CN104383718B - 卡那霉素适配体亲和柱的制备方法 - Google Patents

卡那霉素适配体亲和柱的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104383718B
CN104383718B CN201410724019.0A CN201410724019A CN104383718B CN 104383718 B CN104383718 B CN 104383718B CN 201410724019 A CN201410724019 A CN 201410724019A CN 104383718 B CN104383718 B CN 104383718B
Authority
CN
China
Prior art keywords
kanamycins
aptamers
affinity column
gel
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410724019.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104383718A (zh
Inventor
廖且根
罗林广
胡丽芳
王冬根
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Of Agricultural Products Quality Safety And Standard Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute Of Agricultural Products Quality Safety And Standard Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Of Agricultural Products Quality Safety And Standard Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences filed Critical Institute Of Agricultural Products Quality Safety And Standard Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority to CN201410724019.0A priority Critical patent/CN104383718B/zh
Publication of CN104383718A publication Critical patent/CN104383718A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104383718B publication Critical patent/CN104383718B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

本发明公开一种卡那霉素适配体亲和柱的制备方法，属于亲和层析和兽药残留分析领域。采用环氧活化琼脂糖微球FF作为固相载体，与氨基修饰卡那霉素适配体偶联后，封闭载体中多余活性位点，填入微型小柱制成。所制备的适配体亲和柱能够和卡那霉素特异性结合，其加标回收率在90~100之间，至少可以重复使用五次。

Description

卡那霉素适配体亲和柱的制备方法
技术领域
本发明涉及亲和层析及兽药残留检测技术领域，具体涉及卡那霉素适配体亲和柱的制备方法及其应用。
背景技术
卡那霉素是广谱氨基糖甙类抗生素，是用来作为一种水溶性的硫酸盐，对许多革兰阴性细菌包括淋病，沙门氏菌和肺结核感染有疗效，作为第二线抗生素的形式被广泛应用于人畜共用药。卡那霉素过量可引起耳毒性和肾毒性。卡那霉素可以在动物体内积累，通过食物链传递。
目前，卡那霉素的分析方法中，常用的有高效液相色谱、毛细管电泳、液质联用等。这些仪器分析方法对样品纯度要求较高，需要经过一些前处理，传统的前处理技术有液液萃取、固相萃取等，步骤繁琐、缺乏选择性，容易受其他成分干扰，回收率不稳定。建立高选择、快速有效的样品前处理技术已成为卡那霉素检测分析中需要解决的重要问题。
基于适配体亲和层析是一种新型高效样品前处理技术。它的原理是利用适配体对靶分子选择性吸附来实现对复杂样品中靶分子的提取和净化处理，这种吸附是可逆的。适配体的亲和层析结合常规仪器分析已成为兽药残留分析的一个发展方向，但目前尚未见适配体亲和柱的制备方法及其应用报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种卡那霉素适配体亲和柱的制备方法，所研制的亲和柱是将氨基修饰的卡那霉素适配体与环氧活化的琼脂糖6FF偶联填充于固相萃取柱中，用于纯化含卡那霉素的待测样品。
本发明的技术方案为：一种卡那霉素适配体亲和柱的制备方法，其步骤：1活化：取60mg的环氧活化琼脂糖微球FF在2.0mL去离子水中悬浮溶胀成凝胶1小时。用60mL去离子水分三次洗涤凝胶，静置5min后，移除清洗液；2偶联：将氨基修饰的卡那霉素适配体溶于1mL20.0mmol/LpH10.0的磷酸盐缓冲液中。将步骤（1）溶胀凝胶悬浮于含适配体的缓冲液中，在37℃的水浴中振摇16小时。反应完后，再用3mL去离子水洗涤未反应的适配体，静置5min后，移除清洗液；3封闭：将步骤（2）凝胶悬浮到2mL1mol/LpH8.0乙醇胺溶液中，在50℃的水浴中振摇4小时，反应完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH4.0乙酸缓冲液和3mL含0.5mol/LNaCl的pH8.3偶联缓冲液交替清洗，每次清洗2min，至少循环3次；4装柱：将步骤（3）的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱（内径5.0mm,容积1.0mL），避免产生气泡，用5mL0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液平衡小柱。
氨基修饰的卡那霉素适配体为DNA合成公司商品化生产，卡那霉素适配体的序列为：5'-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGATTTTTT-NH2-3'。
本发明卡那霉素适配体亲和柱的应用方法，按下述步骤进行：a上样：放掉柱内溶液，将提取的样品用0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液溶解或稀释，上样。上样时流速不超过1mL/min，避免样品流干。b淋洗：待样品过柱后，用3mL去离子水淋洗柱床、弃去。c洗脱：用3mL甲醇洗脱，在50℃下氮气吹干，用流动相定容待测。d再生：对于使用之后的凝胶，以2~3倍柱体积的含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH8.3Tris-HCl和含0.5mol/LNaCl的0.1mol/pH4.5乙酸缓冲液交替冲洗2~3次。
本发明的优点在于：本发明制备的适配体亲和柱能够与卡那霉素特异性结合，一次净化能除去绝大部分干扰物。制备的适配体亲和柱最大结合容量约为450ng卡那霉素。采用的洗脱液为甲醇时，加标回收率在70~110%之间。制备的适配体亲和柱重复使用5次，回收率不低于70%。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1卡那霉素适配体亲和柱的制备
1活化：取60mg的环氧活化琼脂糖微球FF在2.0mL去离子水中悬浮溶胀成凝胶1小时。用60mL去离子水分三次洗涤凝胶，静置5min后，移除清洗液；2偶联：将氨基修饰的卡那霉素适配体溶于1mL20.0mmol/LpH10.0的磷酸盐缓冲液中。将步骤（1）溶胀凝胶悬浮于含适配体的缓冲液中，在37℃的水浴中振摇16小时。反应完后，再用3mL去离子水洗涤未反应的适配体，静置5min后，移除清洗液；
3封闭：将步骤（2）凝胶悬浮到2mL1mol/LpH8.0乙醇胺溶液中，在50℃的水浴中振摇4小时，反应完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH4.0乙酸缓冲液和3mL含0.5mol/LNaCl的pH8.3偶联缓冲液交替清洗，每次清洗2min，至少循环3次；
4装柱：将步骤（3）的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱（内径5.0mm,容积1.0mL），避免产生气泡，用5mL0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液平衡小柱。
其中步骤2中氨基修饰的卡那霉素适配体为DNA合成公司商品化生产。
本发明所述卡那霉素适配体亲和柱的性能评价方法：
1、实施例1所制备的亲和柱最大结合容量的测定：分别用10mL100.0ng/mL（1.0μg）过卡那霉素亲和柱。上样液每毫升收集一管，用HPLC-MS/MS测定每管中卡那霉素含量。根据下式计算：最大结合容量（即被吸附的卡那霉素总量）等于上样总量减去洗下的卡那霉素总量。结果发现，1~5mL上样液只测出卡那霉素，到5mL开始无吸附。因此，偶联2.5nmol/L卡那霉素适配体的亲和柱最大结合容量约为450ng。
2、实施例1所制备的亲和柱加标回收率和重复性测定：分别上样20mL的5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL三种不同浓度的卡那霉素，每种浓度作三组平行。收集洗涤液后用HPLC-MS/MS测定回收率。结果见表1，经测定回收率均达到70%以上，相对标准偏差少于10%。
表1制备的亲和柱加标回收率和重复性
3、实施例1所制备的亲和柱重复使用次数的确定：制备亲和柱，分别重复上样、洗涤、洗脱、再生操作，重复试验，收集洗涤液后用HPLC-MS/MS测定回收率。结果显示，五次上样20mL的10.0ng/mL卡那霉素标准溶液过同一亲和柱的回收率依次为86.7%、85.4%、81.2%，79.5%、76.2%。
4、HPLC-MS/MS评价方法的建立：
液相条件:Agilent1290UHPLC；色谱柱为AgilentEclipsePlusC18(2.1mm×100mm，1.8μm),柱温40℃；流速为0.2mL/min；流动相A:0.1%甲酸水溶液（包含10mmol/L甲酸铵）；B:甲醇；梯度洗脱条件：梯度洗脱：0~3min,10%B线性变化至100%B;3~3.1min,100%B线性变化至10%B;3.1~4min,维持10%B。质谱条件:Agilent6460QQQ;ESI(+),毛细管电压4000V,MRM检测，卡那霉素母离子/子离子及碰撞能量（*定量离子）：485.2>324.2*（15）；485.2>163.2(25)。
取1.0mg/L卡那霉素标准溶液配制成系列浓度（10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μg/L），进10.0μL，HLPC-MS/MS分析。以浓度对其线性拟合，线性方程为Y=14.86X+91.25(X，μg/L；R2=0.9970)。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一种卡那霉素适配体亲和柱的制备方法，其步骤：（1）活化：取60mg的环氧活化琼脂糖微球FF在2.0mL去离子水中悬浮溶胀成凝胶1小时，用60mL去离子水分三次洗涤凝胶，静置5min后，移除清洗液；（2）偶联：将氨基修饰的卡那霉素适配体溶于1mL20.0mmol/LpH10.0的磷酸盐缓冲液中，将步骤（1）溶胀凝胶悬浮于含适配体的缓冲液中，在37℃的水浴中振摇16小时，反应完后，再用3mL去离子水洗涤未反应的适配体，静置5min后，移除清洗液；（3）封闭：将步骤（2）凝胶悬浮到2mL1mol/LpH8.0乙醇胺溶液中，在50℃的水浴中振摇4小时，反应完后，用3mL含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH4.0乙酸缓冲液和3mL含0.5mol/LNaCl的pH8.3偶联缓冲液交替清洗，每次清洗2min，至少循环3次；（4）装柱：将步骤（3）的悬浮凝胶液移入固相萃取小柱，避免产生气泡，用5mL0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液平衡小柱。
2.根据权利要求1所述卡那霉素适配体亲和柱的制备方法，其特征在于：其中步骤（2）中氨基修饰的卡那霉素适配体为DNA合成公司商品化生产，卡那霉素适配体的序列为：5'-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGATTTTTT-NH2-3'。
3.根据权利要求1所述卡那霉素适配体亲和柱的制备方法，其特征在于：本发明卡那霉素适配体亲和柱的应用方法，按下述步骤进行：（a）上样：放掉柱内溶液，将提取的样品用0.1mol/LpH8.0磷酸盐缓冲液溶解或稀释，上样，上样时流速不超过1mL/min，避免样品流干；（b）淋洗：待样品过柱后，用3mL去离子水淋洗柱床、弃去；（c）洗脱：用3mL甲醇洗脱，在50℃下氮气吹干，用流动相定容待测；（d）再生：对于使用之后的凝胶，以2~3倍柱体积的含0.5mol/LNaCl的0.1mol/LpH8.3Tris-HCl和含0.5mol/LNaCl的0.1mol/pH4.5乙酸缓冲液交替冲洗2~3次。
CN201410724019.0A 2014-12-04 2014-12-04 卡那霉素适配体亲和柱的制备方法 Active CN104383718B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410724019.0A CN104383718B (zh) 2014-12-04 2014-12-04 卡那霉素适配体亲和柱的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410724019.0A CN104383718B (zh) 2014-12-04 2014-12-04 卡那霉素适配体亲和柱的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104383718A CN104383718A (zh) 2015-03-04
CN104383718B true CN104383718B (zh) 2016-04-06

Family

ID=52601729

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410724019.0A Active CN104383718B (zh) 2014-12-04 2014-12-04 卡那霉素适配体亲和柱的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104383718B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107262074A (zh) * 2017-01-23 2017-10-20 北京美正生物科技有限公司 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇适配体亲和柱及其制备方法和用途
CN107807034A (zh) * 2017-10-31 2018-03-16 北京农业质量标准与检测技术研究中心 一种呕吐毒素核酸适配体亲和柱及其制备方法与应用
CN111499620A (zh) * 2020-04-28 2020-08-07 辽宁科技学院 一种用葛根素核酸适配体提取废水中葛根素的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103335972A (zh) * 2013-07-16 2013-10-02 江南大学 一种基于核酸适配体的卡那霉素残留的检测方法
CN103801110A (zh) * 2012-11-07 2014-05-21 江苏维赛科技生物发展有限公司 呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011032278A1 (en) * 2009-09-17 2011-03-24 Neoventures Biotechnology Limited A method and apparatus for lateral flow determination of analyte concentration

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103801110A (zh) * 2012-11-07 2014-05-21 江苏维赛科技生物发展有限公司 呕吐毒素免疫亲和柱的制备方法
CN103335972A (zh) * 2013-07-16 2013-10-02 江南大学 一种基于核酸适配体的卡那霉素残留的检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Determination of Ochratoxin A with a DNA aptamer;Jorge A. Cruz-Aguado etc.al.;《Journal of agricultural and food chemistry》;20080511;第56卷;第10456-10461页 *
卡那霉素A酶联适配体检测芳芳研究;刘信嘉等;《分析化学研究报告》;20130930;第41卷(第9期);第1428-1433页 *
去氢甲睾酮多克隆抗体免疫亲和柱的制备研究;徐燕等;《中国食品学报》;20111031;第11卷(第7期);第195-199页 *
核酸适配体亲和色谱的研究进展;赵强等;《色谱》;20090930;第27卷(第5期);第556-565页 *
核酸适配体及其在化学领域的相关应用;谢海燕等;《化学进展》;20070630;第19卷(第6期);第1026-1033页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104383718A (zh) 2015-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104399283B (zh) 黄曲霉毒素b1适配体亲和柱的制备方法
Tan et al. Advances in analytical chemistry using the unique properties of ionic liquids
Zhang et al. Novel polymer monolith microextraction using a poly (methacrylic acid-ethylene glycol dimethacrylate) monolith and its application to simultaneous analysis of several angiotensin II receptor antagonists in human urine by capillary zone electrophoresis
Krenkova et al. Iron oxide nanoparticle coating of organic polymer‐based monolithic columns for phosphopeptide enrichment
Allen et al. Capillary electrochromatography with monolithic silica columns: III. Preparation of hydrophilic silica monoliths having surface-bound cyano groups: chromatographic characterization and application to the separation of carbohydrates, nucleosides, nucleic acid bases and other neutral polar species
Schaller et al. Separation of antidepressants by capillary electrophoresis with in-line solid-phase extraction using a novel monolithic adsorbent
CN104383718B (zh) 卡那霉素适配体亲和柱的制备方法
JP2010519532A (ja) 両性イオン性固定相上でのｈｉｌｉｃを用いたメチルマロン酸およびコハク酸の質量分析的定量的検出
Wang et al. Automated solid-phase extraction hyphenated to voltammetry for the determination of quercetin using magnetic nanoparticles and sequential injection lab-on-valve approach
CN105136951A (zh) 一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法
CN101221147A (zh) 一种毛细管电泳法检测雷替曲塞对映异构体的方法
CN104689796A (zh) 一种纳米硫化亚铜修饰的整体柱材料及其制备方法
CN111157641A (zh) 一种hplc-ms-ms法测定人血浆中卡马西平成分含量的方法
Cheng et al. Preparation and chromatographic evaluation of zwitterionic stationary phases with controllable ratio of positively and negatively charged groups
CN105388225A (zh) 一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中udpc的分析检测方法
CN104749292A (zh) 一种分散固相萃取富集环境水样品中痕量汞的方法
CN101929988B (zh) 一种用高效液相色谱法测定非布索坦有关物质的方法
CN101963603B (zh) 用hplc法分析精氨酸、盐酸精氨酸原料及制剂的方法
Bragg et al. High throughput analysis of chiral compounds using capillary electrochromatography (CEC) and CEC-mass spectrometry with cellulose based stationary phases
Zhou et al. Selective extraction and analysis of catecholamines in rat blood microdialysate by polymeric ionic liquid-diphenylboric acid-packed capillary column and fast separation in high-performance liquid chromatography-electrochemical detector
CN104535693A (zh) 一种加米霉素含量检测方法
JP6706497B2 (ja) 親水性化合物の分離分析方法
Cheng et al. Improving sensitivity for microchip electrophoresis interfaced with inductively coupled plasma mass spectrometry using parallel multichannel separation
CN103175930B (zh) 一种测定亚硫酸钠含量的高效液相色谱分析方法
JP6398289B2 (ja) 充填剤、その充填剤を用いたカラム

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant