CN114199974B - 基于同分异构体的特异性结合靶点蛋白的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

基于同分异构体的特异性结合靶点蛋白的筛选方法，利用炔基活性酯作为桥联剂，通过化学方法对氨基纳米磁球进行炔基化修饰，得到炔基化磁球，基于正交反应原理，将炔基化磁球投入不同组给药组的细胞蛋白中发生点击反应，所述给药组包括活性不同的同分异构体的给药组，并对SDS‑PAGE电泳条带进行质谱分析，分别筛选出各给药组结合的相关蛋白并使用String对其相互作用进行分析，从而判断具靶点蛋白。

Description

基于同分异构体的特异性结合靶点蛋白的筛选方法
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，特别是涉及一种基于同分异构体的特异性结合靶点蛋白的筛选方法。
背景技术
药物的靶点确认最常用的方法是磁球捕获法，但是在应用磁球捕获药物的特异性靶点蛋白的过程中，必定会出现非特异性结合，“钓取”出假阳性蛋白的情况。活性分子大多数具有同分异构体，它们的生物活性与其立体结构有着内在的联系。利用活性差异的同分异构体鉴别法是辨别靶点蛋白，排除非特异性吸附蛋白的有效方法。因此为了排除非特异性的干扰，将药物修饰成两种活性各异的衍生物，作为一种同分异构体对捕获的靶点蛋白进行比较，从而可以筛选出特异性结合的蛋白，准确找出特异性的靶点蛋白。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种特异性结合靶点蛋白的筛选方法。
本发明的另一方面，19-叠氮穿心莲内酯和14-叠氮穿心莲内酯在基于同分异构体的靶点蛋白鉴别中的应用。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
利用活性不同的同分异构体在磁性捕获中的差异进行筛选特异性结合靶点蛋白的方法
在上述技术方案中，利用炔基活性酯作为桥联剂，通过化学方法对氨基纳米磁球进行炔基化修饰，得到炔基化磁球，基于正交反应原理，将炔基化磁球投入不同组给药组的细胞蛋白中发生点击反应，所述给药组包括活性不同的同分异构体的给药组，并对SDS-PAGE电泳条带进行质谱分析，分别筛选出各给药组结合的相关蛋白并使用String对其相互作用进行分析，从而判断具靶点蛋白。
在上述技术方案中，活性不同的同分异构体通过以下方法验证：在双荧光素酶报告基因系统检测中，通过计算相对荧光比率，判断活性。
本发明的另一方面，19-叠氮穿心莲内酯和14-叠氮穿心莲内酯在基于同分异构体的靶点蛋白鉴别中的应用。
在上述技术方案中，利用10-5M的19-叠氮穿心莲内酯和14-叠氮穿心莲内酯具有不同的抗炎活性，鉴别靶点蛋白的种类。
在上述技术方案中，所述靶点蛋白为具有穿心莲内酯抗炎作用机制的靶点蛋白。
在上述技术方案中，利用炔基活性酯作为桥联剂，通过化学方法对氨基纳米磁球进行炔基化修饰，得到炔基化磁球，基于正交反应原理，将炔基化磁球投入不同组给药组的细胞蛋白中发生点击反应，所述给药组包括19-叠氮穿心莲内酯给药组和14-叠氮穿心莲内酯给药组，并对SDS-PAGE电泳条带进行质谱分析，分别筛选出各给药组结合的相关蛋白并使用String 对其相互作用进行分析，从而判断具有穿心莲内酯抗炎作用机制的靶点蛋白。
在上述技术方案中，所述19-叠氮穿心莲内酯(19-azide-AG)通过以下方法制备：
步骤1，将原料穿心莲内酯AG溶于二氯甲烷中，加入2,2-二甲氧基丙烷和吡啶对甲苯磺酸盐，搅拌反应完成后，将反应液中加入乙酸乙酯和NaHCO3水溶液洗涤，有机相干燥浓缩得中间体1；
步骤2，将中间体1溶于DMF中，加入咪唑和叔丁基二甲基硅烷基氯(TBDMSCl)室温搅拌，反应完成后，将反应液中加入乙酸乙酯和水溶液萃取，有机相干燥浓缩得中间体2；
步骤3，将中间体2溶于MeOH中，加入对甲苯磺酸，冰浴搅拌，随后加入乙酸乙酯和水溶液萃取，有机相干燥浓缩得中间体3；
步骤4，将中间体3溶于DCM中，加入Et3N，加入4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯，室温搅拌2天，有机相干燥，浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)得中间体4；
步骤5，将中间体4溶于THF中，加入TBAF，反应完成后，加入乙酸乙酯，水洗，有机相干燥，浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)得19-叠氮穿心莲内酯。
在上述技术方案中，所述14-叠氮穿心莲内酯(14-azide-AG)通过以下方法制备：
将原料穿心莲内酯AG溶于DCM中，加入Et3N，加入4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯，冰浴搅拌反应完成后，有机相干燥，浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)得14-叠氮穿心莲内酯。
在上述技术方案中，所述4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯通过以下步骤合成：
步骤a.将对溴苯甲酸甲酯溶于DMF中，加入NaN3后搅拌，反应完成后，加入乙酸乙酯，有机相水洗，干燥浓缩得中间产物2。
步骤b.将中间产物2溶于THF中，加入水，氢氧化锂，冰浴搅拌，反应完成后，析出白色固体，抽滤干燥得中间产物3。
步骤c.将中间产物3溶于二氯亚砜中回流反应，旋蒸蒸去二氯亚砜，得到4-(迭氮基甲基) 苯甲酰氯。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.基于点击化学和磁性捕获对穿心莲内酯进行抗炎作用靶点的研究，在磁球捕获蛋白的过程中，必定会出现非特异性结合的现象，因此为了排除非特异性的干扰，将穿心莲内酯修饰成两种叠氮衍生物，作为一组同分异构体对捕获的靶点蛋白进行比较，从而可以筛选出特异性结合的蛋白，明确其作用靶点。
2.穿心莲内酯的结构中具有C-14和C-19位两个化学环境相近的羟基，选取在穿心莲内酯C-14和C-19位羟基上分别修饰叠氮基团的策略，为后续的靶点蛋白研究作铺垫。
3.本发明合成了两种穿心莲内酯的叠氮化衍生物，并使用双荧光素酶报告基因系统测试两种衍生物的抗炎活性并判断两种衍生物抗炎活性的差异，可用于抗炎作用靶点研究。
附图说明
图1是4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯的合成路径。
图2是19-叠氮穿心莲内酯的合成路径。
图3是14-叠氮穿心莲内酯的合成路径。
图4是穿心莲内酯衍生物的抗炎活性评价。
图5是炔基功能化磁球与叠氮穿心莲内酯的点击化学示意图。
图6是流动相梯度设置。
图7是SDS-PAGE电泳结果图。
图8是使用STRING分析的泳道6和泳道7炎症相关蛋白关系图。
图9是使用STRING分析的泳道6特异性炎症相关蛋白关系图。
图10是使用STRING分析的泳道7特异性炎症相关蛋白关系图。
图11是19-叠氮穿心莲内酯特异性蛋白炎症信号通路图。
图12是Compound 1的核磁图谱。
图13是Compound 2的核磁图谱。
图14是Compound 3的核磁图谱。
图15是Compound 4的核磁图谱。
图16是19-azide-AG的核磁图谱。
图17是14-azide-AG的核磁图谱。
图18是Fe3O4、氨基纳米磁球、炔基化磁球的红外光谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.1
4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯的合成方法包括以下步骤(如图1所示)：
步骤a.将原料1对溴苯甲酸甲酯(1g)溶于10mL DMF中，加入NaN3(0.57g)后搅拌，TLC显示原料完毕，加入乙酸乙酯150mL，有机相水洗，干燥浓缩得0.75g白色固体产物2，产率90％。
步骤b.将产物2(0.75g)溶于10mL THF中，加入水10mL，氢氧化锂0.25g，冰浴搅拌，TLC显示原料反应完全，析出白色固体，抽滤，所得固体抽干得0.66g白色固体化合物3，产率95％。
步骤c.将化合物3(0.66g)溶于5mL二氯亚砜中，回流4h，旋蒸蒸去二氯亚砜，得0.727 g无色油状物产品4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯(产物4)，产率100％。
1.2
19-叠氮穿心莲内酯(19-azide-AG)的合成方法包括以下步骤(如图2所示)：
a.将原料AG(1g)溶于20mL二氯甲烷中，加入2,2-二甲氧基丙烷(2.4mL,19.6mmol)和吡啶对甲苯磺酸盐(72mg,0.29mmol)，搅拌反应，TLC显示原料消失后，将反应液中加入乙酸乙酯和NaHCO3水溶液洗涤，有机相干燥浓缩得1g白色固体compound 1，产率90％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.02–6.86(m,1H),5.02(d,J＝6.0Hz,1H),4.90(s,1H),4.63 (s,1H),4.52–4.39(m,1H),4.35–4.23(m,1H),3.97(d,J＝11.6Hz,1H),3.58–3.42(m,1H),3.33–3.11(m,2H),2.58(t,J＝7.5,7.5Hz,2H),2.49–2.35(m,1H),2.17(s,1H),2.03–1.93(m, 2H),1.90–1.69(m,4H),1.42(s,3H),1.37(s,3H),1.32–1.29(m,1H),1.20(s,3H),0.96(s,3H). 13C NMR(101MHz,CDCl3)δ14.2,16.2,21.1,23.2,25.0,25.3,26.1,27.1,34.5,37.6,37.9,38.4, 52.2,56.0,60.5,63.9,66.0,74.5,76.3,99.2,109.0,128.0,147.0,149.0,170.4,171.3.
b.将原料compound 1(1g)溶于10mL DMF中，加入咪唑0.35g和TBDMSCl 0.423g室温搅拌，TLC显示原料消失后，将反应液中加入乙酸乙酯和水溶液萃取，有机相干燥浓缩得1.16g白色固体compound 2，产率90％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.81–6.69(m,1H),5.05–4.93(m,1H),4.79(s,1H),4.50(s,1H),4.39–4.27(m,1H),4.07–3.96(m,1H),3.87 (d,J＝11.6Hz,1H),3.45–3.36(m,1H),3.08(d,J＝11.5Hz,1H),2.58–2.44(m,1H),2.42– 2.24(m,2H),1.95–1.83(m,3H),1.80–1.57(m,5H),1.32(s,3H),1.28(s,3H),1.24–1.22(m, 1H),1.10(s,3H),0.87(s,3H),0.82(s,9H),0.08(s,3H),0.03(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3) δ-4.6,-4.2,16.5,17.8,23.1,24.8,24.9,25.2,25.7,25.7,26.1,26.9,34.5,37.6,38.0,38.2,51.9, 56.1,64.0,67.0,74.0,76.0,99.2,109.8,127.4,146.7,148.3,170.0.
c.将原料compound 2(1.16g)溶于30mL MeOH中，加入对甲苯磺酸0.039g，冰浴搅拌，随后加入乙酸乙酯和水溶液萃取，有机相干燥浓缩得0.854g白色固体compound 3，产率80％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.91–6.78(m,1H),5.13–5.02(m,1H),4.86(s,1H),4.56 (s,1H),4.47–4.36(m,1H),4.19(d,J＝11.2Hz,1H),4.14–4.03(m,1H),3.58–3.42(m,1H), 3.33(d,J＝11.2Hz,1H),2.91–2.76(m,2H),2.62–2.50(m,1H),2.48–2.36(m,2H),2.03– 1.94(m,1H),1.88–1.77(m,4H),1.76–1.66(m,1H),1.27–1.24(m,4H),0.91(s,9H),0.68(s, 3H),0.16(s,3H),0.12(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ-4.7,-4.2,15.4,17.8,22.7,23.6, 24.7,28.2,37.2,37.7,38.7,42.8,55.1,56.0,64.1,67.0,74.0,80.4,109.7,127.3,146.4,148.3, 170.0.
d.将原料compound 3(0.854g)溶于50mL DCM中，加入Et3N 0.5mL，加入酰氯(0.358g)，室温搅拌2天。有机相干燥，浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)得0.13g白色固体 compound 4，产率12％，回收0.68g原料compound 3(80％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d) δ7.90(d,J＝8.2Hz,2H),7.27(d,J＝7.9Hz,2H),6.75–6.67(m,1H),4.94(d,J＝6.7Hz,1H), 4.76(s,1H),4.47(s,1H),4.32–4.23(m,4H),3.99–3.93(m,1H),3.34–3.25(m,1H),2.54– 2.39(m,1H),2.37–2.25(m,2H),1.98–1.63(m,8H),1.33–1.29(m,1H),1.18–1.14(m,4H), 0.79(s,9H),0.66(s,3H),0.04(s,3H),-0.00(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ-4.7,-4.2,15.0, 17.8,22.6,24.4,24.6,25.6,27.8,37.5,37.8,38.9,42.8,54.2,55.2,56.1,65.5,67.0,73.9,78.7, 109.9,127.4,128.0,130.1,130.6,140.6,146.2,148.1,166.2,170.0.
e.将原料compound 4(0.13g)溶于50mL THF中，加入TBAF(0.054g)，TLC显示反应完毕，加入200mL乙酸乙酯，水洗，有机相干燥，浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1： 1)得0.05g白色固体compound 5(19-azide-AG)，产率47％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d) δ8.00(d,J＝7.9Hz,2H),7.39(d,J＝7.9Hz,2H),6.97–6.88(m,1H),5.02(d,J＝6.0Hz,1H),4.89(s,1H),4.60(d,J＝4.9Hz,1H),4.48–4.43(m,1H),4.43–4.39(m,2H),4.35(d,J＝11.8Hz, 1H),4.28–4.21(m,1H),3.42–3.36(m,1H),2.57(t,J＝6.5,6.5Hz,2H),2.49–2.41(m,1H), 2.11–2.02(m,2H),2.01–1.93(m,2H),1.88–1.79(m,3H),1.78–1.70(m,1H),1.57–1.47(m, 1H),1.34–1.31(m,1H),1.27(s,3H),0.77(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ14.8,22.6,24.5, 24.7,27.8,37.3,37.8,39.1,42.8,54.2,55.2,56.0,65.6,66.0,74.5,78.7,109.0,128.1,130.1,140.7, 146.5,148.8,166.4,170.4.
1.3
14-叠氮穿心莲内酯(14-azide-AG)的合成方法包括以下步骤(如图3所示)：
将原料AG(1g)溶于5mL DCM中，加入Et3N 0.5mL，加入酰氯(0.358g)，冰浴搅拌反应2h。有机相干燥，浓缩，硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝3：1)得0.39g白色固体compound614-叠氮穿心莲内酯，产率36％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.05(d,J＝7.9Hz,2H),7.43(d,J＝7.9Hz,2H),6.17(d,J＝6.0Hz,1H),4.48(s,1H),4.68–4.63(m,1H),4.50–4.45(s, 1H),4.13(d,J＝11.8Hz,1H),2.52–2.35(m,3H),1.78–1.70(m,1H),1.27–1.24(m,1H),1.22 (s,3H),0.59(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ15.1,22.7,23.6,25.4,28.1,36.9,37.6,38.8, 42.7,54.1,55.1,55.7,64.1,68.4,71.7,80.2,108.8,123.8,128.6,130.3,141.5,146.7,151.1,165.67, 169.25.
对C-14位羟基进行叠氮化修饰可以直接得到目标产物，但在尝试直接修饰C-19位羟基时，我们发现这样反应的效率极低，会生成多种副产物且反应的硅胶柱层析分离也较为困难，因此采取了一种“绕路”的合成方式，先将与C-19位羟基活性最相似的C-14位羟基用离去基团覆盖住，再对C-19位羟基进行选择性修饰，随后再将C-14位的离去基团去掉，这样既减少了副产物的生成又提高了原料利用率。通过对核磁谱图的分析，确认了最终产物的结构，也证实了该种方法的准确性。
实施例2
2.1
完全培养基的配制方法：1mL双抗、10mL胎牛血清、89mL DMEM培养基。
2.2
细胞培养：
293T细胞是人胚肾细胞系，购自美国典型培养物保藏中心(American Type CμLture Collection)。将细胞置于5×5培养瓶内(含4mL DMEM完全培养基)，于CO2培养箱(37℃,5％ CO2)中培养，具体操作方法如下：
1)细胞复苏：从-80℃冰箱中取出细胞，迅速放到37℃水浴中，以1000rpm离心3min，弃去上清后使用培养基打散细胞，再次离心并弃去上清，取适量培基分散细胞并转移到培养瓶中，十字法混匀后置于37℃的CO2培养箱中培养。
2)传代：从培养箱中取出培养瓶，观察细胞的生长状况，细胞贴壁长满时即可传代。弃去旧的培养液，使用胰酶预洗后弃去，再加入1mL胰酶反应30s后弃去，用完全培养基终止消化后弃去。用1mL完全培养基将细胞吹散，可铺于96孔细胞板中用于给药实验，也可一分为二传代于培养瓶内继续培养。
3)质粒转染：将293T细胞培养于96孔细胞板中，待细胞生长比例至50-70％时，采用预试效果最佳的比例，将转染试剂PEI(1mg/mL)800ng/孔、NF-κB荧光素酶报告基因质粒pGL4.32 100ng/孔和内参荧光素酶报告基因质粒Renilla 9.6ng/孔共转染入细胞内，转染18h后可用于给药。
4)细胞给药：设置空白对照组(Con)、模型组(Mod)、阳性药物地塞米松组(Dex 10- 4M)、穿心莲内酯不同剂量组(10-4M,10-5M,10-6M)三组、19-叠氮穿心莲内酯(10-4M,10-5M,10-6M) 三组、14-叠氮穿心莲内酯(10-4M,10-5M,10-6M)三组，共12组，每组6孔，与刺激产生细胞炎症模型的TNF-α(10ng/mL)共孵育6h。
5)细胞裂解：给药结束后，弃去细胞培养液，PBS清洗2次，加入1％被动细胞裂解液20μL/孔振荡30min。
6)荧光检测：取15μL细胞裂解上清液，加入100μL配制好的萤火虫荧光素酶检测试剂，轻轻混匀后，用ModμLus荧光检测仪检测并记录NF-κB荧光值。再加入100μL混匀的内参荧光素酶检测试剂，轻轻混匀，用ModμLus荧光检测仪检测并记录Renilla荧光值。计算相对荧光比率(相对荧光比率＝NF-κB荧光值/内参Renilla荧光值)，根据比率的高低判断NF-κB的含量变化。
根据实验结果，绘制柱状图(如图4所示)，同种药物组内对比可以看出穿心莲内酯及其衍生物的相对荧光比率随着药物浓度的升高而减小，这表明穿心莲内酯及其衍生物的抗炎活性随着药物浓度的升高而增强。同时，对比相同浓度的穿心莲内酯及其两种同分异构衍生物的荧光值可以看出，在10-4M时，两种衍生物与穿心莲内酯的相对荧光比率基本相近，表明在高浓度下，衍生物可以保持抗炎活性；到10-5M(中浓度)时，19-叠氮穿心莲内酯与穿心莲内酯的抗炎活性基本相近，而14-叠氮穿心莲内酯衍生物的抗炎活性已经不明显，表明穿心莲内酯的14-叠氮化降低了自身的抗炎活性；到10-6M(低浓度)时，穿心莲内酯及其两种同分异构衍生物的抗炎活性都不明显。根据以上结果可以推断出穿心莲内酯C-19位修饰叠氮的衍生物保留着较好的抗炎活性，而C-14位修饰叠氮的衍生物抗炎活性发生改变，较修饰前的抗炎活性变弱。
实施例3
为后续筛选穿心莲内酯抗炎作用机制的靶点蛋白，借助研究同分异构体在磁性捕获中的差异，确证结合的特异性。因此，修饰叠氮基团的两种穿心莲内酯衍生物的抗炎活性需要有所差异。在双荧光素酶报告基因系统检测中，通过计算相对荧光比率，可以直观的反映出药物对TNF-α刺激产生的细胞炎症模型中NF-κB的抑制作用，从而判断药物的抗炎活性。同时，随着药物浓度的升高，穿心莲内酯表现出的抗炎活性也随之增加。
实验结果表明，穿心莲内酯C-19位修饰叠氮的衍生物保留着较好的抗炎活性，而C-14 位修饰叠氮的衍生物抗炎活性发生改变，较修饰前的抗炎活性变弱。这与Liu等的研究结果相吻合，也证明了我们选择该实验方法探究穿心莲内酯的构效关系是可行的。因此，两种抗炎活性有所差异的穿心莲内酯衍生物可以为后续基于同分异构体的靶点蛋白鉴别方法提供基础，对比两种衍生物结合的靶点蛋白能够确定蛋白结合的特异性，可以更为直观的确定具有抗炎活性的衍生物特异性结合的蛋白，排除非特异性结合蛋白的干扰，准确找出与抗炎作用相关的靶点蛋白。
BEAS-2B细胞培养：
BEAS-2B细胞是人正常肺上皮细胞，购自美国典型培养物保藏中心(AmericanType CμLture Collection)。将细胞置于10×10培养瓶内(含10mL 1640完全培养基)，于CO2培养箱(37℃,5％CO2)中培养，具体操作方法如下：
1)细胞复苏：从-80℃冰箱中取出冻存的细胞，迅速放到37℃水浴中，融化后1000rpm 离心3min，弃去上清后使用培养基打散细胞，再次离心并弃去上清，取适量培基吹散细胞防止细胞粘连，随后转移到10×10培养瓶中，十字法混匀后置于37℃的CO2培养箱中培养。
2)传代：从培养箱中取出培养瓶，观察细胞的生长状况，细胞贴壁长满时即可传代。弃去旧的培养液，使用胰酶预洗后弃去，再加入2.5mL胰酶反应2min后弃去，用完全培养基终止消化后弃去。用5mL 1640完全培养基将细胞吹散，一分为二传代于培养瓶内继续培养，用于后续实验。
BEAS-2B细胞总蛋白的提取
将长满细胞的培养瓶中的培养基弃去，用PBS洗三次细胞确保瓶中无培养基，加入RIPA 细胞裂解液450μL/瓶，冰上水平静置30min，用细胞刮将培养瓶中的细胞脱壁，收集细胞裂解液并于4℃、13000rpm的条件下离心10min，取上清液于-80℃密封保存。
叠氮穿心莲内酯与细胞总蛋白的结合
将提取的BEAS-2B细胞总蛋白分为6组，600μL/组，编号为1、2、3、4、5、6，将1 和4两组直接置于-80℃保存，向2、5两组中以10-4M的浓度加入19-叠氮穿心莲内酯，向 3、6两组中以10-4M的浓度加入14-叠氮穿心莲内酯，将2、3、5、6四组药物与蛋白混合液于4℃振荡反应12h，使其充分结合。
炔基功能化磁球与叠氮穿心莲内酯的结合
分别取30mg未功能化的氨基纳米磁球与30mg炔基功能化氨基纳米磁球，用PBS将两种磁球分别洗两次，以10mg/组的用量将未功能化的空磁球加到编号为1、2、3的三组细胞总蛋白或叠氮穿心莲内酯与细胞总蛋白结合液中，以10mg/组的用量将炔基功能化磁球加到编号为4、5、6的三组细胞总蛋白或叠氮穿心莲内酯与细胞总蛋白结合液中，每组分别以10-4 M的浓度加入VC-CuSO4催化剂，于4℃振荡反应48h(如图5所示)。弃去反应液，用PBS 将磁球洗三次，每组加入450μL 0.1％SDS缓冲液，置于100℃金属浴加热5min，取上清于 -80℃冷冻30min，随后冷冻干燥6h。
SDS-PAGE电泳
冻干后的样品每组加入20μL 1x蛋白上样缓冲液，置于100℃金属浴加热5min，按照 Lane 1：蛋白Marker、Lane 2：蛋白+空球、Lane 3：蛋白+空球+19-叠氮穿心莲内酯、Lane4：蛋白+空球+14-叠氮穿心莲内酯、Lane 5：蛋白+功能化磁球、Lane 6：蛋白+功能化磁球+19- 叠氮穿心莲内酯、Lane 7：蛋白+功能化磁球+14-叠氮穿心莲内酯的顺序加样，80V至蛋白上样缓冲液前沿跑至分离胶，调整电压至120V直至蛋白上样缓冲液跑出分离胶停止电泳。切下胶条并用考马斯亮蓝液染色20min，使用脱色液脱色3h。
电泳质谱检测
将19-叠氮穿心莲内酯与14-叠氮穿心莲内酯功能化磁球所捕获的两组蛋白凝胶电泳泳道 (泳道6和泳道7)分别切下，放入干净的1.5mL离心管中并编号。在每个离心管内加入1mL 水，清洗10min，将水移除，重复一次。在每个离心管中加入1mL胶内消化脱色液，清洗 10min，将脱色液移除，重复一次。加入乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈。加10mMDTT，让胶粒吸收完全，放入56℃水浴锅内，孵育1h。孵育完毕后，移除多余DTT液体，加入55mM IAM，暗室室温孵育45min。孵育完毕后，移除多余IAM液体，加入25mM碳酸氢铵，清洗10min，并重复清洗一次。移除碳酸氢铵，加入脱色液清洗10min，并重复一次。乙腈脱水至胶粒完全变白，真空抽干乙腈。将1μg/μL的酶储液以25mM碳酸氢铵稀释 15倍，加入到脱水后的胶粒中，让胶粒充分吸收。然后加入25mM碳酸氢铵没过胶粒，放入37℃水浴锅，消化过夜。过夜后，加入终浓度0.1％的FA终止消化。取10μL样品上机，使用质谱仪进行Q-E质谱鉴定，流动相梯度设置如下(图6)。
从电泳图(图7)中可以看出，未功能化磁球的三条泳道(泳道2、3、4)基本相同，考马斯亮蓝染色后的颜色较浅，浓度虽有不同但没有明显差异；而在功能化磁球捕获蛋白的泳道中，未给药组的蛋白染色(泳道5)较给药组更浅，19-叠氮穿心莲内酯(泳道6)与14-叠氮穿心莲内酯(泳道7)两组所捕获的蛋白也有所差异，保持抗炎活性的19-叠氮穿心莲内酯与抗炎活性不强的14-叠氮穿心莲内酯相比较有几个存在明显不同的条带，可以推断出泳道6中存在与功能化磁球特异性结合的蛋白，可能是穿心莲内酯抗炎的作用靶点。
电泳质谱结果分析
将19-叠氮穿心莲内酯与14-叠氮穿心莲内酯功能化磁球所捕获的两组蛋白泳道(以下简称泳道6和泳道7)分别切下，进行Q-E质谱鉴定。
质谱结果表明，泳道6共检测出762种蛋白，泳道7共检测出917种蛋白。我们通过对比两泳道的所有蛋白，从泳道6中共筛选出25种与炎症通路相关的蛋白，从泳道7蛋白样品中共筛选出22种与炎症通路相关的蛋白，两组蛋白的具体信息(包括蛋白名称与相关炎症通路)列于表4.1和表4.2中。
表4.1 19-叠氮穿心莲内酯捕获的炎症相关蛋白信息
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表4.2 14-叠氮穿心莲内酯捕获的炎症相关蛋白信息
Figure DEST_PATH_IMAGE002
通过两组表格可以看出，泳道6和泳道7的炎症相关蛋白共有28种。我们使用STRING (https://string-db.org/)分析出这些炎症相关蛋白存在的相互作用关系(图8)。通过KEGG (http://www.kegg.jp/)分析这些蛋白的信号通路，我们筛选出与炎症相关的通路，包括：与 IKBKB、PKN1、PKN2、YWHAB、YWHAH、SYK、MAPK1相关的PI3K/Akt信号通路；与IKBKB、MAPK1、MAPKAPK5、HSPA8、HSPA1A相关的MAPK信号通路；与IKBKB、 SYK、ERC1相关的NF-κB信号通路；与IKBKB、MAPK1、CD4相关的T细胞受体信号通路；与IKBKB、SYK、MAPK1相关的B细胞受体信号通路。通过筛选出的这些炎症信号通路，我们可以看出穿心莲内酯发挥抗炎作用具有多靶点的特性。
同时，从表4.1和表4.2中可以看出，我们筛选的两组炎症相关蛋白中相同的有19种蛋白，泳道6所捕获的炎症相关蛋白有六种(表中斜体标注)，较泳道7的三种更多，且泳道6 中的特异性炎症相关蛋白CD4、IKBKB、PKN1、PKN2、YWHAB、YWHAH与NF-κB通路、 PI3K/Akt通路、MAPK通路、T细胞受体通路等炎症通路相关，比泳道7的炎症相关特异性蛋白更多。随后，我们分别对两组样品的炎症特异性蛋白之间相互作用通过STRING进行检测，分析它们之间在功能上的关系。如图9所示，泳道6样品蛋白中的6种特异性炎症相关蛋白存在着相互作用关系，通过KEGG分析出IKBKB、PKN1、PKN2、YWHAB、YWHAH 这五种蛋白均与PI3K/Akt信号通路相关，CD4、IKBKB与T细胞受体信号通路相关。如图 10所示，泳道7样品蛋白中的3种特异性炎症相关蛋白间几乎不存在相互作用关系，并非与相关炎症通路存在关系的特异性信号通路。
从对比同分异构体衍生物不同的靶点蛋白结果来看，19-叠氮穿心莲内酯能够特异性的结合CD4、IKBKB、PKN1、PKN2、YWHAB、YWHAH这六种炎症相关蛋白，其抗炎活性与调控PI3K/Akt信号通路和T细胞受体信号通路相关，而14-叠氮穿心莲内酯没有特异性介导的炎症信号通路，这也进一步证明了不同的结构修饰能造成穿心莲内酯抗炎活性的差异。
为筛选穿心莲内酯抗炎作用机制的靶点蛋白，我们想借助研究同分异构体在磁性捕获中的差异，确证药物与靶点蛋白结合的特异性。19-叠氮穿心莲内酯衍生物保留着原有的抗炎活性，而14-叠氮穿心莲内酯衍生物的抗炎活性发生了改变，因此对比两种衍生物结合的靶点蛋白能够确定蛋白结合的特异性，准确找出与抗炎作用相关的靶点蛋白。
随后，我们合成了炔基活性酯作为桥联剂，用化学方法对氨基纳米磁球进行炔基化修饰，并对其进行了形态、粒径、磁性等一系列的表征。结果表明，氨基纳米磁球形态和粒径均一且在体系中较为分散，并且剩余磁性更小，超顺磁体的特性明显，能够在体系中保持分散状态从而充分的表露其上修饰的官能团，红外光谱检测结果显示，纳米磁球的炔基化修饰成功。
将19-叠氮穿心莲内酯衍生物与14-叠氮穿心莲内酯衍生物分别与BEAS-2B细胞蛋白进行结合。基于正交反应原理，将炔基化磁球投入不同组给药组的细胞蛋白中发生点击反应，对两种穿心莲内酯衍生物的作用靶点进行捕获并对SDS-PAGE电泳条带进行质谱分析，分别筛选出各组结合的炎症相关蛋白并使用String对其相互作用进行分析，结果表明穿心莲内酯可作用于多个靶点以及多条信号通路，从而发挥抗炎的作用。同时对比两种穿心莲内酯衍生物捕获的靶点蛋白结果，可分析出19-叠氮穿心莲内酯能够特异性的结合CD4、IKBKB、PKN1、 PKN2、YWHAB、YWHAH六种炎症相关蛋白，其抗炎活性与调控PI3K/Akt信号通路和T 细胞受体信号通路相关(图11)，而14-叠氮穿心莲内酯没有特异性介导的炎症信号通路，这也进一步证明了不同的结构修饰能造成穿心莲内酯抗炎活性的差异。
从对比穿心莲内酯同分异构体衍生物不同的靶点蛋白结果来看，C-19修饰的穿心莲内酯保持着较好的抗炎活性，可直接作用于T淋巴细胞的膜糖蛋白CD4，阻断T细胞受体信号通路并介导下游的PI3K/Akt信号通路，还可以抑制IκB的激活从而抑制NF-κB炎症因子的产生，这些都与现有的研究结果相一致。同时，我们也有了新的发现，穿心莲内酯还能够抑制 PKN蛋白激酶，从而介导Rho蛋白诱导的转录激活，抑制Akt促存活诱导激酶活性，除此之外，穿心莲内酯还能够抑制14-3-3酸性蛋白调控家族的活化，介导其对BAD等蛋白的调节能力，阻断细胞的凋亡过程，发挥抗炎的作用。而C-14修饰的穿心莲内酯没有特异性介导的炎症信号通路，不参与调控炎症的主要过程，这也其抗炎活性降低的原因。
我们的研究证实了穿心莲内酯可作用于多个靶点以及多条信号通路，从而发挥抗炎的作用，同时也证明了其发挥抗炎效果的重要功能基团是C-14上的羟基，并且找到了相关的作用靶点与信号通路，这也与现有的研究结果相吻合。由此可以看出，我们采用同分异构体的方法找寻天然产物的特异性结合的靶点蛋白的方法是可靠的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种筛选特异性结合靶点蛋白的方法，其特征在于，利用活性不同的同分异构体在磁性捕获中的差异进行筛选，所述同分异构体为19-叠氮穿心莲内酯和14-叠氮穿心莲内酯，利用所述同分异构体具有不同的抗炎活性，鉴别靶点蛋白的种类，所述靶点蛋白为具有穿心莲内酯抗炎作用机制的靶点蛋白，所述筛选方法包括以下步骤：利用炔基活性酯作为桥联剂，通过化学方法对氨基纳米磁球进行炔基化修饰，得到炔基化磁球，基于正交反应原理，将炔基化磁球投入不同组给药组的细胞蛋白中发生点击反应，所述给药组包括活性不同的同分异构体的给药组，并对SDS-PAGE电泳条带进行质谱分析，分别筛选出各给药组结合的相关蛋白并使用String对其相互作用进行分析，从而判断具有穿心莲内酯抗炎作用机制的靶点蛋白；
所述19-叠氮穿心莲内酯的结构式为：
Figure FDA0003727815280000011
所述14-叠氮穿心莲内酯的结构式为：
Figure FDA0003727815280000012
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，活性不同的同分异构体通过以下方法验证：在双荧光素酶报告基因系统检测中，通过计算相对荧光比率，判断活性。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述19-叠氮穿心莲内酯通过以下方法制备：
步骤1，将原料穿心莲内酯AG溶于二氯甲烷中，加入2,2-二甲氧基丙烷和吡啶对甲苯磺酸盐，搅拌反应完成后，将反应液中加入乙酸乙酯和NaHCO3水溶液洗涤，有机相干燥浓缩得中间体1；
步骤2，将中间体1溶于DMF中，加入咪唑和叔丁基二甲基硅烷基氯室温搅拌，反应完成后，将反应液中加入乙酸乙酯和水溶液萃取，有机相干燥浓缩得中间体2；
步骤3，将中间体2溶于MeOH中，加入对甲苯磺酸，冰浴搅拌，随后加入乙酸乙酯和水溶液萃取，有机相干燥浓缩得中间体3；
步骤4，将中间体3溶于DCM中，加入Et3N，加入4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯，室温搅拌2天，有机相干燥，浓缩，硅胶柱层析得中间体4；
步骤5，将中间体4溶于THF中，加入TBAF，反应完成后，加入乙酸乙酯，水洗，有机相干燥，浓缩，硅胶柱层析得19-叠氮穿心莲内酯。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述14-叠氮穿心莲内酯通过以下方法制备：
将原料穿心莲内酯AG溶于DCM中，加入Et3N，加入4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯，冰浴搅拌反应完成后，有机相干燥，浓缩，硅胶柱层析得14-叠氮穿心莲内酯。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯通过以下步骤合成：
步骤a.将对溴甲基苯甲酸甲酯溶于DMF中，加入NaN3后搅拌，反应完成后，加入乙酸乙酯，有机相水洗，干燥浓缩得中间产物2；
步骤b.将中间产物2溶于THF中，加入水，氢氧化锂，冰浴搅拌，反应完成后，析出白色固体，抽滤干燥得中间产物3；
步骤c.将中间产物3溶于二氯亚砜中回流反应，旋蒸蒸去二氯亚砜，得到4-(迭氮基甲基)苯甲酰氯。
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