CN114890995B - 淫羊藿素PROTACs及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及淫羊藿素PROTACs及其制备方法和应用。本发明以2种淫羊藿素衍生物配体，设计合成了以淫羊藿素的系列PROTACs。本发明还涉及上述淫羊藿素PROTACs的制备方法及基于靶标GRIA3的抗肿瘤活性的应用。
Description
技术领域
本发明涉及以2种淫羊藿素衍生物作为POI配体，以来那度胺和VHL型配体(V0)作为 E3配体，linker选择脂肪链和PEG链，设计合成以淫羊藿素的系列PROTACs的制备方法及基于靶标GRIA3的抗肿瘤活性应用。
背景技术
PROTACs(proteolysis-targeting chimeras)是药物研发领域的新兴方向,PROTACs是双功能分子,主要由三部分组成,包括E3连接酶配体(E3配体)、靶标蛋白配体(POI配体) 以及连接两者的连接链(linker)。E3配体可招募E3连接酶,POI配体可识别结合靶标蛋白，因此PROTACs分子在细胞内会形成POI:PROTAC:E3连接酶三元复合物.在患者体内，PROTAC 的靶蛋白配体和靶蛋白结合，E3泛素连接酶配体和细胞内的E3泛素连接酶的底物结合区结合，从而通过Linker把靶蛋白“拉近”到E3泛素连接酶旁边，实现泛素-蛋白酶体(UPS)系统将靶蛋白降解。PROTACs分子不需要与靶标的高活性区域高度嵌合，只需与其表面产生短暂的黏合效应，即只需要通过一些特殊的分子间作用力、氢键等低键能的弱结合作用即可实现靶标分子的降解。目前，因为PROTACs介导的蛋白质降解的独特驱动模型有巨大的治疗潜力，故该技术目前主要应用在药物开发方面，有些PROTACs已经进行了临床试验。
且PROTAC药物比传统的小分子药物有着众多的优势，大致如下：
(1)PROTAC药物的设计可以不受限于Lipinski法则；
(2)传统小分子的药理作用靠的对靶点蛋白关键位点的占位(即occupancy-driven)，未达到立项的药效，需要维持一定的体内药物浓度，且对小分子结合位点的要求较高。PROTAC 药物的药理学机制是把靶蛋白降解，从而实现药效学作用，数据表明在药效过程中并不需要非常高的药物浓度即可实现，对结合位点的要求相对不高；
(3)人体内约50％的蛋白被发现跟人类疾病相关，其中只有约20％的蛋白能被传统小分子结合而PROTAC理论上可以和蛋白的任何地方相结合；
(4)PROTAC相抵于传统小分子，耐药性的问题可以忽视。理论上PROTAC可以较好的兼容靶蛋白的突变；
(5)PROTAC更持久，抑制力度更强。
淫羊藿素是传统中药淫羊藿中的主要活性成分，过去主用于补肾壮阳，随着研究的深入，发现其具有广泛的抗癌效果，且针对于其的抗肿瘤作用近年来研究颇多，包括血液系统肿瘤例如白血病、骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、前列腺癌以及神经系统相关癌症等。淫羊藿素软胶囊 (阿可拉定，Icaritin)也于2022年1月10日附条件获批上市，用于不适合或患者拒绝接受标准治疗，且从未接受过全身系统性治疗的、不可切除的肝细胞癌。虽然针对于淫羊藿素的抗癌相关机制已经有了一定的研究基础，但其具体相应的抗肿瘤靶标蛋白还未完全阐明。
发明内容
基于以上研究背景，本发明的第一方面在于合成具有抗肿瘤活性的淫羊藿素PROTACs及该淫羊藿素PROTACs的制备方法。
本发明的另一方面为淫羊藿素PROTACs基于靶标GRIA3的抗肿瘤活性的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
下面论述本发明的第一个目的：首先，提供一种通式(a)或(b)所示的淫羊藿素的PROTAC 化合物或其药理或生理上可接受的盐，合成具有抗肿瘤活性的淫羊藿素PROTACs。
以来那度胺和VHL型配体(V0)中的至少一种作为E3配体，linker选择脂肪链和PEG链中的至少一种。所述脂肪链为-(CH2)n1 CO-NH(CH2)n2-，其中n1表示1到6的自然数， n2表示自然数4或5；所述PEG链为-(CH2 CH2 O)n1-CH2CO-NH(CH-R1)-，-(CH2 CH2 O)n1-CH2CO-NH(CH2)n2-，其中n1表示自然数2或3，R1为C5烷基，n2表示自然数4或5。
优选地，本发明提供的淫羊藿素PROTACs包括但不限于如下表1所示的化合物：
表1：
下面提供通式(a)或(b)所示淫羊藿素PROTACs的制备方法：
(1)将上述通式(a)或(b)所示的淫羊藿素PROTACs分为系列I淫羊藿素PROTACs、系列 II淫羊藿素PROTACs。
(2)其中，系列I淫羊藿素PROTACs为通式(a)或(b)所示化合物，Linker脂肪链，E3ligase为那度胺或VHL型配体(V0)。
(3)系列II淫羊藿素PROTACs为通式(a)或(b)所示化合物，Linker为PEG2或PEG3，E3 ligase为那度胺或VHL型配体(V0)。
首先，申请人发现淫羊藿素的衍生物比淫羊藿素本身抗肿瘤活性较高，比起淫羊藿素本身具有多个羟基，不利于后期中间体化合物的设计合成的缺点，淫羊藿次苷II的修饰后产物出发后经断裂糖苷键得到的淫羊藿素衍生物具有显著的优越性。因此，发明以淫羊藿素的衍生物作为靶标蛋白配体(POI Ligand)。本发明提供的POI Ligand的制备方法如下。
POI ligand：
选择水溶性较好和分子量较低的来那度胺作为初步的E3配体小分子，为了便于Linker 与E3配体连接，在E3配体来那度胺的氨基上引入一定长度的连接链。
合成反应式如下：
E3 ligand：
在E3连接酶配体引入一定长度连接链后，在靶标蛋白配体的3-OH上通过亲核取代反应，引入不同长度的溴代羧酸甲酯，得到相应的中间体，随后在LiOH，THF/H2O的反应条件下进行酯水解，得到3-OH引入不同长度的羧基末端的中间体，将此中间体与先前合成的E3配体端中间体进行酰胺缩合反应，实现靶标蛋白配体与E3连接酶配体端的连接，得到最终的系列 I淫羊藿素小分子PROTACs化合物。
合成反应式如下：
系列I淫羊藿素PROTACs合成路线
由于淫羊藿素自身的水溶性表现并不良好，因此为增加整体分子的水溶性，又设计引入亲水性的聚乙二醇(PEG)链作为Linker。选取了二乙二醇和三乙二醇为初始原料，合成了 PEG2和PEG3的Linker。合成反应式如下：
以二乙二醇为例，首先通过亲核取代反应，处理后的混合产物通过柱层析分离得到纯化的一端羟基被对甲苯磺酰基保护的中间体，之后在另一端的羟基上引入溴乙酸叔丁酯后得到中间体p2，之后将该中间体分别与POI配体的3-OH进行连接得到Linker末端为叔丁酯的中间体p3，将P3进行酸水解后与中间体s经酰胺缩合反应即得到了系列Ⅱ淫羊藿素小分子 PROTACs化合物。
合成反应式如下：
系列Ⅱ淫羊藿素PROTACs合成路线
下面论述本发明的第二个目的：本发明所述淫羊藿素PROTACs基于靶标GRIA3的抗肿瘤活性的应用。
与淫羊藿素衍生物本体相比，本发明合成的淫羊藿素PROTACs，通过肿瘤细胞模型进行筛选，部分淫羊藿素PROTACs有效地抑制肿瘤细胞增殖，具有良好的抗肿瘤活性。本发明的淫羊藿素PROTACs对细胞具有高选择性且对癌细胞具有显著的抗增殖活性，可作为治疗肿瘤的一种先导化合物。
进一步地，对于初筛模型抗肿瘤活性和细胞选择性效果较好的淫羊藿素PROTACs进行体外细胞毒实验测定对于Ca46细胞的IC50，结合IC50和化合物结构，选择SI-10作为给药组。
进一步地，进行后期的蛋白质组学研究分析。利用统计学方法筛选差异表达的蛋白，筛选出差异度最明显的前三个蛋白：NLRP13、TECPR2和GRIA3。综合发现淫羊藿素PROTACs的抗肿瘤活性是作用于靶标GRIA3来达到肿瘤细胞的死亡和损伤的效果。
因此，本发明所述的淫羊藿素PROTACs或其药学上可接受的盐在基于靶标GRIA3治疗肿瘤疾病方面具有良好的前景。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图1为蛋白质质控分析图；其中(A)为蛋白多肽鉴定数分布图；(B)为蛋白分子量分布图；(C)为多肽长度分布图；(D)为蛋白鉴定肽段覆率分布；
附图2为差异表达蛋白筛选汇总图；
附图3为差异蛋白对比图，其中(A)为脱给药组VS对照组的差异蛋白对比图；(B)给药组VS空白组的差异蛋白对比图；(C)为给药组VS对照组与给药组VS空白组差异蛋白对比图。
具体实施方式
【实施例1】淫羊藿素衍生物的制备：
(1)中间体1的制备
将淫羊藿次苷II(3g，5.83mmol)溶于干燥丙酮(50ml)中，加入无水碳酸钾(2.01g，14.58mmol)，室温搅拌十分钟后，加入溴代丙炔(754ul，8.75mmol)，后升温至55℃回流，TLC监测反应，约8小时反应完全。反应结束后，加入冰水淬灭，用4N HCl调节PH至6～7，抽滤，水洗滤饼3次，干燥后经柱层析(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝50:1)得到化合物T(黄色固体，3.1g，96.3％)。
将化合物T(3g，5.43mmol)加入到乙醇与水(V:V＝1:1)的混合溶液(100ml)中，室温搅拌五分钟后，缓慢滴加浓硫酸(9.5ml)，加毕，升温至60℃回流，TLC跟踪反应，约 10小时后反应结束。反应结束后，将反应液倒入冰水中，用饱和NaHCO3溶液调节PH至6～7, 抽滤，水洗涤滤饼3次，干燥的粗品经柱层析(石油醚：二氯甲烷：甲醇＝200:50:1)纯化后得到化合物1a(黄色固体，1.92g，86.9％)用于下一步反应。
(2)中间体2的制备
化合物I和1b的合成方法参照T和1。
将淫羊藿次苷II(3g，5.83mmol)溶于干燥丙酮(50ml)中，加入无水碳酸钾(2.01g，14.58mmol)，室温搅拌十分钟后，加入碘甲烷(545ul，8.75mmol)，后升温至55℃回流，TLC监测反应，约10小时反应完全。反应结束后，加入冰水淬灭，用4N HCl调节PH至6～7，抽滤，水洗滤饼3次，干燥后经柱层析(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝60:1)得到化合物I(黄色固体，2.96g，96.1％)。
中间体I:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.67(s,1H),7.89(d,J＝1.8Hz,2H), 7.12(d,2H),6.58(s,1H),5.28(s,1H),5.11(t,J＝6.0Hz,1H),5.00(d,J＝4.5Hz,1H),4.74(s,1H),4.67(s,1H),4.11(q,J＝5.3Hz,1H),4.00(s,1H),3.91 (s,3H),3.86(d,J＝1.6Hz,3H),3.52–3.46(m,1H),3.21–3.09(m,2H),3.10–3.06(m,1H),1.68(s,3H),1.62(s,3H),0.79(d,J＝5.9Hz,3H).13C NMR(101 MHz,DMSO)δ178.73,162.96,161.83,160.12,157.61,153.26,134.91,131.82,130.94,122.76,122.39,114.54,107.50,105.07,102.48,95.66,71.57,71.15,70.77,70.53, 56.96,55.96,25.88,21.61,18.19,17.92.
将化合物I(2.96g，5.6mmol)加入到乙醇与水(V:V＝1:1)的混合溶液(100ml)中，室温搅拌五分钟后，缓慢滴加浓硫酸(10.1ml)，加毕，升温至60℃回流，TLC跟踪反应，约 10小时后反应结束。反应结束后，将反应液倒入冰水中，用饱和NaHCO3溶液调节PH至6～7, 抽滤，水洗涤滤饼3次，干燥后的粗品经柱层析(石油醚：二氯甲烷：甲醇＝200:50:1)纯化后得到化合物1b(黄色粉末固体，1.85g，86.4％)，用于下一步反应。
【实施例2】中间体s1～s6制备(E3 ligand的制备)：
冰浴下，将6-氨基己酸(1g，7.62mmol)溶于Dioxane/H2O(V:V＝2:1)的混合溶液(25ml) 中，缓慢加入1M NaOH溶液(7.65ml)，冰浴搅拌几分钟混合均匀后，加入Boc2O(1.99ml， 8.66mmol)，搅拌稍许后，移去冰浴，缓慢升温至室温反应，间断补加1M NaOH溶液，使反应液的PH保持在8～10，同时TLC跟踪反应，约4小时反应完全。反应停止后，用1MHCl盐酸溶液调节PH至2左右，将反应液用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层后，依次用3％的柠檬水溶液和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤减压浓缩得到s1(无色透明状液体,1.49g， 84.7％)，无需纯化，直接用于下一步反应。
将中间体s1(1.49g，6.44mmol)溶于干燥的DMF(20ml)溶液中搅拌均匀后，加入DIPEA (1.745ul，10.6mmol)搅拌几分钟后，加入HATU(1.60g，4.22mmol)，TLC监测反应活性酯生成后，加入来那度胺(912mg,3.52mmol)至反应液中，室温过夜，TLC监测反应，约12 小时后反应完全。向反应液中加冰水淬灭反应，有白色固体析出，室温搅拌1小时后，抽滤，滤饼用水和乙醚各洗涤三次后，真空干燥。将得到的粗品进行柱层析(二氯甲烷：甲醇＝50:1), 得到中间体s2(白色固体，1.23g，74.1％)。
将中间体s2(1g，2.12mmol)溶于DCM/MeOH(V:V＝3:1)的混合溶液(10ml)中，冰浴下滴加TFA(3ml)，加毕，缓慢移至室温反应，TLC监测反应，约12小时反应完全。反应停止后，减压浓缩除去溶剂，得到中间体s3(白色固体，988mg，96.0％)，无需纯化，直接用于下一步反应。
中间体s4～s6的合成方法与s1～s3类似。
中间体s4：无水透明状液体，87.4％
中间体s5：白色固体，68.9％
中间体s6：白色固体，产率93.0％
【实施例3】终产物3-8，12-17的制备
(1)中间体3a～12a的制备
将中间体1(100mg，0.246mmol)，K2CO3(51mg，0.369mmol)依次加入到干燥丙酮(5ml) 中，室温搅拌十分钟后，加入2-溴乙酸甲酯(28ul，0.295mmol)，升温至50℃回流，TLC监测反应，约5小时反应完全。向反应液中加入冰水淬灭反应，有大量固体析出，室温搅拌几分钟后，抽滤，水洗涤滤饼3次，干燥。粗品经PTLC(二氯甲烷：石油醚：甲醇＝20:15:1) 后得到中间体3a(黄色固体，103mg，产率87.8％)。
中间体3a:1H NMR(400MHz,CHCl3-d):δ12.59(s,1H),8.20(s,2H),7.04(s, 2H),6.52(s,1H),5.22(s,1H),4.81(s,4H),3.92(s,3H),3.76(s,3H),3.54(s,2H),2.58(s,1H),1.82(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3):δ178.46, 169.34,161.78,160.56,160.03,156.00,153.42,136.54,132.26,130.67,122.95, 121.96,113.97,108.51,105.90,96.05,77.62,76.26,68.38,56.49,55.45,52.02,25.80,21.77,18.06.
将中间体1(100mg，0.246mmol)，K2CO3(69mg，0.5mmol)依次加入到干燥丙酮(5ml)中，室温搅拌十分钟后，加入4-溴丁酸甲酯(55ul，0.434mmol)，升温至50℃回流，TLC监测反应，约8小时反应完全。向反应液中加入冰水淬灭反应，有大量固体析出，室温搅拌几分钟后，抽滤，水洗涤滤饼3次，干燥。粗品经PTLC(二氯甲烷：石油醚：甲醇＝20:15:1) 后得到中间体4a(黄色固体，89mg，产率71.4％)。
中间体4a:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ12.75(s,1H),8.07(d,2H),7.04 (d,2H),6.51(s,1H),5.22(t,1H),4.80(d,2H),4.04(t,J＝6.2Hz,2H),3.92(s,3H),3.68(s,3H),3.53(d,J＝6.9Hz,2H),2.58(t,J＝2.4Hz,1H),2.53(t, J＝7.5Hz,2H),2.09–2.04(m,2H),1.80(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz, CDCl3)δ179.16,173.65,161.65,160.47,160.16,156.40,153.56,137.53,132.09,130.31,123.17,122.08,114.00,108.46,106.15,95.95,77.69,76.17,71.58,56.50, 55.43,51.55,30.48,25.75,25.38,21.76,18.01.
将中间体1(120mg，0.295mmol)，K2CO3(143mg，1.03mmol)，KI(15mg，0.09mmol) 依次加入到干燥乙腈(4ml)中，室温搅拌十分钟后，加入5-溴戊酸甲酯(85ul,0.59mmol)，升温至50℃回流，TLC监测反应，约12小时反应完全。向反应液中加入冰水淬灭反应，二氯甲烷萃取3次，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，过滤，减压浓缩后经 PTLC(二氯甲烷：石油醚：甲醇＝15:20:1)纯化得到中间体5a(黄色固体，98mg，产率63.8％)。
中间体5a:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ12.78(s,1H),8.09(d,2H),7.04 (d,J＝7.4Hz,2H),6.51(s,1H),5.22(t,1H),4.80(d,J＝2.4Hz,2H),4.00(t,2H),3.92(s,3H),3.68(s,3H),3.53(d,J＝6.9Hz,2H),2.58(t,J＝2.4Hz,1H), 2.37–2.33(m,2H),1.80(s,3H),1.78(q,J＝3.2Hz,4H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ179.26,173.88,161.62,160.43,160.15,156.39,153.55,137.66, 132.11,130.34,123.20,122.07,113.96,108.42,106.14,95.91,77.69,76.19,72.13, 56.48,55.43,51.49,33.58,29.42,25.78,21.76,21.44,18.03.
将中间体1(120mg，0.295mmol)，K2CO3(123mg，0.89mmol)，KI(15mg，0.09mmol) 依次加入到干燥乙腈(5ml)中，室温搅拌十分钟后，加入6-溴己酸甲酯(70ul，0.44mmol)，升温至50℃回流，TLC监测反应，约10小时反应完全。向反应液中加入冰水淬灭反应，二氯甲烷萃取3次，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，过滤，减压浓缩后经 PTLC(二氯甲烷：石油醚：甲醇＝15:20:1)纯化得到中间体6a(黄色固体，89mg，产率56.4％)。
中间体6a:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ12.79(s,1H),8.10(d,2H),7.04 (d,2H),6.51(s,1H),5.22(t,1H),4.80(d,J＝2.4Hz,2H),4.00(t,J＝6.6Hz,2H),3.93(s,3H),3.92(s,1H),3.68(s,3H),3.53(d,J＝7.0Hz,2H),2.58(t, J＝2.4Hz,1H),2.31(t,J＝7.5Hz,2H),1.80(s,3H),1.79–1.73(m,2H),1.71 (d,J＝1.4Hz,3H),1.68–1.62(m,2H),1.48–1.42(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ179.30,174.04,161.61,160.42,160.15,156.34,153.55,137.72,132.11, 130.36,123.27,122.08,113.93,108.40,106.15,95.90,77.70,76.18,72.58,56.48,55.43,51.48,33.99,29.76,25.78,25.53,24.69,21.76,18.03.
将中间体1(100mg，0.246mmol)，K2CO3(102mg，0.738mmol)，KI(12.5mg，0.07mmol)依次加入到干燥乙腈(5ml)中，室温搅拌十分钟后，加入7-溴庚酸甲酯(88ul，0.496mmol)，升温至50℃回流，TLC监测反应，约24小时反应完全。向反应液中加入冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，过滤，减压浓缩后经 PTLC(二氯甲烷:石油醚:丙酮＝15:20:1)纯化得到中间体7a(黄色固体，70mg，产率51.9％)。
中间体7a:1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ12.80(s,1H),8.14–8.09(m,2H),7.04(d,2H),6.51(s,1H),5.22(t,J＝5.6,2.8,1.3Hz,1H),4.80(d,J＝2.4Hz,2H),4.00(t,J＝6.6Hz,2H),3.92(s,3H),3.68(s,3H),3.53(d,J＝6.9Hz,2H), 2.58(t,J＝2.4Hz,1H),2.31(t,J＝7.6Hz,2H),1.81(s,3H),1.77–1.72(m,2H),1.71(s,3H),1.66–1.60(m,2H),1.46–1.40(m,2H),1.36–1.31(m,2H). 13C NMR(126MHz,CDCl3)δ179.33,174.18,161.59,160.41,160.16,156.30,153.55,137.76,132.11,130.36,123.30,122.09,113.91,108.39,106.15,95.89,77.70,76.17, 72.77,56.48,55.43,51.46,33.99,29.90,28.86,25.78,25.60,24.86,21.77,18.03.
中间体12a～16a的合成方法与3a～7a类似，以12a为例。
将中间体2(104mg，0.272mmol)，K2CO3(76mg，0.55mmol)依次加入到干燥丙酮(4ml) 中，室温搅拌十分钟后，加入2-溴乙酸甲酯(31ul,0.326mmol)，升温至50℃回流，TLC监测反应，约5小时反应完全。向反应液中加入冰水淬灭反应，有大量固体析出，室温搅拌几分钟后，抽滤，水洗涤滤饼3次，干燥。粗品经PTLC(二氯甲烷：石油醚：甲醇＝20:15:1) 后得到中间体12a(黄色固体，102mg，产率82.5％)。
中间体12a:1H NMR(500MHz,CHCl3-d)δ8.20(d,J＝9.1Hz,2H),7.04(d,J ＝9.1Hz,2H),6.42(s,1H),5.20(t,J＝6.7Hz,1H),4.81(s,2H),3.92(d,J＝2.3Hz,6H),3.76(s,3H),3.52(d,2H),1.80(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126 MHz,CDCl3)δ178.46,169.34,162.78,161.73,160.30,155.82,153.33,136.47,132.04,130.64,123.08,122.23,113.94,107.80,105.33,94.92,68.42,56.08,55.42, 51.95,25.74,21.65,17.94.
中间体13a(黄色固体，91mg，产率71.4％):1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ12.76 (s,1H),8.08(d,J＝7.1Hz,2H),7.03(d,J＝7.1Hz,2H),6.42(s,1H),5.21(t,1H),4.04(t,J＝6.2Hz,2H),3.92(d,J＝1.6Hz,6H),3.68(s,3H),3.50(d,J ＝6.9Hz,2H),2.53(t,J＝7.4Hz,2H),2.06(p,J＝13.8,7.5,6.2Hz,2H),1.79 (s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ179.15,173.67,162.65,161.58,160.40,156.24,153.44,137.42,131.93,130.29,123.27,122.31,113.97,107.70, 105.54,94.79,71.57,56.05,55.42,51.54,30.49,25.74,25.39,21.64,17.93.
中间体14a(黄色固体，70mg，产率67.4％):1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ12.79(s,1H),8.09(d,2H),7.03(d,2H),6.42(s,1H),5.21(t,J＝6.4,6.0,3.8Hz,1H),4.01(t,2H),3.92(d,J＝1.5Hz,6H),3.68(s,3H),3.51(d,J＝6.9Hz,2H), 2.37–2.34(m,2H),1.79(s,4H),1.78(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ179.25,173.88,162.63,161.56,160.40,156.22,153.44,137.57,131.94, 130.32,123.32,122.32,113.93,107.68,105.55,94.77,72.12,56.06,55.42,51.47,33.59,29.43,25.76,21.64,21.45,17.94.
中间体15a(黄色固体，68mg，50.9％):1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ8.10(d,2H),7.03(d,2H),6.42(s,1H),5.21(t,J＝6.6,5.4,1.3Hz,1H),4.00(t,J＝6.6Hz,2H),3.92(d,J＝3.2Hz,6H),3.68(s,3H),3.51(d,J＝6.9Hz,2H),2.31 (t,J＝7.5Hz,2H),1.80(s,3H),1.78–1.73(m,2H),1.71(s,3H),1.68–1.62 (m,2H),1.48–1.42(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ179.30,174.04,162.62,161.55,160.40,156.17,153.44,137.62,131.93,130.33,123.38,122.32,113.89, 107.67,105.55,94.75,72.58,56.06,55.41,51.46,33.99,29.77,25.75,25.53,24.69,21.65,17.94.
中间体16a(黄色固体，60mg，46.2％):1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ12.80(s,1H),8.11(d,2H),7.03(d,2H),6.42(s,1H),5.21(t,J＝8.2,6.5,2.7,1.3Hz,1H),4.00(t,J＝6.6Hz,2H),3.92(d,J＝2.5Hz,6H),3.68(s,3H),3.50(dd,J ＝6.9,4.2Hz,2H),2.31(t,J＝7.5Hz,2H),1.80(s,1H),1.77–1.73(m,2H), 1.71(s,3H),1.66–1.60(m,2H),1.46–1.39(m,2H),1.36–1.31(m,2H).13CNMR(126MHz,CDCl3)δ179.32,174.17,162.61,161.53,160.40,156.14,153.44,137.66, 131.93,130.34,123.42,122.33,113.88,107.65,105.56,94.74,72.76,56.05,55.41,51.44,33.99,29.91,28.86,25.75,25.60,24.86,21.65,17.94.
(2)中间体3b～7b，12b～16b的合成
将中间体3a(90mg，0.188mmol)，LiOH(18mg，0.752mmol)溶于THF/H20(V:V＝1:1)的混合溶液(2ml)中，室温搅拌，TLC跟踪反应，约4小时后反应完全。反应停止后，用1M HCl溶液将反应液PH调至1～2，有鹅黄色体析出，抽滤，滤饼用水洗涤三次，干燥称重，得到中间体3b(浅黄色固体，83mg，产率95.0％)，无需纯化，直接用于下一步。
中间体3b:1H NMR(400MHz,Chloroform-d)：δ8.08(d,2H),7.09(d,2H),6.60 (s,1H),5.20(t,J＝7.7Hz,1H),4.83(s,2H),4.40(s,2H),3.95(s,3H),3.55(d,J＝7.0Hz,2H),2.61(s,1H),1.81(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)：δ178.92,162.64,161.64,159.68,157.80,153.62,138.24,132.64,130.47,121.61, 121.52,114.66,109.27,104.96,96.85,77.34,77.23,76.60,72.45,56.66,55.60, 25.76,21.75,18.06.
中间体4b～7b，12b～16b的合成方法与3b类似。
中间体4b：黄色固体，产率94.7％。
中间体5b：黄色固体，产率92.5％。
中间体6b：黄色固体，产率84.0％。
中间体7b：黄色固体，产率94.7％。
中间体12b(黄色固体，产率94.7％):1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ11.69(s,1H),8.08(d,J＝8.3Hz,2H),7.08(d,J＝8.4Hz,2H),6.49(s,1H),5.17(t,J ＝1.4Hz,1H),4.39(s,2H),3.95(s,6H),3.53(d,J＝6.8Hz,2H),1.80(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ178.86,169.96,163.89,162.59,159.95, 157.64,153.51,138.18,132.44,130.43,121.71,114.63,108.61,104.36,95.72,72.54,56.26,55.57,25.72,21.63,17.96.
中间体13b：黄色固体，产率91.6％
中间体14b：黄色固体，产率88.5％
中间体15b：黄色固体，产率92.5％
中间体16b：黄色固体，产率94.1％
(3)终产物3-8，12-17的制备
终产物3～7的合成
将中间体3b/4b(1.1eq)，DIPEA(3eq)依次溶于干燥DMF溶液中，室温搅拌五分钟，加入HATU(1.2eq～1.5eq)，TLC监测反应约半小时后，活性酯生成完全，加入中间体s3(1eq)，室温搅拌。TLC跟踪反应，约12小时反应完全。向反应液中加入碎冰淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷：甲醇＝15:1)纯化后的终产物3/4。
终产物3(浅黄色固体，53.0％)：1H NMR(400MHz,Chloroform-d):δ12.44(s,1H),8.74(s,1H),8.37(d,J＝32.0Hz,2H),7.95(s,2H),7.69(s,2H),7.44(s,1H),7.03(s,2H),6.51(s,1H),5.14(t,J＝17.0Hz,2H),4.79(s,2H),4.42(s,2H), 4.25(s,2H),3.92(s,3H),3.50(t,J＝5.5Hz,2H),3.35(s,2H),2.87–2.68(m,2H),2.60(s,1H),2.49–2.23(m,4H),1.84–1.75(m,5H),1.70(s,3H),1.67 –1.58(m,2H),1.52–1.39(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3):δ178.77,171.74,171.31,169.93,169.03,162.24,161.03,159.72,157.00,153.47,138.00,134.32, 132.96,132.62,132.47,130.18,128.99,126.19,122.00,121.63,120.84,114.54,109.02,105.57,96.33,77.24,76.48,72.74,56.59,55.59,51.85,46.76,38.86,36.75, 31.50,28.81,26.19,25.79,25.17,23.27,21.71,18.06.
终产物4(黄色固体，46.1％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)：δ12.67(s,1H),8.06(d,J＝8.5Hz,2H),7.76(d,J＝7.8Hz,1H),7.65(d,J＝7.4Hz,1H),7.43 (t,J＝7.7Hz,1H),7.26(s,1H),7.02(d,J＝8.5Hz,2H),6.46(s,1H),5.32(s,1H),5.18(t,J＝5.7,4.1,1.8Hz,1H),5.10(s,1H),4.75(d,J＝2.4Hz,2H),4.42 (s,2H),3.90(s,3H),3.84(s,2H),3.50(d,J＝6.8Hz,2H),3.24(s,2H),2.83–2.67(m,2H),2.59(t,J＝2.3Hz,1H),2.52(s,2H),2.42(s,2H),2.00(s,2H), 1.79(s,3H),1.74(s,2H),1.69(s,3H),1.54(s,2H),1.38(s,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ179.29,173.62,172.10,171.57,170.14,169.12,161.95,160.76, 159.74,157.19,153.54,137.23,134.26,133.20,132.57,132.38,130.22,128.98,126.24,122.74,121.79,120.63,114.24,108.85,105.89,96.10,77.54,76.41,70.99, 56.53,55.51,53.45,46.86,39.40,36.62,32.96,31.51,28.96,26.61,26.19,25.78,25.17,23.24,21.73,18.05.
将中间体5b/6b/7b(1.1eq)，DIEA(5eq)，PyBOP(3eq)依次溶于干燥DMF溶液中，室温搅拌，TLC监测反应约半小时后，活性酯生成完全，加入中间体s3(1eq)，室温搅拌。TLC 跟踪反应，约12小时反应完全。向反应液中加入碎冰淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷：甲醇＝15:1)纯化后得到终产物5/6/7。
终产物5(黄色固体，50.38％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)：δ12.71(s,1H),8.91(s,1H),8.66(s,1H),8.07(d,J＝8.6Hz,2H),7.75(d,J＝7.8Hz,1H),7.66 (d,J＝7.4Hz,1H),7.45(t,J＝7.6Hz,1H),7.02(d,J＝8.6Hz,2H),6.48(s,3H),5.32(s,1H),5.19(t,1H),5.13(d,1H),4.78(d,J＝2.4Hz,2H),4.44(s, 1H),3.91(s,5H),3.51(s,3H),3.25(s,2H),2.85–2.69(m,2H),2.59(t,J＝ 2.3Hz,1H),2.45(s,2H),2.30(s,2H),2.16(s,1H),1.84–1.72(m,9H),1.70(s,3H),1.58–1.51(m,2H),1.44–1.37(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ 179.35,173.75,171.99,171.37,169.98,169.07,161.82,160.65,159.88,156.82,153.54,137.56,134.29,133.14,132.60,132.29,130.26,128.98,126.23,122.95,121.89,120.71,114.14,108.71,106.02,96.03,77.60,76.32,71.90,56.53,55.49,51.92,46.81,39.12,36.65,35.82,29.72,26.07,25.77,25.06,23.30,22.51,21.75, 18.04.
终产物6：黄色固体，57.5％。
终产物7(黄色固体，48.3％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ12.74(s,1H),9.14(s,1H),8.81(s,1H),8.08(d,2H),7.75(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(d,J＝7.4Hz,1H),7.43(t,J＝7.7Hz,1H),7.02(d,2H),6.49(s,1H),6.18(s,1H),5.20(t, J＝7.1,5.3,1.7Hz,1H),5.10(d,J＝12.3Hz,1H),4.78(d,J＝2.4Hz,2H),4.41 (s,2H),3.93(d,J＝6.6Hz,2H),3.90(s,3H),3.51(t,2H),3.21(s,2H),2.82 –2.67(m,2H),2.59(t,J＝2.4Hz,1H),2.43(s,2H),2.17–2.01(m,6H),1.80(s,3H),1.71(s,7H),1.58(d,J＝7.3Hz,2H),1.51(s,2H),1.41–1.33(m,4H). 13C NMR(126MHz,CDCl3)δ179.37,173.71,172.09,171.58,170.15,169.14,161.69,160.55,159.98,156.56,153.53,137.69,134.22,133.20,132.54,132.21,130.32,128.99,126.26,123.14,121.98,120.60,114.02,108.57,106.06,95.97,77.67,76.26,72.80,56.51,55.49,51.93,46.87,39.17,36.52,31.49,29.87,29.69,29.14,28.84,26.16,25.76,25.66,25.49,25.02,23.22,21.76,18.03.
(4)终产物12～16的合成
将中间体12b/13b(1.1eq)，DIPEA(3eq)依次溶于干燥DMF溶液中，室温搅拌五分钟，加入HATU(1.2eq～1.5eq)，TLC监测反应约半小时后，活性酯生成完全，加入中间体s3(1eq)，室温搅拌。TLC跟踪反应，约约12小时反应完全。向反应液中加入碎冰淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷：甲醇＝15:1)纯化后的终产物12/13(浅黄色固体，mg,产率)
终产物12(浅黄色固体，47.0％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)：δ12.43(s,1H),8.92(s,1H),8.51(s,1H),8.37(t,J＝5.8Hz,1H),7.93(d,2H),7.71(d,J＝7.9 Hz,1H),7.65(d,J＝7.5Hz,1H),7.42(t,J＝7.7Hz,1H),7.04–7.00(m,2H),6.39(s,1H),5.16(t,J＝6.8,1.5Hz,1H),5.11(q,J＝8.3Hz,1H),4.40(t,2H), 4.25(s,2H),3.93–3.86(m,6H),3.46(d,J＝6.9Hz,2H),3.33(q,J＝6.7Hz,2H),2.83–2.67(m,2H),2.42(t,J＝7.5Hz,2H),2.35–2.21(m,1H),2.17– 2.09(m,1H),1.81–1.74(m,5H),1.69(s,3H),1.63(t,J＝7.2Hz,2H),1.49– 1.40(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ178.72,171.85,171.43,170.01,169.07,169.02,163.22,162.14,160.01,156.75,153.34,137.86,134.29,133.06,132.59,132.22,130.11,128.96,126.19,122.15,121.90,120.72,114.47,108.27,105.01,95.17,72.69,56.17,55.53,51.90,46.76,38.85,36.68,31.47,29.69,26.20,25.73,25.16,23.25,21.59,17.94.
终产物13(黄色固体，47.9％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)：δ12.73(s,1H),8.98(s,1H),8.62(s,1H),8.07(d,2H),7.73(d,J＝7.9Hz,1H),7.67(d,J＝7.5 Hz,1H),7.44(t,J＝7.7Hz,1H),7.07–6.99(m,3H),6.36(s,1H),5.18(t,J＝6.1,5.6,3.4Hz,1H),5.12(dd,J＝13.2,5.0Hz,1H),4.43(t,2H),3.90(s,3H), 3.88–3.83(m,5H),3.49(t,2H),3.27–3.21(m,2H),2.84–2.69(m,2H),2.50(t,J＝6.5Hz,2H),2.41(t,J＝7.5Hz,2H),2.07–1.96(m,4H),1.78(s,3H), 1.77–1.71(m,2H),1.70(s,3H),1.58–1.51(m,2H),1.44–1.37(m,2H).13CNMR(126MHz,CDCl3)：δ179.30,171.97,171.43,169.99,169.09,162.96,161.87, 160.02,157.00,153.45,137.15,134.30,133.13,132.60,132.18,130.19,128.97,126.23,122.90,122.05,120.72,114.19,108.15,105.34,94.94,70.96,56.12,55.47, 51.91,46.78,39.18,36.60,33.10,31.50,29.00,26.59,26.11,25.74,25.11,23.26,21.63,17.95.
终产物14～16的合成方法与终产物5～7类似。
终产物14(黄色固体，48.8％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)：δ12.72(s,1H),8.96(s,1H),8.69(s,1H),8.06(d,2H),7.74(d,J＝7.9Hz,1H),7.66(d,J＝7.5Hz,1H),7.44(t,J＝7.7Hz,1H),7.02(d,2H),6.38(s,1H),6.35(s,1H),5.18 (t,J＝7.0,5.6,1.5Hz,1H),5.12(dd,J＝13.2,5.1Hz,1H),4.43(t,2H),3.92–3.90(m,4H),3.89(s,3H),3.49(t,2H),3.24(q,J＝6.6Hz,2H),2.84–2.68 (m,2H),2.44(t,J＝7.5Hz,2H),2.35–2.24(m,3H),2.18–2.12(m,1H),1.82–1.78(m,5H),1.77–1.71(m,5H),1.70(s,3H),1.56–1.49(m,2H),1.43– 1.36(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ229.34,179.34,173.61,172.09,171.42,170.02,169.08,162.84,161.73,160.14,156.63,153.42,137.46,134.27,133.16,132.58,132.10,130.23,130.23,128.97,126.25,123.07,122.14,120.68,114.09,107.96,105.43,94.87,71.90,56.10,55.47,51.92,46.78,39.01,36.62,35.94,31.50, 29.69,29.12,26.06,25.74,25.05,23.26,22.47,21.63,17.94.
终产物15(黄色固体，61.8％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ12.73(s,1H),8.85(s,1H),8.61(s,1H),8.08(d,J＝8.7Hz,2H),7.75(d,J＝7.9Hz,1H),7.67 (d,J＝7.5Hz,1H),7.44(t,J＝7.7Hz,1H),7.03(d,J＝8.7Hz,2H),6.39(s,1H),6.23(s,1H),5.19(t,J＝6.9,1.5Hz,1H),5.13(d,J＝12.2Hz,1H),4.43 (s,2H),3.95–3.91(m,5H),3.90(s,3H),3.50(d,2H),3.24(s,2H),2.87–2.68(m,2H),2.47–2.41(m,2H),2.27–2.12(m,4H),1.79(s,3H),1.77–1.68(m, 7H),1.67–1.61(m,2H),1.57–1.50(m,2H),1.48–1.42(m,2H),1.41–1.35(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ179.37,173.50,171.36,169.94,169.07,166.01, 162.81,161.70,160.18,156.57,153.42,137.53,133.12,132.58,132.09,131.43,130.28,128.98,126.19,123.15,122.17,114.99,114.04,107.91,105.43,94.86,72.45, 56.10,55.48,51.91,46.80,39.05,36.54,31.51,29.69,29.07,26.02,25.75,25.33,25.19,24.94,23.29,22.69,21.64,17.95.
终产物16(黄色固体，46.5％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)：δ12.74(s,1H),9.04(s,1H),8.75(s,1H),8.08(d,2H),7.75(d,J＝7.9Hz,1H),7.65(d,J＝7.5Hz,1H),7.44(t,J＝7.7Hz,1H),7.02(d,2H),6.39(s,1H),6.15(s,1H),5.19 (t,J＝6.9,5.5,1.6Hz,1H),5.11(d,J＝12.6Hz,1H),4.41(s,2H),3.93(d,J＝6.5Hz,2H),3.90(d,J＝1.6Hz,6H),3.49(d,J＝7.5Hz,2H),3.25–3.19(m, 2H),2.82–2.65(m,2H),2.44(s,2H),2.14(s,4H),1.79(s,3H),1.76–1.71(m,2H),1.71–1.65(m,6H),1.62–1.56(m,2H),1.54–1.48(m,2H),1.42– 1.34(m,5H).13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ179.37,173.69,171.48,170.06,169.11,168.70,162.76,161.63,160.23,156.42,153.42,137.58,134.21,133.18,132.56,132.05,130.30,128.98,126.24,123.24,122.21,120.64,113.99,107.83,105.46,94.82,77.27,76.76,72.79,56.09,55.48,51.92,46.82,39.14,36.57,36.52,29.88,29.69,29.13,28.83,26.13,25.75,25.66,25.48,25.00,23.25,21.64,17.94.
(5)终产物8和17的合成
将中间体4b/13b(1.1eq)，DIPEA(5eq)，PyBOP(3eq)依次溶于干燥DMF溶液中，室温搅拌，TLC监测反应约半小时后，活性酯生成完全，加入中间体s6(1eq)，继续室温搅拌。 TLC跟踪反应，约12小时反应完全。向反应液中加入碎冰淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷：甲醇＝15:1)纯化后的终产物8/17(浅黄色固体，mg,产率；黄色固体， mg，产率)。
终产物8(浅黄色固体，46.3％)：1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.71(s,1H),11.01(s,1H),9.77(s,1H),8.04(d,2H),7.83–7.80(m,2H),7.53–7.45(m,2H),7.15(d,2H),6.61(s,1H),5.17–5.11(m,2H),4.97(d,J＝2.4Hz,2H),4.38(q,2H), 3.96(t,J＝6.6Hz,2H),3.66(t,J＝2.3Hz,1H),3.44(d,J＝7.1Hz,2H),3.06 (q,J＝6.7Hz,2H),2.96–2.86(m,1H),2.61(d,1H),2.36(t,3H),2.20(t,J＝7.5Hz,2H),2.06–1.97(m,1H),1.91–1.83(m,2H),1.73(s,3H),1.62(s, 3H),1.61–1.56(m,2H),1.49–1.40(m,2H).13C NMR(126MHz,DMSO):δ178.99,173.28,171.80,171.69,171.49,168.30,161.91,160.72,159.73,156.37,153.30,137.39,134.25,134.13,133.11,131.98,130.52,129.04,125.65,122.88,122.31,119.42,114.72,108.14,105.67,96.72,79.27,79.01,72.23,57.12,55.94,52.03, 46.96,38.68,35.86,32.21,31.68,29.22,26.26,25.91,23.10,23.00,21.74,18.29.
终产物17(黄色固体，47.9％)：1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.74(s,1H),11.02(s,1H),9.77(s,1H),8.04(d,2H),7.82(t,2H),7.52–7.45(m,2H),7.15(d,2H),6.54(s,1H),5.18–5.10(m,2H),4.35(q,2H),3.95(t,J＝6.6Hz,2H),3.90 (s,3H),3.86(s,3H),3.42(d,J＝6.9Hz,2H),3.06(q,J＝6.6Hz,2H),2.96–2.87(m,1H),2.60(d,J＝17.2,4.4,2.3Hz,1H),2.41–2.31(m,3H),2.20(t, J＝7.5Hz,2H),2.05–1.98(m,1H),1.90–1.83(m,2H),1.71(s,3H),1.62(s,3H),1.61–1.57(m,2H),1.48–1.41(m,2H).13C NMR(126MHz,DMSO):δ178.97, 173.28,171.78,171.67,171.50,168.29,162.86,161.87,160.12,156.21,153.18,137.28,134.26,134.11,133.12,131.83,130.48,129.04,125.63,122.92,122.51, 119.40,114.70,107.44,105.14,95.49,72.22,56.92,55.93,52.01,46.94,38.68, 35.86,32.21,31.68,29.23,26.27,25.87,23.10,23.00,21.65,18.21.
【实施例4】中间体p1～p12的合成
(1)中间体p1的合成
将二乙二醇(1.07ml，11.31mmol)，三乙胺(4.72ml，33.92mmol)，DMAP(138mg，1.13mmol) 依次溶于DCM溶液(40ml)中，冰浴下，分批加入TsCl(3.23g，16.96mmol)后，缓慢升温至室温反应。TLC跟踪反应，约24小时反应完全。反应停止后，用4M盐酸溶液将反应液调至中性，DCM萃取三次，合并有机层，并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经柱层析(PE:EA＝1:1)纯化得到中间体p1(无色透明状液体，440mg,，15％)。
中间体p1：1H NMR(500MHz,CHCl3-d):δ7.83(d,J＝8.4Hz,2H),7.38(d,J ＝8.0Hz,2H),4.22(t,2H),3.75–3.67(m,4H),3.59–3.53(m,2H),2.48(s,3H),1.27(s,1H).
(2)中间体p2的合成
将中间体p1(210mg，0.807mmol)，TBAB(13mg，0.04mmol)，KOH(72.5mg，1.29mmol)依次加入到甲苯溶液(1ml)中，随后加入溴乙酸叔丁酯(141ul，0.968mmol)，室温搅拌。 TLC跟踪反应，约24小时后反应完全。反应停止后，减压除去甲苯，加入DCM和水，用DCM 萃取3次，合并二氯甲烷层，并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC (PE:EA＝2:1)纯化得到中间体p2(无水透明状液体，110mg，36.4％)。
中间体p2：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ7.81(d,J＝7.8Hz,2H),7.36(d,J＝7.8Hz,2H),4.18(t,2H),3.99(s,2H),3.72(t,J＝4.4Hz,2H),3.66(d,4H), 2.46(s,3H),1.49(s,9H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ169.54,144.77,133.06,129.83,127.99,81.61,70.77,70.70,69.26,69.08,68.75,28.13,21.63.
(3)中间体p3/p4的合成
将中间体p2(1eq)，K2CO3(1.2eq)，中间体1/2(1eq)依次溶于干燥丙酮中，室温搅拌几分钟后升温至50℃反应。TLC跟踪反应，约6小时后反应完全。向反应液中加入冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，并用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水洗，有机层用无水硫酸干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷:甲醇＝35:1)纯化后得到中间体 p3/p4。
中间体p3：(黄色固体，41.0％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ12.76(s,1H),8.20(d,J＝8.2Hz,2H),7.04(d,J＝8.1Hz,2H),6.51(s,1H),5.22(t,1H),4.80 (d,J＝2.3Hz,2H),4.26(s,2H),4.02(s,2H),3.92(s,3H),3.80(s,2H),3.73(t,1H),3.70–3.67(m,2H),3.66–3.63(m,2H),3.54(d,J＝7.0Hz,2H),1.81 (s,3H),1.71(s,3H),1.49(s,9H).13CNMR(126MHz,CDCl3):δ179.14,169.63,161.67,160.45,160.13,156.20,153.52,137.46,132.12,130.62,123.20,122.09, 113.97,108.44,106.09,95.93,81.53,77.70,76.16,71.54,70.75,70.49,70.42,69.13,56.50,55.44,28.13,25.75,21.78,18.03.
中间体p4(黄色固体，54.0％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ8.20(d,J＝8.6Hz,2H),7.03(d,J＝8.6Hz,2H),6.42(s,1H),5.21(t,J＝6.9,2.9,1.5Hz,1H),4.26(t,J＝5.7,3.2Hz,2H),3.92(d,J＝1.5Hz,6H),3.81–3.78(m,2H),3.70 –3.67(m,2H),3.65–3.62(m,2H),1.80(s,3H),1.71(s,3H),1.49(s,9H).13CNMR(126MHz,CDCl3):δ179.13,169.64,162.64,161.60,160.37,156.03,153.41, 137.35,131.95,130.57,123.31,122.33,113.92,107.69,105.48,94.77,81.52,71.52,70.74,70.47,70.41,69.10,56.05,55.42,28.12,25.74,21.66,17.94.
(4)中间体p5的合成
将三乙二醇(890ul，6.66mmol)，三乙胺(2.78ml，19.98mmol)，DMAP(82mg，0.67mmol) 依次溶于DCM溶液中，冰浴下，分批加入TsCl(1.90g，10mmol)后，缓慢升温至室温反应。 TLC跟踪反应，约24小时反应完全。反应停止后，用4M盐酸溶液将反应液调至中性，DCM萃取三次，合并有机层，并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经柱层析(PE: EA＝1:1)纯化得到中间体p5(无色透明状液体，450mg，22.2％).
中间体p5：1H NMR(500MHz,CHCl3-d)：δ7.83(d,2H),7.36(d,J＝8.0Hz,1H), 4.19(t,J＝4.7Hz,2H),3.74–3.71(m,4H),3.63(s,4H),3.59(t,J＝4.2Hz,2H),2.47(s,3H),2.16(s,1H).
(5)中间体p6的合成
将中间体p5(210mg，0.71mmol)，TBAB(11.5mg，0.04mmol)，KOH(64mg，1.14mmol)依次加入到甲苯溶液(1ml)中，随后加入溴乙酸叔丁酯(124ul，0.85mmol)，室温搅拌。TLC跟踪反应，约24小时后反应完全。反应停止后，减压除去甲苯，加入DCM和水，用DCM萃取 3次，合并二氯甲烷层，并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(PE:EA＝3:2)纯化得到中间体p6(无水透明状液体，120mg，40.4％)
中间体p6：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.82(d,2H),7.36(d,2H),4.18 (t,2H),4.02(s,2H),3.73–3.69(m,4H),3.69–3.66(m,2H),3.61(s,4H),2.47(s,3H),1.70(s,2H),1.49(s,9H).
(6)中间体p7～p8的合成与p3/p4的合成类似。
中间体p7(黄色固体，49.2％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ8.20(d,J＝8.5Hz,2H),7.03(d,J＝8.4Hz,2H),6.51(s,1H),5.25–5.20(m,1H),4.80(d,J＝2.4Hz,2H),4.26(t,J＝5.7,3.2Hz,2H),4.03(s,2H),3.92(s,3H),3.78(t, J＝4.6Hz,2H),3.74–3.71(m,2H),3.70–3.67(m,2H),3.65–3.60(m,4H), 3.54(d,J＝7.0Hz,2H),2.58(t,J＝2.4Hz,1H),1.81(s,3H),1.71(s,3H),1.48(s,9H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ179.16,169.66,161.66,160.45,160.12,156.20, 153.51,137.44,132.13,130.62,123.19,122.08,113.93,108.43,106.07,95.92,81.54,77.69,76.18,71.54,70.73,70.61,70.43,70.35,69.07,56.49,55.43,28.12,25.76, 21.78,18.03.
中间体p8(黄色固体，44.4％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ12.77(s,1H),8.20(d,J＝8.7Hz,2H),7.03(d,2H),6.42(s,1H),5.21(t,1H),4.26(t,2H),4.03(s,2H),3.92(d,J＝2.2Hz,6H),3.78(t,2H),3.73–3.67(m,4H),3.62(tt, J＝4.8,2.9Hz,4H),3.52(d,J＝7.0Hz,2H),1.80(s,3H),1.71(s,3H),1.48(s,9H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ179.15,169.65,162.63,161.58,160.36,156.02, 153.39,137.34,131.97,130.58,123.30,122.32,113.89,107.68,105.47,94.76,81.52,71.53,70.73,70.61,70.42,70.35,69.06,56.06,55.42,28.11,25.75,21.66,17.95.
(7)中间体p9～p12的合成
冰浴下，将中间体p3/p4/p7/p8(1eq)溶于DCM溶液中，加入苯甲醚(5～6eq)作为保护剂，搅拌均匀后将TFA(15％)缓慢滴加至溶液中，稍许，移去冰浴至室温反应。TLC跟踪反应，约12小时反应完全。反应停止后，加水稀释溶液，二氯甲烷萃取3次，合并有机层，并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后得到中间体p9～p12，无需纯化直接用于下一步反应。
中间体p9：黄色油状液体，98.3％
中间体p10：黄色油状液体，93.6％
中间体p11：黄色油状液体，96.4％
中间体p12：黄色油状液体，95.8％
【实施例5】终产物9～11,18～20的合成
(1)终产物9～11,18～20的合成
终产物9/18的合成
将中间体p9/p10(1.1eq)，DIPEA(5eq)，PyBOP(3eq)依次溶于干燥DMF溶液中，室温搅拌，TLC监测反应约半小时后，活性酯生成完全，加入中间体s3(1eq)，继续室温搅拌。 TLC跟踪反应，约12小时反应完全。向反应液中加入碎冰淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷：甲醇＝15:1)纯化后的终产物9/18。
终产物9(浅黄色固体，44.5％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ12.69(s,1H),8.96(s,1H),8.59(s,1H),8.13(d,2H),7.73(d,J＝7.9Hz,1H),7.65(d,J＝7.5Hz,1H),7.43(t,J＝7.7Hz,1H),7.25(t,J＝5.9Hz,1H),7.02(d,2H),6.38(s, 1H),5.13(dd,J＝13.3,5.2Hz,1H),4.41(s,2H),4.20(t,2H),3.95(s,2H),3.90 (d,J＝2.0Hz,6H),3.75(t,2H),3.66–3.57(m,4H),3.49(s,1H),3.25(q,J＝6.8Hz,2H),2.90–2.84(m,2H),2.82–2.71(m,2H),2.40(t,J＝7.5Hz,2H), 2.11–2.04(m,2H),1.76–1.69(m,2H),1.67(s,6H),1.57–1.50(m,2H),1.40–1.33(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ179.04,171.88,171.53,170.28,169.99, 169.10,162.96,161.91,160.52,156.40,153.30,137.18,134.15,133.12,132.55,130.30,128.94,126.13,122.83,120.66,115.63,107.01,105.24,94.95,77.22,71.51, 70.94,70.35,70.32,69.94,56.16,55.45,51.91,46.71,39.32,38.58,29.68,28.94,26.06,25.56,24.96,23.25,17.01.
终产物18(浅黄色固体，32.3％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ12.71(s,1H),8.80(s,1H),8.44(s,1H),8.14(d,2H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.67(d,J＝7.5Hz,1H),7.44(t,J＝7.7Hz,1H),7.20(s,1H),7.05–7.00(m,2H),6.39(s,1H), 5.15(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.42(s,2H),4.21(t,J＝5.5,3.6Hz,2H),3.96(s,2H),3.90(d,J＝1.7Hz,6H),3.74(t,J＝5.5,3.6Hz,2H),3.65–3.56(m, 4H),3.26(q,J＝6.7Hz,2H),2.90–2.84(m,2H),2.83–2.71(m,2H),2.42(t, J＝7.3Hz,2H),2.20–2.12(m,2H),1.77–1.70(m,2H),1.67(s,6H),1.57– 1.51(m,2H),1.40–1.32(m,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ179.04,171.76,171.36,170.28,169.87,169.02,162.95,161.90,160.51,156.37,153.29,137.17,134.10,133.07,132.59,130.49,130.32,128.97,126.06,122.82,120.72,115.63,114.12,107.00,105.24,94.93,71.50,71.00,70.32,70.26,69.91,56.18,55.47,51.89,46.69, 39.31,38.57,36.52,31.53,29.01,26.10,25.57,24.95,23.30.
(2)终产物10/19的合成
将中间体p11/p12(1.1eq)，DIEA(5eq)，PyBOP(3eq)依次溶于干燥DMF溶液中，室温搅拌，TLC监测反应约半小时后，活性酯生成完全，加入中间体s3(1eq)，继续室温搅拌。TLC跟踪反应，约12小时反应完全。向反应液中加入碎冰淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷：甲醇＝13:1)纯化后得到终产物10/19。
终产物10(浅黄色固体，25.7％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ12.68(s,1H),8.85(s,1H),8.51(s,1H),8.17–8.13(m,2H),7.77(d,J＝7.9Hz,1H),7.65(d, J＝7.5Hz,1H),7.43(t,J＝7.7Hz,1H),7.03(d,2H),6.49(s,1H),5.14(d,J＝13.2,4.8Hz,1H),4.79(d,J＝2.4Hz,2H),4.44(s,2H),4.18(t,J＝4.5Hz, 2H),3.96(s,2H),3.91(s,3H),3.76(dd,J＝5.8,3.5Hz,2H),3.63(s,8H),3.25(d,J＝6.8Hz,2H),2.93–2.87(m,2H),2.85–2.71(m,2H),2.60(t,J＝2.3 Hz,1H),2.43(s,2H),2.12–2.05(m,4H),1.78–1.72(m,2H),1.68(s,6H),1.58 –1.51(m,2H),1.42–1.34(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ179.08,171.43,170.43,169.95,169.04,161.92,160.70,160.33,156.45,156.03,153.40,138.30,137.30,134.04,133.14,132.57,130.37,128.94,126.02,122.77,120.59,115.64,114.12,107.61,105.84,96.04,77.36,76.46,71.51,70.88,70.49,70.37,70.29,70.19, 70.15,56.59,55.45,51.92,46.79,39.50,38.56,36.59,31.51,29.70,28.95,26.03,24.99,23.28,17.13.
终产物19(黄色固体，32.7％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ12.68(s,1H),8.91(s,1H),8.59(s,1H),8.14(d,2H),7.77(d,J＝7.9Hz,1H),7.65(d,J＝7.5 Hz,1H),7.33(s,1H),7.03(d,2H),6.39(s,1H),5.13(dd,J＝13.0,5.0Hz,1H),4.43(s,2H),4.18(t,2H),3.96(s,2H),3.90(s,6H),3.76(t,2H),3.63(d,J＝ 2.7Hz,8H),3.50(q,J＝7.0Hz,1H),3.25(q,J＝6.7Hz,2H),2.91–2.85(m,2H),2.85–2.69(m,2H),2.46–2.40(m,2H),2.19–2.11(m,2H),1.78–1.70 (m,2H),1.59–1.51(m,2H),1.42–1.33(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ179.07,171.95,171.47,170.41,169.96,169.06,162.90,161.85,160.56,156.29,153.30, 141.08,137.20,134.05,133.17,132.55,130.33,128.92,126.04,122.88,120.59,115.63,114.09,106.94,105.25,94.91,71.52,70.87,70.50,70.36,70.30,70.19,70.16,56.16,55.44,51.92,46.76,39.36,38.58,36.56,31.51,28.94,26.04,25.56,25.00,23.26.
(3)终产物11/20的合成
将中间体p9/p10(1.1eq)，DIEA(5eq)，PyBOP(3eq)依次溶于干燥DMF溶液中，室温搅拌，TLC监测反应约半小时后，活性酯生成完全，加入中间体s6(1eq)，继续室温搅拌。 TLC跟踪反应，约12小时反应完全。向反应液中加入碎冰淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷：甲醇＝14:1)纯化后得到终产物11/20。
终产物11(浅黄色固体，53.4％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ12.70(s,1H),8.65(s,1H),8.56(s,1H),8.14(d,2H),7.83(d,J＝7.9Hz,1H),7.65(d,J＝7.4Hz,1H),7.43(t,J＝7.8Hz,1H),7.34(t,1H),7.03(d,2H),6.49(s,1H),5.19 (dd,J＝13.2,5.1Hz,1H),4.79(d,J＝2.4Hz,2H),4.50–4.41(m,2H),4.20(t,J＝6.0,3.3Hz,2H),4.00(s,2H),3.90(s,3H),3.75(t,J＝5.9,3.3Hz,2H),3.68 (t,J＝5.8,2.7Hz,2H),3.62(t,J＝5.7,2.9Hz,2H),3.34(t,J＝20.1,6.7Hz, 2H),2.93–2.87(m,2H),2.60(t,J＝2.3Hz,1H),2.55–2.32(m,4H),2.22–2.16(m,1H),2.12–2.07(m,2H),1.80–1.72(m,2H),1.68(s,6H),1.64–1.58(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ179.06,171.91,171.33,170.76,169.80,169.04,161.98,160.76,160.30,156.57,153.40,137.36,133.49,133.27,132.49,130.35,128.99,125.48,122.71,120.45,114.16,107.69,105.85,96.08,76.48,71.62,71.08,70.35,70.31,69.95,56.61,55.46,51.85,46.53,39.47,37.62,31.53,29.70,28.85,25.55,23.33,22.80.
终产物20(浅黄色固体，35.2％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ12.69(s,1H),8.70(s,1H),8.62(s,1H),8.13(d,2H),7.83(d,J＝7.9Hz,1H),7.65(d,J＝7.5Hz,1H),7.46–7.41(m,1H),7.37(s,1H),7.03(d,2H),6.39(s,1H),5.18(dd, J＝13.0,6.4Hz,1H),4.50–4.41(m,2H),4.25–4.16(m,2H),4.01(s,1H),3.90 (d,J＝5.5Hz,6H),3.77–3.73(m,2H),3.70–3.66(m,2H),3.64–3.58(m,2H),3.41–3.23(m,2H),2.91–2.74(m,4H),2.55–2.30(m,4H),2.11–2.05 (m,2H),1.78–1.71(m,2H),1.67(s,6H),1.64–1.58(m,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ179.04,171.95,171.35,170.77,169.82,169.05,162.97,161.91,160.52, 156.41,153.30,137.25,133.50,133.29,132.60,132.48,130.31,128.98,125.52,122.81,120.43,115.63,114.13,107.02,105.25,94.95,71.60,71.09,70.35,70.30, 69.94,56.18,55.45,51.85,46.55,39.33,37.69,31.53,29.69,28.83,25.57,23.32, 22.79。
【实施例6】VHL型配体V0的合成
(1)中间体V1的合成
将对溴苄胺(681ul，5.37mmol)溶于EA/H2O(V:V＝1:1)的混合溶液(40ml)中，室温搅拌均匀后，加入NaHCO3(91mg，1.07mmol)，稍许后加入Boc2O(1.36ml，5.91mmol)，加毕，室温反应。TLC跟踪反应，约2小时后反应完全。反应停止后，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，并用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后得到中间体V1(白色固体，1.365g，88.6％)，无需纯化，直接用于下一步。
(2)中间体V2的合成
在N2保护下，将中间体V1(1g，3.49mmol)，KOAc(686mg，6.99mmol)和醋酸钯(1％，8mg，0.03mmol)加入到干燥DMF(12ml)溶液中，加入4-甲基噻唑(636ul，6.99mmol)，升温至90℃回流。TLC跟踪反应，约4小时后反应完全。静置稍冷后向反应液中加入碎冰淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，并用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水依次洗涤3次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后得到的粗品经柱层析(PE:EA＝5：1)纯化即得到中间体V2(白色固体，864mg,，81.5％)。
中间体V2：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.47(d,J＝8.4Hz,2H),7.19(d, 2H),4.88(s,1H),4.28(s,2H),1.48(s,9H).
(3)中间体V3的合成
将中间体V2(500mg,，1.64mmol)溶于DCM(2.5ml)溶液中，缓慢滴加TFA(VTFA:VDCM＝1:1)至反应液中，室温搅拌。TLC跟踪反应，约1小时后反应完全。停止反应，减压除去溶剂，静置得到中间体V3(白色至微黄色固体，312mg，92.5％)，无需纯化，直接进行下一步反应。
(4)中间体V4的合成
冰浴下将Boc-L-羟脯氨酸(240mg，1.04mmol)，DIPEA(4.71mmol，821ul)，HATU(430mg， 1.13mmol)依次溶于干燥DMF(5ml)溶液中，加冰保持反应液温度在0～5℃，TLC监测活性酯生成后，加入中间体V3(300mg，0.94mmol)，缓慢升温至室温反应。TLC监测反应，约12小时反应完全。向反应液中加冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，并依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水依次洗涤3次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷:甲醇＝20:1)纯化得到中间体V4(白色粘稠状液体，298mg，75.7％)。
(5)中间体V5的合成
将中间体V4(250mg，0.6mmol)溶于盐酸乙醇(5ml)溶液中，室温搅拌，反应液中逐渐有白色固体析出。TLC监测反应，约12小时后反应完全。反应停止后，减压浓缩除去溶剂，真空干燥后得到中间体V5(白色至微粉色固体，181mg，95.2％)，无需纯化，直接用于下一步反应。
(6)中间体V6的合成
将N-Boc-L-叔亮氨酸(150mg，0.65mmol)，DIPEA(514ul，1.67mmol)，HATU(270mg，0.71mmol)依次溶于干燥DMF(5ml)溶液中，TLC监测活性酯生成后，加入中间体V5(208mg，0.59mmol)，置于室温搅拌。TLC监测反应，约24小时后反应完全。向反应液中加冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，并依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水依次洗涤3 次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷:甲醇＝15:1)纯化得到中间体V6(白色粘稠状液体，236mg，75.4％)。
(7)中间体V0的合成
将中间体V6溶于盐酸乙醇(236mg，0.44mmol)溶液中，室温搅拌，反应液中逐渐有白色固体析出。TLC监测反应，约24小时后反应完全。反应停止后，减压浓缩除去溶剂，真空干燥后得到中间体V0(白色固体，186.7mg，89.9％)，无需纯化，直接用于下一步反应。
中间体V0：1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.09(s,1H),8.77(t,J＝6.0Hz,1H), 8.18(s,3H),4.56(t,2H),4.43(dd,J＝15.8,6.5Hz,1H),4.38(s,1H),4.25(dd, J＝15.8,5.6Hz,1H),3.91(q,J＝5.5Hz,1H),3.79(d,J＝11.0Hz,1H),3.56(dd,J＝11.0,3.9Hz,1H),2.46(s,3H),2.16–2.10(m,1H),1.92–1.86(m,1H).13C NMR(126MHz,DMSO):δ171.98,167.21,152.26,147.69,140.01,131.88,129.94,129.16,127.90,69.45,59.46,58.49,57.01,42.14,38.57,34.88,26.48,16.19.
【实施例7】终产物21～24的合成
将中间体p9/p10/p11/p12(1.1eq)，DIPEA(5eq)，PyBOP(3eq)依次溶于干燥DMF溶液中，室温搅拌2小时后，加入中间体V0(1eq)，继续室温搅拌。TLC跟踪反应，约12小时后反应完全。向反应液中加冰水淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，并依次用饱和氯化铵溶液和饱和食盐水依次洗涤3次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩后经PTLC(二氯甲烷:甲醇＝15:1)纯化后，得到终产物21～24。
终产物21(黄色固体，35.8％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d):δ12.73(s,1H),8.70(s,1H),8.15(d,2H),7.34(s,5H),7.02(d,2H),6.49(s,1H),4.79(d,J＝ 2.4Hz,2H),4.75(t,J＝7.9Hz,1H),4.60–4.49(m,3H),4.33(dd,J＝14.9,5.2 Hz,1H),4.27–4.17(m,2H),4.09(t,1H),4.04(s,1H),3.98(s,1H),3.90(s,3H),3.78(t,J＝4.8Hz,2H),3.67–3.60(m,5H),2.92–2.87(m,2H),2.59(t, J＝2.3Hz,1H),2.52(s,3H),2.18–2.04(m,4H),1.68(s,6H).13C NMR(126MHz, CDCl3):δ179.04,171.38,170.68,170.49,161.82,160.57,160.45,156.26,153.39,150.38,148.18,138.21,137.38,136.66,131.77,130.72,130.41,129.45,128.13, 122.91,115.64,114.03,107.47,105.92,95.94,77.38,76.41,71.52,71.21,70.42,70.38,70.26,70.15,58.41,57.17,56.68,56.55,55.44,43.23,35.79,34.96,29.70, 26.38,25.54,17.13,15.94.
终产物22(黄色固体，36.3％)：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)：δ12.73(s,1H),8.71(s,1H),8.14(d,2H),7.43(t,J＝6.0Hz,1H),7.34(s,5H),7.02(d,2H),6.40(s,1H),4.75(t,J＝7.9Hz,1H),4.60–4.50(m,3H),4.33(dd,J＝14.9, 5.2Hz,1H),4.26–4.17(m,2H),4.09(t,1H),4.04(s,1H),3.98(s,1H),3.90 (d,J＝7.2Hz,6H),3.78(t,2H),3.67–3.60(m,5H),2.90–2.85(m,2H),2.58–2.53(m,1H),2.52(s,3H),2.17–2.11(m,1H),2.09–2.05(m,2H),1.67(s, 6H),0.95(s,9H).13C NMR(126MHz,CDCl3)：δ179.04,171.37,170.71,170.49,162.78,161.75,160.66,156.10,153.29,150.37,148.06,144.72,138.26,137.27,131.84, 130.65,130.37,129.44,128.14,123.02,115.64,114.00,106.80,105.33,94.82,71.52,71.22,70.42,70.38,70.26,70.15,58.42,57.18,56.69,56.12,55.44,43.23,35.81, 26.39,25.56,17.00,15.88.
终产物23：黄色固体，34.5％
终产物24：黄色固体，35.9％
【实施例8】本发明的淫羊藿素PROTACs化合物的体外抗肿瘤活性测试(IC50)
对本发明的淫羊藿素PROTACs化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制能力测试，测试方法采用常规的CCK-8法。将对数生长期的肿瘤细胞(CA46细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞)收集起来，用PBS洗后用培养基(1640+13％FBS)将细胞稀释悬浮成单细胞悬液，调整细胞密度为7 ×104个/mL，每孔加入100μL接种于96孔板中，再分别加入不同浓度的化合物，每个浓度平行三个复孔，并设置实验组和对照组，置37℃、5％CO2培养箱内孵育48小时后，向每孔加入10μLCCK-8溶液，然后37℃下避光孵育3小时，再用酶标仪测450nm OD值。得到数据使用SPSS软件计算半数抑制浓度IC50。
实验结果：进一步评价目标化合物的体外抗肿瘤活性，选用CA46细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞)作为测试肿瘤株，淫羊藿素衍生物本体(a/b)作为对照组。测试结果如表2所示，整体看淫羊藿素PROTACs化合物抗肿瘤活性优于淫羊藿素衍生物本体。结合IC50和化合物结构，选择SI-10作为给药组，进一步进行后期的蛋白质组学研究分析。
表2：
【实施例9】本发明的淫羊藿素PROTACs化合物的蛋白质组学研究分析
共设置9个细胞样本，分为3组，即PROTACs组(给药组)，atNP组(对照组)和空白组，各组对应的生物学重复均为3例。产生3组数据对比，给药组VS对照组，给药组VS空白组和对照组VS空白组。所得数据使用Proteome Discoverer软件(PD)(version 2.4.0.305,Thermo Fisher Scientific)及内置的Sequest HT搜索引擎进行搜库分析。
实验结果：基于LC-MS对蛋白质进行定量分析，本次实验共鉴定到6518个蛋白(groups)， 49713条多肽。蛋白多肽鉴定数分布如图1A，蛋白分子量分布如图1B，多肽长度分布如图1C，蛋白鉴定肽段覆率分布如图1D。利用统计学方法筛选差异表达的蛋白，其中差异表达蛋白筛选标准：Student’s t-test的P-VALUE<0.05且FOLD CHANGE≤0.83或FOLDCHANGE≥ 1.2。所有差异表达的蛋白汇总数据如表3所示。根据筛选标准，给药组和对照组中的差异表达蛋白分析得到总差异蛋白34个，其中上调的蛋白有18个(fc>＝1.2)，下调的蛋白有16个 (fc<＝0.83)(图3A)。由于PROTACs小分子的作用机制是可以直接发挥降解蛋白的效果，因此我们重点关注总差异蛋白中下调的部分差异蛋白，同时结合给药组和空白组的差异表达蛋白(图3B)对比分析，(基于筛选原则)筛选出两组对比中共有的差异蛋白，并按照差异度进行排列，得出差异度最明显的前三个蛋白：NLRP13、TECPR2和GRIA3(图3C)。研究表明，GRIA3作为转录因子CUX1的下游效应靶标，其低水平表达可抑制胰腺癌细胞的增殖，诱导凋亡。GRIA3的低水平表达还可影响MAPK/ERK信号通路从而抑制非小细胞肺癌细胞侵袭转移。结合差异蛋白组学结果确定GRIA3为淫羊藿素抗肿瘤的潜在靶标。
Claims (6)
1.一种PROTAC化合物或其药理或生理上可接受的盐在制备NLRP13、TECPR2和GRIA3抑制剂中的用途，其特征在于：所述PROTAC化合物选自下列化合物中的至少一种：
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的PROTAC化合物或其药理或生理上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的PROTAC化合物或其药理或生理上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：化合物5的制备方法为：
5.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于：所述的PROTAC化合物或其药理或生理上可接受的盐的制备方法，还包括如下步骤
6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：S1的制备方法为
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