CN108593792B - 水样中环境内分泌干扰物的磁固相萃取-hplc-紫外检测方法 - Google Patents
水样中环境内分泌干扰物的磁固相萃取-hplc-紫外检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种水样中环境内分泌干扰物的磁固相萃取‑HPLC‑紫外检测方法，属于环境监测技术领域。本发明的检测方法通过利用磁性氧化石墨烯对水样中的低浓度EDCs进行吸附萃取，然后洗脱、定容，由此得到了富集后的EDCs样品。而且本发明还针对此类样品的HPLC分析条件进行了优化，使得检测方法具有低成本、高灵敏度的优点。
Description
技术领域
本发明属于环境监测技术领，具体涉及一种水样中环境内分泌干扰物的磁固相萃取-HPLC-紫外检测方法。
背景技术
环境内分泌干扰物(EDCs)是广泛存在于环境中的一类污染物，能够干扰人类和动物的内分泌系统，威胁人类和动物的健康、生存及繁衍。环境内分泌干扰物与人类的生殖障碍、发育异常及某些癌症等密切相关，其对生态环境的影响更为显著，在极低浓度水平就可对环境中的生物体造成危害。由于这类污染物在环境中的存在浓度很低，目前的仪器分析方法灵敏度根本无法满足其测定的要求，因此需要样品前处理技术进行富集和纯化。传统的样品前处理方法，如索氏提取、液液萃取等，大多具有操作复杂、处理周期长、有机溶剂损耗大、萃取效率低等缺点。为了能更有效地达到富集、净化的目的，实现环境内分泌干扰物的痕量分析检测，近年来固相萃取、固相微萃取、微波辅助萃取法、加速溶剂萃取、基质固相分散萃取、免疫萃取法、超临界流体萃取法等方法广泛地被应用到样品前处理中。环境内分泌干扰物的检测方法包括色谱法、色质联用、免疫分析法等，尤其是GC-MS/MS，LC-MS/MS被广泛应用于环境内分泌干扰物的分析检测中。然而，GC-MS/MS，LC-MS/MS这些大型仪器不仅价格昂贵，而且使用成本也很高，不适合普通实验室使用。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，并提供一种水样中环境内分泌干扰物的磁固相萃取-HPLC-紫外检测方法。
本发明所采用的具体技术方案如下：
水样中环境内分泌干扰物的磁固相萃取-HPLC-紫外检测方法，其步骤如下：
1)将磁性氧化石墨烯加入盛有待测水样的容器中，然后对水样进行振荡，使水样中的环境内分泌干扰物充分吸附于磁性氧化石墨烯上；
2)将振荡后的容器放在磁铁上，待磁性氧化石墨烯与上清液分离后，去除上清液并用超纯水将容器底部的磁性氧化石墨烯转移至敞口容器中；
3)将敞口容器放在磁铁上，待磁性氧化石墨烯与上清液分离后，去除上清液再向底部的磁性氧化石墨烯中加入洗脱液，对磁性氧化石墨烯上的待测环境内分泌干扰物进行洗脱；
4)收集洗脱液，并氮吹至干，最后加入乙腈水溶液定容，微孔滤膜过滤制得待测样品；
5)对所述待测样品中的环境内分泌干扰物含量进行高效液相色谱(HPLC)分析。
本发明中，具体参数可采用如下优选方式实现：
作为优选，所述超纯水的加入量不多于50mL。
作为优选，所述洗脱液为丙酮和含1％乙酸的丙酮，且洗脱时依次加入5mL丙酮和5mL含1％乙酸的丙酮。
作为优选，所述的乙腈水溶液的浓度为57％(v/v,体积百分数)。
作为优选，所述的微孔滤膜孔径为0.22μm。
作为优选，所述HPLC分析所采用的色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C18柱(5μm，4.6×150mm)，柱温为35℃，紫外检测波长为230nm，进样量20μL，流动相为54～58％(v/v)乙腈水溶液，流速0.5～0.8mL/min。
作为优选，流动相优选为57％(v/v)乙腈水溶液，流速优选为0.7mL/min。
作为优选，所述的磁性氧化石墨烯为经过十二胺改性后的磁性氧化石墨烯。
本发明的检测方法，通过利用磁性氧化石墨烯对水样中的低浓度EDCs进行吸附萃取，然后洗脱、定容，由此得到了富集后的EDCs样品。而且本发明还针对此类样品的HPLC分析条件进行了优化，使得检测方法具有低成本、高灵敏度的优点。
附图说明
图1为流动相中乙腈含量变化对液相分离的影响；
图2为流速对保留时间的影响；
图3为流速对峰面积的影响；
图4为不同水样的色谱图，其中：a为标样，b为湖水加标水样，c为某医院处理污水加标水样；
图5为MGO(a)与MGO-DDA(b)对提取效果的影响；
图6为材料用量对提取效果的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。
实施例1：改性磁性氧化石墨烯制备
本实施例中，固相萃取剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)氧化石墨烯(GO)的制备：将23mL浓硫酸，1g石墨粉和0.5g硝酸钠在冰水浴条件下搅拌1h，使其充分混合均匀；之后缓慢加入3g高锰酸钾，将温度调节至15℃(此过程中需保持体系温度不高于20℃)，搅拌1h；然后升温至35℃，继续搅拌5h后加入另外的3g高锰酸钾，35℃下搅拌12h；之后加入140mL超纯水搅拌30min，最后加入1mL 30％的双氧水，得到亮黄色溶液，终止反应。将反应得到的溶液在8000rpm的转速下进行离心，弃去上清液，用200mL 30％的盐酸溶液和超纯水将沉淀物反复清洗至上清液的pH为4-5左右为止，收集下层沉淀，置于30℃真空干燥箱中干燥24h得到GO。
(2)磁性氧化石墨烯(MGO)的制备：取0.3g GO固体溶于100mL超纯水中，超声1h使其充分溶解，得到分散均匀的黄色GO溶液；取0.01mol FeCl2·4H2O与0.02mol FeCl3·6H2O溶于10mL超纯水中，超声10min，通氮气30min后将其逐滴加入GO溶液得到混合溶液。将混合溶液在氮气气氛保护下搅拌2h，再将体系升温至65℃后，以10滴/min的速度加入28％的氨水，将体系pH调节至11，搅拌2h。反应停止后收集得到的黑色沉淀，并用乙醇和超纯水进行多次洗涤，得到的固体置于40℃真空干燥箱中干燥12h，得到MGO。
(3)磁性氧化石墨烯的修饰：称取0.4g MGO分散于10mL超纯水中得到MGO溶液，0.3g十二胺(DDA)溶于10mL乙醇中得到DDA溶液，将MGO溶液和DDA溶液在锥形瓶中混合，于室温下搅拌20h，得到的固体用乙醇，超纯水和丙酮反复洗涤后，置于40℃真空干燥箱中干燥，得到经十二胺改性的磁性氧化石墨烯MGO-DDA。
下面选取若干种典型环境内分泌干扰物(EDCs)作为研究对象考察经修饰磁性石墨烯固相萃取剂的提取效果。EDCs共7种，分别为雌酮(E1)、β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、17α-乙炔基雌二醇(EE2)、雄烯二酮(A)、双酚A(BPA)、己烷雌酚(HEX)。
1.磁性氧化石墨烯修饰前后提取效果的对比
分别用本实施例中步骤(2)制得的MGO(a)和步骤(3)制得的DDA修饰后的MGO-DDA(b)作为萃取材料，对7种含有不同EDCs的200mL水样(浓度均为5×10-8M)进行处理。7种水样中，MGO和MGO-DDA的投加量均为80mg，最终7种EDCs的回收率如图5所示。MGO-DDA的回收率在78.46～90.40％之间；而MGO对E3，E2，E1的回收率仅在41.68～43.48％之间，对其它4种EDCs的回收率也明显不如MGO-DDA。由此表明，DDA修饰显著提高了MGO对EDCs的提取能力。
2.萃取材料用量对提取效果的影响
向7种含有不同EDCs的200mL水样(浓度均为5×10-8M)中，投加不同用量的MGO-DDA萃取材料。萃取材料用量对提取效果的影响如图6所示，对于含5.0×10-8M EDCs的200mL水样，MGO-DDA的用量在80mg以下时，并不能够提供足够的吸附容量来提取回收EDCs，而材料用量大于80mg后，用量继续增加对回收率大小的影响不大：从80mg增加到140mg，BPA，EE2，HEX，A的回收率分别有6.57％，2.02％，2.73％，1.41％提高，E3，E2，E1的回收率反而有2.53％，0.55％，2.6％的下降。因此80mg量基本可以满足提取效果的要求，继续增加用量总体影响不大。
实施例2：EDCs检测
本实施例中，用于水样中典型环境内分泌干扰物的磁固相萃取-HPLC-紫外检测方法，基本步骤如下：
(1)磁固相萃取：将80mg实施例1中制备的萃取材料MGO-DDA置于试剂瓶中，加入200mL待测水样，放入恒温振荡箱中，于20℃下以200rpm的转速混合摇匀30min后取出，使水样中的EDCs充分吸附于MGO-DDA上。将试剂瓶在磁铁上放置一段时间，待MGO-DDA材料在磁铁的作用下与水体分离完全后，将上层清水倒出，用不多于50mL的超纯水将试剂瓶底部的材料转移至50mL烧杯中。将烧杯置于磁铁上，将材料吸附至烧杯底部并与上层清水分离，在空气中干燥片刻，然后依次加入5mL丙酮和5mL含1％乙酸的丙酮，将待测物从材料上洗脱，收集洗脱液，并缓慢氮吹至干，最后加入0.5mL乙腈水溶液(57wt.％)定容，并用0.22μm的微孔滤膜过滤制得待测样品用于分析。
(2)对上一步制得的待测样品中的EDCs含量进行HPLC分析，液相色谱分离测定条件如下：HPLC分析所采用的色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C18柱(5μm，4.6×150mm)，柱温为35℃，紫外检测波长为230nm，进样量20μL。
本实施例中，典型环境内分泌干扰物(EDCs)选取雌酮(E1)、β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、17α-乙炔基雌二醇(EE2)、雄烯二酮(A)、双酚A(BPA)、己烷雌酚(HEX)作为研究对象，分别配置成待测水样，试验上述磁固相萃取-HPLC-紫外检测方法的应用效果。
首先，对HPLC的流动相和流速进行确定。
P1.液相分离流动相的选择
分别试验以甲醇，乙腈以及两者的混合溶液作为流动相，对液相分离效果的影响，结果表明乙腈作为流动相分离效果较好。
进一步试验乙腈与水百分含量对分离效果的影响，结果如图1所示。流动相中乙腈含量(v/v％)在65％，63％，60％时，HEX和E1不能被有效分离；继续降低到53％，HEX出峰时间与A重合；而57％和55％的乙腈含量均可以使各个物质峰得到有效分离，两种浓度下的各个峰面积也无明显差异，因此乙腈作为流动相最佳含量为57％。
P2.液相分离条件流动相流速的选择
流动相流速对分析物出峰时间和峰面积的影响如图2、图3所示，流速的增大使得出峰时间大大缩短，与此同时也使得峰面积显著减小，而流速过小(0.5mL/min)时，目标峰出现拖尾。在保证合理运行时间同时使峰面积尽量更大，0.7mL/min为最佳的流速。
根据上述试验，可以得到本检测方法应用时，流动相参数可选择为：流动相54～58％(v/v)乙腈，流速0.5～0.8mL/min。
P3.线性范围与检测限确定
利用该方法对7种不同EDCs的线性范围与检测限进行试验，检测具体步骤如前步骤(1)和(2)，HPLC分析时流动相为57％(v/v)乙腈，流速为0.7mL/min。7种不同EDCs的线性范围与检测限如表1所示，结果表明本发明的方法具有较低的检测限。
表1 利用该方法对7种不同EDCs检测的线性范围与检测限
P4.加标回收试验
为试验检测方法在实际环境水样中的应用可行性，采集了某高校景观湖中的湖水进行了加标回收试验，进行了三种不同浓度(0.5×10-8mol/L、2.5×10-8mol/L、5.0×10- 8mol/L)的加标回收实验，检测过程与P3相同。回收率结果如表2所示。湖水中回收率在74.9％-114.7％之间，五次平行的相对标准偏差RSD<6.9％。
表2 湖水加标回收率(n＝5)
P5.不同类型水样色谱图
选择3种不同的加标水样，利用本发明的方法进行色谱分析，3种水样分别为标样(a)、湖水加标水样(b)和某医院处理污水加标水样(c)，其中(a)标样中7种不同EDCs组分浓度均为2.0×10-5mol/L；(b)、(c)水样中7种不同EDCs组分加标浓度均为5.0×10-8mol/L，其色谱图见图4。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。例如萃取过程中，并非限制在一定采用MGO-DDA，也可以采用其他MGO来实现，但需保证萃取材料具有较好的提取效果。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种水样中环境内分泌干扰物的磁固相萃取-HPLC-紫外检测方法，所述的内分泌干扰物为雌酮、β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔基雌二醇、雄烯二酮、双酚A和己烷雌酚；其特征在于，步骤如下：
1）将磁性氧化石墨烯加入盛有待测水样的容器中，然后对水样进行振荡，使水样中的环境内分泌干扰物充分吸附于磁性氧化石墨烯上；
2）将振荡后的容器放在磁铁上，待磁性氧化石墨烯与上清液分离后，去除上清液并用超纯水将容器底部的磁性氧化石墨烯转移至敞口容器中；
3）将敞口容器放在磁铁上，待磁性氧化石墨烯与上清液分离后，去除上清液再向底部的磁性氧化石墨烯中加入洗脱液，对磁性氧化石墨烯上的待测环境内分泌干扰物进行洗脱；
4）收集洗脱液，并氮吹至干，最后加入乙腈水溶液定容，微孔滤膜过滤制得待测样品；
5）对所述待测样品中的环境内分泌干扰物含量进行HPLC分析；
所述超纯水的加入量不多于50 mL；所述洗脱液为丙酮和含1%乙酸的丙酮，且洗脱时依次加入5 mL丙酮和5 mL含1%乙酸的丙酮；所述的乙腈水溶液的浓度为57%，v/v；所述的微孔滤膜孔径为0.22 μm；所述HPLC分析所采用的色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C18柱，型号为5 μm，4.6×150 mm，柱温为35℃，紫外检测波长为230 nm，进样量20 μL，流动相为体积百分数为57%乙腈水溶液，流速为0.7 mL/min；所述的磁性氧化石墨烯为经过十二胺改性后的磁性氧化石墨烯，其制备方法如下：
1）氧化石墨烯的制备：将23 mL浓硫酸，1 g石墨粉和0.5 g硝酸钠在冰水浴条件下搅拌1 h，使其充分混合均匀；之后缓慢加入3 g高锰酸钾，将温度调节至15 ℃，搅拌1 h；然后升温至35 ℃，继续搅拌5 h后加入另外的3 g高锰酸钾，35℃下搅拌12 h；之后加入140 mL超纯水搅拌30 min，最后加入1 mL 30 %的双氧水，得到亮黄色溶液，终止反应；将反应得到的溶液在8000 rpm的转速下进行离心，弃去上清液，用200 mL 30%的盐酸溶液和超纯水将沉淀物反复清洗至上清液的pH为4-5为止，收集下层沉淀，置于30 ℃真空干燥箱中干燥24 h得到GO；
2）磁性氧化石墨烯的制备：取0.3 g GO固体溶于100 mL超纯水中，超声1 h使其充分溶解，得到分散均匀的黄色GO溶液；取0.01 mol FeCl2·4H2O与0.02 mol FeCl3·6H2O溶于10mL超纯水中，超声10 min，通氮气30 min后将其逐滴加入GO溶液得到混合溶液；将混合溶液在氮气气氛保护下搅拌2 h，再将体系升温至65℃后，以10 滴/min的速度加入28 % 的氨水，将体系pH调节至11，搅拌2 h；反应停止后收集得到的黑色沉淀，并用乙醇和超纯水进行多次洗涤，得到的固体置于40℃真空干燥箱中干燥12 h，得到MGO；
3）磁性氧化石墨烯的修饰：称取0.4 g MGO分散于10 mL超纯水中得到MGO溶液，0.3 g十二胺溶于10 mL乙醇中得到DDA溶液，将MGO溶液和DDA溶液在锥形瓶中混合，于室温下搅拌20 h，得到的固体用乙醇，超纯水和丙酮反复洗涤后，置于40 ℃真空干燥箱中干燥，得到经十二胺改性的磁性氧化石墨烯MGO-DDA。
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