CN109283262B - 通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，采用以下方式进行：色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.005mol/L四丁基溴化铵水溶液‑甲醇为流动相，检测波长为210～310nm，柱温为25～40℃，流动相速度为0.5～2.0mL/min，其中四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.0～9.0；样品溶液配制：采用极性溶剂分别配制含雷替曲塞及其杂质各0.1～1.0mg/mL的溶液；测定：将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。利用本发明的方法可以快速准确地进行雷替曲塞原料药及其制剂的有关物质的定量分析，从而保证雷替曲塞的质量可控性。

Description

通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法。
背景技术
雷替曲塞是由英国的Royal Marsden医院的癌症研究署与Zeneca共同合作开发的药物。它是一种胸腺核苷酸合成酶抑制剂，属于叶酸的衍生物，用于治疗晚期直肠结肠癌患者。1996年在英国首次上市，商品名Tomudex，同年在法国等国家上市。其作为晚期结直肠癌的一线治疗药物，具有毒副作用小、给药方便、价格便宜等优点，在中国的需求量大。
雷替曲塞的结构式如下：
雷替曲塞的主要不良反应包括对胃肠道、血液系统及肝酶的可逆性影响。其中胃肠道系统最常见的不良反应有恶心、呕吐、腹泻及食欲不振。这些不良反应可能是由其中的杂质引起。雷替曲塞合成过程中的起始原料、中间体、终产物类似物以及降解产物等均可能成为其杂质，从而影响产品的质量。因此，对原料药及制剂进行质量控制一直是药物研发工作中的重点和难点。
本申请的发明人对雷替曲塞合成过程中可能引入的杂质进行了深入研究，杂质的结构如下表所示：
杂质A是雷替曲塞合成过程中的中间体(5-氨基噻吩-2-羰基)-L-谷氨酸二乙酯的水解物，杂质C、D、E、F是合成的副产物，杂质G(5-硝基-2-噻吩甲酸)和杂质H(6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮)为合成雷替曲塞的起始原料。因此，对这七个相关物质的定量控制具有重要意义。
文献“注射用雷替曲塞的质量控制”(中国医院药学杂志，2009，29(12):1003-1005)公开了以缓冲液(含0.03mol/L磷酸氢二钾及0.03mol/L三乙胺，磷酸调pH7.2)-甲醇(68：32)为流动相用高效液相色谱法测定雷替曲塞制剂中有关物质的方法。
文献“高效液相色谱法测定雷替曲塞的含量”(抗感染药学，2008，5(1)：19-21)公开了以甲醇：0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(42：58，用磷酸调节pH值2.5)为流动相用高效液相色谱法测定雷替曲塞含量及有关物质的方法。
文献“高效液相色谱法测定大鼠血浆中雷替曲塞浓度”(药物分析杂志，2005，25(7):778-780)公开了以1％醋酸-甲醇-乙腈(60：25：15)为流动相用高效液相色谱法测定大鼠血浆中雷替曲塞浓度的方法。
目前尚未见关于雷替曲塞与上述七个杂质的分离测定方法的文献报道。亦无文献公开杂质C和杂质F的结构以及在雷替曲塞原料药或制剂中对其进行质量控制的方法。因此，开发一种分离测定雷替曲塞与该七个杂质的方法对于控制雷替曲塞的质量，提高药品疗效、降低毒副作用是非常必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，可以对雷替曲塞及其相关的杂质进行分离测定。
所述的相关杂质可选自杂质A、C、D、E、F、G、H，其具体的化学结构及分子式如前所述。
本发明是通过以下技术手段实现的：
一种通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，采用以下方式进行：
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液-甲醇为流动相，检测波长为210～310nm，其中四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.0～9.0；
样品溶液配制：采用极性溶剂分别配制含雷替曲塞及其杂质各0.1～1.0mg/mL的溶液；
测定：将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。
所述的通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，流动相四丁基溴化铵水溶液与甲醇的体积比为65：35～75：25。
所述的通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，样品溶液配制采用的极性溶剂选自0.1mol/L氢氧化钠水溶液、甲醇、乙腈，优选0.1mol/L氢氧化钠水溶液。
所述的通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，优选流动相四丁基溴化铵水溶液与甲醇的体积比为70：30，四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.5。
所述的通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，检测波长优选226nm。
所述的通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，柱温为25～40℃，优选30℃。
所述的通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，流动相速度为0.5～2.0mL/min，优选1.0mL/min。
所述的通过高效液相色谱法分离测定雷替曲塞及其杂质的方法，样品溶液配制优选为含雷替曲塞1.0mg/mL，杂质各0.5mg/mL的溶液。
本发明的有益效果：采用本发明的方法来控制雷替曲塞中的杂质含量，可以实现雷替曲塞与各杂质的完全分离，其与各杂质的分离度均大于1.5，各杂质间的分离度均大于1.2，理论板数按雷替曲塞峰计算达到6487。杂质的检测灵敏度非常高，杂质A、C、D、E、F、G、H的检测限依次为79.2、59.4、20.7、1.3、11.7、6.3、5.2ng/mL。利用本发明的方法可以快速准确地进行原料药雷替曲塞及其制剂的有关物质的定量分析，从而保证雷替曲塞及其制剂的质量可控性。
附图说明
图1：实施例3系统适用性溶液测定的图谱
图2：实施例3雷替曲塞供试品溶液测定的图谱
图3：实施例3注射用雷替曲塞冻干粉针制剂供试品溶液测定的图谱
图4：实施例3注射用雷替曲塞冻干粉针空白辅料溶液的图谱
图5：参考例1系统适用性溶液测定的图谱
图6：参考例2系统适用性溶液测定的图谱
具体实施方式
以下实施例仅对本发明内容作进一步说明，并不限定本发明。
以下实施例所用的杂质A～F为公司自制，5-硝基-2-噻吩甲酸购自南京沃伦科技有限公司，6-溴甲基-3,4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮购自连云港方和化工有限公司。其中杂质C、杂质F分别参照实施例1、实施例2制备。
实施例1杂质C的制备
(1)5-硝基-2-噻吩甲酰氯的制备
将30g 5-硝基-2-噻吩甲酸与50ml氯化亚砜投入100ml的三颈瓶中，升温，控制内温75℃～80℃搅拌反应2h后，取反应液约1ml，加入2ml无水甲醇衍生化，以5-硝基-2-噻吩甲酸为对照，TLC检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。将反应液转移至250ml单口瓶中，浓缩至干，加入30ml甲苯减压带干，得绿色针状结晶。
(2)N-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备
将35.0gL-谷氨酸二乙酯、150ml二氯甲烷及12.5ml二异丙基乙胺投入250ml三颈瓶中，降温，控制内温0℃～5℃缓慢滴加50ml的二氯甲烷/5-硝基-2-噻吩甲酰氯溶液，滴毕，保温0℃～5℃搅拌反应30min，取样约1ml进行TLC检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，将反应液依次用2mol/L盐酸100ml×2洗涤，饱和碳酸氢钠100ml×2洗涤，分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干得N-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯38.2g。
(3)N-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备
将上步制备得到的38.2gN-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯、76.4g还原铁粉、30.6g硫酸亚铁、573ml甲醇、191ml纯化水投入1L的三颈瓶中，升温，控制内温60℃～65℃搅拌反应5h后取样约1ml进行TLC检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5)至反应终点。反应毕，布氏漏斗垫76.4g硅藻土抽滤，以76.4ml甲醇洗涤滤饼，合并滤液减压浓缩至无液滴。旋蒸残留物以150ml×3二氯甲烷萃取，合并有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸至干得到棕色油状物42.4g。该油状物以150ml二氯甲烷分散，55g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5～1:1)分离共得到淡黄色油状物28.7g。
(4)N-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯
将上述得到的28.7g淡黄色油状物以287mlDMA溶解后加入到500ml的三颈瓶中，依次加入25.8g碘甲烷，6.6g吡啶后升温，控制内温50℃～55℃搅拌反应12h，取样1ml加入5ml纯化水淬灭后以1ml乙酸乙酯萃取，吸取有机相TLC检测乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应结束。反应毕，以二氯甲烷150ml×3萃取，合并有机相以饱和氯化钠溶液150ml×2洗涤后分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，浓缩，得到21.1g棕色油状物，该油状物以150ml二氯甲烷分散，45g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:2～1:1.5)分离共得到淡黄色油状物18.7g。
(5)杂质C的制备
将10gN-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯以50ml无水乙醇分散后加入预先冷却至5℃～10℃氢氧化钠水溶液中(5gNaOH、80ml纯化水)，控制内温5℃～10℃搅拌反应5h，取样约1ml进行TLC检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，以50ml×2乙酸乙酯洗涤水相，分取水相，以2mol/L的盐酸调节pH至3.5，将反应液减压浓缩至干进行脱盐操作(加入50ml×3乙腈洗涤旋蒸后的残留物，合并乙腈浓缩至干)，共得到目标化合物6.7g。1H NMR：δ1.92(2H，tr)，2.25-2.28(2H，q)，2.94(6H，s)，4.20-4.22(1H，d)，5.88-5.89(1H，d)，7.50-7.51(1H，d)，7.77(1H，s)，ESI-：299.1[M-H]-
实施例2杂质F的制备
(1)N-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯的制备
参照实施例1的步骤(1)、(2)、(3)制备。
(2)N-(5-甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯
将DMF 100ml、2,6-二甲基吡啶2.0g、N-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯10g、碘甲烷4.5g加入到250ml三口瓶中，搅拌均匀，加热升温，控制料液温度50-60℃反应6小时。HPLC监控反应结束，降温至10～30℃，加入15％食盐水80ml淬灭，用乙酸乙酯200ml平均分3次萃取，静置分液。合并有机相，加入无水硫酸镁搅拌脱水2小时，抽滤至无液体流出。滤液转移至旋转蒸发仪中，浓缩至无液体流出，得油状物。柱层析纯化得中间体N-(5-甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯8.02g。
(3)中间体II的制备
将N-(5-甲氨基-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸二乙酯1.3g用N,N-二甲基甲酰胺75ml热溶解备用。将三氯甲烷75ml、6-溴甲基-3，4-二氢-2-甲基-喹唑啉-4-酮4.45g、碳酸氢钠2.05g加入到三口瓶中，搅拌2分钟后，加入中间体Ⅲ的溶液。升温，控温68～75℃回流反应6小时，反应结束后，降温至10～30℃，抽滤至无液体流出，滤液用15％食盐水300ml平均分两次洗涤。分出水相，用二氯甲烷150ml平均分两次萃取。合并有机相，加入无水硫酸镁搅拌脱水2小时，抽滤至无液体流出。滤液转移至旋转蒸发仪中，浓缩结束后，得油状物，柱层析纯化得中间体Ⅱ2.2g。
(4)杂质F的制备
将纯化水40ml和氢氧化钠2g加入100ml三口瓶中，搅拌至溶解，降温至0～10℃。缓慢加入中间体Ⅱ，控制料液温度0～10℃，反应2小时后取样，TLC跟踪检测至反应终点。反应结束，反应液用乙酸乙酯平均分两次洗涤。收集水相，抽滤至无液体流出，将滤液转移至100ml三口瓶中，搅拌下控制料液温度0～5℃滴加2mol/L盐酸溶液，调节pH至3.50～3.70。控制料液温度0～5℃，继续析晶2小时。反应结束后，抽滤至无液体流出。收集滤饼，转移至真空干燥箱内，烘箱温度控制在50℃，烘干10小时后，得目标化合物1.72g。1H-NMR(500MHz,d6-DMSO):1.91(m,1H),2.04(m,1H),2.34(t,2H),2.45(s,3H),2.54(s,3H),3.10(s,3H),4.32(m,1H),4.53(s,2H),5.08(s,2H),6.04(d,1H),7.6～8.2(m,8H)；13C-NMR(125MHz,d6-DMSO):21.867,23.404,27.050,31.214,40.683,46.659,52.292,57.823,102.618,120.216,121.109,121.444,123.291,125.121,127.584,127.700,130.536,133.303,134.238,134.676,136.439,146.901,148.696,154.855,155.362,161.909,162.012,162.170,162.265,174.217,174.480；ESI-:[M-H]-：629.19。
实施例3专属性试验
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪
检测器：DAD
工作站：Agilent OpenLAB CDS(EZChrom Edition)
色谱柱：Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
进样量：10μL
流动相：缓冲液-甲醇(70：30)，其中缓冲液为0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液(用磷酸调节pH为8.5)
空白溶液配制：精密量取0.1mol/L的氢氧化钠水溶液0.4mL，置10mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀即得。
定位溶液配制：分别精密称取各杂质约10.0mg，置20mL量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠水溶液0.4mL并超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含0.5mg的各杂质定位溶液。
系统适用性溶液配制：精密称取雷替曲塞10.0mg，置10mL量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠水溶液0.4mL并超声使溶解，冷却，再向其中加入上述各杂质定位溶液100μL，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
雷替曲塞供试品溶液配制，精密称取雷替曲塞约10.0mg，置10mL量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠水溶液0.4mL并超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得1.0mg/mL的溶液。
自身对照溶液配制：精密量取雷替曲塞供试品溶液100μL，置10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
注射用雷替曲塞冻干粉针制剂供试品溶液配制：精密称取注射用雷替曲塞冻干粉针制剂适量，用0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释制成1.0mg/mL的溶液。
注射用雷替曲塞冻干粉针制剂空白辅料溶液配制：精密称取注射用雷替曲塞冻干粉针制剂的空白辅料适量，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液溶解并稀释制成相应浓度的溶液。
测定：取空白溶液、各定位溶液、自身对照溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果：空白溶液对测定无干扰；杂质E、H、A、G、D、雷替曲塞、杂质C、杂质F依次出峰，保留时间分别为2.160min、3.593min、7.340min、8.173min、8.960min、10.360min、12.693min、16.173min。
取系统适用性溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，雷替曲塞峰与杂质D峰和杂质C峰的分离度分别为2.2和3.5，杂质E、H、A、G、D相邻峰间分离度依次为11.9、15.1、2.7、2.2，杂质C峰与杂质F峰间的分离度为5.5，均符合要求。
取雷替曲塞供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2，按自身对照法计算，杂质E含量为0.02％，杂质A、C、D、F、G、H未检出，其它未知单杂含量0.03％，雷替曲塞含量为99.95％。取注射用雷替曲塞冻干粉针制剂供试品溶液和空白辅料溶液各10μL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果分别见图3、图4，结果显示空白辅料无干扰，杂质E含量0.01％，其它未知杂质含量为0.03％，杂质A、C、D、F、G、H未检出。所以本法可用于雷替曲塞原料及制剂的质量控制。
实施例4耐用性试验
在实施例3的检测色谱条件的基础上改变流动相的比例、pH值、柱温、流速、波长等条件，考察检测方法的耐用性。
溶液配制及测定方法参照实施例3，各色谱条件见下表所示：
结果如下表所示：
结论：在不同色谱条件下，雷替曲塞与相邻色谱峰均能达到基线分离，各杂质间的分离度均符合要求，本方法耐用性良好。
实施例5检测限试验
取各定位溶液分别用0.1mol/L氢氧化钠水溶液稀释制成一系列低浓度的溶液，分别进样，直至S/N≥3，即为检测限。结果杂质A、C、D、E、F、G、H的检测限依次为79.2、59.4、20.7、1.3、11.7、6.3、5.2ng/mL。
实施例6强制降解试验
本申请的发明人对雷替曲塞进行了强制降解试验，考察所产生的降解产物与主峰的分离情况，并采用光二极管阵列检测器进行主峰纯度检查以验证本方法专属性是否达到要求。
(1)溶液强制降解试验
水降解溶液：精密称取雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液0.4ml超声使溶解，再向其中加入纯化水2.0ml，于80℃烘箱中加热4h后，冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
酸降解溶液：精密称取雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液0.4ml超声使溶解，再向其中加入0.1mol/L的盐酸溶液2.0ml，于80℃烘箱中加热4h后，冷却，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液2.0ml中和多余的酸后，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
碱降解溶液：精密称取雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液2.0ml超声使溶解，于80℃烘箱中加热4h后，冷却，用0.1mol/L的盐酸溶液2.0ml中和多余的碱后，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化降解溶液：精密称取雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液0.4ml超声使溶解，再向其中加入3％的过氧化氢溶液2.0ml，室温放置24h后，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
光照降解溶液：精密称取雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液0.4ml超声使溶解，再向其中加入流动相2.0ml，于光照箱中放置10天后，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
紫外降解溶液：精密称取雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液0.4ml超声使溶解，再向其中加入流动相2.0ml，于紫外灯下放置10天后，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：精密量取各强制降解溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见下表所示：
(2)固态强制降解试验
高温降解溶液：精密称取于105℃烘箱中加热48h的雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液0.4ml超声使溶解，冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
高湿降解溶液：精密称取于75％RH放置14天的雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液0.4ml超声使溶解，冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
光照降解溶液：精密称取于光照箱中放置10天的雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液0.4ml超声使溶解，冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
紫外降解溶液：精密称取于紫外灯下放置10天的雷替曲塞约10.0mg，置10ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液0.4ml超声使溶解，冷却，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：精密量取各强制降解溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见下表所示：
结论：
本品固体对高湿稳定，各杂质及总杂均未增加；对高温、光照及紫外不稳定，在高温、光照和紫外条件下，杂质个数和杂质总量均有一定程度增加；本品溶液在水、酸、碱、氧化条件下均不稳定，杂质个数和杂质总量均有一定程度增加；各破坏条件下降解产物与主峰能够完全分离，破坏前后物料平衡系数均在90％～110％之间，各破坏条件下主峰峰纯度满足测定要求。本方法专属性好。
参考例1
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪
检测器：DAD
工作站：Agilent OpenLAB CDS(EZChrom Edition)
色谱柱：Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样量：10μL
流动相：缓冲液-甲醇(70：30)，其中缓冲液为0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液(用磷酸调节pH为6.5)
溶液配制方法及测定方法照实施例3进行，系统适用性溶液的图谱见图5，从图中可以看出，杂质H、A基线部分重合，不能完全分离，杂质G、D不能完全分离，雷替曲塞主峰与杂质D间的分离度达不到1.2，说明流动相的pH值对分离效果影响大。
参考例2
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪
检测器：DAD
工作站：Agilent OpenLAB CDS(EZChrom Edition)
色谱柱：Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：226nm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
进样量：10μL
流动相：缓冲液-甲醇(70：30)，其中缓冲液为0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液(用磷酸调节pH为9.5)
溶液配制方法及测定方法照实施例3进行，系统适用性溶液的图谱见图6，从图中可以看出，雷替曲塞出峰时间太晚，在1h的测定范围内杂质F尚未出峰，不适合有关物质检测。
参考例3
采用文献“中国医院药学杂志，2009，29(12):1003-1005”公开的以缓冲液(含0.03mol/L磷酸氢二钾及0.03mol/L三乙胺，磷酸调pH7.2)-甲醇(68：32)为流动相的色谱条件分离雷替曲塞与上述杂质，结果雷替曲塞与杂质C不能实现基线完全分离。
参考例4
采用文献“抗感染药学，2008，5(1)：19-21”公开的以甲醇：0.02mol/L磷酸二氢钠溶液(42：58，用磷酸调节pH值2.5)为流动相的色谱条件分离雷替曲塞与上述杂质，结果雷替曲塞与杂质D不能实现基线完全分离。

Claims (10)

1.一种分离测定雷替曲塞及其杂质的液相色谱方法，其特征在于，采用以下方式进行：
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.005mol/L的四丁基溴化铵水溶液-甲醇为流动相，检测波长为210~310nm，其中四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.0~9.0，四丁基溴化铵水溶液与甲醇的体积比为65：35~75：25；
溶液配制：采用极性溶剂分别配制含雷替曲塞及其杂质各0.1~1.0mg/mL的溶液；
测定：将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析；
所述杂质选自以下杂质：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述极性溶剂选自0.1mol/L氢氧化钠水溶液、甲醇或乙腈。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相四丁基溴化铵水溶液与甲醇的体积比为70：30，其中四丁基溴化铵水溶液用磷酸调节pH值为8.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测波长为226nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，柱温为25~40oC。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，柱温为30oC。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相速度为0.5~2.0mL/min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，流动相速度为1.0mL/min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，溶液配制采用的极性溶剂为0.1mol/L氢氧化钠水溶液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，溶液配制为含雷替曲塞1.0mg/mL，杂质各0.5mg/mL的溶液。
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