CN113861213B - 一种具有stat3降解活性的川楝素protac化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有stat3降解活性的川楝素protac化合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
一种具有STAT3降解活性的川楝素PROTAC化合物，其结构通式如下式(I)：Y为E3泛素连接酶复合体中的特定蛋白配体，为Cereblon蛋白配体或VHL蛋白配体；X为川楝素与E3泛素连接酶复合体中的特定蛋白配体之间的连接基团。还提供了一种具有STAT3降解活性的川楝素PROTAC化合物的制备方法和在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本发明的蛋白降解嵌合体衍生物在多种头颈癌细胞及结直肠癌细胞上与原型药川楝素相比显示增强的抗肿瘤活性，通过检测STAT3蛋白含量，发现在两种细胞中低剂量下均可特异性降解STAT3蛋白。本发明的蛋白降解嵌合体对头颈癌及结直肠癌肿瘤模型均有显著抑制活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一系列具有选择性降解STAT3蛋白的川楝素PROTAC化合物及其应用，该化合物可被制成用于STAT3介导的相关肿瘤的治疗药物。
背景技术
根据2020年全球最新癌症数据显示，中国新发癌症人数位居全球第一，严重危害我国人类生命健康。肿瘤分类及机制复杂，抗肿瘤靶标及靶向药物严重不足，纵观2006到2015 年间各领域新药研发成功率，肿瘤仅有5.1％，是亟需创新药物的重大疾病领域。
STAT3转录因子作为重要的致癌基因，在肿瘤微环境中被各种细胞因子和生长因子激活后，会触发STAT3的磷酸化，随后STAT3二聚化并转移至细胞核，参与调控肿癌细胞增殖、血管生成、侵袭、转移、耐药性及免疫逃逸。STAT3高表达于结直肠癌及头颈部肿瘤，与肿瘤的发生发展密切相关，是治疗两种肿瘤的潜在靶点。STAT3在头颈癌中的异常激活不仅是恶性行为的基础，也是铂类化疗和放疗等标准治疗中关键的耐药机制，此外，靶向STAT3通路已被证明可以消除HNSCC中EGFR抑制剂的耐药性。
目前通过靶向上游受体和非受体酪氨酸激酶通路抑制STAT3的小分子，由于缺乏特异性，无法应对其他信号通路的代偿；靶向SH2结构域的短肽及模拟肽抑制剂存在稳定性低、生物利用度低的局限性；靶向SH2结构域的非肽类抑制剂则由于仅抑制二聚化的STAT3，而难以抑制单体STAT3的转录活性，从而参与介导致癌基因如MET、MRAS的转录；作用于DNA或RNA 水平的CRISPR-CAS9和siRNA/shRNA技术面临不可逆编辑、存在脱靶效应等弊端。
靶向蛋白降解嵌合体PROTAC作为一种新兴的蛋白降解技术近年来脱颖而出，也受到了广大制药公司的关注。PROTAC是一种“杠铃状”的双特异性分子，一端靶向需要降解的靶蛋白，另一端靶向E3泛素化连接酶，三元复合物一经形成，则可引发多聚泛素化过程诱导靶蛋白降解。
中药活性有效成分因资源丰富，结构复杂骨架多样，是药源分析及发现的重要来源。因此，基于PROTAC的优势，筛选可特异性结合STAT3的中药小分子川楝素，将其应用于STAT3 的靶向降解对肿瘤的治疗具有重要意义。目前还未见类似的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有STAT3降解活性的川楝素PROTAC化合物及其制备方法和应用，所述的这种具有STAT3降解活性的川楝素PROTAC化合物及其制备方法和应用要解决现有技术中的药物对于治疗结直肠癌及头颈部肿瘤的效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种化合物(具有STAT3降解活性的川楝素PROTAC化合物)，其结构通式如下式(I)：
Y为E3泛素连接酶复合体中的特定蛋白配体，为Cereblon蛋白配体或VHL蛋白配体，所述Cereblon蛋白配体选自沙立度胺或其衍生物、来那度胺或其衍生物、泊马度胺或其衍生物、酰胺类化合物或者邻苯二酰亚胺类化合物中的任意一种；
X为川楝素与E3泛素连接酶复合体中的特定蛋白配体之间的连接基团。
优先的，所述的Cereblon蛋白配体的结构通式如下：
或者/>
其中A选自O或者S；
优选的A选自O；
优选的，所述的VHL蛋白配体的通式如下：
或者/>
其中R选自：-H、卤素或者C1-5直链/支链烷基。
在本发明的优选实施方式中，所述R选自：-H或者-CH3。
优选的，所述的连接基团为下述结构的任意一种：
或者/>
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
本发明提供了上述一种化合物的制备方法，包括下列步骤：
(a)首先以相应蛋白配体和3-(溴甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯为原料，以N-甲基吡咯烷酮为溶剂体系，加入二异丙基乙胺，搅拌反应至原料反应完全得产物S2,
(b)将上述产物S2溶于二氯甲烷，以三氟乙酸室温催化反应完全得到产物S3,
(c)将川楝素S4
溶于二氯甲烷，分别加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶，室温反应完全。粗品溶于乙酸乙酯，洗涤浓缩即可得到产物S5，
(d)以产物S3和S4为原料，无水N，N-二甲基甲酰胺、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'- 四甲基脲六氟磷酸酯和二异丙基乙胺为反应溶剂，0℃搅拌至原料反应完全，洗涤并浓缩，即可得到蛋白降解嵌合体衍生物S6；
具体的，所述的蛋白配体的结构式为：
本发明还提供了上述化合物、上述化合物其药学上可接受的盐、上述化合物的立体异构体、上述化合物的几何异构体、上述化合物的互变异构体、上述化合物的酯、上述化合物的前药、上述化合物的溶剂化物、上述化合物的代谢产物、上述化合物的氮氧化物或者上述化合物的氘代化合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
进一步的，所述的肿瘤为结直肠癌或者头颈部肿瘤。
本发明还提供了上述化合物、上述化合物其药学上可接受的盐、上述化合物的立体异构体、上述化合物的几何异构体、上述化合物的互变异构体、上述化合物的酯、上述化合物的前药、上述化合物的溶剂化物、上述化合物的代谢产物、上述化合物的氮氧化物或者上述化合物的氘代化合物在制备治疗STAT3过度激活相关的肿瘤的药物中的用途。
本发明提供的化合物，通过中间体Linker分别在一端靶向所要降解的目标蛋白STAT3，另一端靶向结合E3泛素连接酶，形成一个完整的化合物分子(蛋白降解嵌合体)。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。体外药理实验表明本发明的蛋白降解嵌合体衍生物在多种头颈癌细胞及结直肠癌细胞上与原型药川楝素相比显示增强的抗肿瘤活性，通过检测STAT3蛋白含量，发现在两种细胞中低剂量下均可特异性降解STAT3蛋白。体内药理实验均表明该类蛋白降解嵌合体对头颈癌及结直肠癌肿瘤模型均有显著抑制活性，并优于原型药川楝素。临床前研究发现可抑制头颈癌PDX模型及结直肠癌PDO模型，具有高效、低毒等优点，因此可用于制备抗头颈部肿瘤及抗结直肠癌药物。
附图说明
图1为根据本发明所有实施例的蛋白降解嵌合体的LS-MS图谱验证。
图2为根据本发明所有实施例的蛋白降解嵌合体的降解STAT3蛋白的作用。
图3为根据本发明一个实施例的蛋白降解嵌合体TSM-1的核磁数据。
图4为根据本发明一个实施例的蛋白降解嵌合体TSM-1对STAT3蛋白的选择性降解作用。
图5为根据本发明一个实施例的蛋白降解嵌合体TSM-1的体内抗肿瘤作用。
具体实施方式
以下结合具体实施例，所述实施例的示例在附图中示出，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1本发明蛋白降解嵌合体衍生物的制备
表1本发明蛋白降解嵌合体的结构式
下面以制备蛋白降解嵌合体TSM-1为例进行具体描述，合成路线：
合成步骤：
取S1(260mg，1mmol)、3-(溴甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(250mg，1mmol)溶于5mL N-甲基吡咯烷酮，加入二异丙基乙胺0.1mL，80℃搅拌反应至原料反应完全，乙酸乙酯稀释，水洗三次，浓缩后二氯甲烷/甲醇＝20/1柱层析得黄色固体产物S2(347mg，81％)，ESI-MS:m/z 429.2[M+H]+。
取上述S2溶于10mL二氯甲烷，滴入1mL三氟乙酸，室温搅拌至反应完全，蒸干溶剂，粗品溶于水中，滴入饱和碳酸氢钠溶液，降至5℃，析出产物，过滤得白色固体S3(260mg，98％)，ESI-MS:m/z 329.1[M+H]+。
取S4(574mg，1mmol)溶于10mL二氯甲烷，加入丁二酸酐(500mg，5mmol)、4- 二甲氨基吡啶(244mg，2mmol)，室温搅拌至原料反应完全，蒸干溶剂，粗品溶于乙酸乙酯中，依次用1N HCl溶液、水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体粗品S5(640mg， 95％)，ESI-MS:m/z 674[M]+。
取上述S3(329mg，1mmol)、S5(674mg，1mmol)溶于10mL无水N，N-二甲基甲酰胺，0℃加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(570mg，1.5mmol)，二异丙基乙胺(495uL，3.0mmol)，继续在0℃搅拌至原料反应完全，乙酸乙酯稀释，水洗三次，浓缩后水(1g/L碳酸氢铵)/乙腈＝50/50反相柱纯化得白色固体产物S6(TSM-1)(493mg， 50％)，ESI-MS:m/z 985.05[M+H]+。
实施例中所用试剂均为市售分析纯，制备液相所用溶剂为色谱纯。
TSM-2-14的制备方法参考TSM-1的进行，具体步骤如下所示：
TSM-2的合成路线：
取S19(19.3g，100mmol)、3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(16.5g，100mmol)溶于100mL醋酸，加入醋酸钠(9.84g，120mmol)，90℃搅拌反应至原料反应完全，加入1L水稀释，析出产物，过滤得紫色固体S20(28.9g，95％)，ESI-MS:m/z 304.2[M+H]+。
取上述S20(3.0g，10mmol)溶于20mL甲醇，加入10％钯碳(300mg)，碳酸氢铵(1.2g，15mmol)，氢气置换三次，室温搅拌至原料反应完全，加硅藻土抽滤，甲醇洗三次，合并滤液蒸干得绿色固体S21(2.6g，96％)，ESI-MS:m/z 274.3[M+H]+。
取上述S21(2.7g，10mmol)、3-甲酰基氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(3.7g，20mmol)、三氯化铝(2.7g，20mmol)溶于50mL无水二氯甲烷，室温搅拌10分钟后加入三乙酰氧基硼氢化钠(10.6g，50mmol)，醋酸0.5mL，室温搅拌反应至原料反应完全，加入二氯甲烷稀释，水洗三次，浓缩后二氯甲烷/甲醇＝20/1柱层析得黄色固体产物S22(1.8g，40％)， ESI-MS:m/z443.5[M+H]+。
S23操作过程同S3，得到黄色固体S23(336mg，98％)，ESI-MS:m/z 343.3[M+H]+。
S24操作过程同S6，得到黄色固体产物S24(610mg，61％)，ESI-MS:m/z 1000.0[M+H]+。
TSM-3的合成路线：
S42操作过程同S12，得到棕色固体S42(250mg，73％)，ESI-MS:m/z 341.4[M+H]+。
S43操作过程同S28，得到白色固体S43(497mg，50％)，ESI-MS:m/z 998.0[M+H]+。
TSM-4的合成路线：
取上述S1(2.6g，10mmol)、N-(叔丁氧羰基)甘氨酸(1.93g，11mmol)溶于15mL 无水N，N-二甲基甲酰胺，0℃加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(5.7g，15mmol)，二异丙基乙胺(5.0mL，3.0mmol)，继续在0℃搅拌至原料反应完全，加水稀释有白色固体析出，过滤水洗三次得白色固体产物S16(3.6g，87％)，ESI-MS: m/z 417.4[M+H]+。
S17操作过程同S3，得到白色固体产物S17(310mg，98％)，ESI-MS:m/z 317.3[M+H]+。
S18操作过程同S6，得到白色固体产物S18(530mg，54％)，ESI-MS:m/z 974.0[M+H]+。
TSM-5的合成路线；
取S25(16.4g，100mmol)、3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(16.5g，100mmol)溶于100mL醋酸，加入醋酸钠(9.84g，120mmol)，90℃搅拌反应至原料反应完全，加入1L水稀释，析出产物，过滤得紫色固体S26(25.8g，94％)，ESI-MS:m/z 275.2[M+H]+。
取上述S26(274mg，1mmol)、7-溴-1-庚醇(390mg，2mmol)、碳酸氢钠(252mg，3mmol)、碘化钾(498mg，3mmol)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺，80℃搅拌反应至原料反应完全，乙酸乙酯稀释，水洗三次，浓缩后二氯甲烷/甲醇＝20/1柱层析得白色固体产物 S27(260mg，67％)，ESI-MS:m/z 389.4[M+H]+。
取上述S27(388mg，1mmol)、S5(674mg，1mmol)溶于10mL无水N，N-二甲基甲酰胺，0℃加入(1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺)盐酸盐(288mg，1.5mmol)，4-二甲氨基吡啶(366mg，3.0mmol)，移至室温搅拌至原料反应完全，乙酸乙酯稀释，水洗三次，浓缩后水(1g/L碳酸氢铵)/乙腈＝50/50反相柱纯化得白色固体产物S28(530mg，50％)，ESI-MS: m/z1046.1[M+H]+。
TSM-6的合成路线:
取S36(1.49g，10mmol)溶于10mL甲醇，加入二碳酸二叔丁酯(3.27g，15mmol)、三乙胺(2.77mL，20mmol)，室温搅拌反应至原料反应完全，蒸干溶剂，粗品溶于乙酸乙酯，依次用1N HCl溶液、水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩得无色油状液体S37(2.25mg，90％)，ESI-MS:m/z 250.3[M+H]+。
取上述S37(2.49g，10mmol)溶于无水二氯甲烷，加入对甲苯磺酰氯(2.29g,12mmol)、 4-二甲氨基吡啶(61mg，0.5mmol)，室温搅拌反应至原料反应完全，蒸干溶剂，粗品溶于乙酸乙酯，水洗三次，浓缩后石油醚/乙酸乙酯＝2/1柱层析得无色油状液体S38(3.64g，90％)， ESI-MS:m/z 404.5[M+H]+。
TSM-7的合成路线：
S53操作过程同S16，得到白色固体S53(510mg，81％)，ESI-MS:m/z 628.8[M+H]+。
S54操作过程同S3，得到白色固体S54(510mg，97％)，ESI-MS:m/z 528.7[M+H]+。
S55操作过程同S6，得到白色固体S55(602mg，51％)，ESI-MS:m/z 1185.4[M+H]+。
TSM-8的合成路线：
取S42(340mg，1mmol)溶于10mL无水二氯甲烷，加入吡咯(272mg，4mmol)、三苯基磷(1049mg，4mmol)，氮气置换3次后，加入碘(1015mg，4mmol)，室温搅拌反应至原料反应完全，滴加饱和亚硫酸氢钠溶液淬灭，二氯甲烷萃取，水洗三次，浓缩得棕色固体S44(400mg，89％)，ESI-MS:m/z 451.3[M+H]+。
取上述S44(450mg，1mmol)、1-叔丁氧羰基哌嗪(205mg，1.1mmol)溶于10mL无水N，N-二甲基甲酰胺，加入二异丙基乙胺(495uL，3.0mmol)，80℃搅拌反应至原料反应完全，乙酸乙酯稀释，水洗三次，浓缩后二氯甲烷/甲醇＝15/1柱层析得白色固体产物S45(410mg，80％)，ESI-MS:m/z 509.6[M+H]+。
S46操作过程同S3，得到白色固体S46(394mg，97％)，ESI-MS:m/z 409.5[M+H]+。
S47操作过程同S6，得到白色固体S47(565mg，53％)，ESI-MS:m/z 1063.1[M+H]+。
TSM-9的合成路线:
取S29(1.95g，10mmol)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺，加入碳酸钾(2.76g，20mmol)、溴化苄(2.38mL，20mmol)，室温搅拌反应至原料反应完全，乙酸乙酯稀释，水洗三次，浓缩后石油醚/乙酸乙酯＝90/10柱层析得无色油状液体S30(2.62g，92％)，ESI-MS:m/z286.2 [M+H]+。
取上述S30(570mg，2mmol)、S26(274mg，1mmol)、碳酸氢钠(252mg，3mmol)、碘化钾(498mg，3mmol)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺，80℃搅拌反应至原料反应完全，乙酸乙酯稀释，水洗三次，浓缩后二氯甲烷/甲醇＝20/1柱层析得白色固体产物S31(410 mg，86％)，ESI-MS:m/z 479.5[M+H]+。
取上述S31(478mg，1mmol)溶于10mL甲醇，加入10％钯碳(100mg)，氢气置换三次，室温搅拌至原料反应完全，加硅藻土抽滤，甲醇洗三次，合并滤液蒸干得白色固体S32(367g，95％)，ESI-MS:m/z 389.4[M+H]+。
取上述S32(388mg，1mmol)、1-叔丁氧羰基哌嗪(205mg，1.1mmol)溶于10mL无水N，N-二甲基甲酰胺，0℃加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(570mg，1.5mmol)，二异丙基乙胺(495uL，3.0mmol)，继续在0℃搅拌至原料反应完全，乙酸乙酯稀释，水洗三次，浓缩后二氯甲烷/甲醇＝15/1柱层析得白色固体产物S33(457 mg，82％)，ESI-MS:m/z 557.6[M+H]+。
S34操作过程同S3，得到白色固体S34(436mg，95％)，ESI-MS:m/z 457.5[M+H]+。
S35操作过程同S6，得到白色固体产物S35(670mg，60％)，ESI-MS:m/z 1114.2[M+H]+。
TSM-10的合成路线：
S2’操作过程同S2，得到白色固体产物S2’(370mg,83％)，ESI-MS:m/z 443.5[M+H]+。
S3’操作过程同S3，得到白色固体产物S3’(332mg,97％)，ESI-MS:m/z 343.4[M+H]+。
S6’操作过程同S6，得到白色固体产物S6’(520mg,52％)，ESI-MS:m/z 1000.0[M+H]+。
TSM-11的合成路线：
合成路线参考TSM-10，S2”操作过程同S2，得到白色固体产物S2”(365mg,80％)，ESI-MS:m/z 457.5[M+H]+。
S3”操作过程同S3，得到白色固体产物S3”(347mg,97％)，ESI-MS:m/z 357.4[M+H]+。
S6”操作过程同S6，得到白色固体产物S6”(510mg,50％)，ESI-MS:m/z 1014.1[M+H]+。
TSM-12的合成路线；
取S3(328mg，1mmol)、3-甲酰基氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(370mg，2mmol)溶于10mL甲醇，加入氰基硼氢化钠(315mg，5mmol)，醋酸0.1mL，室温搅拌反应至原料反应完全，蒸干溶剂，粗品溶于乙酸乙酯中，水洗三次，浓缩后二氯甲烷/甲醇＝20/1柱层析得白色固体产物S8(350mg，70％)，ESI-MS:m/z 498.6[M+H]+。
S9操作过程同S3，得到白色固体产物S9(382mg，96％)，ESI-MS:m/z 398.5[M+H]+。
S10操作过程同S6，得到白色固体产物S10(570mg,54％)，ESI-MS:m/z 1055.1[M+H]+。
TSM-13的合成路线：
取3-(苄氧基)-3-氧代丙酸(233mg，1.2mmol)溶于5mL无水二氯甲烷，0℃下加入草酰氯(0.12mL，1.4mmol)，催化量无水N，N-二甲基甲酰胺，移至室温搅拌至原料反应完全，蒸干溶剂，粗品溶于2mL无水二氯甲烷。另取S4(574mg，1mmol)溶于5mL无水二氯甲烷，加入三乙胺(0.27mL，2mmol)，0℃下滴入上述粗品溶液，移至室温搅拌至原料反应完全，加入二氯甲烷稀释，水洗三次，浓缩后石油醚/乙酸乙酯＝1/2柱层析得到白色固体产物S5”’(390mg，52％)，ESI-MS:m/z 751.8[M+H]+。
取上述S5”’溶于10mL甲醇，加入10％钯碳(100mg)，氢气置换三次，室温搅拌至原料反应完全，加硅藻土抽滤，甲醇洗三次，合并滤液蒸干得粗品S6”’(310mg，90％)，ESI-MS:m/z 660.7[M]+。
S7操作过程同S6，得到白色固体产物S7(460mg,47％)，ESI-MS:m/z 972.0[M+H]+。
TSM-14的合成路线：
取S1(260mg，1mmol)溶于浓盐酸/水(5mL/5mL)，-5℃下缓慢滴加亚硝酸钠水溶液(138mg,2mmol,溶于1mL水)，继续搅拌1小时后滴加碘化钾水溶液(332mg,2mmol, 溶于1mL水)，滴加完移至室温搅拌过夜，TLC(二氯甲烷/甲醇＝15/1)监测原料反应完全后，过滤水洗三次得棕色固体S11(250mg，67％)，ESI-MS:m/z 371.1[M+H]+。
取上述S11(370mg，1mmol)，碘化亚铜(380mg，5mmol)，二(三苯基膦)二氯化钯(105mg，0.15mmol)，三乙胺(696uL，5mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺，氮气置换3 次后，加入3-丁炔氨基甲酸叔丁酯(519uL，3mmol)，85℃搅拌反应5小时，反应完全后乙酸乙酯稀释，水洗三次，浓缩后二氯甲烷/甲醇＝20/1柱层析得棕色固体产物S12(290mg， 70％)，ESI-MS:m/z 412.4[M+H]+。
取上述S12(290mg，0.71mmol)溶于10mL乙醇，加入10％钯碳(100mg)，氢气置换三次，室温搅拌至原料反应完全，加硅藻土抽滤，乙醇洗三次，合并滤液蒸干得粗品S13(280mg，96％)，ESI-MS:m/z 416.4[M+H]+。
S14操作过程同S3，得到白色固体产物S14(302mg，96％)，ESI-MS:m/z 316.4[M+H]+。
S15操作过程同S6，得到白色固体产物S15(490mg，50％)，ESI-MS:m/z 974.0[M+H]+。
实施例2本发明所有实施例(TSM 1-13)的蛋白降解嵌合体的LS--MS图谱验证
LC-MS数据见附图1示。本发明的各蛋白降解嵌合体的分子量如下表1示。
表1本发明的化合物TSM-1～13的分子量
实施例3本发明所有实施例的蛋白降解嵌合体对STAT3蛋白的降解作用
将本发明所有蛋白(TSM 1-14)降解嵌合体分别用DMSO配制成浓度为10mM的储存液。预先将细胞CAL33、HCT116分别以1.5*105个/毫升的密度铺在六孔板中，贴壁生长过夜后，弃去原培养基，分别加入含不同浓度上述药物的低血清培养基，将培养板在37℃，体积百分比浓度为5％CO2培养箱中预培养36小时。给药结束后，弃去培养基，加入一定体积的细胞裂解液，冰上裂解并收取蛋白，进行Western实验。最后使用化学发光显影液对目的条带进行显影并分析做图。结果如附图2所示，本发明所有实施例的蛋白降解嵌合体在头颈癌细胞系 CAL33和结直肠癌细胞系HCT116中对STAT3蛋白具有明显的降解作用。
实施例4本发明所有实施例的蛋白降解嵌合体的体外抗肿瘤作用
4.1实验方法：采用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒测试本发明中蛋白降解嵌合体对头颈癌细胞CAL33及结直肠癌细胞HCT116的抗增殖活性。在96孔板中分别配置100μL的CAL33 和HCT116细胞悬液，将培养板在37℃，体积百分比浓度为5％CO2培养箱种预培养12小时。次日，弃去原培养基，并向培养板中加入100μL含有不同浓度蛋白降解嵌合体的低血清培养基，并在培养箱孵育48小时。给药结束后，向每孔中加入10μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1小时后用酶标仪测定450nm处的吸光度。
按如下公式计算药物对CAL33及HCT116细胞的抑制率：
抑制率＝[(Ac-As)]/[(Ac-Ab)]×100％，
As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物)，
Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测药物)，
Ab：空白孔(不含细胞和待测药物的培养基、CCK-8)。
4.2实验结果
体外抗肿瘤实验见表2
表2本发明的化合物TSM-1～13体外抗肿瘤实验结果
由上表可见，本发明化合物均对CAL33及HCT116细胞有较强的抑制活性，极高的提升了川楝素的抗肿瘤活性。
实施例5本发明一个实施例TSM--1的核磁数据
核磁数据见附图3示。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.13(s,1H),7.34-7.31(m,2H),7.22-7.19(m,1H),7.11(s,1H),6.75(d,J＝8Hz,1H),6.12(d,J＝1.2Hz,1H),5.74(s,1H),5.26(s, 1H),5.22(s,1H),5.13-5.10(m,1H),4.60(s,1H),4.32-4.20(m,5H),4.14-4.06(m, 1H),3.92-3.90(s,1H),3.76(s,1H),3.60(s,1H),3.42(s,1H),2.95-2.91(m,2H), 2.76-2.68(m,6H),2.36(m,2H),2.22-2.17(m,2H),2.09-2.05(m,2H),2.04-2.03(m, 2H),2.00(s,2H),1.96(s,3H),1.93(s,1H),1.90(s,2H),1.69(d,J＝9.2Hz,1H), 1.56-1.51(m,1H),1.34-1.32(dd,J＝2.6Hz,J＝4.9Hz,1H),1.30(s,3H),1.14-1.08(m,3H),0.78(s,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ207.17,172.20,171.78,171.44,170.67,170.21,143.02, 142.98,142.55,141.50,140.79,132.04,129.94,126.89,122.62,117.42,116.51,112.93,112.74,112.07,94.97,78.74,83.72,72.21,70.16,70.06,74.88,51.97,48.62, 45.97,44.06,42.64,41.54,39.40,39.39,38.46,38.43,35.11,33.67,29.14,28.80,28.62,28.06,23.83,23.30,22.43,21.58,20.90,19.28,19.24,15.77.
实施例6本发明一个实施例TSM--1对STAT3蛋白的选择性降解作用
以蛋白降解嵌合体TSM-1为例考察其对靶蛋白STAT3的特异性降解作用。称取适量的药物配制成浓度为2mM的储存液。预先将细胞CAL33、HCT116分别以1.5*105个/毫升的密度铺在六孔板中，贴壁生长过夜后，弃去原培养基，分别加入含不同浓度TSM-1的低血清培养基，将培养板在37℃，5％CO2培养箱中预培养36小时。给药结束后，弃去培养基，加入一定体积的细胞裂解液，冰上裂解并收取蛋白，进行Western实验。最后使用化学发光显影液对目的条带进行显影并分析做图。结果如附图4所示，TSM-1能够在低浓度(0.1μM)下特异性降解STAT3蛋白，并具有剂量依赖性，但对STAT家族其他蛋白几乎没有影响，
实施例7本发明一个实施例TSM--1的体内抗肿瘤作用
7.1模型建立
雌性裸鼠，腋下靠近背部接种HN6细胞(密度1×107个/只)，约8天形成肿瘤。
7.2评价TSM-1的体内抗肿瘤作用
实验分组：①空白组；②原型药组2mg/kg；③TSM-1组2mg/kg。给药方式：采用尾静脉注射的方式，药物溶解方法：体积百分比浓度5％DMSO：体积百分比浓度10％PEG400：体积百分比浓度5％Tween 80：体积百分比浓度80％生理盐水，评价指标为：①以瘤体积≈1000mm3为终点，解剖出小鼠肿瘤，比较各组肿瘤大小；②跟踪记录实验过程中小鼠健康状况，饮食、饮水和体重变化，比较副作用。
图5为该蛋白降解嵌合体TSM-1显著抑制裸鼠皮下HN6头颈部肿瘤的生长。(A)肿瘤照片。(B)裸鼠肿瘤体积生长曲线，与空白组和原型药组相比，TSM-1明显抑制肿瘤生长，优于原型药物川楝素。(C)裸鼠生长体重曲线，与空白组和原型药组相比，TSM-1组裸鼠体重无明显变化，原型药川楝素组裸鼠体重有所下降，停药后体重有回升趋势。(D)瘤重。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物具有以下任意一个结构式：
2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤为结直肠癌或者头颈部肿瘤。
4.权利要求1所述的一种化合物的制备方法，其特征在于包括下列步骤：
(a)首先以相应蛋白配体和3-(溴甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯为原料，以N-甲基吡咯烷酮为溶剂体系，加入二异丙基乙胺0.1mL，80℃搅拌反应至原料反应完全得产物1；
(b)将上述产物1溶于二氯甲烷，以三氟乙酸室温催化反应完全得到产物2；
(c)以川楝素溶于二氯甲烷，分别加入丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶，室温反应完全，粗品溶于乙酸乙酯，多次洗涤浓缩即可得到产物3；
(d)以产物2和3为原料，无水N，N-二甲基甲酰胺、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和二异丙基乙胺为反应溶剂，0℃搅拌至原料反应完全，多次洗涤并浓缩，即可得到蛋白降解嵌合体衍生物。
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