CN104880357A - 一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法 - Google Patents

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苏志国
马光辉
孔英俊
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一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法，该方法包括石英毛细管内壁处理、石英毛细管内壁氨基衍生、琼脂糖活化、琼脂糖偶联、蛋白质配基的偶联和封闭步骤。其特点在于毛细管亲和层析柱的制备过程简单，不需要复杂的仪器设备，层析柱内不含有微球等固体颗粒填料或常规层析介质，样品溶液在层析柱内流动阻力小，在实际应用中所需样品量小，适于微量或痕量样品的处理。

Description

一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一种层析柱的制备方法，特别地，本发明提供了一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法。
背景技术
层析技术在生物分子分离与分析中应用十分广泛，可高效、快速地从混合物中分离出目标物或去除杂质，也常用于样品浓缩、净化或溶液置换等。亲和层析是层析技术的一种，将可与目标物特异性结合的配基（如抗体、蛋白质、酶或其抑制剂等）固定在层析柱内，当样品溶液通过层析柱时目标物与固定在层析内的配基特异性结合而滞留在层析柱中，其它不被吸附的分子直接流出，通过选用适当的溶液洗脱层析柱可将被结合的蛋白质洗脱出，从而实现目标物分子的分离。常规亲和层析技术是将亲和配基（如抗体或酶的抑制剂等）固定在亲和层析介质（微球）上，再将层析介质装填到层析柱内，这种亲和层析技术常用于大量样品的高效分离，如细胞因子、抗体或酶抑制剂的分离纯化。
亲和层析技术由于其分离特异性强、高浓缩比和快速等特点在分析和检测中的应用日益广泛。在疾病诊断、污染物检测和农药残留分析等领域，常借助亲和层析将样品进行处理，再使用分析仪器（如质谱）或化学发光技术进行目标物检测，所需的样品体积较小，经常是毫升或微升级，如基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的检测技术，所需样品体积常常低于3微升。基于层析微球的亲和层析技术所需样品体积较大，对于微量或痕量样品而言，采用常规的亲和法将导致样品被稀释或回收率低，造成目标物难以被有效地检测出，导致假阳性或假阴性的结果。另外，常规层析技术也难应用于微量蛋白质样品的脱盐和浓缩、小分子标记物去除、添加物或酶的保护剂去除等。
由于传统亲和层析技术在分析和检测应用中存在的问题，尤其是样品预处理过程中存在的难于处理微量或痕量样品、处理过程导致样品稀释严重以及难以批量处理等问题，本发明旨在提供一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法，使其更适于基于仪器分析或化学发光样品的微量或痕量检测。
发明内容
本发明提供了一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法，通过毛细管表面处理和配基偶联，制备出可用于微量或痕量样品亲和层析处理的毛细管层析柱。本发明的一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法包括以下步骤：
（1）石英毛细管内壁处理，将体积比为3:7～7:3的95%的硫酸与H2O2混合液注入到内径为10微米-500微米的石英毛细管，在70℃-90℃下恒温处理0.2h-2h，使用10倍毛细管体积的去离子水冲洗毛细管内壁，使用高纯氮气将毛细管内壁吹干。
（2）石英毛细管内壁氨基衍生，将氨基硅烷溶于苯或苯同系物溶液中，浓度控制在0.01mol/L-1mol/L，将溶液注入到石英毛细管，在10℃-50℃放置10min-60min，使用10倍毛细管体积的甲苯或苯清洗毛细管内壁，使用高纯氮气将毛细管内壁吹干。
（3）多糖活化，取琼脂糖或魔芋葡甘聚糖溶于0.5mol/L-3mol/L的NaOH溶液（含1mg/mL-20mg/mL的硼氢化钠），在10℃-50℃反应1h-5h，加入1,4-丁二醇-二缩水甘油醚，在10℃-50℃反应5h-15h。加入反应液体积2倍的乙醇，离心后收集沉淀出的多糖，重新悬浮在0.1mol/L-10mol/L的NaHCO3-Na2CO3缓冲液。
（4）多糖偶联，将步骤（3）获得的活化后的多糖溶液注入步骤（2）处理后的石英毛细管，在10℃-50℃范围内放置1h-6h，使用10倍毛细管体积的NaHCO3-Na2CO3缓冲液（0.1mol/L-10mol/L）冲洗毛细管。
（5）蛋白质配基偶联，将配基蛋白质溶解于0.1mol/L-10mol/L的NaHCO3-Na2CO3缓冲液，浓度控制在0.5mg/ml-5mg/ml；将该溶液注入到步骤（4）处理后的毛细管后在10℃-50℃放置1h-5h，使用10倍毛细管体积的清水清洗毛细管。
（6）封闭：将乙醇胺溶液（浓度1mol/L-10mol/L）注入到步骤（5）处理后的毛细管，在10℃-50℃反应1h-6h，依次用10倍毛细管体积的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.0-5.0）和硼酸-四硼酸钠缓冲液（pH8.0-9.0）及去离子水清洗毛细管内壁，获得内壁偶联蛋白质配基的毛细管层析柱。
优选地，所述步骤（1）石英毛细管内壁处理过程中硫酸与H2O2的比例控制在5:5到7:3。
优选地，所述步骤（2）石英毛细管内壁氨基衍生过程中使用的氨基硅烷可以是3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基戊基三乙氧基硅烷、3-氨基己基三乙氧基硅烷。
优选地，所述步骤（2）石英毛细管内壁氨基衍生过程中用于溶解氨基硅烷的溶剂可以是苯或苯同系物，更为优选地可以是甲苯。
优选地，所述步骤（3）多糖活化过程中使用的糖可以是琼脂糖或魔芋葡甘聚糖，其分子量范围可控制在10kDa～200kDa。
本发明的特点在于一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法，通过石英毛细管内壁处理技术将氨基引入到毛细管内壁，通过活化技术将多糖链上引入环氧基团，将活化后的多糖偶联到石英毛细管内壁后，再将蛋白质配基偶联到固定在石英毛细管内壁的多糖链上。本发明的一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法其优点在于：
（1）石英毛细管亲和层析柱的制备过程简单，不需要复杂的仪器设备。
（2）制备的石英毛细管亲和层析柱内不含有微球等固体颗粒填料或常规层析介质，样品溶液在层析柱内流动阻力小。
（3）石英毛细管亲和层析柱体积小，所需样品量小，非常适于微量或痕量样品的处理。
附图说明
图1是本发明的一种石英毛细管亲和层析柱的内部结构图
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，值得提出的是，实施例只是对本发明的一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法的说明，并不能代表本发明专利的全部，更不能理解为对本发明保护范围的限制，在不脱离本发明实质的构思的前提条件下，还可以做出若干调整或改进，均属于本发明的保护范围。
实施例1：
石英毛细管：内径100微米，壁厚30微米。琼脂糖：纯度95%，分子量范围10kDa-15kDa。配基蛋白：牛胰蛋白酶抑制剂。氨基硅烷：3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
（1）石英毛细管内壁处理，将体积比为7:3的95%的硫酸与H2O2混合液注入到内径为石英毛细管，在90℃下恒温处理1小时，使用10倍毛细管体积的去离子水冲洗毛细管内壁，使用高纯氮气将毛细管内壁吹干。
（2）石英毛细管内壁氨基衍生，将氨基硅烷溶于甲苯，浓度控制在0.05mol/L，将该溶液注入到石英毛细管，在25℃放置30min，使用10倍毛细管体积的甲苯或苯清洗毛细管内壁，使用高纯氮气将毛细管内壁吹干。
（3）琼脂糖活化，取琼脂糖溶于0.5mol/L的NaOH溶液（含10mg/mL的硼氢化钠），浓度控制在1mg/ml，在25℃反应1h，加入1,4-丁二醇-二缩水甘油醚，在25℃反应5h。加入反应液体积2倍的乙醇，离心后收集沉淀出的琼脂糖，重新悬浮在1mol/L的NaHCO3-Na2CO3缓冲液。
（4）琼脂糖偶联，将步骤（3）获得的活化后的琼脂糖溶液注入步骤（2）处理后的石英毛细管，在25℃范围而内放置4h，使用10倍毛细管体积的NaHCO3-Na2CO3缓冲液（0.1mol/L-10mol/L）冲洗毛细管。
（5）胰蛋白酶抑制剂偶联，将胰蛋白酶抑制剂溶解于0.1mol/L-10mol/L的NaHCO3-Na2CO3缓冲液，浓度控制在1mg/ml；将该溶液注入到步骤（4）处理后的毛细管后在25℃放置3h，使用10倍毛细管体积的清水清洗毛细管。
（6）封闭：将1mol/L的乙醇胺溶液注入到步骤（5）处理后的毛细管，在37℃下反应2h，依次用10倍毛细管体积的乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.0-5.0）和硼酸-四硼酸钠缓冲液（pH8.0-9.0）及去离子水清洗毛细管内壁，获得内壁偶联胰蛋白酶抑制剂的毛细管层析柱。

Claims (3)

1.一种石英毛细管亲和层析柱的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：
（1）石英毛细管内壁处理，将体积比为3:7～7:3的硫酸与H2O2混合液注入到石英毛细管，在70℃-90℃下恒温处理0.2h-2h，使用10倍毛细管体积的去离子水冲洗毛细管内壁，使用高纯氮气将毛细管内壁吹干；
（2）石英毛细管内壁氨基衍生，将氨基硅烷溶于苯或甲苯，浓度控制在0.01-1mol/L，将溶液注入到石英毛细管，在10℃-50℃范围而内放置10min-60min，使用10倍毛细管体积的甲苯或甲苯清洗毛细管内壁，使用高纯氮气将毛细管内壁吹干；
（3）多糖活化，取琼脂糖或魔芋葡甘聚糖溶于含1mg/ml-20mg/ml硼氢化钠的0.5mol/L-3mol/LNaOH溶液，在10℃-50℃反应1h-5h，加入1,4-丁二醇-二缩水甘油醚，在10℃-50℃反应5h-15h，加入反应液体积2倍的乙醇，离心后收集沉淀出的多糖，重新悬浮在0.1mol/L-10mol/L的NaHCO3-Na2CO3缓冲液；
（4）多糖偶联，将步骤（3）获得的活化后的多糖溶液注入步骤（2）处理后的石英毛细管，在10℃-50℃范围内放置1h-6h，使用10倍毛细管体积的0.1mol/L-10mol/L的NaHCO3-Na2CO3缓冲液冲洗毛细管；
（5）蛋白质配基偶联，将配基蛋白质溶解于0.1mol/L-10mol/L的NaHCO3-Na2CO3缓冲液，浓度控制在0.5mg/ml-5mg/ml；将该溶液注入到步骤（4）处理后的毛细管后在10℃-50℃放置1h-5h，使用10倍毛细管体积的清水清洗毛细管；
（6）封闭：将浓度为1mol/L-10mol/L的乙醇胺溶液注入到步骤（5）处理后的毛细管，在10℃-50℃反应1h-6h，依次用10倍毛细管体积的pH4.0-5.0乙酸-乙酸钠缓冲液和pH8.0-9.0的硼酸-四硼酸钠缓冲液及去离子水清洗毛细管内壁，获得内壁偶联蛋白质配基的毛细管层析柱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（2）中使用的氨基硅烷可以是3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丁基三乙氧基硅烷、3-氨基戊基三乙氧基硅烷或3-氨基己基三乙氧基硅烷。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（3）使用的多糖是分子量范围为10kDa～200kDa的琼脂糖或魔芋葡甘聚糖。
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