CN117551052A - 一种具有抗肿瘤活性的噁二唑衍生物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的多取代噁二唑衍生物及其制备方法和应用，其结构为：其中，R1选自H、4‑Br、4‑CH3、3‑CH3、2‑Cl中的一种；R2选自H、CH3、Ph中的一种；R3选自H、C4H10中的一种；R4选自C6H4、4‑ClC6H4、4‑BrC6H4、3‑ClC6H4、2‑BrC6H4、2‑ClC6H4、4‑CH3C6H4、4‑CH3OC6H4、4‑NO2C6H4、Et、2‑Thiophene中的一种。本发明公开的多取代噁二唑衍生物对肝癌细胞具有较强的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的噁二唑衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
含噁二唑骨架的化合物在有机合成与药物化学中有着重要的应用，具有广泛的生物活性，如具有抗生素、抗增殖、抗癌、抗菌、抗炎等活性。由于该类杂环骨架具备的优良的生物学和药理学性质，受到了研究者的广泛关注。因此，近年来研究者一直致力于合成各类多取代噁二唑化合物，到目前为止已经建立了多种构建噁二唑骨架的策略，其中，代表性的方法有：(1)以氯仿为一氧化碳(CO)源，氢氧化铯作为碱，钯催化下芳基卤化物与和四唑生成2,5-二取代噁二唑(Adv.Synth.Catal.2015，357，3469-3473)。(2)铜催化肼与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)直接环化反应，高效合成一类多取代噁二唑(Adv.Synth.Catal.2019，361，3986-3990)。尽管这些方法各自具有各自的优点，但仍然存在一些缺点，如产率低、操作步骤多、官能团耐受性差、反应条件苛刻等等。因此开发出一种步骤简单、条件温和的方法合成/制备噁二唑仍然具有重要的意义。
癌症是全球主要的公共卫生问题，世卫国际癌症研究机构数据显示，2020年全球新发癌症病例约2000万，死亡病例约1000万。中国由于人口基数大，发病死亡率也较高，远超其它国家，形势严峻。其中肝癌发病率高、死亡率高，5年生存率大约为18％，是仅次于胰腺癌的第二大致死性肿瘤。有数据显示：一是中国每年新发肝癌病例数占到全球的50％；二是死亡病例数也占到全球的50％。传统治疗肝癌的化疗药物副作用明显，开发分子靶向药物更有利于提高患者的生存质量，因此合成具有抗肿瘤(尤其是抗肝癌)活性的小分子化合物对于患者来说是一大福音。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种具有抗肿瘤活性的噁二唑衍生物及其制备方法和应用。
本发明提供一种具有抗肿瘤活性的多取代噁二唑衍生物，其结构如式I所示：
其中，
R1选自H、4-Br、4-CH3、3-CH3、2-Cl中的一种；
R2选自H、CH3、Ph中的一种；
R3选自H、C4H10中的一种；
R4选自C6H4、4-ClC6H4、4-BrC6H4、3-ClC6H4、2-BrC6H4、2-ClC6H4、4-CH3C6H4、4-CH3OC6H4、4-NO2C6H4、Et、2-Thiophene中的一种。
本发明还提供一种如上述的多取代噁二唑衍生物的制备方法，合成路线(II)如下：
进一步的，包括以下步骤：
S1.将氯化亚铜与叔丁基过氧化氢加入干燥的三颈烧瓶中，其中所述氯化亚铜与所述叔丁基过氧化氢的摩尔比为1：(13.5-16.5)，然后对三颈烧瓶进行抽真空并通入氮气保护；
S2.在室温下依次加入(N-异氰基)三苯基磷亚胺(结构式见合成路线(II)中的反应物1)、多取代叔胺(结构式见合成路线(II)中的反应物2)、酸(结构式见合成路线(II)中的反应物3)，加入无水乙腈，其中所述氯化亚铜和(N-异氰基)三苯基磷亚胺的摩尔比为1：(9-11)，所述(N-异氰基)三苯基磷亚胺、所述多取代叔胺：酸的摩尔比为2：(3.6-4.4)：(2.7-3.3)，所述酸与所述无水乙腈的摩尔体积比为0.27-0.33mmol/mL；
S3.升温至55-66℃，并搅拌8-12小时反应，反应完全后除去溶剂得到粗产物；
S4.所述粗产物经柱层析分离即得多取代噁二唑衍生物(结构式见合成路线(II)中的产物4)。
进一步的，所述步骤S3中反应温度为60℃，利用TLC监测反应完全，反应时间为8-12小时。
进一步的，所述步骤S4的柱层析分离所用的溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合溶液，其中乙酸乙酯与石油醚体积比为1：4。
进一步的，所述步骤S1中所述氯化亚铜与所述叔丁基过氧化氢的摩尔比为1：15。
进一步的，所述步骤S2中所述(N-异氰基)三苯基磷亚胺、所述多取代叔胺：酸的摩尔比为2：4：3。
进一步的，所述制备方法的步骤具体为：
将10mg(0.1mmol)的氯化亚铜与1.5mmol的叔丁基过氧化氢加入干燥的25mL三颈烧瓶中，随后对三颈烧瓶进行抽真空并通入氮气保护；在室温下依次加入302mg(1.0mmol)的(N-异氰基)三苯基磷亚胺、270mg(2.0mmol)的多取代叔胺、234mg(1.5mmol)的酸，加入5mL的无水乙腈；将反应液升温至60℃并搅拌8-12小时(TLC监测)，反应完全后除去溶剂得到粗产物；粗产物经柱层析分离即得噁二唑衍生物。
进一步的，所述步骤S4中得到的多取代噁二唑衍生物如下：
进一步的，所述步骤S4中得到的多取代噁二唑衍生物为化合物4f(4-bromo-N-methyl-N-((5-(p-tolyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)methyl)aniline)，其结构式如下：
本发明还提供一种如上述的多取代噁二唑衍生物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
本发明还提供一种如上述的多取代噁二唑衍生物在制备治疗肝癌药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提供一种具有抗肿瘤活性的噁二唑衍生物及其制备方法和应用，该制备方法利用简单、易得的原料((N-异氰基)三苯基磷亚胺、多取代叔胺、酸)进行连续的铜催化氧化Ugi/aza-Wittig反应，一步合成一种结构新颖的噁二唑化合物，对其进行了体外肿瘤细胞抑制活性测试，结果显示其对肝癌细胞具有较强的抗肿瘤活性。
2、本发明的制备方法合成路线简单、条件温和、产率高，较现有的制备方法具有显著的进步。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为化合物4f的1H NMR(400MHz，CDCl3)图；
图2为化合物4f的13C{1H}NMR(100MHz，CDCl3)图；
图3为实施例2大鼠肝癌细胞的活性检测各组细胞平均OD值统计图；
图4为实施例3显微镜下各组划痕的细胞单层愈合0、24、48h的图像；
图5为实施例3各组迁移细胞总数统计图统计图；
图6为实施例4各组细胞结晶子染色图；
图7为实施例4各组平板克隆细胞数目统计图；
图8为实施例5EdU和DAPI的荧光染色图；
图9为实施例5Edu阳性细胞率统计图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
本发明实施例提供一种具有抗肿瘤活性的多取代噁二唑衍生物，其结构如式I所示：
其中，
R1选自H、4-Br、4-CH3、3-CH3、2-Cl中的一种；
R2选自H、CH3、Ph中的一种；
R3选自H、C4H10中的一种；
R4选自C6H4、4-ClC6H4、4-BrC6H4、3-ClC6H4、2-BrC6H4、2-ClC6H4、4-CH3C6H4、4-CH3OC6H4、4-NO2C6H4、Et、2-Thiophene中的一种。
优选的，所述多取代噁二唑衍生物的结构为：
本发明实施例还提供一种如上述的多取代噁二唑衍生物的制备方法，合成路线(II)如下：
具体的，包括以下步骤：
S1.将氯化亚铜与叔丁基过氧化氢加入干燥的三颈烧瓶中，其中所述氯化亚铜与所述叔丁基过氧化氢的摩尔比为1：(13.5-16.5)，然后对三颈烧瓶进行抽真空并通入氮气保护；
S2.在室温下依次加入(N-异氰基)三苯基磷亚胺(结构式见合成路线(II)中的反应物1)、多取代叔胺(结构式见合成路线(II)中的反应物2)、酸(结构式见合成路线(II)中的反应物3)，加入无水乙腈，其中所述氯化亚铜和(N-异氰基)三苯基磷亚胺的摩尔比为1：(9-11)，所述(N-异氰基)三苯基磷亚胺、所述多取代叔胺：酸的摩尔比为2：(3.6-4.4)：(2.7-3.3)，所述酸与所述无水乙腈的摩尔体积比为0.27-0.33mmol/mL；
S3.升温至55-66℃，并搅拌8-12小时反应，反应完全后除去溶剂得到粗产物；
S4.所述粗产物经柱层析分离即得多取代噁二唑衍生物(结构式见合成路线(II)中的产物4)。
具体的，所述步骤S3中反应温度为60℃，利用TLC监测反应完全，反应时间为8-12小时。
具体的，所述步骤S4的柱层析分离所用的溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合溶液，其中乙酸乙酯与石油醚体积比为1：4。
优选的，所述步骤S1中所述氯化亚铜与所述叔丁基过氧化氢的摩尔比为1：15。
优选的，所述步骤S2中所述(N-异氰基)三苯基磷亚胺、所述多取代叔胺：酸的摩尔比为2：4：3。
具体的，所述制备方法的步骤具体为：
将10mg(0.1mmol)的氯化亚铜与1.5mmol的叔丁基过氧化氢加入干燥的25mL三颈烧瓶中，随后对三颈烧瓶进行抽真空并通入氮气保护；在室温下依次加入302mg(1.0mmol)的(N-异氰基)三苯基磷亚胺、270mg(2.0mmol)的多取代叔胺、234mg(1.5mmol)的酸，加入5mL的无水乙腈；将反应液升温至60℃并搅拌8-12小时(TLC监测)，反应完全后除去溶剂得到粗产物；粗产物经柱层析分离即得噁二唑衍生物。
具体的，所述步骤S4中得到的多取代噁二唑衍生物如下：
优选的，所述步骤S4中得到的多取代噁二唑衍生物为化合物4f(4-bromo-N-methyl-N-((5-(p-tolyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)methyl)aniline)，其结构式如下：
本发明实施例还提供一种如上述的多取代噁二唑衍生物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
优选的，所述多取代噁二唑衍生物为上述的化合物4f。
本发明实施例还提供一种如上述的多取代噁二唑衍生物在制备治疗肝癌药物中的用途。
优选的，所述多取代噁二唑衍生物为上述的化合物4f。
本发明实施例还提供一种如上述的多取代噁二唑衍生物在治疗肿瘤疾病中的用途。
优选的，所述肿瘤疾病为肝癌。
优选的，所述多取代噁二唑衍生物为上述的化合物4f。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明，本发明的内容完全不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。下述实施例中的数据采用SPSS26.0软件进行统计学处理，数据资料以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，p<0.05为差异有统计学意义。
实施例1多取代噁二唑衍生物的制备
按以下步骤制备多取代噁二唑衍生物：
(1)将10mg(0.1mmol)的氯化亚铜与1.5mmol的叔丁基过氧化氢加入干燥的25mL三颈烧瓶中，随后对三颈烧瓶进行抽真空并通入氮气保护；在室温下依次加入302mg(1.0mmol)的(N-异氰基)三苯基磷亚胺、270mg(2.0mmol)的多取代叔胺、234mg(1.5mmol)的酸，加入5mL的无水乙腈；将反应液升温至60℃并搅拌8-12小时(TLC监测)，反应完全后除去溶剂得到粗产物；
(2)粗产物经柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚＝1:4v/v)得到目标产物噁二唑衍生物。
(3)对目标产物进行表征：4-bromo-N-methyl-N-((5-(p-tolyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)methyl)aniline(4f).White solid(yield 0.233g，65％)，mp 97-98(C；1H NMR(CDCl3，400MHz):δ(ppm)7.86(d，J＝8.0Hz，2H)，7.35-7.27(m，4H)，6.77-6.75(m，2H)，4.71(s，2H)，3.11(s，3H)，2.41(s，2H)；13C{1H}NMR(CDCl3，100MHz):δ(ppm)165.4，163.1，147.4，142.4，131.9，129.7，126.8，120.8，114.8，110.3，47.5，39.0，21.6.LCMS(ESI)m/z[M+H]+:358.Anal.Calcd for C17H16BrN3O:C，57.00；H，4.50；Br，22.30；N，11.73；O，4.47；Found:C，56.82；H，4.62；Br，22.08；N，11.60；O，4.21.
见图1和图2，可知目标产物的结构为化合物4f:4-bromo-N-methyl-N-((5-(p-tolyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl)methyl)aniline的结构式为：
实施例2多取代噁二唑衍生物的抗肝癌活性测试
按以下步骤进行测试：
2.1细胞培养：大鼠肝癌细胞于5％ CO2、恒温培养箱中培养。使用培养基为含10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM，细胞长至75％左右时进行传代，所有细胞实验均取自对数生长期细胞，并重复3次。
2.2CCK8法检测细胞活力：按5×10 3个细胞/孔将大鼠肝癌细胞细胞接种到96孔板中，培养箱中培养24h，然后用不同浓度的实施例1制备的化合物4f(0、3、10、30μM)处理细胞48h。向每孔中加入10μL CCK-8试剂，培养箱孵育3h，酶标仪检测450nm处吸光度，Graphpad Prism8软件绘制细胞生存曲线。如图3所示，化合物4f分子浓度为0、3、10、30μM时，其细胞活力值分别为100±1、84±1.6、75±3.2、40±2.2(数据表示为平均值±标准差(n＝3)，下同)。该结果表示在化合物4f分子浓度在10μM以下，没有细胞毒性(p>0.05)。为后期的细胞实验提供了药物浓度依据。
实施例3细胞划痕实验
细胞划痕实验分析化合物4f分子对肝癌细胞迁移能力的影响。使用marker笔在6孔板背后，每隔0.5cm划5条线，取对数期生长期细胞，以每孔5×105个细胞接种于6孔板，培养箱中孵育24h，融合率达到90％左右，用20μL无菌枪头在孔内垂直横线划痕，用PBS洗除脱落细胞后，加入含有不同浓度(0、1、3μM)的化合物4f的无血清培养基继续培养，并在0、24、48h显微镜下观察各孔并拍照，每组实验重复3次及以上。用Image J软件测量划痕面积，用Graphpad Prism8软件测量划痕愈合率。如图4和图5所示，24h时对照组、1和3μM化合物4f分子处理组迁移细胞总数分别为215±2.2、174±0.9和52±1.8；48h时对照组、1和3μM化合物4f分子处理组迁移细胞总数分别为462±0.9、296±2.1和183±2.3。与对照组相比，实验组中迁移的细胞总数减少，划痕处细胞闭合时间延长(p>0.05)，表示化合物4f可显著抑制肝癌细胞迁移。
实施例4Transwell迁移试验
Transwell小室可检测肝癌细胞迁移能力。Transwell聚酯透明膜嵌套细胞小室(3407)购于美国康宁公司。将肝癌细胞饥饿12h后用胰酶消化，用无血清培养基配置细胞悬液，每个小室内加入200μL含有化合物4f分子的细胞悬液，浓度为0、1、3μmol/L，接种密度为每孔1×104个，小室放置于含10％血清的完全培养基的24孔板中，置于培养箱中48h后取出小室至4％多聚甲醛中固定15min后用0.5％结晶紫染色10min，晾干小室后荧光显微镜(奥林巴斯IX73，奥林巴斯，东京，日本)拍照计数。细胞迁移率＝实验组细胞数/对照组细胞数，每次实验重复3次。如图6和图7所示，对照组克隆细胞数目为409.88±14.5；1和3μM化合物4f分子处理组克隆细胞数目分别为222.33±21.3和74.45±8.75。与对照组相比，1μM组和3μM组细胞平板克隆形成能力显著降低(p<0.05)，表示化合物4f处理后可明显抑制肝癌细胞迁移，且存在剂量依赖性。
实施例5EDU细胞增殖实验
采用EdU法检测化合物4f处理后的肝癌细胞增殖，用不同浓度的化合物4f(0、1和3μM)处理肝癌细胞，具体操作如下：在24孔板中铺设14mm细胞爬片，将对数期生长的肝癌细胞C6以每孔1×104个细胞的密度接种于细胞爬片上中，调整细胞至适宜密度后计数，待细胞贴壁后加化合物4f分子，浓度为0、1、3μmol/L，培养24h后每孔加入100μL50μmo/L EdU的培养基孵育2h，之后在4％多聚甲醛中室温固定细胞30min，PBS洗3遍，加入通透液室温孵育20分钟，PBS洗两遍，加入配置好的Click反应液，室温避光孵育30分钟，PBS洗一遍，用DAPI进行核染色，荧光显微镜(奥林巴斯IX73，奥林巴斯，东京，日本)观察细胞发光情况，红色荧光为增殖细胞，蓝色荧光为细胞核染色。EdU-488细胞增殖检测试剂盒(C0071S)购于上海碧云天生物技术有限公司。如图8和图9所示，对照组EdU阳性细胞率为0.46±0.03；1μM化合物4f处理细胞EdU阳性细胞率为0.37±0.04(p<0.05)；3μM化合物4f处理组细胞EdU阳性细胞率为0.22±0.05(p<0.05)。该结果可看出，随着化合物4f浓度的增加，肝癌EdU阳性细胞数逐渐减少，表示化合物4f可明显抑制肝癌细胞增殖。
以上结果均表明化合物4f在10μM以下，没有细胞毒性，并且对肝癌具有一定抑制活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有抗肿瘤活性的多取代噁二唑衍生物，其结构如式I所示：
其中，
R1选自H、4-Br、4-CH3、3-CH3、2-Cl中的一种；
R2选自H、CH3、Ph中的一种；
R3选自H、C4H10中的一种；
R4选自C6H4、4-ClC6H4、4-BrC6H4、3-ClC6H4、2-BrC6H4、2-ClC6H4、4-CH3C6H4、4-CH3OC6H4、4-NO2C6H4、Et、2-Thiophene中的一种。
2.一种如权利要求1所述的多取代噁二唑衍生物的制备方法，其特征在于，所述噁二唑衍生物的合成路线如下：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将氯化亚铜与叔丁基过氧化氢加入干燥的三颈烧瓶中，其中所述氯化亚铜与所述叔丁基过氧化氢的摩尔比为1：(13.5-16.5)，然后对三颈烧瓶进行抽真空并通入氮气保护；
S2.在室温下依次加入(N-异氰基)三苯基磷亚胺、多取代叔胺、酸，加入无水乙腈，其中所述氯化亚铜和(N-异氰基)三苯基磷亚胺的摩尔比为1：(9-11)，所述(N-异氰基)三苯基磷亚胺、所述多取代叔胺：酸的摩尔比为2：(3.6-4.4)：(2.7-3.3)，所述酸与所述无水乙腈的摩尔体积比为0.27-0.33mmol/mL；
S3.升温至55-66℃，并搅拌8-12小时反应，反应完全后除去溶剂得到粗产物；
S4.所述粗产物经柱层析分离即得多取代噁二唑衍生物。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中反应温度为60℃，利用TLC监测反应完全，反应时间为8-12小时。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4的柱层析分离所用的溶剂为乙酸乙酯与石油醚的混合溶液，其中乙酸乙酯与石油醚体积比为1：4。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中所述氯化亚铜与所述叔丁基过氧化氢的摩尔比为1：15。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述(N-异氰基)三苯基磷亚胺、所述多取代叔胺：酸的摩尔比为2：4：3。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4得到的多取代噁二唑衍生物的结构式为：
9.一种如权利要求1所述的多取代噁二唑衍生物在制备治疗肿瘤药物中的用途。
10.一种如权利要求1所述的多取代噁二唑衍生物在制备治疗肝癌药物中的用途。
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