/v)の無脂肪ドライミルクを含むTBS中で2
5℃で1時間か4℃で一晩のいずれかでブロッキングした。それからブロットを、1
％の無脂肪ドライミルクを含むTBS-トウィーン中のアビジン-西洋ワサビペルオ
キシダーゼ(HRP)複合体(BioRad、1:2000希釈)で、25℃で30分間処理した。この
ブロットをTBS-トウィーンを用いて3回洗浄(10分間/洗浄)し、スーパーシグナル
化学蛍光試薬(SuperSignal chemiluminescence reagents)(Bio-Rad)で処理を行
ってから現像する前に0.1分から8分間フィルムに露光した。非処理のシャーロテ
イン試料(Charotein samples)に対してSTI-処理した試料を比較するために、FP
ビオチン標識の相対量をアルファイメージャー(AlphaImager)2000(AlphaInnotec
h)を用いて膜密度分析装置によって見積もった。
【０１４０】 アビジン親和性精製による標的タンパク質の同定 ABPとともにタンパク質試料(0.5〜2.5mL、0.5〜1.0mg/mL)をインキュベートし
た後、この試料をトリスまたはリン酸塩緩衝液中で2.5mLに希釈し、過剰の未処
理のABPを除去するためにPD-10サイズ排除カラムに通した。タンパク質を3.5mL
の緩衝液でカラムから集め、SDSを用いて処理(最終濃度、0.5％)してから80℃で
10分間加熱する。続いて試料を2.5倍に希釈し、100マイクロリットルのアビジン
アガロースビーズ(Sigma)とともに室温で1〜4時間インキュベートする。次にこ
のビーズを数回に分けた容量で洗浄することで結合しなかったタンパク質を除去
し、ABP標識したタンパク質を100マイクロリットルの標準SDS-PAGE添加液を用い
て90℃で5分間かけて溶出させる。溶出させたタンパク質をSDS-PAGEゲル上に流
し、ABP標識したタンパク質を染色および／またはアビジンブロッティングによ
って同定し、ゲルから切り出した後でトリプシンで消化させ、それから得られた
ペプチド混合物をMALDIおよび／またはエレクトロスプレー質量分析法によって
特徴を明らかにする。このマススペクトルの情報をデータベース検索で用いるこ
とによって、ABP標識したタンパク質を同定できる。
【０１４１】 実施例3 FPビオチン反応性タンパク質の分子特徴 脳可溶性抽出物を、AKTA FPLC(Amersham Pharmacia Biotech)を用いてQセファ
ロースカラム上に載せ、0〜500mMのNaClを直線勾配で溶出した。溶出画分(10×2
.5mLの画分)の試料を上述したようにFPビオチンを用いて標識し、75kDおよび85k
Dの標識されたタンパク質を含むこれらの画分をプールしMono-Qセファロースカ
ラムに通した。タンパク質を直線勾配にした200〜500mMのNaClを用いてMono-Qカ
ラムから溶出させ、続いて二つの標識タンパク質を多く含む溶出画分をSDS-PAGE
にかけてから電気ブロット法によって二フッ化ポリビニリジン(PVDF)膜に転写し
た。75kDaおよび85kDaのFPビオチン反応性タンパク質を含むPVDF膜の領域を切り
出してトリプシンで消化させた後、得られたペプチドを、マトリックス支援レー
ザ脱離イオン化反応(MALDI)および曲線領域のレフレクトロン(curved field ref
lectron)を装着したクラトスコンパクトSeqインスツルメント(Kratos Kompact S
eq Instrument)でのMALDIポストソース分解飛行時間型質量分析法(Chaurandら(1
999) J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 10、91-103)によって分析した。MAlDIのペ
プチドデータはプロテインプロスペクトル(ProteinProspector)データベース(ht
tp://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/mshome3.2.htm)のMSフィット（MS-Fit）およびM
Sタグ（MS-Tag）検索で用い、それによってヒトのタンパク質配列KIAA0436にラ
ットの相同体としての75kDaのタンパク質と、アシルペプチド加水分解酵素（APH
)としての85kDaのタンパク質が同定された(図5参照)。
【０１４２】 HEK-293細胞におけるセリン加水分解酵素の発現 ラットAPH cDNAを次のようにクローニングした。プライマーを酵素のcDNA配列
に基づいて設計し(Kobayashiら(1989) J. Biol. Chem. 264、8892-8899)、ポリ
メラーゼ連鎖反応実験で用いて1.4kbの部分的cDNAクローンをラット肝臓の5'ス
トレッチプラスcDNAライブラリー(5' Stretch Plus cDNA library)(Clontech)か
ら増幅した。この増幅したcDNAをプローブに用いて、肝臓ライブラリーより全長
APHcDNAを単離した。APH cDNAを真核生物の発現ベクターであるpcDNA3にサブク
ローニングし、前述したようにHEK-293細胞に一過的にトランスフェクトした。
トランスフェクトした細胞をトリプシン処理によって収集し、ヘペス(Hepes)緩
衝液(125mMのヘペス、pH8.0、100mMのNaCl)を用いて洗浄してからヘペス緩衝液
中でダウンスでホモジナイズした。サイトソルと膜の画分を前述したように単離
し(GiangおよびCravatt(1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94、2238-2242)、上
述したようにFPビオチンを用いて標識した。
【０１４３】 ビオチン化フルオロホスホネート、FPビオチンの設計および合成 タグが付けられ、酵素のセリン加水分解酵素ファミリーに対する活性に基づく
プローブを作製するために本発明者らは、数個の候補反応性基と標識付けの戦略
を考えた。ギリン（Glynn）とその同僚らによる以前の仕事は、サリゲニンホス
ホラミデートが神経経路標的エステラーゼ(NTE)の強力な阻害剤であり、組織抽
出物に含まれるこのタンパク質を同定するためにビオチンタグを用いて合成でき
ることを証明した(Gylnnら(1994)301、551-556)。しかしながらこの阻害剤はこ
れらの実験においてNTEに対して顕著な特異性を示し、したがってあまりに選択
的であるためにセリン加水分解酵素に対する一般的なプローブとしては用いるこ
とができないと思われた。パワーズ（Powers）とその同僚らは、セリン加水分解
酵素阻害剤としてビオチンに結合したイソクマリン阻害剤を作製した(Kamら(199
3) Bioconjugate Chem. 4、560-567、Winklerら(1996) Mol. Immunol. 33、516-
623)。これらのイソクマリンが前述したサルゲニンホスホラミデートよりも範囲
の大きいセリン加水分解酵素と反応するのに対し、これらの化合物には、安定な
不可逆的阻害を達成するための酵素の活性部位にある第2の官能基をアルキル化
する必要性があることによって、有意の数のセリン加水分解酵素がそのような試
薬に対して感受性がないままであることが示唆された。対照的にFP阻害剤は、1)
主要なセリン加水分解酵素に対する反応性、および2)種々のクラスの加水分解酵
素の中でこの酵素ファミリーに対する選択性を示す二重の必要性を満足するよう
に思われた。放射性標識を施したFPは市販され入手可能であり、かつ本発明者ら
自身の合成の試み(Patricelliら(1999) Biochemistry 38、9804-9812)により入
手できるが、フルオログラフィーによってそのような試薬を検出することは数日
から数週間を必要とし(Patricelliら、前記、Keshavarz-Shokriらの(1999) Anal
. Biochem. 267、406-411)、そのことがセリン加水分解酵素発現および機能のプ
ロファイリングのために迅速で高感度のプローブとして一般的に使用することを
かなり制限する。
【０１４４】 10-ウンデセン-1-オール(1)(スキーム1からの番号)をトシレート中間体(2)を
経てヨウ素化化合物3に変換した(2)。還流条件下で3を過剰のトリエチルホスフ
ァイトと反応させると、ジエトキシホスホネート4が得られ、それは臭化トリメ
チルシリル(TMSBr)を用いて処理することによってエトキシヒドロキシホスホネ
ート5に変換した。6の二重結合は三塩化ルテニウムと過ヨウ素酸ナトリウムを用
いて酸化的に開裂させた(Carlsenら(1981) J. Org. Chem. 46、3k936-3938)と、
末端がカルボキシル酸の生成物6が得られた。6を過剰のジエチルアミノ三フッ化
硫黄(DAST)とN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いて処理するとN-スクシニ
ルフルオロホスホネート中間体が得られ、それが5-(ビオチンアミド)ペンチルア
ミン(NH2-ビオチン)と反応してFPビオチン(7)が生成した。この合成経路はまた
、蛍光のフルオロホスホネート、FP-フルオレセイン[8、MALDI-FTMS(DHB)m/z 77
8.2671 (C38H47FN3O8PS+Na+は778.2703を必要とする]を生成するフルオレセイン
カダベリンを含む他のレポーター群に6を容易にカップリングさせた。
【０１４５】 同様のスキームを、図4に示されたようなABPと同様に使用するためにビオチン
化スルホネートエステルを合成するために用いた。同様に図4は、VI型の配座が
十分定義されたスピロエポキシドの立体制御した合成法についての戦略を示して
いる(また、その全体が本明細書に参照文献として組み入れられるソーネンセン
（Sornensen）らの、Angew. Chem. Int. Ed.、1999、38:971-974も参照)。VI型
の化合物は、メタロプロテアーゼ(MetAp-2)阻害剤のフマギリンの類似体であり
、本明細書ではABPとして用いられる。
【０１４６】 実施例4 FPビオチンは、セリン加水分解酵素に対する活性に基づくプローブである。 セリン加水分解酵素に対する活性に基づくプローブとしてFPビオチンの利用性
を最初に試験するために本発明者らは、この試薬を哺乳動物のセリンアミダーゼ
、脂肪酸アミド加水分解酵素(FAAH)(Cravattらの(1996) Nature(London) 384k、
83-87)と反応させた。FPビオチンはFAAHの強力な不可逆性阻害剤として挙動し、
この酵素の他のFP阻害剤の性質と類似の性質を示す(Patricelliら、前記、Deuts
chらの(1997) Biochem. Pharmacol. 53、255-260)。本発明者らは、セリン残基2
41がFAAHの触媒性求核試薬として作用し、この残基がアラニンに突然変異(S241A
)すると不活性型酵素が生成することを示した(Patricelliら、前記)。したがっ
てFPビオチン(2μM)をFAAHとS241A突然変異体(80nM)の両方と10分間反応させ、
その後でこのタンパク質で、抗FAAH抗体または検出試薬としてのアビジンのいず
れかを用いて標準SDS-PAGE-ウエスタンブロット法を行なった(図1A)。抗FAAH抗
体はFAAHとS241A突然変異体の両方を同定したが、アビジンはFPビオチン反応に
おけるFAAHのみを検出し、このことはこの阻害剤が酵素の活性型と排他的に反応
することを示している。
【０１４７】 さらにFPビオチンの反応性をセリン加水分解酵素を用いて調べるために本発明
者らは、この阻害剤とともにラットの精巣の可溶性画分をインキュベートした。
この組織において見られるプロテアーゼの存在量(Monseesらの(1997) Adv. Exp.
Med. Biol. 424、111-123)と一致して、FPビオチンは10個を超える精巣タンパ
ク質を標識した。25〜40kDaの間で見出される高濃度の標識されたタンパク質を
伴い、20〜100kDaの範囲内の種々の分子量のホスホニル化タンパク質が観察され
、これはおそらくセリンプロテアーゼのカリクレイン族のメンバーを示していた
(MacDonaldらの(1996) J. Biol. Chem. 271、13864-13690)。重要なことである
が、FPビオチンを用いて処理を行う前にタンパク質試料を煮沸してほとんどすべ
てのタンパク質標識を遮断するが、これによってこのタグを付けた阻害剤が活性
依存的な様式でセリン加水分解酵素と反応することがさらに確認される。速度論
解析では、一分以内に完了することが明らかになるように標識されているより大
きなタンパク質のうちの二つと、数分の過程でよりゆっくりと反応するより小さ
なタンパク質のほとんどを用いて同定したセリン加水分解酵素が顕著に異なる速
度のFPビオチン反応性を示したことが明らかにされた。
【０１４８】 多くのセリンプロテアーゼが内因性の阻害タンパク質と不活性な複合体として
インビボで存在すること(Kato (1999) Hum Mutat. 13、87-98、Declerckらの(19
97) Adv. Exp. Med. Biol. 425、89-97、Monseesら、前記)を考慮して、本発明
者らは遊離のプロテアーゼと阻害剤結合性のプロテアーゼの両方と反応するFPビ
オチンの能力を比較した。FPビオチンは遊離のトリプシンと強く反応するが、タ
グをつけた阻害剤は、有意に大量のトリプシンの後の反応で存在するにもかかわ
らず、クニッツ（Kunitz）型のセリンプロテアーゼ阻害剤、大豆のトリプシン阻
害剤（STI)とともにあらかじめインキュベートしたトリプシン試料を標識しなか
った。このプロテアーゼ阻害剤の比較的広範な特異性と一致して、数個の、すべ
てではないFPビオチン反応性タンパク質はSTI-処理した試料において有意に低い
標識強度を示した。
【０１４９】 ひとまとめにするとこれらの結果は、酵素量に対して補正することなく酵素活
性が変わる特定の場合においてでさえも、FPビオチンがセリン加水分解酵素の機
能的状態での違いを検出できることを際だたせている。このような観察から、セ
リンプロテアーゼと阻害剤の複合性と多様性が細胞全体および組織試料に通常存
在することを考慮する場合、特定の有意性が得られる(Kato、前記、Declerck、
前記、Deutschら、前記)。FPビオチンのような活性に基づくプローブを用いるこ
となく、標準のゲノミクスおよび／またはプロテオミクスの研究はこれらの試料
に含まれる阻害剤結合性(不活性型)プロテアーゼから遊離物(活性型)を識別する
ことは困難であった。最後にFPビオチン標識の速度をモニターする能力は、セリ
ン加水分解酵素活性におけるかなり微妙な変化を同定する際に非常に役立つ。
【０１５０】 FPビオチン反応性タンパク質の分子特徴 未精製の組織抽出物においてFPビオチンによって標識されたタンパク質が実際
はセリン加水分解酵素であったことを証明するために、二つのホスホニル化タン
パク質をラットの脳のサイトソルから単離した。最も強く標識された脳タンパク
質は75〜85kDaの範囲内の大きさであり、300mMと450mMの間のNaClでQセファロー
スカラムから溶出した。Q溶出物に含まれるこれらのタンパク質の含有量を見積
もるために、FPビオチンを用いたそれらの標識の強度を、阻害剤を用いて完了ま
で反応させるFAAH試料の連続希釈液の強度と比較した。75kDaおよび85kDaの両方
のFPビオチン反応性タンパク質は、タンパク質の配列情報を得るために必要とさ
れる範囲内で十分なこれらのタンパク質の量に対しての制限がより低く設定され
ているFAAH(0.35ピコモル)の20ngの試料の強度に類似の標識強度を表示した。85
kDaおよび75kDaのタンパク質は、アシルペプチド加水分解酵素(APH)(Kobayashi
らの(1989) J. Biol. Chem. 264、8892-8899)、DIFPと反応することがわかって
いるセリンペプチダーゼ(Scaloniらの(1992) J. Biol. Chem. 267、3811-3818)
、およびヒトタンパク質配列KIAA0436のラットの相同分子種(Ishikawaらの(1997
) DNA Res. 4、307-313)のような標準のタンパク質化学技術によって同定された
。興味深いことに相同性検索は、KIAA0436タンパク質が前核性の酵素プロテアー
ゼIIと30％の同一性を共有することを示し、またDIFPと反応するセリン加水分解
酵素も確立した(Yoshimotoらの(1995) J. Biochem. 117、654-660)。プロテアー
ゼIIのSer-His-Asp触媒性三残基はKIAA0436タンパク質に保存されており、この
ことは哺乳動物のタンパク質がセリンプロテアーゼのプロテアーゼIIファミリー
の新規のメンバーであることを支持している。最終的にFPビオチンはまた、かな
り低レベル(FAAHの15フェムトモル、すなわち〜1ng)で発現すると思われる100kD
aの脳タンパク質を標識したが、このことは、このタグを付けた阻害剤がナノモ
ル以下の濃度のセリン加水分解酵素(ゲル1レーンあたり15フェムトモル/20μL)
を容易に検出できることを証明している(図5参照)。
【０１５１】 FPビオチンが未精製の細胞抽出物においてセリン加水分解酵素の発現レベルに
おける変化を記録できるかどうかを試験するために、本発明者らはHEK-293細胞
に、APHおよびFAAHの両方に対するcDNAをトランスフェクトした。これらの細胞
のサイトソルと膜の画分のFPビオチンを用いた処理を行うとAPHでトランスフェ
クトされた細胞において強くホスホニル化された85kDaのタンパク質が同定され
たが、空のベクターまたはFAAHのcDNAのいずれかを用いてトランスフェクトした
対照細胞では同定されなかった。この標識パターンと対照的に、完全な膜タンパ
ク質の場合のこのセリン加水分解酵素の以前の特徴付けと一致して、豊富な65kD
aのホスホニル化タンパク質がFAAHでトランスフェクトされた細胞の膜画分にお
いて排他的に同定された(GiangおよびCravatt、前記、Patricelliらの(1998) Bi
ochemistry 37、15177-15187)。偽トランスフェクトしたHEK細胞とFAAHでトラン
スフェクトされたHEK細胞においてサイトソルブロットをより長く露光させると
、この細胞型でAPHの内因性レベルを表示することができる85kDaの弱いシグナル
を同定した。
【０１５２】 要約するとこの示されたデータは、FPビオチンが1)未精製の細胞および組織試
料に含まれる非常に多くのセリン加水分解酵素と反応でき、2)セリン加水分解酵
素のナノモル以下の濃度を検出し、かつ3)これらの酵素の機能的状態と発現レベ
ルの両方における違いを記録できることを証明している。標準アビジン-HRP化学
発光アッセイ法を用いるFPビオチン標識したタンパク質の同定がきわめて迅速で
ある(秒から数分のみの露光時間を必要とする)ことを強調することも重要であり
、このことはこの化学物質を、高処理量のプロテオミクス研究のために特に十分
に適したものにする。さらにビオチン分子をホスホニル化セリン加水分解酵素に
共有結合することは、これらの酵素の続く生化学的特徴付けにおいて助けとなる
。例えばシュリーマー（Schriemer）と同僚らは、ビオチン化タンパク質とペプ
チドの化学分析を容易にするために固定化アビジンビーズをMALDI質量分析と組
み合わせた方法を最近開発した(Schreimerらの(1998) Anal. Chem. 70、1569-15
75)。FPビオチンと統合されると、この技術は全細胞と組織の試料から直接的に
セリン加水分解酵素(それぞれの触媒性求核試薬と同様に)を分子レベルで同定す
ることを可能にする。
【０１５３】 実施例5 ラット組織におけるセリン加水分解酵素のFPビオチンを用いたプロファイリング セリン加水分解酵素発現の複合パターンを解析するFPビオチンの能力を試験す
るために、本発明者らはラットの脳、肝臓、精巣、および前立腺の可溶性抽出物
から得られるホスホニル化タンパク質のプロファイルを比較した。より小さい分
子量の範囲では、明らかな組織特異的、および組織制限的なFPビオチン反応性タ
ンパク質が同定された。興味深いことに強く標識された33kDaのタンパク質は、
前立腺(III)においては排他的に同定された。このホスホニル化タンパク質の分
子の大きさは、ヒト前立腺特異的抗原(PSA)を持つ集合体と一致しているが(Bei
らの(1995) J. Clin. Lab. Anal. 9、261-268)、この組織で主に発現したセリン
プロテアーゼ、PSAの相同分子種は、前記の分子(サザンブロット法)と細胞生物
学的(免疫細胞化学)研究に基づく齧歯類に存在するとは考えられない(Karrらの(
1995) Cancer Res. 55、2455-2462)。ラットの前立腺で豊富にかつ選択的に発現
したFPビオチン反応性タンパク質の同定は、この器官が実際はヒトPSAの機能的(
高い配列関連性が必須ではないが)相同体を所有できることを示唆し、この観察
は、前立腺癌のための原理的マーカーとしてPSAの状態を考慮する更なる研究に
価値がある(Polascikら(1999) J. Urol. 162、293-306)。数種の他のFPビオチン
反応性タンパク質も、精巣特異的な42kDaタンパク質（I)と、二つの38kDaのタン
パク質であり、その一つが脳および精巣に存在し、また他方が脳および肝臓に存
在する二つのタンパク質(II)とを含む組織限定的な発現パターンを示した。より
大きな分子量の範囲では、FPビオチン反応性タンパク質のほとんどは広い組織分
布を示すと考えられた。しかしながら標識された65kDaのタンパク質は、肝臓に
おいてもっとも高い相対的存在量で、精巣および前立腺においては低レベルで見
出されており、また脳においては検出されなかった(I)。同様にホスホニル化さ
れた70kDaのタンパク質は肝臓において排他的に見出された(II)。
【０１５４】 対象の発明は、酵素試料におけるクラス、サブクラスまたはクラスの個々のメ
ンバーについての酵素活性を同定するために用いることのできる試薬を提供する
。この試薬は、活性部位でアミノ酸と反応する官能基、検出の目的に依存し、ク
ラスのすべてまたはほとんどのメンバー、クラスのサブグループ、またはクラス
の個々のメンバーに結合すると思われるリンカー、および試薬結合酵素を隔離す
るためのリガンドを含む。このように組織または細胞を、薬物、熱、感染、外科
的介入、新形成などのような外部刺激に対する応答を調べるために、上記に示さ
れた異なるグループの酵素活性についてアッセイすることができる。さらに細胞
の性質の変化は、老化、形質転換、遺伝子治療などを用いて決定できる。クラス
のメンバーに対して特異的な試薬は、リンカーの組み合わせ合成法を用い、かつ
特異的酵素に対して高い親和性を持つ化合物についてスクリーニングを行うこと
で調製される。このリガンドは、試薬が特異性を示す酵素を同定するために、試
薬が反応した酵素を単離し同定することを可能にする。一旦同定されるとリンカ
ーは、最適化するためにさらに修飾してもよい。
【０１５５】 実施例6 FPビオチンとFP-PEG-ビオチンのセリン加水分解酵素プロファイルの比較 結果 FP-Peg-ビオチン(9)の合成 第1世代のFP-プローブ、FPビオチンは、アミド結合を介して5-(ビオチンアミ
ド)-ペンチルアミンにそのFP反応基を結合する直鎖状デカメチレン鎖を有してい
た(15)。試薬のデカメチレン鎖がより親水性のあるテトラエチレングリコールリ
ンカーに置換されたFPビオチンの変異形を合成した。簡単に言うとテトラエチレ
ングリコール(1)をモノシリル化して後にアルキルヨウ素3に変換する化合物2を
提供し、それをトリエチルホスファイトと反応させてホスホネート4が得られた
。HF-ピリジンを用いて4を脱シリル化反応した後、N,N-ジスクシンイミジルカー
ボネートで処理することでNHS-カーボネート6が得られた。化合物6は塩化オキサ
リルを用いて処理し、続いて加水分解させることによってモノエトキシホスホン
酸7に変換した。化合物7はDASTで処理することでフルオロホスホネート8を生成
し、それが次に5-(ビオチンアミド)ペンチルアミン(Pierce)に結合してFP-peg-
ビオチン(9)が得られた。
【０１５６】 FP-peg-ビオチンは活性依存的にセリンプロテアーゼと反応する ビオチン化FPが不活性なチモーゲンから活性なプロテアーゼを識別できること
を証明するために、FP-peg-ビオチンを等量のトリプシン、トリプシノーゲン、
キモトリプシン、およびキモトリプシノーゲンとともにインキュベートした。続
いてそれぞれの反応の生成物をSDS-PAGEとアビジンを用いるブロット法によって
比較した（図16)。FP-peg-ビオチンはトリプシンとキモトリプシンの両方を強く
標識したが、それぞれのチモーゲンとはほとんど、または全く反応性を示さなか
った。タンパク質染色法によって、キモトリプシン試料の有意の画分が反応を準
備する過程で崩壊したことが示された。それにもかかわらずFP-peg-ビオチンは
さらに、キモトリプシノーゲンの相対物を用いた場合よりも、キモトリプシン試
料を用いた場合の方が、前者の反応で存在するタンパク質が実質的に量がより低
いにもかかわらず標識強度がかなり強いことを示した。実際に、キモトリプシノ
ーゲン試料で観察された低レベルのFP-peg-ビオチン標識(5×露光パネルにのみ
見られる)が、購入した酵素前駆体が2％までの活性なプロテアーゼを含むと報告
されているため、チモーゲン自体を用いた場合よりもむしろ微量のキモトリプシ
ンを用いた場合に反応性を実際に表した。
【０１５７】 FPビオチンおよびFP-peg-ビオチンを用いて作製したセリン加水分解酵素活性プ
ロファイルの比較 ラット精巣の可溶性画分(1μg/μL)をFPビオチンまたはFP-peg-ビオチン(4μM
)のいずれかとともに、室温で1時間処理し(50mMのトリス、pH7.2、150mMのNaCl)
、標識されたセリン加水分解酵素活性をSDS-PAGEおよびアビジンを用いたブロッ
ト法によって検出した。ビオチン化FPで処理する前にプロテオームを熱変性させ
た対照の反応も、非特異的(熱非感受性)タンパク質の反応性から特異的(熱感受
性)タンパク質を識別するために分析した。それぞれのビオチン化FPによって生
じさせたセリン加水分解酵素活性のプロファイルは、一個の顕著な例外と互いに
著しく類似していた(図17A)。一対の50kDaのセリン加水分解酵素活性がFP-peg-
ビオチンによって強く標識されたが、FPビオチンと非常に低い反応性しか示さな
かった(矢印の先端)。より長時間(2時間から一晩)進行させたFP-プロテオーム反
応はいくつかのセリン加水分解酵素の標識強度を増加させたが、如何なる新規の
熱感受性タンパク質の反応性も検出する結果には至らなかった。したがって一時
間のFP-プロテオーム反応は、セリン加水分解酵素活性の「最大適用範囲」を示
すと考えられるプロファイルを提供し、別記して記載しない限り引き続き記載さ
れた反応はこの時間で進行させた。
【０１５８】 FP-プロテオーム反応のプローブ濃度依存性 ラットの精巣プロテオームの試料は、FPビオチンまたはFP-peg-ビオチンのい
ずれかで、プローブ濃度0.5〜8.0μMの範囲で1時間処理した(図17BおよびC)。ほ
とんどのFp-ビオチン標識されたタンパク質は増加させた量のプローブを用いて
シグナル強度が高まっていることを示したが、このことは低マイクロモルのFPビ
オチン濃度ではそれらの反応が飽和されなかったことを示している。対照的に数
個のFP-peg-ビオチン標識されたタンパク質は、プローブの濃度を増加させても
シグナル強度に変化が検出されなかったことを示していた(図17C、矢印の先端)
。これらの酵素は完了時まで反応させたか、または試験したFP-peg-ビオチン濃
度のすべてにおいて標識の速度が飽和したかそのいずれかであった。これらのタ
ンパク質すべてについて明らかな濃度依存的標識が短時間で進行した反応で観察
できたため、速度論的な実験により前者の説明が支持された(1分間、図17D、矢
印の先端)。
【０１５９】 注目すべきことにFP-peg-ビオチンの濃度を4〜8μMとして1時間進行させた反
応においては、少なくとも18個の別個のセリン加水分解酵素活性を一次元のSDS-
PAGEゲルの一つのレーンで分解できた(図17C)。さらに高い濃度のFP-peg-ビオチ
ン(16μM)は、4μMおよび8μMのプローブを用いて観察されたセリン加水分解酵
素活性のプロファイルと質的に類似したプロファイルを形成するだけでなく(す
なわち、16μMで検出された新規の熱感受性タンパク質の反応性はなかった)、ま
た高レベルの非特異的タンパク質の反応性も生じた。したがって、ビオチン化FP
が4μMから8μMの範囲の濃度で、特異的プロテオームの反応性が非特異的なプロ
テオーム反応性に対して最大の比率となることを示したと結論づけられた。
【０１６０】 FP-プロテオーム反応のpH依存性 一つの混合型緩衝液アッセイ法を、pHが6.0〜9.0の範囲におけるFP-プロテオ
ーム反応のpH依存性を評価するために用いた(条件：1μg/μLの可溶性精巣タン
パク質、4μMのビオチン化FP、50mMのビス-トリスプロパン、50mMのCAPS、50mM
のクエン酸塩、150mMのNaCl、一時間の反応)。数種類のpH依存性が、pH8.0で最
適なFP反応性を示すいくつかのセリン加水分解酵素を用いた場合(図18、三つの
矢印の先)、およびpHが9.0にまで上昇するように強度が増加し続けたFP反応性を
示す他のセリン加水分解酵素を用いた場合(二つの矢印の先)に、FP標識したタン
パク質の中で観察された。多数のセリン加水分解酵素が「pH非依存性」FP反応性
を示すと思われたが、速度論的解析は、これらの酵素のほとんどが反応の時間が
経過するにつれて完了まで標識したことを示した(上記参照)。このようにこれら
の酵素は、標識の速度を遅める反応のパラメータを修飾する(例えばプローブ濃
度を低下させたり、および／またはインキュベート時間を減少させたりする)こ
とによって可視化できるpH依存的な様式でFPと反応する可能性が高い。最後にバ
ックグラウンドのFP反応性は、あらかじめ熱した対照レーン(一重の矢印の先)に
表れる数個の標識されたタンパク質をともなって、pH9.0で有意に増加した。ク
マーシーブルー染色を行うと、これらの標識されたタンパク質が精巣プロテオー
ムのすべての高い存在量の構成成分であったことが明らかとなったが、このこと
は、熱非感受性の標識がFP反応性の非特異型を表すことを示している。大部分の
セリン加水分解酵素が、pH8.0でのFP反応性がpH9.0に比較して似ている(すなわ
ちより大きい)ことを示したことをさらに考慮すると、前者のpHのほうが複合プ
ロテオームに含まれるこの酵素ファミリーの機能解析により適していると思われ
る。
【０１６１】 FP-プロテオーム反応の速度論的解析 一時点での測定は、複合プロテオームに存在する活性なセリン加水分解酵素の
一般的なプロファイルを得るための簡単で迅速な手段を提供するが、速度論的解
析には酵素活性のより複雑な変化を解読することが必要とされる。例えば、酵素
存在量の変化がない場合に起こるセリン加水分解酵素活性の変化は、反応性の速
度が測定されない限りビオチン化FPを用いては依然として検出できないままであ
る場合がある。FP-プロテオーム反応の速度論を調べるために、ラットの脳の膜
画分をビオチン化FPを用いて処理し、タンパク質標識の時間経過後、SDS-PAGEお
よびアビジンを用いたブロッティング法を行った。これらの研究の目標は、1)膜
関連セリン加水分解酵素をビオチン化FPを用いてプロファイリング化することを
確認すること、および2)個々のセリンヒドラーゼがFPビオチンとFP-peg-ビオチ
ンと反応性のそれぞれの速度において有意な違いを示したかどうかを試験するこ
と、といった2部分からなる。
【０１６２】 まず脳の膜タンパク質を、FP-膜プロテオーム反応に対する界面活性剤の作用
を調べるために、トライトンX-100を用いて可溶化する前と後の両方でFPビオチ
ンを用いて処理した。類似のセリン加水分解酵素活性のプロファイルは、膜関連
性でトライトン可溶化脳タンパク質試料を用いて観察されたが(図19)、このこと
は界面活性剤の可溶化によって触媒活性状態の膜結合性セリン加水分解酵素のほ
とんどが維持されることを示した。したがって続く標識化実験は、トライトン可
溶性の脳膜タンパク質を用いて行なわれた。ほとんどの脳膜セリンヒドラーゼは
、以下のセットの反応条件の下で1〜60分間の時間が経過する間にモニターでき
るFP反応性の速度を示した：4μMのビオチン化FP、1μg/μLのタンパク質、50mM
のトリス緩衝液、pH8.0、0.2％のトライトンX-100。興味深いことに実施例は、
セリンヒドラーゼの反応性プロファイルの三つの可能性のある型、すなわち、1)
FP-peg-ビオチンよりも速い速度でFPビオチンで標識される酵素(図20A、一重の
矢印の先)、2)FPビオチンよりも速い速度でFP-peg-ビオチンで標識される酵素(
二重の矢印の先)、および3)FPビオチンおよびFP-peg-ビオチンを用いて同じ速度
で標識される酵素(三重の矢印の先)のそれぞれに対して観察された。特定すると
65kDaのSH活性は1分間でFPビオチンを用いて完成するまで明らかに標識されたが
(図20A、左のパネル)、FP-peg-ビオチンを用いるとかなりゆっくりとした速度で
反応した(そのシグナル強度は30分から60分でさらに増加した、図20A、右のパネ
ル)。本発明者らはそのことに気づいた。
【０１６３】 このセリン加水分解酵素が脂肪酸アミド加水分解酵素(FAAH)、すなわち長鎖の
脂肪族アミド基質に対して強い優先性を示す脳の不可欠な膜酵素であることを証
明するために、本発明者らは各ビオチン化FPを用いて脳の膜タンパク質を処理し
、反応時の二回の時点でFAAHの触媒活性を測定した。10分間または60分間のいず
れかの間インキュベートした後のFPビオチン処理した試料ではFAAH活性は検出で
きなかった。対照的に有意のFAAH活性が、10分間および60分間のインキュベート
を行った場合、両時点でFP-peg-ビオチン処理した試料において観察され、それ
はそれぞれ60％および30％のFAAH活性(非処理の対照試料に比較して)を示した。
このようにFAAHは、FP-peg-ビオチンよりもFPビオチンによってかなり速い速度
で不活性化され、それはこの酵素の基質選択性と一致していた。
【０１６４】 いくつかの脳の膜セリン加水分解酵素が他ものよりも1つのビオチン化FPと優
先的に反応したことを考慮すると、本発明者らは両方のプローブの混合物と単一
のプロテオームを処理することによって、より完全なセリン加水分解酵素の活性
プロファイルが得られることが示された。それぞれ2μMのFPビオチンおよびFP-p
eg-ビオチンと脳の膜タンパク質を処理すると、個々にそれぞれのFPを用いて生
じたプロファイルの予測された合併に密接に似ているセリン加水分解酵素活性の
プロファイルを提供した(図20B)。これらのデータは、多数の活性に基づくプロ
ーブを単一のプロテオームに加えることで(「複合化」)、この試料に存在する活
性な酵素の適用範囲を高めることができることを示している。
【０１６５】 異なるラットの組織から得られる膜関連セリン加水分解酵素活性のプロファイル
の比較 脳膜と関連する非常に多数のセリン加水分解酵素が観察されたが、本発明者ら
はラットの組織パネルから得られる膜画分のセリン加水分解酵素活性のプロファ
イルを比較した。それぞれの膜画分は、トライトンX-100を用いてそのタンパク
質含有物を可溶化する前にまず1MのNaClを用いて洗浄した。このプロトコールは
不可欠な膜タンパク質、すなわち標準のプロテオミクス法による解析に対して周
知の抵抗性を示すタンパク質のクラスを濃縮するために選択された。興味深いこ
とに検査したそれぞれの組織は、膜関連のセリン加水分解酵素活性の独特で複合
化されたプロファイルを持っていた(図21)。注目すべきことに3つの48〜52kDaの
セリン加水分解酵素活性のセットは、脳膜で濃縮された(一重の矢印の先)。同様
に心臓濃縮されたセリン加水分解酵素活性および精巣濃縮されたセリン加水分解
酵素活性も観察された(それぞれ二重および三重の矢印の先)。
【０１６６】 非共有結合性セリン加水分解酵素阻害剤の標的選択性の評価 ビオチン化FPはチモーゲンから得られる活性なセリン加水分解酵素を区別する
(図16)だけでなく、阻害剤結合性酵素も形成する。複合プロテオームにおいて直
接的にセリン加水分解酵素阻害剤の標的選択性を証明するために、それぞれのビ
オチン化FPを、さまざまな濃度のオレオイルトリフルオロメチルケトン(OTFMK)
、前述した非共有結合性FAAH阻害剤で処理した脳膜のプロテオームに添加した。
30分間のインキュベートを行った後その反応を停止し、SDS-PAGEおよびアビジン
を用いるブロッティング法で解析した。いくつかのセリン加水分解酵素は、増加
させた濃度のOTFMKの存在下でFP反応性が減少することを示したが（図22）、こ
のことはこの求電子性のケトンがFAAHの有効な阻害剤であるだけでなく、他の脳
膜セリン加水分解酵素も同様に有効な阻害剤であることを示している。フィルム
濃度測定法は、それぞれのセリン加水分解酵素標的の阻害剤としてOTFMKの効力
を見積もるために用いた。一対の50kDaのセリン加水分解酵素は、それぞれ50μM
および200μMのOTFMKの存在下でFPビオチンとFP-peg-ビオチンの両方の反応性が
約40％および80％減少したことを示した(大括弧)。対照的にFAAHのFP-peg-ビオ
チンの反応性は、それぞれ5μM、50μM、および200μMのOTFMKの存在下で約30％
、90％、および95％減少した(矢印の先)。これらのデータは、他の脳膜のセリン
加水分解酵素のなかでもFAAHに対して比較的大きくない(約10倍分)選択性を示す
ことを表している。濃度が50μMおよび200μMの両方のOTFMKはFAAHのFP-peg-ビ
オチンの反応性を90％を超えて遮断したが、この酵素のFPビオチン反応性は、50
μMと200μMのOTFMKによってそれぞれ、ほんの弱く(〜20％の減少)、部分的に(
〜70％の減少)影響を受けた。これらの明らかに相反するデータは以下のように
解釈できる。三つの観察されたOTFMK感受性セリン加水分解酵素については、用
いた反応条件下ではあまりに速くてモニターできないほどの速度でFAAHが独占的
にFPビオチンと反応した(図19A、左のパネル)。このような場合では、可逆的阻
害剤の結合性からは、反応時間が経過時に完了するまでにタンパク質がそれ以上
標識されない範囲にまでその阻害剤がFP反応性のタンパク質標的速度を減少させ
たかどうかが検出されるにすぎないであると思われる。このようにFAAHのOTFMK
に対する感受性は、30分間のFPビオチン競合性アッセイ法では過小評価される可
能性が高かった。一方FP-peg-ビオチンは、続く60分間の時間経過の間に充分に
ゆっくりとした速度でFAAHを標識し(図19A、右のパネル)、したがってこのプロ
ーブを用いて行なわれた反応は、競合的な活性部位指向性物質に対するFAAHの感
受性についてより正確な評価をもたらした。合わせるとこれらの結果は、ビオチ
ン化FPが識別可能な標識速度論を示す場合に、そのビオチン化FPが複合プロテオ
ームにおいて直接的に非共有性の阻害剤のセリン加水分解酵素標的を同定できる
ことを証明している。
【０１６７】 FP標識されたセリン加水分解酵素の親和的単離および分子の特徴付け プロテオミクス研究に対して継続して使用されるべき活性に基づくプローブ様
のビオチン化FPについては、これらの試薬はタンパク質検出のための手段として
役立つだけでなく、タンパク質の単離および同定のためにも役立つ必要がある。
アビジンアガロースクロマトグラフィーによってFPビオチン化タンパク質を親和
性精製しようとする試みの課程で、本発明者らは数個の標識されたタンパク質が
、それらの天然の状態ではアビジンマトリックスに結合できなかったことに気づ
いた(図23A、矢印の先)。しかしながらタンパク質試料がアビジンビーズで処理
される前に変性された場合、ビオチン化タンパク質のすべての効率的に枯渇した
。続いてこのビーズを洗浄し、SDS-PAGEにかける緩衝液を用いて溶出すると、ビ
オチン化タンパク質が非常に濃縮された試料が得られた(図8A、右側のパネル)。
この溶出試料をSDS-PAGEゲルで流し、ビオチン化されたタンパク質をゲルから切
り出し、トリプシンで消化してから得られたペプチド混合物をMALDI質量分析法
によって分析した。この一段階単離法は、ラット精巣の可溶性プロテオームに存
在する7つの標識されたセリン加水分解酵素を、すなわちアシルペプチド加水分
解酵素(82kDa、アクセッション番号CAA33040)、プロリルオリゴペプチダーゼ(80
kDa、BAA25544)、カルボキシルエステラーゼ1(80kDa、アクセッション番号JX005
4)、カルボキシルエステラーゼ10(60kDa、アクセッション番号P16303)、長鎖ア
シルCoA加水分解酵素(48kDa、アクセッション番号088267)、血小板活性化因子(P
AF)アセチル加水分解酵素a1サブユニット(32kDa、アクセッション番号NP_032802
)、およびPAFアセチル加水分解酵素a2サブユニット(30kDa、アクセッション番号
035264)として同定した(図8B)。別の45kDaのセリン加水分解酵素活性はMALDIト
リプシン分解したペプチドのマップを提供したが、これは公開のデータベースに
含まれるいかなるタンパク質のペプチドマップにも適合しなかった。このタンパ
ク質から得られるトリプシンによって生じたペプチドの一つについてのエレクト
ロスプレイMS断片化パターン(M+H+＝1099Da)の分析は、次の配列情報、すなわち
GFVVAIEHRを提供した。このペプチド配列を用いたブラスト（BLAST）データベー
ス検索では、血漿PAFアセチル加水分解酵素またはLDL関連ホスホリパーゼA2(ヒ
トタンパク質アクセッション番号AAB04170.1)と言われる45kDaのセリン加水分解
酵素のそれぞれヒトおよびイヌのバージョンにおいて、80％および90％の同一の
配列を同定した。このように単離された45kDaのFPビオチン反応性の精巣タンパ
ク質は、分泌されたセリン加水分解酵素のこのファミリーの新規の齧歯類のメン
バーである可能性が高かった。
【０１６８】 実施例7 ABPSとしてのスルホン酸エステル組み合わせライブラリー 材料および方法 合成のアルキルおよびアリールスルホン酸エステル すべての反応は特定しない限りアルゴンガス雰囲気下で行った。塩化メチレン
(CH2Cl2)を活性化アルミナカラムを通過させて乾燥した。純度の高い市販の試薬
を購入し、別記しない限りさらに精製することなく用いた。NMRスペクトルはブ
ルーカー(Bruker)AMX-400装置で得られ、残渣の溶媒ピークに対して較正した。
多重度は次のように省略されている。すなわち、s＝一重項、d＝二重項、t＝三
重項、q＝四重項、p＝五重項、m＝多重項である。10-((2-ピリジルスルホニル)
オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド(1)の合成法は、11個のビオチ
ン化アルキルおよびアリールスルホン酸塩(1-11)の代表的合成法として提供され
る。
【０１６９】 ((2-ピリジルスルホニル)オキソ)-10-ウンデセン(13)： ピリジン(4mL)中のα-ウンデシレニルアルコール(12)(0.5g、2.91ミリモル、1
.0等量)の溶液を0℃に冷却し、コーレイ（Corey）と同僚らの方法[Coreyら(1989
). J. Org. Chem. 54、389-93]にしたがって調製した2-ピリジルスルホニルクロ
ライド(1.04g、5.87ミリモル、2.0等量)を用いて処理した。その反応混合液を0
℃で6時間維持し、続いて酢酸エチル(50mL)と水(25mL)との間で分割した。有機
層を10％のHCl水溶液(2×50mL)とNaCl飽和水溶液(50mL)で洗浄し、乾燥(MgSO4)
した後減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィー(2％のEtOAc/Hex)により無
色のオイルとして13が得られた(98％)。 マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)-FTMS 334.1433 (C16H25NO3S＋N
a+は334.1447を必要とする)。
【０１７０】 10-((2-ピリジルスルホニル)オキソ)-デカン酸(14)： 全量35mLにしたCCl4-CH3CN-H2O(10mL-10mL-15mL)からなる二相溶液中の化合物
13(0.90g、2.88ミリモル、1等量)を、過ヨウ素酸ナトリウム(2.53g、11.80ミリ
モル、4.1等量)とトリ塩化ルテニウム水和物(0.005g、0.02ミリモル、0.03等量)
とを連続的に用いて処理した。この反応液を25℃で一晩攪拌し、続いてCH2Cl2(1
00mL)と1NのHCl水溶液(2×100mL)との間で分割した。有機層をNaCl飽和水溶液(1
00mL)で洗浄し、乾燥(MgSO4)した後減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィ
ー(40％のEtOAc/Hex)を行うことにより14が得られた(80％)。
【０１７１】 10-((2-ピリジルスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド(1
)： -78℃でCH2Cl2(15mL)中の14(0.030g、0.09ミリモル、10等量)の溶液に、(ジエ
チルアミノ)三フッ化硫黄(0.027mL、0.21ミリモル、22等量)を滴下して処理し、
25℃にしてから10分間攪拌した。続いてその反応液を、N-ヒドロキシスクシンイ
ミド(0.05g、0.04ミリモル、40等量)を含む反応液の2分の1容量のジメチルホル
ムアミドを用いて処理し、さらに25℃で15分間攪拌した。この反応混合液を酢酸
エチル(50mL)と水(50mL)の間で分画した。有機層をNaCl飽和水溶液(200mL)で洗
浄し、乾燥(NaSO4)した後減圧下で濃縮すると、10-((2-ピリジルスルホニル)オ
キソ)-N-(ヒドロキシスクシニル)デカンアミド(未精製の1H NMRによって判断さ
れたとおり。データは示されていない)が得られた。さらに精製することなくそ
の中間体をMeOH(0.04mL)中の5-(ビオチンアミド)-ペンチルアミン(Pierce、0.00
3g、0.009ミリモル、1.0等量)を用いて処理し、30分間攪拌した。溶媒を窒素気
流下で蒸発させ、残った残渣を酢酸エチル(2×2.5mL)で洗浄してから最小量のク
ロロホルムに溶解し、きれいなガラス容器に移し替えた後、溶媒を蒸発させた。
この段階を過剰の試薬と副産物から望ましいビオチン化生成物を取り出すために
繰り返すと、白色フィルムとして4が得られた(0.004g、46％)。
【０１７２】 10-((ベンゼンスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド(2)
：
【０１７３】 10-((p-トルエンスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド(3
)：
【０１７４】 10-((4-メトキシベンゼンスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカン
アミド(4)：
【０１７５】 10-((メチルスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド(5)：
【０１７６】 10-((ブチルスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド(6)：
【０１７７】 10-((オクチルスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド(7)
：
【０１７８】 10-((4-ニトロベンゼンスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンア
ミド(8)：
【０１７９】 10-((8-キノリンスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド(9
)：
【０１８０】 10-((2-ナフタレンスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド
(10)：
【０１８１】 10-((2-チオフェンスルホニル)オキソ)-N-ビオチンアミドペンチルデカンアミド
(11)：
【０１８２】 1-(2-ピリジルスルホニル)オキソ-オクタン(15)： 0℃にした無水トリエチルアミン(23.04ミリモル、30等量)の3.0mLに1-オクタ
ノール(0.10g、0.77ミリモル、1等量)を添加し、続いて2-ピリジルスルホニルク
ロライドを一度に添加した。この混合液を0℃で3時間維持し、続いて水(5mL)を
添加した。得られた混合液をジエチルエーテル(3×50mL)で抽出し、それから有
機抽出液を合わせてNaHCO3水溶液(50mL)で洗浄し、乾燥(MgSO4)を行ってから減
圧して濃縮した。カラムクロマトグラフィー(2％のEtOAc/Hex)により15(99％)が
得られた。
【０１８３】 1-(2-ピリジルスルホニル)オキソ-エタン(16)： 0℃にしたジクロロメタン(3mL)中のトリエチルアミン(0.86g、8.51ミリモル、
2.2等量)の溶液にエタノール(0.18g、3.87ミリモル、1等量)を添加し、続いて2-
ピリジルスルホニルクロライド(0.83g、4.65ミリモル、1.2等量)を添加した。0
℃で4時間攪拌した後、その溶液を減圧下で濃縮した。この濃縮液をNaHCO3水溶
液(50mL)に溶解し、ジエチルエーテル(3×50mL)で抽出した。このエーテル抽出
液を合わせてNaCl水溶液(50mL)で洗浄し、乾燥(MgSO4)を行ってから減圧下で濃
縮した。カラムクロマトグラフィー(5％のEtOAc/Hex)により16(95％)が得られた
。
【０１８４】 1-(メタンスルホニル)オキソ-オクタン(17)： ジクロロメタン(3mL)中のトリエチルアミン(0.12g、1.15ミリモル、1.5等量)
の溶液にオクタノール(0.10g、0.77ミリモル、1.0等量)を0℃で添加し、続いて
塩化メタンスルホニル(0.10g、0.85ミリモル、1.1等量)を5分間かけて添加した
。0℃で30分経過後、その反応混合液をジクロロメタン(50mL)で希釈し、氷冷水(
50mL)、氷冷した10％のHCl水溶液(50mL)、NaHCO3飽和水溶液(50mL)、およびNaCl
飽和水溶液(50mL)を用いて抽出した。有機層を乾燥(MgSO4)してから減圧下で濃
縮することによって17(97％)が得られた。
【０１８５】 プロテオーム試料の調製、標識、および検出 ラットの組織をトリス緩衝液(50mMのトリス-HCl緩衝液、pH8.0、0.32Mのスク
ロース)中でダウンスでホモジネートした。組織抽出物を1,100×g(10分間)、22,
000×g(30分間)、および105,000×g(60分間)で連続的に遠心分離した。最終的な
上清(可溶性画分)をトリス緩衝液(スクロースを含まない)を用いてタンパク質0.
5mg/mLに調整し、使用するまで0℃で維持した。別記して示さない限りタンパク
質試料とビオチン化試薬との間の反応は次のように行なった。すなわち、すべて
のビオチン化試薬を20℃でDMSO中のストック溶液に保存し、それからタンパク質
抽出物とともに反応液に直接添加してDMSO濃度を反応液の全容量の1％で一定に
維持した。この反応混合液を25℃で30分間インキュベートし(プローブの最終濃
度は5μMであった)、その後1容量等量の標準2×SDS-PAGE添加液(還元性)を添加
することによって反応停止した。反応停止した反応液をSDS-PAGE(7.5μgのタン
パク質/ゲルの1レーン)で流し、電気ブロッティング法によってニトロセルロー
ス膜に転写し、それを1％のトウィーン(TBS-トウィーン)と3％(重量/容積)の無
脂肪ドライミルクを含むトリス緩衝食塩水(TBS)中で、25℃で1時間、または4℃
で一晩のいずれかでブロッキングした。次にブロットを、TBS-トウィーン中のア
ビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(Bio-Rad、1:1,500希釈)を用い、25
℃で2時間かけて処理した。このブロットをTBS-トウィーンを用いて三回洗浄し(
5分間/洗浄)、スーパーシグナル化学蛍光試薬(Bio-Rad)で処理してから現像する
前に0.1分間から20分間、フィルムに露光した。pH依存性の研究では、次の反応
緩衝液を用いた；pH6-8で50mMのトリス-HCl、pH8-10で50mMのトリス・HCl、50mM
のCAPS。
【０１８６】 55kDaのスルホネート反応性タンパク質の濃縮および分子の特徴付け ラット肝臓の可溶性画分を、AKTA FPLC(Amersham Pharmacia Biotech)を用い
ることによってQセファロースカラム上に載せ、0-500mMのNaClを直線的勾配にし
て溶出した。素通り画分(3×2.5mLの画分)だけでなく溶出画分(10×2.5mLの画分
)のアリコートを上述したとおりの1を用いて標識し、標識されたタンパク質を含
む画分を同定した。55kDaのタンパク質を含んでいた素通り画分を1mgタンパク質
/ml体積というある体積にまで濃縮し、その後標準的な条件で1を用いて2.5mlの
試料を標識した。30分間この反応液をインキュベートした後PD-10サイズ排除カ
ラムにかけ、pH8で50mMのトリス・HCl緩衝液、3.5mlを用いて溶出した。ドデシ
ル硫酸ナトリウム(SDS)(0.5％ 重量/容積)を添加し、ビオチン部分がより影響を
受けやすくなるようにタンパク質を変性させるために、この標識された試料を10
分間、90℃に加熱した。続いてその試料を2.5倍(0.2％のSDS)に希釈し、50〜100
μLのアビジンビーズを用いて25℃で1時間、回転装置上でインキュベートした。
次に溶出液を除去し、続いて5mlの0.2％のSDSを用いて洗浄してからpH8で50mMの
トリス-HCl緩衝液を用いて3回洗浄した。標準の2×SDS-PAGE添加液を添加し、そ
の後アビジンビーズから1を用いて標識したタンパク質を溶出させるためにこの
試料を90℃に加熱した。溶出液を8％のノベックストリス-グリシンゲル(Novex T
ris-Glycine gel)に流し、クマーシーブルー染色を用いて染色し、続いて30％の
メタノール水溶液中で脱染色した。望ましい55kDaの1に反応性のあるタンパク質
をゲルから切り出し、トリプシンで消化させた。得られたペプチドをマトリック
ス支援レーザー脱離飛行時間型(matrix assisted laser desorption time-of-fl
ight)(MALDI-TOF)質量分析法によって分析した。MALDIペプチドデータは、プロ
テインプロスペクトル(Protein Prospector)データベース(falcon.ludwig.ucl.a
c.uk/mskome3.2.htm)のMSフィット検索およびプロテオメトリックス(Proteometr
ics)データベース(www.proteometrics.com/prowl-cgi/ProFound.exe)のプロファ
ウンド（ProFound）検索の両方で用いられ、これはサイトソル2クラスIラットの
アルデヒドデヒドロゲナーゼ(cALDH-I)として同定された。
【０１８７】 cALDH-Iの組換え発現および精製 プライマーはcALDH-IのcDNA配列に基づいて設計され、肝臓のcDNAライブラリ
ー(Clontech)から得られる酵素のcDNAを増幅するために用いられた。このcALDH-
IのcDNAを前核生物の発現ベクターであるTrcHisAにサブクローニングし、続いて
形質転換させてから大腸菌（E.coli）BL-21細胞で発現させた。発現は、培養物
のOD600が0.6にまで増殖した場合に1mMのイソプロピルα-D-チオガラクトシド(I
PTG)を用いて誘導された。4時間後、細胞を沈殿させ上清を除去した。この細胞
ペレットをトリス緩衝液(20mMのトリス-HCl緩衝液、pH8.0、100mMのNaCl)に再懸
濁し、リゾチーム(1mg/ml)を用いて30分間処理することによって溶解し、続いて
超音波処理した。その可溶性画分を39,800×g(25分間)で遠心分離して単離した
。HisタグをつけたcALDH-Iを4℃で30分間、テイロン(Talon)コバルトビーズとと
もに回転させ、続いて遠心分離を行い、可溶化液を取り除くことによって可溶性
画分から精製した。洗浄後、このビーズを80mMのイミダゾール緩衝液で溶出し、
溶出したタンパク質を10mgのタンパク質/mLにまで濃縮した。この濃縮されたタ
ンパク質溶液をゲル濾過クロマトグラフィー(スーパーローズ(Superose)6カラム
、AKTA FPLC、Amersham Pharmacia Biotech)にかけた。精製したcALDH-Iを含む
ゲル濾過した試料を合わせ、濃縮してから1mMのDTTを含むトリス緩衝液中で、-7
8℃で保存した(最終のcALDH-Iタンパク質濃度は1.5mg/mL)。
【０１８８】 真核細胞におけるcALDH-Iの発現 cALDH-IのcDNAを真核生物の発現ベクターpcDNA3にサブクローニングし、前述
した方法[Liuら(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA96、14694-99]を用いてCOS-
7細胞とMCF-7細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞
をかき取って採取し、トリス緩衝液に再懸濁してからそれらのタンパク質濃度を
検出した(D．タンパク質アッセイキット、Bio-Rad)。完全細胞の懸濁液を上述し
たように1を用いて標識した。
【０１８９】 cALDH-I酵素アッセイ法および阻害の研究 cALDH-Iの活性をトリス緩衝液(20mMのトリス-HCl、pH8、100mMのNaCl)中、25
℃で測定した。精製したcALDH-I(0.2μM)を、950μLの容量にされたDMSO(30μL
、3％の全インキュベート容量)中の15(2.5μM〜15μM)とともに5-45分間あらか
じめインキュベートした。阻害剤とともに酵素をあらかじめインキュベートした
後、残存触媒活性は、50μLの緩衝液中のNAD+(500μMの最終濃度)とプロピオン
アルデヒド(1mMの最終濃度)を添加することによって測定した。プロピオンアル
デヒドの酸化反応によってNADHが生成されたことは、340nmでの吸収の変化を2分
間測定することによってモニターした。基質競合アッセイ法においては、精製さ
れたcALDH-I(0.2μM)をNAD+(50μM)またはプロピオンアルデヒド(25μM)のいず
れか、および10μMの15とともに25℃で10分間、950μLの容量にしてあらかじめ
インキュベートした。残存触媒活性は上記のようにモニターした。
【０１９０】 結果 候補のABPとしてビオチン化スルホン酸エステルの選択および合成 候補のABPのライブラリーは、図9に概略を示した一般的な骨格に基づいて合成
した。ABPの構造は概念的に4つの部分に分割した。すなわち、結合基(BG)、反応
基(RG)、リンカー(L)、およびタグ(T)である。このライブラリーの反応基は、以
下の基準に基づいてスルホン酸エステルとして選択した。一連のビオチン化スル
ホン酸塩(1-11、図10)は、スキーム1に概略を示したように連続した3段階にした
がって合成した。対応するアリールまたは塩化アルキルスルホニルを、0℃でピ
リジンに溶解したウンデセン-1-オール(12)の溶液にゆっくりと添加することに
よって、スルホン酸塩(13)を形成した。シャープレス（Sharpless）と同僚の手
法を用いて末端のオレフィンを酸化的に開裂すると、その結果対応するカルボキ
シル酸(14)を形成した[Carlsenら(1981) J. Org. Chem. 46、3936-38]。ジエチ
ルアミノ三フッ化硫黄（DAST)を用いて14を処理した後、N-ヒドロキシスクシン
イミドを添加することによって、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル中間体
が得られた。後者の化合物は、メタノールに溶解した市販の5-(ビオチンアミド)
ペンチルアミン（NH2-ビオチン、Pierce)と反応させることによって、望ましい
ビオチン化スルホネートを生成した。
【０１９１】 ビオチン化スルホネートの特異的プロテオームの反応性の評価 スルホネートライブラリーのメンバーがプロテオーム中のタンパク質を特異的
に標的化するかどうかを決定するために、プローブの特異的および非特異的なプ
ロテオーム反応性を迅速に識別するための方法が開発された。それぞれのスルホ
ネート(5μM)をラット精巣のプロテオームの2つのバージョンである、天然型の
プロテオームおよび変性したプロテオーム(タンパク質試料を80℃で5分間あらか
じめ熱することで生成した)と反応させた。25℃で30分間が経過した後、そのス
ルホネート-プロテオーム反応液を標準SDS-PAGE添加液の一反応容量を添加する
ことによって反応停止し、それからSDS-PAGEおよびアビジンブロッティング法に
よって分析した。スルホネートの特異的および非特異的なプロテオーム反応性は
、それぞれ熱感受性および熱非感受性の標識を示したタンパク質標的として定義
された。オクチルスルホネート7以外のすべてのスルホネートは、熱感受性の様
式で精巣プロテオームの少なくとも一つのメンバーを標識した(図11A、11B)。興
味深いことに、特異的プロテオーム反応性の4つの一般的なパターンは、スルホ
ネートにおいて観察された。p-トルエンスルホネート3、ブチルスルホネート6、
およびナフチルスルホネート10は、それぞれ特異的に1つの55kDaのタンパク質を
標識した（図11A、11B、一重の矢印の先）p-メトキシベンゼンスルホネート4お
よびメチルスルホネート5は熱感受性の方式でプロテオームの4つのメンバーを標
識した[図11A、55kDa(一重の矢印の先)、42kDa(二重の矢印の先)、40kDa(三重の
矢印の先)、および32kDa(一個の点)]だけでなく、あらかじめ熱したプロテオー
ムとの有意の別の反応性も示した。ベンゼンスルホネート2は4および5によって
標識された4つのタンパク質のうちの3つと反応したが、40kDaのタンパク質のみ
特異的に標識することができなかった。p-ニトロベンゼンスルホネート8、キノ
リンスルホネート9、およびチオフェンスルホネート11はそれぞれ、55kDaのタン
パク質と特異的に反応し、同様に二つの別のタンパク質は他の試薬によって不十
分に標識された[図11B、36kDa(一個の点)および30kDa(三個の点)]。最後にピリ
ジンスルホネート1は55kDaのタンパク質と31kDaのタンパク質を標識し(図11Aお
よびB、それぞれ一重の矢印の先および二個の点)、後者のタンパク質は調べたス
ルホネートのうち1と独特の反応性を示すことが明らかになった。重要なことで
あるが、2、4、および5を除くほとんどのスルホネートプローブは、予め加熱し
たプロテオームとは低い反応性または無視してよいほどの反応性しか示さなかっ
た。
【０１９２】 数個のスルホネートプローブは特異的プロテオーム反応性について重複するパ
ターンを示したが、個々のタンパク質とのそれらの相対的な反応性はかなり異な
っていた。例えば36kDaのタンパク質は、ピリジルスルホネート1、p-ニトロベン
ゼンスルホネート8またはチオフェンスルホネート11とよりもキノリンスルホネ
ート9とより強く反応するが、これに対して55kDaのタンパク質は反対のプローブ
選択性を示した(図11B)。個々のスルホネートによって示された異なるプロテオ
ーム反応性をさらに調べるために、ピリジルスルホネート1の標識パターンを、
並列して行った分析におけるメチルスルホネート5とキノリンスルホネート9の標
識パターンと比較した(それぞれ図12Aおよび3B)。それぞれのスルホネートは特
有のセットのタンパク質を標識した。1および5の特異的反応性のパターンは互い
にほとんど直交していると思われ、これは1が55kDaと31kDaのタンパク質を最も
強く標識し(図12A、左側のパネル、二重の矢印の先)、5が42kDaと32kDaのタンパ
ク質を最も強く標識していた(図12A、左側のパネル、一重の矢印の先)。1と9の
プロテオーム反応性を比較すると、1との好適な反応性を示した二つのタンパク
質(図12B、左側のパネル、55kDaおよび31kDa、二重の矢印の先)と、9との高い反
応性を示した二個のタンパク質(図12B、左側のパネル、36kDaおよび30kDa、一重
の矢印の先)を同定した。5がより大きな非特異的反応性を持つことも、この試薬
が1と9に対して非反応性であった数個のタンパク質を熱非感受性の方式で標識し
たためにこれらの並列的な比較法で明らかであった。注目すべきことに、タンパ
ク質ゲルを染色したクマーシーブルーにより、予め加熱したプロテオームにおい
て5によって標識されたタンパク質が非常に豊富なタンパク質であることを示し
たことが明らかにされ(図12A、右側のパネル、一重の矢印の先)、このことは熱
非感受性の標識がスルホネート反応性の非特異的形態を反映しているという考え
と一致している。対照的にスルホネートライブラリーの熱感受性プロテオームの
反応性は、豊富なタンパク質に対してのにこのような偏りを示さなかった。
【０１９３】 スルホネートの特異的プロテオームの反応性に影響を与えるパラメータ スルホネート-プロテオーム反応の以下の特徴は、観察された特異的および非
特異的タンパク質の標識パターンに対するそれらの影響を試験するために変化さ
せた。すなわち時間、スルホネートの濃度、pH、および捕獲する求核試薬の存在
/非存在である。これらの研究では、ピリミジルスルホネート1の精巣プロテオー
ムとの反応性が調べられた。1によって特異的に標的とされる二つの精巣タンパ
ク質は、5-40分間でそれらのシグナル強度が増加し、その後の40-120分間ではプ
ラトーに達するといった同じ速度で標識された(図13A)。40-120分間ではさらに
反応性を示さなかったことは、タンパク質が40分間までに完了するまで標識され
たのか、または可能性は低いが、この反応において1の濃度がこれらの後の時間
では有意になっていたのかということを意味すると思われる。
【０１９４】 スルホネート1の特異的なプロテオーム反応性と非特異的なプロテオーム反応
性は、ある範囲のプローブ濃度(1-50μM)で評価した。1-10μMではスルホネート
1は31kDaおよび55kDaのタンパク質と、試薬の濃度を増加させるにつれて強度が
増加するといった特異的な反応性を示した(図13B)。この濃度範囲では、スルホ
ネート1はプロテオームと、非常に低レベルの熱非感受性の反応性しか示さなか
った。1が10μMから50μMでは、31kDaのタンパク質のシグナル強度は増加し続け
たが、これに対して55kDaのタンパク質は比較的一定のままであった。この濃度
範囲ではスルホネート1の非特異的標識は、特にほとんどの豊富な精巣タンパク
質が存在するより高分子の集合体の範囲で劇的に増加した。しかしながら重要な
ことに、この濃度範囲で同定される新規の特異的に標識されたタンパク質の標的
物はなかった。このように5-10μMの濃度範囲が、スルホネート1の非特異的プロ
テオーム反応性に対する特異的プロテオーム反応性を最大にするのに最適である
ことが明らかになった。
【０１９５】 スルホネート1の非特異的および特異的なプロテオーム反応性は異なるpH依存
性を示し、前者は逆ベル型曲線として現れ（pH7と8よりもpH6と9においてバック
グラウンド標識が高い）、また後者はpH6から8では強度が増加し、pH8から10で
はプラトーに達した(図13C、D)。このようにpH7および8で行なわれる反応は最高
レベルの特異的反応性を生じ、その際同じ時点では結果的に、非特異的反応性が
最低の程度であった。
【０１９６】 求核試薬とのスルホネート1の本質的な反応性は、ミリモル濃度の遊離のチオ
ール(グルタチオン、α-メルカプトエタノール、またはジチオスレイトール)の
存在下でプロテオーム反応を行なうことによって調べた。このスルホネートが一
般的な求核試薬と高い反応性を示した場合、チオール処理したプロテオーム反応
ではプローブの有効濃度がかなり減少するはずであり、その結果特異的に標識さ
れたタンパク質のシグナル強度は有意に減少することになる。しかしながら55kD
aのタンパク質の標識強度に影響を与えた試験されたチオールはなく、このこと
はスルホネート1の求核試薬との本質的な反応性が低いことを示している(図13D)
。対照的に31kDaのタンパク質の標識強度が緩和に減少することが、遊離のチオ
ールの存在下で検出された。
【０１９７】 ビオチン化スルホネートにより標識されたタンパク質の分子の同定 上記に記載されたスクリーニング法は、スルホネートライブラリーのメンバー
によって特異的に標識されたタンパク質標的を迅速に同定するために行なわれた
。スルホネートと熱感受性の反応性を示したものとして「特異的タンパク質標的
物」を定義することによって、活性がスルホネート標識によって影響されるよう
なタンパク質に焦点が限定された。この戦略に固有の仮定は、熱感受性の標識が
小さな分子の結合に適したタンパク質の構造的部分内において行われる現象を反
映していることであった。このような構造は、受容体のリガンド結合ポケットま
たは酵素の活性部位のいずれかに相当することが多いと予測された。したがって
、スルホネートが受容体または酵素にあるこれらの部位の一つと特異的に反応す
る場合には、その反応はこのタンパク質の活性に影響を与えると予想されると思
われる。したがって、スルホネートライブラリーの数個のメンバーによって特異
的に標識された55kDaのタンパク質の分子同定法が研究された。
【０１９８】 スルホネート1を用いて組織ブロットを行うと、標識された55kDaタンパク質は
ラット肝臓の可溶性画分において最も豊富であり、したがってこのタンパク質は
この供給源より精製した。55kDaのタンパク質はQ-セファロース陰イオン交換ク
ロマトグラフィーによって部分的に精製した。このカラムの素通り画分と溶出し
た画分のアリコートを1で標識し、55kDaのタンパク質を素通り画分において同定
した。これらの画分を合わせて5μMの1を用いて30分間標識し、続いてこのタン
パク質をサイズ排除クロマトグラフィーによって過剰のスルホネートから分離し
た。このタンパク質試料を次にアビジンアガロースビーズを用いて処理すること
によって、1で標識した55kDaのタンパク質を単離した。アビジン結合性タンパク
質の溶出は、標準SDS-PAGE添加液のある容量を添加し、加熱する(90℃、5分間)
ことによって達成した。このアビジンに基づく親和性精製法は、SDS-PAGE、およ
びアビジンを用いるブロット法(図14A)またはクマーシーブルーを用いる染色法
によって分離された55kDaのタンパク質の高濃度の試料を提供した。この55kDaの
タンパク質は染色されたゲルから切り出し、トリプシンで処理してから得られた
ペプチド混合物をMALDI-TOF質量分析法によって分析した。タンパク質データベ
ースのMSフィット（MS-FIT）およびプロファウンド(Profound)検索によって、サ
イトソルの2クラスIアルデヒドデヒドロゲナーゼ(cALDH-I、1189Daから2055Daの
範囲内の9個のトリプシン作用のペプチドがこの酵素に適合した。全配列の適合
範囲が50％、図14A)、すなわち内因性および外因性のアルデヒドのカルボン酸へ
の酸化の原因となるNAD+依存的酵素のスーパーファミリーのメンバーとしてタン
パク質が同定された[Wangら(1996) J. Biol. Chem. 271、16288-93、Yoshidaら(
1998) Eur. J. Biochem. 251、549-57]。
【０１９９】 cALDH-Iの組換え発現 cALDH-Iのスルホネート1との特異的反応性を確認するために、このタンパク質
を真核生物系と前核細胞系の両方で組換え発現させた。cALDH-IのcDNAをpcDNA3
哺乳動物発現ベクターにサブクローニングしてからCOS-7細胞とMCF-7細胞にトラ
ンスフェクトした。cALDH-IをトランスフェクトしたCOS-7およびMCF-7細胞は両
方とも、スルホネート1で強く標識された55kDaのタンパク質を発現した(図14B)
。対照的にこのスルホネート反応性タンパク質は、それぞれの細胞型の偽トラン
スフェクトのものでは検出されなかった。cALDH-Iはまた、pTrcHis系を用いた大
腸菌においても組換え発現させた。cALDH-Iを形質転換した大腸菌の可溶化液を
スルホネート1で処理し、N末端ヒスチジン標識を有するcALDH-I酵素について予
測された大きさ(60kDa、図14C)である一個の反応性タンパク質を発現することを
見出した。His標識したcALDH-Iは、続いて行われる金属親和性およびゲル濾過ク
ロマトグラフィーによって大腸菌可溶化液から精製した。この前核細胞の発現系
から、15mg/L培養物容積の精製されたcALDH-I酵素が日常的な操作で得られた。
【０２００】 ピリジルスルホネートは、cALDH-I触媒活性の時間依存的な阻害剤である cALDH-Iが触媒するプロピオンアルデヒドからプロピオン酸への酸化反応は、N
AD+がNADHに還元するのを340nmで観察することによって測定した。Hisでタグさ
れた組換えcALDH-Iによって示されたプロピオンアルデヒドについて観察された
ミカエリス定数(Km＝4.2μM)が、この酵素について報告されている文献値(Km＝6
.5μM)[Penzesら、(1997) Biochim. Biophys. Acta 1342、175-81]と比較された
。cALDH-Iの触媒活性に対するスルホネートの作用を調べるために、この酵素を
種々の濃度の2-ピリジルスルホニルオクタノエート(15)、すなわちプローブのビ
オチンタグを欠いている1の異型で処理した。スルホネート15は、2.5μMから15
μMまでの阻害剤から得られる速度が増加する時間依存的な様式でcALDH-Iの触媒
活性を阻害した(図15A)。15μMを超える濃度の15が、あまりにも速すぎて用いた
アッセイ条件下では測定できないほどの速度でcALDH-Iを不活性化した。2.5μM
、5.0μM、7.5μM、10μM、および15μMの15で行なった反応から算出された平均
的なKobs/[I]値は、(9.7＋1.8)×103M-1分-1であった。それぞれの濃度の15を用
いたcALDH-Iの不活性化は擬似一次速度論に適合できるが、ゼロ時点に戻してこ
れらの反応を推定しても100％の酵素活性は予測しなかった。cALDH-Iがホモ四量
体のタンパク質であることを考慮すると、このデータについての一つの可能な説
明は、個々のcALDH-Iサブユニットが異なる速度の15との反応性を示したことで
あった。この概念を概して支持した場合、より低い濃度の15で行なった反応の速
度論は、50％を超えるcALDH-I活性が阻害される時点よりもcALDH-I不活性化速度
がわずかに速いことが予測される50％の酵素阻害に先立つ時点を伴って、本質的
に二相性を表した。最後に、cALDH-Iを添加する前に60分間、反応緩衝液(20mMの
トリス・HCl、pH8.0、100mMのNaCl、1mMのDTT)中で15をインキュベートしても阻
害剤の能力に影響はなかったが、このことはこのスルホネートが用いたアッセイ
条件(過剰の遊離のチオールが存在する場合を含む)で安定であることを示した。
【０２０１】 15のcALDH-Iとの相互作用の性質を探索するために、プロピオンアルデヒドとN
AD+の両方を用いた競合的研究が行われた。組換えcALDH-Iを25μMのプロピオン
アルデヒドまたは50mMのNAD+が存在する場合、または存在しない場合のいずれか
で10分間、10μMの15を用いて処理し、残存酵素活性のパーセントを調べた(表1)
。プロピオンアルデヒドは15の不活性化速度論に対して検出可能な作用を持たな
かった。対照的に50μMのNAD+は15のcALDH-Iについての阻害作用を有意に減少さ
せ、より高濃度のNAD+は酵素が不活性化することから完全に保護した。
【０２０２】
【表１】 cALDHにおいてプロピオンアルデヒドおよびNAD+を用いた15について
の競合的研究
【０２０３】 cALDH-Iの不活性化の原因となる15の特徴 15の類似体は、試薬のオクチルおよびピリジル置換基をそれぞれエチル基(16)
およびメチル基(17)で置換して合成した。cALDH-Iは50μMの15、16、または17の
いずれかとともに60分間インキュベートし、残存cALDH-I活性のパーセントを測
定した(表2)。15はこれらの条件下でcALDH-Iを完全に不活性化するが、これに対
して16および17は、それぞれ弱い阻害作用を持っているものおよび阻害作用を持
たないものであった。0.25M-1分-1というKobs/[I]値が16に対して算出されたが
、これは15に対して決定された二次阻害速度定数よりも40000倍も低い二次阻害
速度定数であることを示した。15-17はまた、可溶性の精巣プロテオームにおけ
るcALDH-Iとのスルホネート1の反応性を遮断する能力についても試験した。この
精巣プロテオームは、5または50μMの濃度でそれぞれの非ビオチン化スルホネー
トとともに30分間あらかじめインキュベートした。その後でこのプロテオーム試
料を5μMの1で処理し、反応混合物をSDS-PAGEおよびアビジンブロッティング法
によって解析する前に30分間インキュベートした。上記に記載した阻害速度論と
一致して、15だけが精巣プロテオームにおいて1によるcALDH-Iの標識をブロッキ
ングした(図15B)。このように、精製したcALDH-Iのスルホネート不活性化に対し
て決定された構造活性相関(SAR)は、複合プロテオームにおけるこの酵素のスル
ホネート標識で観察されたSARとよく相関していた。ひとまとめにするとこれら
のデータは、15(および推定1によって)とcALDH-Iとの相互作用が阻害剤の構造の
アリール基とアルキル鎖の基の両方に依存していることを目立たせている。
【０２０４】
【表２】 精製したcALDHのスルホネート不活性化に対する構造活性相関
【０２０５】 多様なABPがプロテオームの適用範囲を大きくする ラットの精巣プロテオームを2.5μMのスルホネート1、5μMのFPビオチン、ま
たは2.5μMの1と5μMのFPビオチンからなる混合物のいずれかを用いて処理し[Li
uら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96、14694-99]、得られた熱感受性の標識プ
ロファイルをSDS-PAGEおよびアビジンブロッティング法によって可視化した。図
17において見ることができるように、精巣プロテオームにスルホネート1とFP-pe
g-ビオチンの混合物を提供すると、個々に両方のプローブによって標識されたタ
ンパク質が一個の試料中で効率的に検出された。注目すべきことに、同じプロー
ブ混合物で処理された予め加熱された試料は、それぞれのプローブが単独で試験
された場合に観察された非特異的な反応性に匹敵するほどの非常に低レベルで標
識が示されていることを示した。これらのデータは、多様なABPを用いることに
よって、一回のプロテオームアッセイ法で検出可能な特異的タンパク質反応性の
適用範囲を有意に増加できることを支持している。
【０２０６】 実施例8 金属加水分解酵素とNT依存的酵素のような他の酵素の活性部位に対する化学的
プローブを作製するために、本発明者らは活性依存的な様式で金属加水分解酵素
およびNT依存的酵素をプロファイル化できる化学的プローブを開発できると思わ
れる。この特定の目的のための実験には、i)金属加水分解酵素およびNT依存的酵
素のタグされた活性部位指向性阻害剤の設計と合成、ならびにii)細胞全体およ
び組織全体の試料において金属加水分解酵素およびNT依存的酵素を用いた、選択
的かつ活性に基づく反応性について候補の阻害剤の試験が含まれる。
【０２０７】 セリン加水分解酵素を用いた場合、金属加水分解酵素とNT依存的酵素は、内因
性の阻害作用のタンパク質またはシス作用の自己阻害性配列のいずれかによって
翻訳後に調節されることが多い。まとめるとこれらの翻訳後の調節機構は従来の
ゲノム/プロテオームのアプローチを、金属加水分解酵素および／またはキナー
ゼの作用における動力学を記録するために不適当なものにする。この特定の計画
の目標は、金属加水分解酵素とNT依存的酵素を標的とする候補の活性に基づく化
学的プローブを設計、合成、および試験することにある。
【０２０８】 金属加水分解酵素とNT依存的酵素を標的とする活性な部位指向性の化学的プロー
ブの設計と合成 金属加水分解酵素指向性物質については、本発明者らは、ビオチンに結合した
ヒドロキサミン酸阻害剤を、これらの物質が金属加水分解酵素の活性部位にしっ
かりと結合する(可逆的または不可逆的のいずれかで)と期待して作成する。付着
したビオチンタグによって反応性のタンパク質を迅速に検出して単離することが
可能になる。本発明者らは、R1位およびR2位で多様化したタグの付いたヒドロキ
サメートからなる適度な大きさの組み合わせライブラリーを合成し、1)定義した
クラスの金属加水分解酵素との広域スペクトルの反応性、および2)関連しないタ
ンパク質との低い交叉反応性の両方を示す阻害剤を選択する。金属加水分解酵素
の活性に基づくプローブの候補をさらにいくつか合成することもできるがこれは
、潜在的な反応性をルイス酸の活性部位結合性金属イオンに配位結合して明らか
にされる基をこれらの分子が所有すべきであるという原理に基づいている。これ
らの試薬には、ピリジルスルホネートならびに金属誘導性のビニルニトロソニウ
ムおよびアジリジニウムイオンが含まれる。NT依存的酵素を標的とする活性に基
づくプローブは、適当なNTのビオチン標識した反応性または加水分解不可能な化
学的類似体からなる。これらの分子は、多くのNT依存的酵素が自己阻害された状
態ではNTに結合しないという事実を利用しているはずである。
【０２０９】 一旦それぞれの候補のプローブが作製されると、市販され入手可能な酵素およ
び完全な細胞/組織の試料のどちらに対してもスクリーニングを行う。観察され
た相互作用の活性に基づく性質についての最初の評価は、加熱されていないタン
パク質試料に対して加熱されたタンパク質試料の反応性を比較することによって
決定される。MMPと選択的で熱感受性の反応性を示すこれらの金属加水分解酵素
指向性試薬については、TIMP(不活性型)によって結合したものと遊離のMMP(活性
型)を識別する能力に対してさらに研究されると思われる。選択的で熱感受性の
反応性を示すNT依存的酵素に対して指向するこれらの試薬は、不活性型(例えば
、自己阻害された)酵素に対して活性型酵素を識別する能力についてさらに研究
されると思われる。最後に本発明者らの実験的戦略について主要な利点に重点を
置くことが重要である。すなわち、本発明者らが合成したそれぞれの化学的試薬
はビオチンに結合するため、本発明者らは複合プロテオームにおける特定の活性
部位を迅速に限定するための機会を持っている。こうしてかりに試薬が提案され
た標的(例えば、金属加水分解酵素)と反応できなかった場合でさえも、本発明者
らは他の酵素ファミリーと特定の反応性を示すかどうかをさらに評価する。この
要領で、提案された作業が金属加水分解酵素とNT依存的酵素に対してクラス選択
性の試薬を同定するだけでなく、さらに他の酵素ファミリーを標的として同時に
反応する化学的基も同定されうる。この逆転した形態での薬物発見は、その際に
は仮定された化学的阻害剤が全細胞/組織抽出物と混合され、その標的選択性が
タグを認識することによって明らかにされるが、これは今度は、活性に基づくプ
ロテオームの研究に対して開発できる新規の小分子-酵素相互作用の同定を行う
ためにかなり強力であることを証明する必要がある。
【０２１０】 対照の阻害剤を種々の方法で使用できる。一つの応用法は、生理学的試料のセ
リン加水分解酵素活性を検出することである。この試料は血液、細胞、組織、ま
たは対照となる他の生理学的試料であることができる。いくつかの状況では、セ
リン加水分解酵素タンパク質を遺伝子操作して、合成効率が目的となる場合のよ
うにあるものを含むと予測されるか、またはセリン加水分解酵素を含んでいる試
料をモニターすることができる。組織または細胞の場合では、細胞はホモジナイ
ザー、混合機、ペレット化、遠心分離装置または他の便利な装置を用いる従来の
条件にしたがって溶解できる。得られた可溶化細胞組成物は遠心分離し、この上
清をタンパク質含有量について調節した。リガンドの性質に応じてその上清画分
は、天然に存在するリガンドおよび／または受容体から遊離させることができる
。この上清はさらに、適宜緩衝液を添加したり、さらに希釈したり、クロマトグ
ラフィーによって分画して処理することができる。分画した場合、個々の画分が
このアッセイ法で用いられると思われる。
【０２１１】 一個またはそれ以上の加水分解酵素を用いて反応混合物を調製し、阻害速度に
対する影響をモニターすることによって、セリン加水分解酵素の機能不全が関与
する適応症、特にセリン加水分解酵素の特異性または基が阻害されるための適応
症に関連する治療法として使用できる候補の化合物がモニターできる。一個また
はそれ以上の対照の化合物と候補の化合物を添加し、続いてアリコートを単離し
、セリン加水分解酵素活性について該アリコートを分析するか、または結合性の
セリン加水分解酵素を単離し、該結合セリン加水分解酵素を分析することによっ
て阻害速度をモニターする。
【０２１２】 別記して定義しない限り、本明細書で用いたすべての技術用語および科学用語
は、本発明が属する当業者によって通常理解されているのと同じ意味を持ってい
る。本明細書に記載された方法および材料と同じまたは等価の方法および材料を
本発明を実施または試験する際に用いることができるが、適切な方法および材料
が下記に記載されている。本明細書中で述べたすべての刊行物、特許出願、特許
、および他の参照文献は、その全体を参照として組み入れられる。論争が起きる
場合には、本発明の定義を含む明細書が調節すると思われる。また、材料、方法
、および実施例は単なる説明であって、限定することを意図していない。
【０２１３】 本発明はある好適な態様を参照して詳細に説明されたが、修飾および変形が、
説明されかつ主張された本発明の精神および範囲内のものであることを理解され
ると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 標的同定を用いた(すなわち、対応する標識またはタグ付きライ
ブラリーを用いた)生物活性の化合物(すなわち、非標識またはタグなしライブラ
リー)についての集積セルに基づくスクリーニングの概略図である。
【図２】 加熱(-)または加熱しないでピリジルスルホネートABPを用いた場
合、および加熱(-)または加熱しないでメチルスルホネートABPを用いた場合の、
還元SDS-PAGE上の精巣抽出物から得られるタンパク質プロファイルを示す。
【図３】 新規なADH酵素の同定のための、ABPとしてのスルホネート(アリ
ール)の非依存性タグ付きライブラリーの結果を示す。
【図４】 ABPとして使用するためのビオチニル化スルホネートエステルを
合成する方法、およびVI型の配置的に十分に定義されたスピロエポキシドの立体
制御された合成方法の例示を示す(その全体が参照として本明細書に組み入れら
れる、Sornensenら、Angew.Chem.Int.Ed.38：971〜974、1999も参照のこと)。
【図５】 ラット脳から得られるFPビオチン反応性タンパク質の同定を示す
。ABPとしてのFPビオチンの標識強度を、阻害剤との反応を完了させたFAAH試料
の一連の希釈物と比較した。
【図６】 FPビオチンについてのタンパク質プロファイルと比較した、FP-P
EG-ビオチンについてのタンパク質プロファイルを示す。
【図７】 ピリジルスルホネート1のプロテオーム反応性に影響するパラメ
ーターを示す。1-プロテオーム反応(5μMの1、0.5μg/μLタンパク質、50mMトリ
ス-HCl、pH8.0)の時間依存性。B,1-プロテオーム反応の濃度依存性。左側パネル
、1μM、2.5μMおよび5μM濃度の1を、精巣プロテオーム(0.5μg/μLタンパク質
、50mMトリス-HCl、pH8.0、30分反応)と反応させた。右側パネル、5μM、10μM
、20μMおよび50μM濃度の1を、精巣プロテオーム(0.5μg/μLタンパク質、50mM
トリス-HCl、pH8.0、30分反応)と反応させた。これらの反応の短い(上部右側パ
ネル)および長い(下部右側パネル)フィルム露光が示される。未処理精巣プロテ
オームを含むレーンにおいて、内在性の80kDaのアビジン反応性タンパク質の存
在に注目されたい。C、1-プロテオーム反応(5μMの1、0.5μg/μLタンパク質、3
0分反応)のpH依存性。左側パネル、pH6.0〜8.0で行なわれた反応。右側パネル、
pH8.0〜10.0で行われた反応。D、1-プロテオーム反応のチオール依存性。対照反
応は、標準条件下で行われた。1の添加の前に、各チオール(2mM)を、プロテオー
ムに添加した。
【図８】 ポリエチレンリンカーを用いた、活性に基づくプローブ調製の工
程図である。
【図９】 ビオチニル化スルホネートエステルの生成に関する、例示の合成
経路である。
【図１０】 A、プローブの4つの主要な構成要素：結合基(BG)、反応性基(R
G)、リンカー(L)、およびタグ(T)を強調した、活性に基づくプローブ(ABP)の全
般的構造。B、BGが変化して、RGがスルホネートエステルであり、Lが伸長アルキ
ル鎖であり、Tはビオチンである、ABPライブラリーの構成要素の構造。
【図１１】 スルホネート1-7(A)および8-11(B)の特異的および非特異的プ
ロテオーム反応性を示す。AおよびBについて、ラット精巣プロテオームの加熱お
よび非加熱型の両方との、各スルホネートの反応性を示す(標準反応条件：5μM
スルホネート、0.5μg/μL精巣タンパク質、50mMトリス-HCl、pH8.0、100mM Na
Cl；30分反応、25℃)。スルホネート標識タンパク質は、SDS-PAGE(7.5μgタンパ
ク質/レーン)およびアビジンブロッティングによって検出された。矢印およびド
ットで強調されているのは、熱感受性様式でスルホネートと反応したタンパク質
である。予熱プロテオームを含むレーンで標識されたタンパク質(D)は、全て、
内在性アビジン反応性タンパク質を表した(すなわち、スルホネートで処理され
ないプロテオームでも観察された；図13B参照)80kDaタンパク質以外は「非特異
的」スルホネート反応性と考えられた。異なるフィルム露光時間は、フィルム飽
和の前に標識タンパク質のシグナルが示されるように、高分子量(45kDa〜100kDa
、1×時間露光)および低分子量(27kDa〜45kDa、4×時間露光)のタンパク質それ
ぞれに異なるフィルム露光時間を与えた。
【図１２】 スルホネート1、5および9のプロテオーム反応性の並立比較を
示す。A左側パネル、スルホネート1および5のプロテオーム反応性。1および5の
それぞれについて選択性のある熱感受性タンパク質反応性が強調されている(そ
れぞれ、二重および一重の矢印)。右側パネル、1および5で処理された試料の、
クーマシーブルーで染色されたタンパク質ゲル。矢印は、予熱したプロテオーム
で5によって標識されたタンパク質と、分子量で相互に関連する主要なタンパク
質を強調する。B、左側パネル、スルホネート1および9のプロテオーム反応性。1
および9について選択性のある熱感受性タンパク質反応性を強調した(それぞれ、
二重および一重矢印)。右側パネル、1および9で処理された試料の、クーマシー
ブルーで染色されたタンパク質ゲル。AおよびBについて、異なるフィルム露光時
間は、フィルム飽和の前に、標識タンパク質のシグナルが示されるように、高分
子量(45kDa〜100kDa、1×時間露光)および低分子量(27kDa〜45kDa、4×時間露光
)のタンパク質それぞれに異なるフィルム露光時間を与えた。
【図１３】 細胞質ゲルのクラスIアルデヒドデヒドロゲナーゼ(cALDH-I)と
して55kDaの特異的に標識されたスルホネート標的の同定を示す。A.55kDa1-標識
タンパク質のアビジンに基づく親和性単離。示されているのは、部分的に精製さ
れた55kDaタンパク質(Q素通り画分)および親和性単離55kDaタンパク質(アビジン
ビーズ)を含む試料のアビジンブロットである。さらに示されているのは、cALDH
-Iとして同定したこのタンパク質から得られるトリプシンのペプチドである。B
、スルホネート1は、真核生物の発現システムで、組換えcALDH-Iを標識する。cA
LDH-IcDNAまたは空のベクター(偽)で形質移入されたCOS-7(左側パネル)およびMC
F-7(右側パネル)細胞から得られるタンパク質試料を1と反応させ、SDS-PAGEおよ
びアビジンブロッティングによって決定された。強力に標識された55kDaタンパ
ク質は、cALDH-Iで形質移入された細胞でのみ同定された。C、スルホネート1は
、原核生物の発現システムで、組換えcALDH-Iを標識する。Hisタグ付き型のcALD
H-Iで形質転換された大腸菌（E.coli）BL-21細胞を1と反応させ、SDS-PAGEおよ
びアビジンブロッティングによって決定した。追加のN-末端ヒスチジンタグを伴
う、予め検出された分子量のcALDH-Iに対応して、強力に標識された60kDaタンパ
ク質を同定した。
【図１４】 ピリジルスルホネートが、cALDH-Iの時間依存性の阻害剤であ
ることを示す。A、スルホネート15濃度の関数としての、cALDH-Iの時間依存的不
活性化。組換え体である精製cALDH-Iを、様々な濃度の15とインキュベートし、
図示される時点で、アリコートの反応が取り出され、1mMプロピオンアルデヒド
および0.5mM NAD＋をそれぞれ、基質および補因子として用いて、酵素活性につ
いて分析した。15の濃度は、黒塗りの菱形、2.5μM；白抜きの菱形、5μM；黒塗
りの円形、7.5μM；白抜きの円形、10μM；黒塗りの四角、15μM；であった。B
、スルホネート15-cALDH-I反応についての構造-活性関係。スルホネート15は、
精巣プロテオーム中で、1によってcALDH-Iの標識を有効に阻害した。このスルホ
ネートのピリジルおよびオクチル基が、それぞれ、メチルおよびエチル基に置換
された15の類似体(それぞれ、16および17)は、1による、cALDH-Iの標識を阻害し
なかった。
【図１５】 ABPを複合化することは、単独のプロテオームで検出されるタ
ンパク質活性の数を増加させることを示す。示されているのは、ピリジルスルホ
ネート1(2.5μM)、FPビオチン(4μM)、またはピリジルスルホネート1(2.5μM)お
よびFPビオチン(4μM)の混合物で処理された精巣プロテオームの熱感受性標識化
パターンの比較である。混合物で処理されたプロテオームは、各ABP単独で処理
されたプロテオームのプロファイルを結合することから推定されるものに類似の
、標識化プロファイルを示した。
【図１６】 FP-peg-ビオチンは、セリンプロテアーゼを標識するが、それ
らの個々の酵素原は標識しない。各タンパク質(100nM)の試料を、1時間、FP-peg
-ビオチン(4μM)で(50mMトリス、pH7.2)処理し、2×SDS-PAGE充填緩衝液(還元)
で反応を停止させ、SDS-PAGEおよびアビジンを用いたブロッティング(45ngタン
パク質/レーン、下部の2つのパネル)によって分析した。50×タンパク質保存液
も、SDS-PAGEゲルにかけられ、クーマシーブルーで染色された(2.2μg/レーン、
上部パネル)。長い露出により、キモトリプシノーゲン・試料で見られる弱いア
ビジンシグナルは、混入するわずかな量のキモトリプシンとでFP-peg-ビオチン
の反応を表す可能性があり、それが、購入されたプロ酵素の2％に及ぶことが報
告されていることに注目すべきである。
【図１７】 FPビオチンおよびFP-peg-ビオチンのプロテオーム反応性を比
較している。この図で描かれた実験の全てについて、タンパク質試料は、ラット
精巣の可溶性画分(1μgタンパク質/μL)を表す。(A)タンパク質試料を、1時間、
4μMのFPビオチンまたはFP-peg-ビオチンのいずれか(50mMトリス、pH7.2)で処理
し、SDS-PAGEおよびアビジンを用いたブロッティングによって分析した。FPビオ
チンでなく、FP-peg-ビオチンによって強力に標識された一対の48kDaセリンヒド
ロラーゼが、強調されている(矢印)。(B〜D)FP-プロテオーム反応の濃度依存性
。タンパク質試料を、1時間、0.5μM、1μM、2μM、4μM、または8μMのFPビオ
チン(B)またはFP-peg-ビオチン(C)のいずれか(50mMトリス、pH7.2)で処理し、SD
S-PAGEおよびアビジンを用いたブロッティングによって分析した。上部および下
部パネルは、それぞれ、1分および10分のフィルム露光を表す。1時間の反応でFP
-peg-ビオチン濃度依存性がないことを示す(C、矢印)ように見えるいくつかのセ
リンヒドロラーゼは、1分の反応で強力なプローブ濃度依存性を示した(D、矢印)
。
【図１８】 FP-プロテオーム反応のpH依存性。タンパク質試料を、1時間、
pH6.0、7.0、8.0または9.0で、FPビオチン(左側パネル)またはFP-peg-ビオチン(
右側パネル)のいずれか(50mMトリソ50mM CAPSo50mMクエン酸ナトリウム)で処理
し、SDS-PAGEおよびアビジンを用いたブロッティングによって分析した。8およ
び9のpH最適条件を表示するセリンヒドロラーゼは、それぞれ、三重および二重
矢印によって強調されている。pH9で熱非感受性FP反応性を示すタンパク質は、
一重矢印によって強調されている。
【図１９】 トリトン可溶化脳膜のセリンヒドロラーゼ活性プロファイルは
、不溶化脳膜のものに類似する(反応条件：1μg/μLタンパク質、2μM FPビオ
チン、30分の反応、50mMトリス、pH8.0、0.2％トリトンX-100を用いるかまたは
用いない)。
【図２０】 (A)FP-プロテオーム反応の速度論的分析。トリトン可溶化脳膜
(1μgタンパク質/μL)を、指示された反応時間の間、4μMのFPビオチン(左側パ
ネル)またはFP-peg-ビオチン(右側パネル)のいずれかで処理し、その後、分析物
を、2×SDS-PAGE充填緩衝液で反応を停止させ、SDS-PAGE-アビジン・ブロッティ
ングによって分析した。FPビオチンまたはFP-peg-ビオチンと、高速で反応した
セリン・ヒドロラーゼ活性は、強調されている(それぞれ、一重および二重矢印)
。上部および下部パネルは、それぞれ、1分および5分のフィルム露光を表す。(B
)ビオチン化FPの複合化は、複合プロテオームでの活性セリン・ヒドロラーゼの
適用範囲を増強する。可溶化脳膜タンパク質を、指示濃度のビオチン化FPで処理
した(30分反応)。強調されているのは、各プローブと単独で行われる反応(括弧)
の場合よりも、FPビオチンおよびFP-peg-ビオチンの混合物を含むFP-プロテオー
ム反応の場合にいっそう明らかに、集約的に可視化される3つのセリン・ヒドロ
ラーゼである。
【図２１】 ラット組織のパネルで発現した膜関連セリン・ヒドロラーゼ活
性の比較。タンパク質試料(1μg/μL)を、1時間、FPビオチン(4μM)(50mMトリス
、pH8.0、0.2％トリトン)で処理し、2×SDS-PAGE充填緩衝液で反応を停止させ、
10％(左側パネル)または8％(右側パネル)ポリアクリルアミドゲルのいずれかでS
DS-PAGE/アビジン・ブロッティングによって分析した。強調されているのは、脳
に豊富な(単独矢印)、心臓に豊富な(二重矢印)、および精巣に豊富な(三重矢印)
、セリン・ヒドロラーゼ活性である。
【図２２】 複合プロテオームにおける、非共有結合のセリン・ヒドロラー
ゼ阻害剤の標的選択性の評価。異なる濃度のオレオイル・トリフルオロメチル・
ケトン(OTFMK)およびビオチニル化FPの競合反応によっては、OTFMKによって標的
化されるいくつかの脳膜セリン・ヒドロラーゼが同定される。矢印は、公知のOT
FMK標的の脳酵素脂肪酸アミドヒドロラーゼ(FAAH)を強調し、括弧は、OTFMKに対
して感受性のある2つの別の脳膜セリンヒドロラーゼを強調する。
【図２３】 FP-標識セリンヒドロラーゼ活性の親和性単離および分子特徴
付け。(A)アビジン-アガロースビーズは、未変性でなくて変性されたFP-標識タ
ンパク質を有効に結合する。FPビオチン-標識タンパク質(プレ-アビジンビーズ)
の試料を、変性前の段階(85℃で、10の間、1％SDS中で加熱すること)を伴うか、
または使わずに、1時間、室温で、アビジンアガロースビーズと混合させた。SDS
-PAGE/アビジンブロッティング(ポスト-ビーズ)による上清の可視化により、SDS
-処理試料(＋SDS)中でアビジンビーズを単に結合させるいくつかのタンパク質(
矢印)を同定し、そのタンパク質は対照試料(-SDS)に比べて対応の溶出画分(溶出
)が特に豊富であった。ただし、左側パネルは3分の露光を表すが、右側パネルは
、1秒の露光を表す。様々な露光時間は、この方法により達成されるFPビオチン
標識タンパク質の高い濃度を反映している。(B)分子同定FPビオチン標識タンパ
ク質。アビジンの豊富なFP標識タンパク質の内の8つが、SDS-PAGEゲルから切除
され、トリプシンで消化され、生じたペプチドを、MALDIおよび／または電気噴
霧質量分析法によって分析した。質量情報は、これらのタンパク質の全てを、セ
リンヒドロラーゼとして同定した(GenBankアクセッション番号についてのテキス
トを参照)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｑ 1/26 1/34 1/34 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣＣ Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣＣＺ 33/50 ＺＮＡ 33/50 ＺＮＡＺ 33/68 33/68 (31)優先権主張番号 ６０／２２２，５３２ (32)優先日 平成12年８月２日(2000．8．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ソレンセン エリック アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン ディエゴ キングスフィールド コート 13296 (72)発明者 パトリセリ マシュウ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン ディエゴ フィートストーン ＃94 2750 (72)発明者 ラバト マーサ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン ディエゴ ポート ラ パズ ＃140 4015 (72)発明者 アダム グレゴリー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン ディエゴ カニミト エル リンコン ＃86 3568 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FA34 FB05 4B063 QA01 QA18 QQ79 QQ91 QR01 QR02 QR10 QS36 QX02 4C071 AA01 BB01 CC02 CC21 DD06 EE13 FF04 GG06 GG07 HH04 JJ01 JJ05 JJ06 JJ07 KK14 LL01 LL07 LL10 4H006 AA03 AB80 4H045 AA10 AA30 BA10 BA50 EA50 FA10

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 複合タンパク質組成物の標的タンパク質メンバーと、式R*(F
    -L)-Xの複数のメンバーを含む組み合わせ化学ライブラリーの少なくとも一つの
    活性に基づいたプローブ(「ABP」)メンバーの少なくとも一個の共有結合生成物
    を含む組成物であって、 式中、Xが、生成物が形成される前に存在しているリガンドか、またはリガン
    ドを提供するために反応性の官能基に添加されたリガンドであり、該リガンドが
    ライブラリーのメンバーのそれぞれについて同じ化学構造を持っており、 Lが該ライブラリーのそれぞれのメンバーにおいて同じである結合基すなわち
    連結基であり、 Fがタンパク質メンバーの活性部位で反応性の官能基であり、官能基は該ライ
    ブラリーのメンバーのそれぞれにおいて同じ反応性官能基を含んでおり、および Rがライブラリーのメンバーのそれぞれで異なった1kDal未満の基であり、 *が、RがFまたはLの部分であることを意図しており、ならびに 該ライブラリーのメンバーが前記タンパク質メンバーと速度が異なる組成物。
  2. 【請求項２】 Fがアシル基、ならびにRが、ライブラリーの別個のメンバー
    において大きさ、立体配座および電荷分布の少なくとも一つが異なる脱離基であ
    る、請求項1記載の組成物。
  3. 【請求項３】 ライブラリーが、R基が異なる少なくとも10個の異なるメン
    バーを含む、請求項1記載の組成物。
  4. 【請求項４】 Fが、アルキル化官能基、アシル化官能基、ケトン官能基、
    エポキシド官能基、アルデヒド官能基、スルホニル官能基およびホスホリル官能
    基からなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
  5. 【請求項５】 ライブラリーの各メンバーに対するリガンドおよび連結基の
    少なくとも一つが、別個の非天然量の少なくとも一つの安定な同位体元素リンカ
    ーを含む、請求項４の組成物。
  6. 【請求項６】 リガンドが、電磁気シグナルを発生する、請求項1記載の組
    成物。
  7. 【請求項７】 Xがオリゴヌクレオチドである、請求項1記載の組成物。
  8. 【請求項８】 Xがコードされた粒子である、請求項1記載の組成物。
  9. 【請求項９】 標的タンパク質が酵素であり、同じ触媒活性を持つ酵素群の
    メンバーである、請求項1記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 酵素が加水分解酵素である、請求項9記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 リンカーが、開裂可能なリンカーである、請求項1記載の
    組成物。
  12. 【請求項１２】 複合タンパク質組成物の標的酵素と、式R(F-L)-Xの複数の
    メンバーを含む組み合わせ化学ライブラリーの少なくとも一つの活性に基づいた
    プローブメンバーとの少なくとも一個の共有結合生成物を含む組成物であって、 式中、Xが、生成物が形成される前に存在しているリガンドか、またはリガン
    ドを提供するために反応性の官能基に添加されたリガンドであり、該リガンドは
    ライブラリーのメンバーのそれぞれについて同じ化学構造を持っており、 Lが該ライブラリーのそれぞれのメンバーにおいて同じである結合基すなわち
    連結基であり、 Fが標的酵素の活性部位で反応性のスルホニル基であり、および Rがライブラリーのメンバーのそれぞれで異なった1kDal未満の有機基でありF
    に結合しており、ならびに ライブラリーのメンバーが標的酵素と速度が異なる組成物。
  13. 【請求項１３】 Rが、アルキル基、シクロアルキル基、ヘテロサイクリル
    基およびアリール基ならびにそれらの置換されたメンバーからなる群より選択さ
    れる、請求項12記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 Fがエポキシドである、請求項1記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 式R(F-L)-Xの複数のメンバーを含む組み合わせ化学ライブ
    ラリーであって、 式中、Xが相互受容体に結合するためのリガンドであり、 Lがライブラリーのそれぞれのメンバーにおいて同じである結合基すなわち連
    結基であり、 Fが標的酵素の活性部位で反応性のスルホニル基であり、および Rがライブラリーのメンバーのそれぞれで異なった1kDal未満の有機基でありF
    に結合しており、ならびに ライブラリーのメンバーが標的酵素と速度が異なる組み合わせ化学ライブラリ
    ー。
  16. 【請求項１６】 式R(F-L)-Xの複数のメンバーを含む組み合わせ化学ライブ
    ラリーであって、 式中、Fがスルホニルであり、 Lが1-3アミド基またはポリオキシアルキレンからなるアルキレン連結基であり
    、 Xがビオチンであり、および Rがスルホン酸エステルを形成するようにFに結合し、アリールまたはヘテロア
    リールである、組み合わせ化学ライブラリー。
  17. 【請求項１７】 一つのメンバーRに対するヘテロアリールが、ピリジルま
    たはチオフェニルである、請求項15記載の組み合わせライブラリー。
  18. 【請求項１８】 式R(F-L)-Xの複数のメンバーを含む組み合わせライブラリ
    ーであって、 式中、Xが相互受容体に結合するためのリガンドであり、 Lが連結基であり、 Fが標的酵素の活性部位で反応性のスルホニル基であり、および Rがライブラリーのメンバーのそれぞれで異なっている1kDal未満の有機基であ
    りLの鎖にあり、ならびに ライブラリーのメンバーが標的酵素と速度が異なる、組み合わせ化学ライブラ
    リー。
  19. 【請求項１９】 式 R*(F-L)-X、 の複数のメンバーを含む組み合わせ化学ライブラリーを用い、生物供給源由来の
    タンパク質の複合混合物に含まれる活性なタンパク質に対して親和性を持つ分子
    についてスクリーニングを行う方法であって、 式中、Xが、生成物が形成される前に存在しているリガンドか、またはリガン
    ドを提供するための反応性の官能基に添加されたリガンドであり、該リガンドは
    ライブラリーのメンバーのそれぞれについて同じ化学構造を持っており、 Lが該ライブラリーのそれぞれのメンバーにおいて同じである結合基すなわち
    連結基であり、 Fがタンパク質メンバーの活性部位で反応性の官能基であり、官能基は該ライ
    ブラリーのメンバーのそれぞれにおいて同じ反応性官能基を含んでおり、および Rがライブラリーのメンバーのそれぞれで異なった1kDal未満の基であり、 *が、RがFまたはLの部分であることを意図しており、ならびに 該ライブラリーのメンバーがタンパク質メンバーと速度が異なっていて、 (1)官能基を活性なタンパク質と反応させて結合体が形成できる条件下で組み
    合わせ化学ライブラリーを、活性型および不活性型の複合混合物と結合させる段
    階、 (2)活性型および不活性型の複合混合物から結合体を単離する段階、および (3)活性型および不活性型複合体と形成された結合体を比較する段階 を含み、それによって該不活性型複合混合物中には存在しないが該活性型複合混
    合物には含まれる結合体が、該組み合わせライブラリーのメンバーと反応する活
    性なタンパク質のみからなるようにしたスクリーニング方法。
  20. 【請求項２０】 複合混合物が細胞のプロテオームである、請求項19記載さ
    れた方法。
  21. 【請求項２１】 Fがスルホン酸エステルである、請求項19記載の方法。
  22. 【請求項２２】 Fがエポキシドである、請求項19記載の方法。
  23. 【請求項２３】 天然の供給源由来のタンパク質の複合混合物における細胞
    の表現型に影響を与えるタンパク質メンバーに対して親和性を持つメンバーにつ
    いて組み合わせライブラリーをスクリーニングする方法であって、 (1)式中、Xがリガンドであり、リガンドがライブラリーのメンバーのそれぞれ
    で同じ化学構造を持っており、 Lが結合基または連結基であり、それが該ライブラリーのそれぞれのメンバー
    において同じであり、 Fがタンパク質メンバーの活性部位で反応性の官能基であり、官能基は該ライ
    ブラリーのメンバーのそれぞれにおいて同じ反応性官能基を含んでおり、および Rがライブラリーのメンバーのそれぞれで異なった1kDal未満の基であり、 *が、RがFまたはLの部分であることを意図しており、ならびに 該ライブラリーのメンバーがタンパク質メンバーと速度が異なる、 式 R*(F-L)-X の複数のメンバーを含む第1の切断型組み合わせ化学物質を、野生型プロテオー
    ムを含む第1の細胞型と、官能基を活性型タンパク質と反応させて結合体を形成
    できる条件下で結合させる段階であり、第1の組み合わせライブラリーの切断型
    メンバーがXを欠如している段階、 (2)表現型の変化を持つ第1の細胞型に対し、第1の細胞型の表現型の変化を検
    出する段階、 (3)官能基を活性タンパク質と反応させて結合体を形成できる条件下で、Xを持
    つ組み合わせ化学ライブラリーを、野生型プロテオームを含む該第1の細胞型か
    ら得られる可溶化液と結合させる段階、 (4)野生型プロテオームから結合体を単離する段階、および (5)結合体に含まれるタンパク質を特徴づける段階 を含む方法。
  24. 【請求項２４】 Fが、アルキル化官能基、アシル化官能基、ケトン官能基
    、エポキシド官能基、アルデヒド官能基、スルホニル官能基およびホスホリル官
    能基からなる群より選択される、請求項23記載の方法。
  25. 【請求項２５】 組み合わせライブラリーの各メンバーに対するリガンドお
    よび連結基の少なくとも一つが別個の非天然量の少なくとも一つの同位体元素を
    含み、かつ結合体の少なくとも一個のリガンドおよび／または連結基について同
    位体元素組成物を検出する段階を含む、請求項23記載の方法。
  26. 【請求項２６】 酵素の活性部位に対する特異的親和性を持つ部分を同定す
    るための方法であって、 a)式中、Xが、生成物が形成される前に存在しているリガンドか、またはリガ
    ンドを提供するために反応性の官能基に添加されたリガンドであり、該リガンド
    はライブラリーのメンバーのそれぞれについて同じ化学構造を持っており、 Lが該ライブラリーのそれぞれのメンバーにおいて同じである結合基または連
    結基であり、 Fがタンパク質メンバーの活性部位で反応性の官能基であり、官能基が該ライ
    ブラリーのメンバーのそれぞれにおいて同じ反応性官能基を含んでおり、および Rがライブラリーのメンバーのそれぞれで異なった1kDal未満の基であり、 *が、RがFまたはLの部分であることを意図しており、ならびに 該ライブラリーのメンバーがタンパク質メンバーと速度が異なる、 式 R*(F-L)-X の複数のメンバーを含む組み合わせライブラリーを、酵素結合体を生成するため
    に酵素を含む試料と接触させる段階、 b)酵素結合体を単離する段階、および c)該酵素複合体を崩壊させて、該結合体の該ライブラリーの該メンバーを同定
    する段階、 を含み、活性部位に該メンバーを指向させるR基が、該活性部位に対する親和性
    を持つR基の指標であるような方法。
  27. 【請求項２７】 リンカーが開裂可能な結合を含み、崩壊が開裂可能な結合
    の開裂である、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 試料が、生物体液、細胞画分、または細胞可溶化液である
    、請求項２６の方法。
  29. 【請求項２９】 共通の活性部位を持つタンパク質属のメンバーに対して特
    異的な親和性を持ち、タンパク質属に対して特異的な官能基、結合受容体に結合
    するためのリガンド、リンカーおよび親和性部分を含み、リンカーのファミリー
    を含む抗体に基づくプローブ(「ABP」)を同定する方法であって、 候補のABPを、活性に基づくプローブがメンバーの活性部位に結合して結合体
    を形成する条件下で該タンパク質属の少なくとも一つの活性なメンバーと結合さ
    せる段階、 候補のABPを、活性なメンバーを用いた場合と同じ条件下で共有結合以外の別
    の結合によって不活性化させたメンバーと結合させる段階、 受容体に結合するリガンドによって活性なメンバーと不活性なメンバーを用い
    て形成した結合体を単離する段階、 該不活性なメンバーを用いて形成した結合体の量を検出する段階、および 複合体の量が所定レベルを超えた場合に候補のABPを拒絶する段階 を含み、拒絶されないABP候補に対してプローブを同定し、それによってメンバ
    ーに対して特定の親和性を持つABPが同定される方法。
  30. 【請求項３０】 親和性部分が少なくとも一つの天然型および/非天然型の
    アミノ酸ならびにヌクレオチドのオリゴマーである、請求項29記載の方法。
  31. 【請求項３１】 不活性なメンバーが、熱変性によって不活性化される、請
    求項29記載の方法。
  32. 【請求項３２】 酵素がセリン加水分解酵素であり、かつ活性な官能基がフ
    ルオロリン酸誘導体であるか、または該酵素がシステイン加水分解酵素であり、
    かつ該活性な官能基がα-ハロカルボニルであるか、または該酵素がシステイン
    、ヒスチジン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸をその活性部位に持つ酵素
    であり、かつ該活性な官能基がスルホン酸ジエステルまたはエポキシドであるか
    、または該酵素が還元酵素であり、かつ該活性な官能基がアルキンであるか、ま
    たは該酵素がメタロ酵素であり、かつ該官能基がαハロヒドロキサミン酸である
    、請求項29記載の方法。
  33. 【請求項３３】 候補のABPの組み合わせライブラリー由来のプロテオーム
    の標的タンパク質メンバーに対する活性に基づくプローブ(「ABP」）を同定する
    ためのシステムであって、 式中、Xが、生成物が形成される前に存在しているリガンドか、またはリガン
    ドを提供するために反応性の官能基に添加されたリガンドであり、該リガンドは
    ライブラリーのメンバーのそれぞれについて同じ化学構造を持っており、 Lが該ライブラリーのそれぞれのメンバーにおいて同じである結合基または連
    結基であり、 Fがタンパク質メンバーの活性部位で反応性の官能基であり、官能基は該ライ
    ブラリーのメンバーのそれぞれにおいて同じ反応性官能基を含んでおり、および Rがライブラリーのメンバーのそれぞれで異なった1kDal未満の基であり、 *が、RがFまたはLの部分であることを意図しており、ならびに 該ライブラリーのメンバーがタンパク質メンバーと速度が異なる、 式 R*(F-L)-X の複数のメンバーと、関連する標的タンパク質の少なくとも一個の群を含む候補
    のABPの組み合わせ化学ライブラリー、 標的タンパク質のそれぞれに対するABPのそれぞれの親和性を決定するために
    、該ABPと該標的タンパク質の結合体の形成に基づいて組み合わせライブラリー
    と標的タンパク質の組み合わせから得られる結果を評価する段階、および対象の
    該標的タンパク質に対する該ABPのそれぞれの親和性のプロファイルを提供して
    前記結果を得るための方法を用いる段階のためのプログラムを含む、値を受け入
    れかつ伝達するためのプログラムされたデータ処理装置を含むシステムであり、 該ABPと該標的タンパク質の結合条件下で結合させることによって、該標的タ
    ンパク質に対する該ABPの親和性に関して該ABPを該標的タンパク質に結合させる
    段階、 データ処理装置のための結果としてそれぞれの標的タンパク質に対するそれぞ
    れのABPの結合体の量を決定する段階、 該データ処理装置に結果を送る段階、および 結合体を形成するABPを同定するために該ABPのそれぞれの結合のための値を伝
    達する段階を含むシステム。
  34. 【請求項３４】 値が、系統樹として伝達される、請求項33記載のシステム
    。
  35. 【請求項３５】 系統樹が、色および／または明るさを結合性に関連させた
    色スキームを用いて提供されている、請求項34記載のシステム。
  36. 【請求項３６】 値が、存在比として伝達される、請求項33記載のシステム
    。
  37. 【請求項３７】 候補の化合物の組み合わせライブラリー由来の活性に基づ
    くプローブ(「ABP」）を、 式中、Xが、生成物が形成される前に存在しているリガンドか、またはリガン
    ドを提供するために反応性の官能基に添加されたリガンドであり、該リガンドは
    ライブラリーのメンバーのそれぞれについて同じ化学構造を持っており、 Lが該ライブラリーのそれぞれのメンバーにおいて同じである結合基または連
    結基であり、 Fがタンパク質メンバーの活性部位で反応性の官能基であり、官能基は該ライ
    ブラリーのメンバーのそれぞれにおいて同じ反応性官能基を含んでおり、および Rがライブラリーのメンバーのそれぞれで異なった1kDal未満の基であり、 *が、RがFまたはLの部分であることを意図しており、ならびに 該ライブラリーのメンバーが、タンパク質メンバーと速度が異なる、 式 R*(F-L)-X の複数のメンバーと、結合体を形成するための標的タンパク質との候補のABPの
    親和性に関連して標的タンパク質と候補のABPが反応する条件下で関連する標的
    タンパク質の少なくとも一つの群とを含む候補のABPの組み合わせライブラリー
    を結合させる段階、およびそれぞれの結合体の量および／またはそれぞれの結合
    体の相対的な存在量を決定する段階から得られる結果を用いて同定するためのシ
    ステムであって、 それぞれの結合体の量および／またはそれぞれの結合体の相対的な存在量を分
    析し、かつ該標的タンパク質を用いて候補のABPの速度を決定するためのプログ
    ラムを含む、データを受け取りかつ伝達するためのプログラムされたデータ処理
    装置を含む、システム。
  38. 【請求項３８】 値が系統樹として伝達される、請求項36記載のシステム。
  39. 【請求項３９】 系統樹が、色および／または明るさを速度に関連させた色
    スキームを用いて提供されている、請求項38記載のシステム。
  40. 【請求項４０】 値が存在比として伝達される、請求項36記載のシステム。
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