JP2001519538A

JP2001519538A - 核酸アレイのレプリカ増幅

Info

Publication number: JP2001519538A
Application number: JP2000515912A
Authority: JP
Inventors: チャーチ，ジョージ・エム
Original assignee: プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ
Priority date: 1997-10-10
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2001-10-23
Also published as: EP1028970A1; AU737174B2; AU9209498A; US6432360B1; CA2305449A1; WO1999019341A1

Abstract

(57)【要約】支持体に付けられた核酸分子の異種プールを含む、第１のランダムにパターン化された、固定化された核酸アレイの核酸分子をインサイチオで増幅し、そのような増幅により生成した核酸分子の少なくとも１つのサブセットを第２の支持体に移し、そしてそのように移されたサブセットを第２の支持体に付けて、第２のランダムにパターン化された、固定化された核酸アレイを生成し、ここで、第２のアレイの核酸分子は第１のアレイ上のそれらが増幅された元の核酸分子の位置に対応する位置を占め、このことにより第１のアレイがテンプレートとして働いて複数を生成する、の各工程をこの順に含む、複数の核酸アレイを生成する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、一般に、核酸アレイの再生産可能な大量生産に関する。発明の背景核酸分子のアレイは、ゲノムの特性決定（例えば、ポリモルフィズム分析およ
びハイスループット配列決定技術）、遺伝的疾患のリスクについての臨床患者ま
たは家系全体のスクリーニング、蛋白質／ＤＮＡ相互作用または蛋白質／蛋白質
相互作用の解明、または医薬化合物候補の効力のアッセイをめざす方法を容易に
する上で多大な有用性を有する。しかし、そのようなアレイを慣用の方法により
製造することは労働集約的かつ高価である。核酸フラグメントの高度に順序づけ
られたアレイは当該技術分野において知られている（Ｆｏｄｏｒｅｔａｌ．
，米国特許Ｎｏ．５，５１０，２７０；Ｌｏｃｋｈａｒｔｅｔａｌ．，米国
特許Ｎｏ．５，５５６，７５２）。ＣｈｅｔｖｅｒｉｎおよびＫｒａｍｅｒ（Ｗ
Ｏ９３／１７１２６）は、増幅することができる高度に順序づけられたアレイを
開示していると言われる。

【０００２】ＣｈｅｔｖｅｒｉｎおよびＣｈｅｔｖｅｒｉｎａの米国特許Ｎｏ．５，６１６
，４７８は、核酸分子のプールがそれらが共有結合的に結合されていない支持体
マトリックス上に配置されている核酸増幅の方法を特許請求していると伝えられ
る。Ｕｔｅｒｍｏｈｌｅｎ（米国特許Ｎｏ．５，４３７，９７６）は、再使用可
能なマトリックス上にランダムに固定化された核酸分子を開示していると言われ
る。

【０００３】当該技術分野においては、核酸アレイの設計および製造の改良された方法が必
要とされている。発明の概要本発明は、複数の核酸アレイを製造する方法を提供する。該方法は、支持体に
付けられた核酸分子の異種プールを含む、第１のランダムにパターン化された、
固定化された核酸アレイの核酸分子をインサイチオで増幅し、そのような増幅に
より生成した核酸分子の少なくとも１つのサブセットを第２の支持体に移し、そ
してそのように移されたサブセットを第２の支持体に付けて、第２のランダムに
パターン化された、固定化された核酸アレイを生成し、ここで、第２のアレイの
核酸分子は、第１のアレイがテンプレートとして働いて複数を生成するように、
第１のアレイ上のそれらが増幅された元の核酸分子の位置に対応する位置を占め
る、の各工程をこの順序で含む。

【０００４】本明細書において核酸アレイに関して用いる場合、"複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）"との用語は、２つまたはそれ以上のそのようなアレイを称するものと定義され、ここで第１の（または"テンプレート"）アレイおよびそれから作成される
第２のアレイは、複数を含む。そのような複数が３以上のアレイを含む場合、第
２のアレイから先のアレイは、第１のアレイまたはその任意のコピーをテンプレ
ートとして用いて製造することができる。

【０００５】本明細書において用いる場合、"ランダムにパターン化された"または"ランダム"との用語は、意図された設計（またはそのような設計を行うことができるプログラム）により、または個々の核酸特徴を配置することにより得られたもので
はない、順序づけられない、非デカルト分布である（別の表現では、グリッドの
ｘ軸およびｙ軸に沿ってあらかじめ定められた点で、または放射状パターンの中
心から所定の’クロック位置’、度またはラジアンで配置されていない）支持体
上の核酸分子を表す。そのような核酸の"ランダムにパターン化された"または" ランダム"なアレイは、核酸分子のプールを含む溶液、乳濁液、エアロゾル、蒸気または乾燥調製物を、それらを支持体上の特定の部位に向けるいかなる介在も
なしに、支持体上に滴下、スプレイ、塗布または散布し、核酸分子を支持体上に
定着（ｓｅｔｔｌｅ）させることにより得ることができる。

【０００６】本明細書において用いる場合、"固定化された"または"付けられた（ａｆｆｉｘ）"との用語は、核酸分子と支持体マトリックスとの間の共有結合を表す。

【０００７】本明細書において用いる場合、"アレイ"との用語は、支持体マトリックス上に
分配された核酸分子の異種プールを表す。好ましくは、配列の異なるこれらの分
子がアレイの別々の特徴の同定が可能であるように互いに十分に距離をおいて配
置されている。

【０００８】本明細書において用いる場合、"異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）"との用
語は、多数の異なる配列を含む核酸分子の集団または集合を表すと定義される。
核酸分子の異種プールは、細胞の未分画または部分分画されたＲＮＡまたはＤＮ
Ａ調製物から得られたものであることが企図される。

【０００９】 "未分画"核酸調製物は、それが調製された元の生物学的サンプルにあるような
ＲＮＡまたはＤＮＡの相補物中に存在する配列が選択的に除去されていない調製
物であると定義される。成分核酸分子の切断により平均分子量が低くなっている
が、依然としてすべての配列を保持している核酸調製物は、それが調製された元
の生物学的サンプル中に存在する配列の多様性を保持しているため、この定義に
したがえば、やはり"未分画"である。

【００１０】 "部分的に分画された"核酸調製物は、定性的サイズ選択をへたものでもよい。
この場合、切断されていない配列、例えば全染色体またはＲＮＡ分子は、サイズ
に基づいて選択的に保持されるか除去される。さらに、"部分的に分画された"調
製物は、目的とする配列とのハイブリダイゼーションによる選択をへた分子を含
んでいてもよい。あるいは、"部分的に分画された"調製物は、ハイブリダイゼー
ションにより望ましくない配列が除去されていてもよい。核酸分子の"部分的に分画された"プールは、生物学的サンプルから抽出された後に純粋なまたは実質的に純粋なまでに濃縮された単一の配列を含まないであろうことが企図される。

【００１１】この文脈において、"実質的に純粋な"とは、プールの大部分の核酸分子により
表される単一の核酸配列を表す。ここでもまた、これはインビトロでの配列の濃
縮を表す。明らかに、生物学的サンプル中においてある配列が重く表される場合
、これを含む調製物は本発明にしたがう使用から除外されるものではない。

【００１２】本明細書において用いる場合、"生物学的サンプル"との用語は、全生物または
その組織、細胞または組成成分（例えば液体）のサブセットを表す。また、"生物学的サンプル"は、全生物またはその組織、細胞または組成成分のサブセットから調製されたホモジネート、溶解物、または抽出物、あるいはそれらの画分ま
たは部分を表す。さらに、"生物学的サンプル"とは、細胞成分、例えば核酸分子
を含む、生物が増殖してきた培地、例えば栄養培地またはゲルを表す。

【００１３】本明細書において用いる場合、"生物"との用語は、すべての細胞生命体、例え
ば原核生物および真核生物、ならびに非細胞性核酸含有物体、例えばバクテリオ
ファージおよびウイルスを表す。

【００１４】本明細書において用いる場合、"特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）"との用語は、アレイ
上の別々の物理学的位置を占めている各核酸配列を表す。ある配列が２以上のそ
のような部位において表される場合、各部位は特徴として分類される。この文脈
において、"核酸配列"との用語は、単一の核酸分子（二本鎖または一本鎖）、ア
レイ上の同じ物理学的位置に存在する核酸分子の増幅されたコピーの"クローン"
、またはそのようなクローンの別の支持体上のレプリカを表す。

【００１５】本明細書において用いる場合、"増幅する"との用語は、プライミングされた酵
素的合成の繰り返しにより、アレイの核酸分子のコピーを製造することを表す。
"インサイチオ増幅"とは、そのような増幅が、溶液中ではなく、本発明にしたが
う支持体上に配置されたテンプレート核酸分子で生ずることを示す。

【００１６】本明細書において用いる場合、"支持体"との用語は、その上に核酸アレイの核
酸分子が固定化されたマトリックスを表す。好ましくは、支持体は半固体である
。

【００１７】本明細書において用いる場合、"半固体"との用語は、固体および液体成分の両
方を有する圧縮性マトリックスを表し、ここで液体は固体マトリックス要素間の
孔、空間または他の隙間を占める。

【００１８】本明細書において核酸分子または特徴の物理的配置、および／または本発明の
アレイ上におけるそれらの互いの方向に関して用いる場合、"対応する"または" 対応している"との用語は、アレイの特徴の互いの配置が複数のアレイの間で保存されるように、第２のアレイ上で、それらが第２のアレイの生成のためのテン
プレートとして働く第１のアレイ上で増幅された元の分子の位置と同一または鏡
像のいずれかの位置を占めているか、またはその逆である分子を表す。

【００１９】上の記述から暗示されるように、本発明にしたがう複数の核酸アレイの第１の
アレイおよび第２のアレイは、同様のキラリティーのものであっても逆のキラリ
ティーのものであってもよい。すなわち、核酸アレイのパターン形成は、同一で
あっても鏡像であってもよい。

【００２０】本明細書において用いる場合、"レプリカ"との用語は、本発明にしたがう、テ
ンプレートとして第１のランダムにパターン化された固定化された核酸アレイを
用いるプリンティング方法により製造される任意の核酸アレイを表す。

【００２１】好ましい態様においては、該方法は、第１のアレイの分子を増幅することによ
り生成した核酸分子の少なくとも１つのサブセットを第２の支持体に移す工程の
後に、第１のアレイの分子を増幅することにより生成した核酸分子の別のサブセ
ットを追加の第２の支持体に移して付けるように、その工程を繰り返すことをさ
らに含む。

【００２２】好ましくは、増幅された核酸分子を第２の支持体に移す工程の後に、増幅され
た核酸分子を追加の第２の支持体に移すことを繰り返す前に、第１の支持体上に
保持された核酸分子を増幅する。

【００２３】別の好ましい態様においては、該方法は、第１のアレイの分子の増幅により生
成した核酸分子の少なくとも１つのサブセットを第２の支持体に移す工程の後に
、第２の支持体に移された分子の少なくとも１つのサブセットを第３の支持体に
移して付ける工程をさらに含む。

【００２４】好ましくは、該方法は、第２のアレイの核酸分子を増幅する工程をさらに含む
。

【００２５】核酸分子のプールはＲＮＡまたはＤＮＡから調製されたものであることが好ま
しい。

【００２６】また、核酸分子のプールがｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことが好ましい
。

【００２７】好ましくは、核酸分子のプールはライブラリである。

【００２８】好ましい態様においては、核酸分子のプールは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ
を核酸ベクターのクローニング部位中にクローニングし、次に核酸分子をベクタ
ーから切断することにより調製され、ここでクローニング部位のいずれかの側に
は切断後に核酸分子に連結されたままであるオリゴヌクレオチド配列が隣接して
いる。

【００２９】オリゴヌクレオチド配列が制限酵素の認識部位を含むことが好ましく、ライブ
ラリのその部位が連結されている核酸分子を次に酵素で切断することにより、ラ
イブラリの各メンバーのいずれかの末端に独特の配列を含むオリゴヌクレオチド
プライマーの対が放出されることが特に好ましい。

【００３０】好ましくは、認識部位は、タイプＩＩＳ制限酵素の認識部位である。

【００３１】本明細書において用いる場合、"タイプＩＩＳ"との用語は、の認識配列から離
れた部位を切断する制限酵素を表す。そのような酵素は、その認識部位から０か
ら２０塩基対の距離で切断することが知られている。

【００３２】支持体が半固体であることが好ましい。

【００３３】好ましくは、半固体支持体は、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリアミド
（ナイロン）、および架橋アガロースおよび架橋デキストラン、および架橋ポリ
エチレングリコールを含む群より選択される。

【００３４】核酸分子の増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことが特に好ま
しい。

【００３５】好ましくは、核酸分子の支持体への付加は、酸化３−メチルウリジン、アクリ
リル基およびヘキサエチレングリコールを含む群より選択される共有結合リンカ
ーを用いて行う。

【００３６】核酸分子の支持体への付加を、プールのメンバーを、支持体に共有結合的に結
合した核酸分子にハイブリダイズさせることにより行うこともまた意図される。

【００３７】好ましくは、支持体に結合した核酸分子は合成オリゴヌクレオチドである。

【００３８】本明細書においてこの文脈で用いる場合、合成オリゴヌクレオチドとの用語は
、化学的に合成されたまたは生物系の生成物、例えばプライミングされたまたは
されない酵素的合成の生成物である、短い（１０から１，０００ヌクレオチドの
長さ）、２本鎖または１本鎖核酸分子を表す。

【００３９】第１のアレイから第２の支持体への核酸分子の移動が、第１のアレイを、増幅
により生成した核酸分子の少なくとも１つのサブセットが支持体に移されるよう
に、支持体と接触させることを含むことが好ましい。

【００４０】別の好ましい態様においては、移動は、第１のアレイを、増幅により生成した
核酸分子の少なくとも１つのサブセットが担体に移されるように、円筒形ローラ
ー、スタンピング装置、膜および支持体を含む群より選択される担体と接触させ
、そして次に担体を支持体と接触させることを含む。

【００４１】本発明はまた、複数の核酸アレイを含有し、ここで該複数は、支持体上にラン
ダムに固定化された核酸分子のプールを含む、ランダムにパターン化された固定
化された第１のテンプレート核酸アレイ、および、ランダムにパターン化された
、固定化された第２の核酸アレイを含み、ここで、第２のアレイの核酸分子はプ
ールの核酸増幅生成物であり、第２のアレイの核酸分子は、第２のアレイ上で、
第１のアレイ上のそれらが増幅された元の核酸分子の位置に対応する位置を占め
る。

【００４２】本発明の別の観点は、固定化された核酸アレイを提供することを含む、染色体
の遺伝的要素の連続順序を決定する方法である。該方法は、固定化された染色体
を提供し、染色体の核酸配列を増幅し、増幅された配列を、増幅により生成した
核酸分子のサブセットが支持体上に保持されるように半固体支持体と接触させ、
そしてそのように保持された分子を支持体に共有結合的に付けて、第１の固定化
された核酸アレイを生成し、ここで、アレイのメンバーの位置は、染色体上のそ
れらが増幅された元のＤＮＡ配列の位置に対応しており、そして染色体上の遺伝
的要素の順序を決定し、ここで、順序の決定は、アレイの特徴を同定することを
含み、ここで、アレイ上での第２の特徴に対する第１の特徴の位置は、染色体上
での第２の遺伝的要素に対する第１の遺伝的要素の位置に対応する、の各工程を
含む。

【００４３】増幅はＰＣＲにより行うことが好ましい。

【００４４】好ましくは、同定は、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、定
量的増加蛍光ヌクレオチド付加配列決定（ＱＩＦＮＡＳ）または段階的ライゲー
ションおよび切断を用いて行う。

【００４５】好ましい態様においては、該方法は、染色体の増幅された配列を支持体と接触
させた後に、第１のアレイの分子をＰＣＲにより増幅し、そして第１のアレイを
、増幅された核酸分子の少なくとも１つのサブセットが支持体に移されるように
、第２の支持体と接触させ、そして核酸分子を第２の支持体に共有結合的に付け
て第２の固定化された核酸アレイを生成し、ここで第２のアレイのメンバーの位
置は第１のアレイにおけるそれらの位置に対応する、の工程をさらに含む。

【００４６】本発明の別の観点は、固定化された核酸アレイを提供することを含む、細胞ま
たは組織切片中におけるＲＮＡ分子の位置を決定する方法である。該方法は、固
定化された細胞または組織切片を提供し、細胞または組織切片のＲＮＡ分子を逆
転写して、逆転写産物を含む特徴のアレイを生成し、逆転写産物の少なくとも１
つのサブセットが支持体により保持されるようにアレイを支持体と接触させ、逆
転写産物を支持体に共有結合的に付けて、固定化された核酸アレイを生成し、そ
してＲＮＡ分子の位置を決定し、これはアレイの特徴を同定することを含み、こ
こで、アレイ上の特徴の位置は、細胞または組織切片中のＲＮＡ分子の位置に対
応する、の各工程を含む。

【００４７】該方法は、さらに逆転写産物を増幅する工程を含むことが好ましい。

【００４８】また、増幅はＰＣＲにより行うことが好ましい。

【００４９】好ましくは、同定は、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、定
量的増加蛍光ヌクレオチド付加配列決定（ＱＩＦＮＡＳ）、または段階的ライゲ
ーションおよび切断を用いて行う。

【００５０】好ましい態様においては、該方法は、逆転写産物を支持体と接触させた後に、
第１のアレイの分子をＰＣＲにより増幅し、増幅された核酸分子の少なくとも１
つのサブセットが支持体に移されるように、第１のアレイを第２の支持体と接触
させ、そして、核酸分子を第２の支持体に共有結合的に付けて第２の固定化され
た核酸アレイを生成し、ここで第２のアレイのメンバーの位置は、第１のアレイ
上のそれらが増幅された元の分子の位置に対応する、の工程をさらに含む。

【００５１】本発明はまた、複数の固定化された核酸アレイを得る方法を含み、ここで、複
数のアレイは異なる核酸プールから得られたものである。該方法は、プールの核
酸分子の酵素による切断によりプールの各メンバーのいずれかの末端に独特の配
列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの対が放出されるように、それぞれ制限
酵素認識部位を含むオリゴヌクレオチド配列の両方の末端に連結されている核酸
分子の第１のプールを含む第１の固定化された核酸アレイを提供し、アレイの核
酸分子をＰＣＲにより増幅し、第１の固定化された核酸アレイを、増幅により生
成した核酸分子の少なくとも１つのサブセットが支持体に移されるように、支持
体と接触させ、核酸分子を支持体に共有結合的に付けて第１の固定化された核酸
アレイのレプリカを生成し、ここでレプリカ上の核酸分子の位置は、それらが増
幅された元の第１のアレイの核酸分子の位置に対応し、レプリカの核酸分子を制
限酵素で切断し、このことにより、第１の核酸アレイの各特徴のいずれかの末端
に独特の配列を含む、固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーのアレイを生
成し、切断によりオリゴヌクレオチドプライマーから放出された核酸フラグメン
トをオリゴヌクレオチドプライマーから洗浄し、プライマーを、オリゴヌクレオ
チドプライマーと第２の核酸プールの核酸分子との間にハイブリダイゼーション
が生ずるように、相補的な核酸分子のハイブリダイゼーションを可能とする条件
下で核酸分子の第２のプールと接触させ、プライマーにそのようにハイブリダイ
ズした第２のプールの核酸分子を増幅し、ここでそれらがハイブリダイズした固
定化されたオリゴヌクレオチドプライマーは該増幅をプライミングするよう働き
、このことにより第２のプールの核酸分子の固定化されたアレイを生成する、の
各工程を含む。

【００５２】好ましくは、増幅はＰＣＲにより行う。

【００５３】第１の固定化された核酸アレイを、増幅により生成した核酸分子の少なくとも
１つのサブセットが支持体に移されるように支持体と接触させ、核酸分子を支持
体に共有結合的に付けて、第１の固定化された核酸アレイのレプリカを生成し、
ここで、レプリカ上の核酸分子の位置は、それらが増幅された元の第１のアレイ
の核酸分子の位置に対応し、レプリカの核酸分子を制限酵素で切断し、このこと
により第１の核酸アレイの各特徴のいずれかの末端にユニークは配列を含む固定
化されたオリゴヌクレオチドプライマーのアレイを生成し、切断によりオリゴヌ
クレオチドプライマーから放出された核酸フラグメントをオリゴヌクレオチドプ
ライマーから洗浄し、オリゴヌクレオチドプライマーと第２の核酸プールの核酸
分子との間にハイブリダイゼーションが生ずるように、相補的な核酸分子のハイ
ブリダイゼーションを可能とする条件下で、プライマーを核酸分子の第２のプー
ルと接触させ、プライマーにそのようにハイブリダイズした第２のプールの核酸
分子を増幅し、ここで、これらがハイブリダイズする固定化されたオリゴヌクレ
オチドプライマーは増幅をプライミングするように働き、このことにより第２の
プールの核酸分子の固定化されたアレイを生成する、の工程のサイクルを繰り返すことが好ましい。

【００５４】好ましくは、該方法は、第１の固定化された核酸アレイを増幅により生成した
核酸分子の少なくとも１つのサブセットが支持体に移されるように支持体と接触
させる工程と、核酸分子を支持体に共有結合的に付けて第１の固定化された核酸
アレイのレプリカを生成し、ここで、レプリカ上の核酸分子の位置は、それらが
増幅された元の第１のアレイの核酸分子の位置に対応する、の工程との間に、レ
プリカの核酸分子をインサイチオで増幅し、そしてレプリカを、増幅により生成
した核酸分子の少なくとも１つのサブセットが第２の支持体に移されるように第
２の支持体と接触させ、核酸分子の末端をブランクに共有結合的に付けて第１の
固定化された核酸アレイの第２のレプリカを生成し、ここで第２のレプリカ上の
核酸分子の位置は、それらが増幅された元のレプリカの核酸分子の位置に対応す
る、の工程をさらに含む。

【００５５】異なる核酸プールが個々の生物の異なる組織から得られたものであることが好
ましい。

【００５６】異なる核酸プールが単一種の異なる個々の生物から得られたものであることが
非常に好ましい。

【００５７】異なる核酸プールが異なる種の生物から得られたものであることもまた非常に
好ましい。

【００５８】好ましくは、核酸分子の第１のプールおよび第２のプールはライブラリである
。発明の詳細な説明本発明は核酸配置チップ、そのようなチップの再生を可能にする方法、並びに
核酸の複製もしくは増幅、ゲノムの特徴付け、遺伝子発現の研究、医療診断及び
集団遺伝学に関連する多様な用途においてそれらを用いることを可能にする方法
を指向する。複製配置を有する核酸配置チップには現在利用可能な方法を上回る
幾つかの利点がある。

【００５９】既知の配列又はそれらの組み合わせ配列に加えて、未知のＤＮＡ配列を含む全
ゲノムを本発明に従って複製することができる。複製される核酸断片又はプライ
マーのサイズは約２５量体ないし９０００量体であり得る。また、本発明は迅速
で費用的に有効でもある。ある生物の発見からその生物の全ゲノム配列をチップ
上に配置するのに、チップ当たり約＄１０で約１週間かかるだけである。加えて
、チップの厚みは３０００ｎｍであり、これによってより高い感受性がもたらさ
れる。このチップは安価なイン・サイツＰＣＲ装置に適合し、１００回も再利用
することができる。

【００６０】本発明は Chetverin 及び Kramer（WO 93／17126）、Chetverin 及び Chetver
ina、1997（米国特許第 5,616,478号）、並びに他のものの配置を越えた進歩をもたらすもので、支持体に共有結合し（したがって、広く再利用可能である）、
かつプロセスの出発点に戻ることなくそのものの忠実度の高いコピーを作製する
ことを可能にし、それにより時間を浪費する高価な工程を排除し、かつ配置のコ
ピーを作製したとき及びそれらを用いたときに再現性のある結果をもたらす無作
為核酸配置を生成する方法がここに記述される。その高い有用性にもかかわらず
、この方法が明白ではないことは明らかである。オリゴヌクレオチド配置の特許
又は論文にはこの脈絡での複製の植え付け又は印刷への言及はなされていないも
のと思われる。従来技術には、核酸分子のプールを支持体に共有結合させて無作
為配置を形成する工程、その核酸分子を増幅させる工程、及び続いてその配置を
複製する工程を包含する、一組の核酸配置を生成するための方法はない。

【００６１】核酸分子を支持体上に直接化学合成する配置の作製においては製造の再現性及
び耐久性は重要な関心事ではないが、その配置の分子が天然のものを起源とする
（例えば、生物に由来するｍＲＮＡの試料）場合にはそれらが重要性の中核をな
す。天然資源から得られる核酸試料の各々は独自の分子プールを構成する；これ
らの分子は、それら自体、支持体の表面全体に独自に分布し、このパターンの外
部に存在するオリジナルは無作為である。従来技術の方法のいずれによっても、
核酸分子のプールの単純な無作為堆積から生成される配置は再現不可能である；
しかしながら、一組の関連する配置は、その複製された組からのいずれのコピー
から誘導される情報もその組の他のメンバーを用いて生成したデータの同一性及
び／又は品質の信頼性を高めるため、有用性が高い。本発明において提供される
方法は、基本的には、５つの工程からなる：１）核酸分子のプールを提供する工
程、２）そのプールを固体支持体上に植え付け、又は他の方法で転移する工程、
３）イン・サイツ増幅の工程、４）増幅した核酸を複製印刷する工程、及び５）
特徴を同定する工程。このようにして生成された配置の組、又はそれらのメンバ
ーは、次に、あらゆるチップ親和性の読み取り用途に用いることができ、そのう
ちの幾つかが以下にまとめられている。本発明による一組の配置の作製が実施例
１に記載されている。以下の例は例示のためだけに示されるものであり、上述の
広義の用語で記述されている本発明の範囲を限定しようとするものではない。実施例１本発明による複数の核酸配置の作製工程１本発明による配置を構築するための核酸プールの生成ｎ量体（ｎ＝２０ないし９０００）のプール又はライブラリーは幾つかの方法
のいずれによっても作製される。そのプールを増幅する（例えば、ＰＣＲにより
）か、又は未増幅のままにする。適切なイン・ビトロ増幅”ベクター”、例えば
、フランキングＰＣＲプライマー、又は使用前に増幅された分子が切り出される
イン・ビボ・プラスミド、ファージもしくはウイルスベクターが用いられる。必
要であれば、巨大核酸分子の無作為剪断又は酵素開裂を用いてプールを生成する
。それらの核酸分子を増幅する場合には、開裂は増幅の前又は後のいずれかに行
う。あるいは、核酸試料を、例えばタグ付き３’末端６量体で、無作為に初回刺
激し、次いで電気泳動でサイズ選択する。核酸はゲノム、合成又はｃＤＮＡ配列
から選択する（Power, 1996, J. Hosp. Infect., 34: 247-265；Welshら, 1995,
Mutation Res., 338: 215-229）。上記の手順のいずれかから得られた、コピー
された、又は未増幅の核酸断片を、所望であれば、電気泳動、沈降、及びクロマ
トグラフィーを含む様々な方法（手の込んだ高価な手順又は有限の資源を含むこ
とが、引き続く安価な複製方法がそのような労力の投入を正当化し得るために起
こり得る）によってサイズ又は親和性により分画する。

【００６２】核酸分子のプールを、この段階で、支持媒体に直接塗布する（下記工程２を参
照）。あるいは、それらを核酸ベクターにクローン化する。例えば、固有の極性
を有する断片、例えば、ｃＤＮＡ分子を含んでなるプールを、それらの断片に非
対称フランキング配列をもたらすオリゴヌクレオチド・リンカーをクローン化部
位に含む核酸ベクターに定方向クローン化（directionally cloned）する。クロ
ーン化された断片及びリンカー配列の両者の外側でそのベクターを開裂する酵素
での制限によるそれらの引き続く除去により、両端に規定された（及び異なる）
配列を有する分子が生成する。これらの分子を変性させ、好ましいフランキング
・リンカーの１つに相補的であるオリゴヌクレオチドが共有結合する半固体支持
体上にそれらを広げることにより、その配置における各々の分子の方向が支持体
表面に対して決定される。このような極性配置はその配置のイン・ビトロ転写／
翻訳、又は方向が均一であることが好ましいあらゆる目的に有用なものである。工程２核酸プールの支持媒体上への転移核酸プールを、ガラス・スライドのような固体表面上の半固体媒体（例えば、
ポリアクリルアミドゲル）上に、増幅可能な分子が０．１ないし１００マイクロ
メートル離れるように希釈して全面に広げる（”塗布する”）。反復される増幅
及び複製の間に配置の特徴が互いに混入せずにいるのに十分な間隔を維持する。
一端が固定されている分子が各々の複製の間に拡散可能な距離はせいぜい分子１
つ分であるものと推定される。明らかに、短い分子の配置は長い分子を含むもの
よりも高密度に塗布される。

【００６３】本発明に従って有用である固定化媒体は、核酸分子の堆積、増幅及び引き続く
配置の複製に必要とされる条件下で物理的に安定で、かつ化学的に不活性である
。有用な支持マトリックスはＰＣＲに必要な温度の急激な変化及びその極端さに
耐え、複製印刷プロセスの間の応力の下で構造の完全性を保持する。この支持材
料は酵素的な核酸合成を許容する；所定の物質がそのように振る舞うかどうかが
わからない場合は、本発明に従って一組の配置を生成しようと試みる前にそれを
経験的に試験する。この支持構造体は半固体（すなわち、ゼラチン状）格子又は
マトリックスを含み、ここで格子又はマトリックスの要素間の間隔又は細孔は水
性又は他の液状媒体が充填されている；典型的な細孔（又は”シーブ”）サイズ
は１００μｍないし５ｎｍの範囲にある。マトリックスの要素間のより大きな間
隔は許容限界内であるが、固定化前の増幅産生物が拡散する可能性が増加する。
半固体支持体は圧縮性であり、そのため、それが目的ではないものの、２つの支
持体を封着するのに本質的に十分である完全な表面と表面との接触を複製印刷の
間達成することができる。支持体は印刷のために平坦であるように、又は有効に
平坦であるように調製する；例えば、有効に平坦な支持体は、平坦又は円筒状の
いずれかである他の支持体と一方を他方の上に転がすことによって接触させるた
めに、配置の核酸がその外面全体に分布するように円筒状であってもよい。最後
に、本発明に従って有用である支持材料は、配置の核酸という特徴物が以下に列
挙される手段によってそれに固定化（共有結合）されることを許容する。これら
の要件を満足する物質には有機及び無機物質の両者が含まれ、限定するものでは
ないが、ポリアクリルアミド、セルロース及びポリアミド（ナイロン）に加えて
、架橋アガロース、デキストラン又はポリエチレングリコールが含まれる。

【００６４】核酸分子のプールのメンバーを固着することができる支持媒体のうち、特に好
ましいものはガラス支持体、例えば、プレート、スライド又はチップ上の薄いポ
リアクリルアミドゲルである。このタイプのポリアクリルアミド・シートは以下
のように合成する：アクリルアミド及びビス−アクリルアミドを、そのゲルにお
いて用いられる混合物の全体的なパーセンテージがそのポリアクリルアミド・シ
ートに必要とされる張力特性をもたらすように調整されるときに所望の細孔サイ
ズを生じる、個々のポリマー鎖間の架橋の程度が得られるように設計された比（
例えば、３８：２の比が配列決定ゲルに典型的である）で混合する。ポリアクリ
ルアミドゲルの流延法は当該技術分野において公知であり（Sambrookら, 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition , Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, NY を参照）、当業者にはそのような調
整を行う上での困難はない。

【００６５】このゲル・シートを２つの硬い表面の間に流延するが、そのうちの少なくとも
１つはガラスであり、他方を取り除いた後もゲル・シートはそのガラスに付着し
たままになる。重合の完了後に取り除かれる流延表面を、ゲルの重合を妨げない
潤滑剤で被覆する；この目的では通常シランが用いられる。シランの層をヒュー
ム・フードの下で表面上に広げ、ほぼ乾燥するまで静置する。その後、過剰のシ
ランをエタノールで（拭うことで、又は、対象が小さい場合には徹底的にすすい
で）除去する。ゲルシートと接したままとなるガラス表面は、流延に先立ち、し
ばしば’架橋シラン’と呼ばれるγ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシ
ラン（カタログ番号Ｍ６５４１、Sigma；セントルイス、ＭＯ）で処理する。ゲルと接することになるこのガラス表面をこの薬剤で３回被覆する。１２００ｃｍ ² に等しい面積を処理する度にエタノール２５ｍｌ中の架橋シラン１２５μｌが必要となる。この溶液をガラス表面に広げる直前に、７５０μｌの水及び７５μ
ｌの氷酢酸の混合液と合わせて激しく振盪する。コーティングの合間にエタノー
ル溶媒を蒸発させ（ヒューム・フードの下で約５分）、最後の被膜が乾燥した後
、他の支持プレートによるゲルの’挟み込み’を防止するため、過剰の架橋シラ
ンを徹底的なエタノール洗浄によって完全に除去する。その後、これらのプレー
トを組み立てて望み通りにゲルを流延する。

【００６６】本発明に従って有用であるゲルのサイズを決定する唯一の作業上の制約は、そ
のようなゲルを流延する当業者の肉体的能力である。長さ１メートルまでゲルを
流延することは、厄介ではあるが、核酸の配列決定技術の熟練研究者に公知の手
順である。製造されるのであれば、より大きなゲルも本発明に従って有用なもの
である。極端に小さいゲルは重合が完了した後により大きな全体から切り出す。

【００６７】そのマトリックス内に酵素のような生理活性物質を取り込んだポリアクリルア
ミドゲルを流延する少なくとも１つの手順が当該技術分野において公知であるこ
とに注意されたい（O’Driscoll, 1976, Methods Enzymol., 44: 169-183）；光
架橋性ポリエチレングリコール樹脂を用いる、生活細胞のゲル・マトリックス内
への取り込みを可能にする同様のプロトコルも文書化されている（Nojima 及び
Yamada, 1987, Methods Enzymol., 136: 380-394）。このような方法は本発明に
従って有用なものである。以下に述べられるように、無傷の染色体ＤＮＡをパル
スフィールド電気泳動に適するマトリックス内に搬送する目的で、又は Benton
及び Davis の方法に従ってプラークを引き上げる前にバクテリオファージの成長を支持する宿主細胞の”芝生”としての役割が果たされるように、全細胞を典
型的にはアガロース中に流延する（Maniatis ら, 1982, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habo
r, NYを参照）。簡潔に述べると、電気泳動グレードのアガロース（例えば、Ult
rapure；Life Technologies/Gibco-BRL；を生理学的（等張）バッファに溶解し、管、瓶又はフラスコ内で５０゜ないし５２℃の温度で平衡にする。次に、細胞
をアガロースに添加し、完全に、しかしながら急速に（瓶又は管の場合にはキャ
ップをして反転させることにより、フラスコの場合には回旋により）混合した後
、その混合物をゲル・トレイにデカントし、又はピペットで移す。低融点アガロ
ースが用いられる場合には、細胞を添加する前により低い温度にすることができ
る（アガロースの濃度に応じてほぼ室温まで低下させる）。これは幾つかの細胞
型にとって望ましい；しかしながら、電気泳動が得られた核酸プールの分子を支
持体に共有結合させる前の細胞溶解に続くものである場合には、冷蔵下、例えば
、４゜ないし１０℃の’コールド’ルーム内で行う。

【００６８】本発明による支持マトリックスへの核酸分子の固定化は幾つかの手順のうちの
いずれかで達成する。支持体への共有結合に適する化学基を有する３’末端タグ
の使用によるもののような直接固定化、既に支持体に結合しているオリゴヌクレ
オチド・プライマーへの核酸分子プールの一本鎖分子のハイブリダイゼーション
、又は支持体と共有結合することが可能なプライマーを塗布の前もしくは後のい
ずれかに導入することを伴う支持体上への核酸分子の延展を行うことができる。
予め固定化されているプライマーを用いる場合、それらは、特別な配列モチーフ
に変種を含む特定の配列又は核酸と相同である広スペクトルの配列モチーフ（例
えば、所定の鎖長を有する全ての可能性のある多量体、例えば、６量体）、核酸
を捕獲するように設計される。あるいは、これらのプライマーは、核酸分子のプ
ールの全てのメンバーに共通の合成分子特徴物、例えば、リンカー配列を含む（
上記参照）。

【００６９】本発明に従って有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸テンプレートと
ハイブリダイズして第２の核酸鎖の酵素合成を初回刺激することが可能である一
本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。このプライマーは、本発明の配置の組の調製
において用いられる核酸分子のプール中に存在する標的分子の一部に相補的であ
る。

【００７０】このような分子は、化学的もしくは酵素的な合成法によって調製することが意
図されている。あるいは、そのような分子又はそれらの断片は天然のものであり
、そのものの天然資源から単離するか、又は業者から購入する。オリゴヌクレオ
チド・プライマーの長さは、異なる長さを有するオリゴヌクレオチドは有用では
あるが、６ないし１００ヌクレオチドで１，０００ヌクレオチドまででさえもあ
るが、理想的には１０ないし３０ヌクレオチドである。

【００７１】典型的には、２つの核酸配列が実質的に相補的である（少なくとも１４ないし
２５ヌクレオチドの広がりにわたって少なくとも約６５％相補的、好ましくは少
なくとも約７５％相補的、より好ましくは少なくとも約９０％相補的である）と
きに選択的ハイブリダイゼーションが生じる。Kanehisa, M., 1984, Nucleic Ac
ids Res. 12: 203 を参照。この文献は参照することによりここに組み込まれる。結果として、初回刺激部位でのある程度の不一致は許容されるものと期待され
る。そのような不一致は小さいもの、例えば、１、２もしくは３ヌクレオチドで
あり得る。あるいは、途切れることのない４つ以上のヌクレオチドの連続を不一
致が含む領域と我々が定義する、ループを含んでいてもよい。

【００７２】全体として、５つの要素が、第２の核酸分子へのプライマーのハイブリダイゼ
ーションの効率及び選択性に影響を及ぼす。（ｉ）プライマーの長さ、（ii）ヌ
クレオチド配列及び／又は組成、（iii）ハイブリダイゼーション温度、（iv）バッファの化学及び（ｖ）プライマーがハイブリダイズすることが必要な領域に
おける立体障害の可能性であるこれらの要素は、非無作為初回刺激配列が設計さ
れる場合には重要な考慮対象である。

【００７３】プライマーの長さとプライマーが標的配列とアニールする際の効率及び精度と
には正の相関がある；より長い配列はより短いものよりも高いＴ_Mを有し、かつ所定の標的内列内で反復されることが少ないものと思われ、それにより無差別の
ハイブリダイゼーションが減少する。Ｇ−Ｃ含量が高いプライマー配列又は回文
構造配列を含むものは、それらが目的とする標的部位と同様に、溶液中では一般
に二分子ではなく単分子のハイブリダイゼーション動態が優勢であることから、
自己ハイブリダイズする傾向にある；その反面、標的配列に緊密に結合するの十
分な数のＧ−Ｃヌクレオチド対を含むプライマーを設計することが重要であり、
これは、そのような対の各々がＡ及びＴ塩基が対を形成するときに見出される２
つの水素結合ではなく３つの水素結合によって結合するためである。ハイブリダ
イゼーション温度はプライマーのアニーリング効率とは逆に変化し、これはハイ
ブリダイゼーション混合物中に含まれ得る有機溶媒、例えば、ホルムアミドの濃
度と同様であり、塩濃度が増加すると結合が促進される。厳密なハイブリダイゼ
ーションの条件下ではより長いプローブはより短いものよりも効率的にハイブリ
ダイズするが、より短いもののハイブリダイズもより寛大な条件下では十分なも
のである。厳密なハイブリダイゼーション条件は、典型的には約１Ｍ未満、通常
は約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダ
イゼーション温度は０℃という低いものから、２２℃超、約３０℃超、及び（頻
繁には）約３７℃超の範囲をとる。より長い断片は特異的ハイブリダイゼーショ
ンにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とする。幾つかの要素がハイブ
リダイゼーションの厳密性に影響を及ぼすため、いずれか１つ単独の絶対的な測
定よりもパラメータの組み合わせがより重要である。

【００７４】プライマーは上記の４つの考慮対象を心に留めて設計する。多くの配列の相対
的な利点の見積もりが頭の中でなされているが、これらの幾つかのパラメータの
評価及びプライマー配列の最適化を支援するためにコンピュータ・プログラムが
設計されている。このようなプログラムの例は、ＤＮＡＳｔａｒ（商標）ソフト
ウェア・パッケージの”ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ”（DNAStar, Inc.；Madison
, WI）及びＯＬＩＧＯ４．０（National Biosciences, Inc.）である。ひとたび
設計したら、適切なオリゴヌクレオチドを適切な方法、例えば、Beaucage 及び
Carruthers （1981, Tetrahedron Lett., 22: 1859-1862）によって記述されるホスホロアミダイト法もしくは Matteucci ら（1981, J. Am. Chem. Soc., 103:
3185）によるトリエステル法（これらの両者は参照することによりここに組み込まれる）により、又は市販の自動オリゴヌクレオチド・シンセサイザーもしく
はＶＬＳＩＰＳ（商標）技術を用いる他の化学的方法によって調製する。

【００７５】核酸分子を本発明の好ましい支持体、ポリアクリルアミドゲル・シートに架橋
する２つの手段を幾らか詳細に説明する。（Khrapko ら、1996、米国特許第 5,5
52,270 号によって提供される）第１のものは、核酸分子を３−メチルウリジンで３’キャッピングすることを包含する；この方法を用いて、この修飾塩基がそ
れらの３’末端に含まれるように本発明のライブラリーの核酸分子を調製する。
引用したプロトコルにおいては、厚みが３０μｍの８％ポリアクリルアミドゲル
（３０：１、アクリルアミド：ビスアクリルアミド）シートを流延し、次いで５
０％ヒドラジンに室温で１時間露出する；このようなゲルも本発明に従って有用
なものである。次に、このマトリックスを、以下に記載されるように、核酸分子
を含む溶液を吸収する程度まで風乾する。３’末端に３−メチルウリジンを含む
核酸分子を１ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ₄）を用いて室温で１０分ないし１時間酸化し、アセトン中２％のＬｉＣｌＯ₄ ８ないし１０容量で沈殿させ、１０ｐｍｏｌ／μｌの濃度で水に溶解する。この濃度を調整し、核酸分子を
支持体上にその表面を均一に覆う容積で広げ、さらに支持体によって効率的に（
すなわち、完全に）吸収されるとき、配置の核酸分子の密度が上に論じられる範
囲内に入る。核酸分子をゲルの表面全体に広げ、それらのプレートを加湿チャン
バ内に４時間入れる。その後、それらを室温で０．５時間乾燥させ、引き続きそ
れらを使用するのに適するバッファで洗浄する。あるいは、ゲルを水ですすぎ、
再度乾燥させて必要となるまで−２０℃で保存する。ゲルに結合する核酸の全体
的な収率は８０％であり、これらの分子のうち９８％がそれらの酸化された３’
基を介して特異的に連結するものといわれる。

【００７６】核酸分子をポリアクリルアミド・シートに結合させる上で有用である第２の架
橋部分は５’アクリリル基であり、これは実施例６において用いられるプライマ
ーに結合されている。このような修飾塩基をそれらの５’末端に有するオリゴヌ
クレオチド・プライマーを本発明に従って用いることができる。特には、そのよ
うなオリゴヌクレオチドは、そのアクリリル基が重合するマトリックスに欠くこ
とのできない共有結合部分となるようにゲルに直接流延する。このプライマーの
３’末端は未結合のままであり、プールの核酸と自由に相互作用してそれらにハ
イブリダイズし、その酵素的第２鎖合成を初回刺激する。

【００７７】その代わりに、核酸分子をナイロン又は他の支持マトリックスに共有結合させ
るのにヘキサエチレングリコールが用いられる（Adams 及び Kron、1994、米国特許第 5,641,658 号）。加えて、核酸分子は紫外線を照射することによってナイロンに架橋される。支持体を照射する時間の長さに加えて紫外線源からの最適
距離は波長及び透過力の変動のために用いられる各々の器機について較正される
が、核酸分子をハイブリダイゼーション膜に架橋させるために特別に設計された
照射装置が少なくとも１つ市販されている（Stratalinker；Stratagene）。照射
による架橋のプロセスにおいては、核酸分子の有限のニッキング（nicking）が生じることに注意するべきである；しかしながら、ニッキングの量はハイブリダ
イゼーション手順において用いられるもののような条件下では一般に無視できる
ものである。５’末端及び３’末端のいずれでもない位置での核酸分子の支持体
への結合も生じるが、そのように架橋した配置の利用可能性はほとんど損なわれ
ることがないことに注意するべきであり、これは、そのような架橋が固定化され
た分子へのオリゴヌクレオチド・プライマーのハイブリダイゼーションを、それ
が支持体に結合されている場所で阻害することがないためである。本発明の配置
の”末端”コピー、すなわち、さらなる複製のテンプレートとしての機能を果た
すことのないものの生成は架橋の方法によって影響を受けることはない；しかし
ながら、共有結合部位が好ましくは配置の分子の末端である状況においては、紫
外線照射以外の架橋方法が用いられる。工程３．アレイ核酸分子の増幅熱サイクルＰＣＲ（ＭｕｌｌｉｓａｎｄＦａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ，１５５：３３５−３５０）または等熱３ＲＳ（Ｇｉ
ｎｇｅｒａｓｅｔａｌ．，１９９０，ＡｎｎａｌｅｓｄｅＢｉｏｌｏｇ
ｉｅＣｌｉｎｉｑｕｅ，４８（７）：４９８−５０１；Ｇｕａｔｅｌｌｉｅ
ｔａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．
，８７：１８７４）のような標準分子技術により分子はその場所で増幅された（
Ｔｓｏｎｇａｌｉｓｅｔａｌ．，１９９４，（ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ４０：３８１−３８４；ＬｏｎｇａｎｄＫｏｍｍｉｎｏｔｈに
よる総説もまた参照されたい，１９９７，ＭｅｔｈｏｄＭｏｌ，Ｂｉｏｌ．，
７１：１４１−１６１）。本発明に従って使用される核酸増幅の別の方法は、い
くつかの細菌ＤＮＡリガーゼの活性により特異的な短い配列の指数関数的増加を
可能にすると記載されているＤＮＡリガーゼ増幅法である（ＷｕａｎｄＷａ
ｌｌａｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０）。この論文の内容は本
明細書において援用される。

【００７８】問題とする標的配列を増幅するために、熱安定性、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼにより触媒されるＤＮＡ複製の多サイクルを使用するポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）は本分野では良く知られており、下記の実施例に詳しく説明されて
いる。第二の増幅法、３ＳＲは高増幅レベルを達成するために必要な増幅サイク
ルの数を少なくするため、細菌ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの高プロモータ
ー配列特異性および反復特性を利用する転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）での増幅
である。（Ｋｗｏｈｅｔａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３；１１７３−１１７７）。３ＳＲ法は等熱、自己
持続性配列複製増幅反応を含んでおり、以下の様に実施される：各々の開始オリゴヌクレオチドはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ結合配列（ＴＡ
ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ［配列ＩＤ番号：１］）および好適な転写開始
部位を含んでいる。各々のプライマーの残りの配列は増幅されるべき分子上の標
的配列と相補的である。

【００７９】３ＳＲ増幅反応は、標的ＲＮＡ、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐｈ８．１、２０
ｍＭＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジンＨＣｌ、５ｍＭジチオスレイトール、８
０μｇ／ｍｌＢＳＡ、１ｍＭｄＡＴＰ、１ｍＭｄＧＴＰ、１ｍＭｄＴＴ
Ｐ、４ｍＭＡＴＰ、４ｍＭＣＴＰ、１ｍＭＧＴＰ、４ｍＭｄＴＴＰ、４
ｍＭＡＴＰ、４ｍＭＣＴＰ、４ｍＭＧＴＰ、４ｍＭＵＴＰおよび適量の
オリゴヌクレオチドプライマー（２５０ｎｇの５７−ｍｅｒ；この量はプライマ
ー配列の長さに依存して増量または減量される）を含んでいる１００μｌの反応
液で実施される。３から６アトモルの３ＳＲ反応の核酸標的が使用される。バッ
クグラウンドのための対照として、標的無しの３ＳＲ反応（Ｈ₂Ｏ）が行われる。反応混合物は１００℃で１分間加熱し、続いて急速に４２℃に冷却する。１分
後、１０単位（通常、約２μｌの容量）の逆転写酵素（例えば、鳥類の骨髄芽球
症ウイルス逆転写酵素、ＡＭＶ−ＲＴ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／
Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加する。反応液は１０分間４２℃でインキュベートし
、次に１分間１００℃に加熱する。（もし、３ＳＲ反応が一本鎖鋳型を使用して
実施されるなら、反応混合物は６５℃で１分間加熱される。）反応液は次に２分
間３７℃に冷却した後、１．６μｌのＡＭＶ−ＲＴ（１８．５単位／μｌ）、１
．０μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（１００単位／μｌ）（両方とも、例えば
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡから）および２．０μｌの大腸
菌ＲＮａｓｅ（４単位／μｌ）（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む４．６μｌの３ＳＲ
酵素混合物を加える。異なったロットまたは異なった製造元により供給された酵
素の比活性の変化を計算して酵素用量を調節することは当業者にはよく知られて
いる。反応液は３７℃で１時間インキュベートし、凍結により停止させる。試薬
の取り扱いはアレイの物理的サイズに依存して変化するが（平たい表面は、もし
大きいならば、チューブよりもむしろトレーまたは耐熱性ハイブリダイゼーショ
ンバッグでのような包み込みを必要とする）、この方法は本発明に従ったアレイ
分子の増幅に使用される。

【００８０】アレイ分子の増幅に使用される他の方法には、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡ
ＳＢＡ；Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５０：９１−９２、本明
細書において援用される）および鎖置換増幅（ＳＤＡ；Ｗａｌｋｅｒｅｔａ
ｌ．，１９９２，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０：１６９１−１
６９６、本明細書において援用される）が含まれるが、それらに制限されるわけ
ではない。工程４．アレイの複製ａ．工程１から３で発生させたマスタープレートは、同様のゲルチップ上へ多
くの方法によりレプリカプレートを作ることができる（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，１
９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２１（３）：３９５−９による総説がある）。こ
のレプリカは二つのゲルの圧縮性の表面を、各々のクローンのいくつかの分子が
マスターからレプリカへ移されるのに十分な圧力で表面と表面とを直接接触させ
ることにより実施される。そのような接触は１秒から２分程度の短いものである
。このことは同一のマスターから追加のレプリカにも行え、移動に利用できる増
幅後の分子数を、受容可能な忠実なコピーを達成するために移動されなければな
らない最小分子数で割った数によってのみ制限される。フィーチャー当たり一分
子だけの移動でも理論的には可能であるが、より伝統的な方法が採られる。移動
に利用可能な各々の分子種の数は、アレイが意図される応用の許容の制限内に以
下の型のエラーがある限り、フィーチャー損失の可能性についての興味を起こさ
せるほどの低い値、またフィーチャーにおける一構成物の複製の間の塩基置換が
、増幅の続いての回に、有意な（検出可能な）突然変異した分子集団を作ること
ができる点までは決して近づかない。アレイ分子の異なった複製効率は、溶液ま
たは非共有結合アレイにおける、ファージライブラリーのような通常のライブラ
リーの増幅の場合であるように、大きな関心事ではない。フィーチャー分子の分
散に対する物理的制限のため、効率よく増幅されているものは、効率の悪くコピ
ーされるものより”過増殖”できないが、アレイ上の後者の完全分子の密度は低
いであろう。フィーチャー当たり１０から１００分子でプリンティング過程の間
に忠実性を達成するのに十分であることが見積もられる。典型的には、少なくと
も１００から１０００の分子が移動される。

【００８１】もしくは、プレートされたＤＮＡは、ｉｎｓｉｔｕ増幅に適した二つのオリ
ゴヌクレオチド（一つまたは両方がその５’末端で固定化されている）の初期均
一（またはパターン化）被覆を持つ表面上へのマイクロコンタクトプリンティン
グまたはμＣＰ（Ｊａｃｋｍａｎｅｔａｌ，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
６９（５２２４）：６６４−６６６，１９９５）により費用をかけずに複製され
る。パターン要素は弾力のある支持体（その物理的特性が、本発明に従った有用
な支持体材料と比較して）から、その上を転がされた堅い曲線状の物体へ移され
る；もし望むなら、堅い円柱または他の物体から支持体上へのさらなる第二のパ
ターン要素の移動が実施される。一つまたは両方の表面は均一な接触を達成する
ことに応じている。例えば、オリゴマーの共有結合での固定化に、並びにインサ
イチュウハイブリダイゼーションのために３０ミクロンの薄いポリアクリルアミ
ドフィルムが使用される（Ｋｈｒａｐｋｏ，ｅｔａｌ，１９９１，ＤＮＡＳ
ｅｑｕｅｎｃｅ，１（６）：３７５−８８）。有効な接触プリンティングは、各
々のサブフィーチャーからの二本鎖または一本鎖ＤＮＡの非常に少ない分子の、
受容体支持体上の対応する点への移動で達成される。

【００８２】ｂ．レプリカは次に工程３のように増幅される。

【００８３】ｃ．もしくは、レプリカは工程４のような続いての工程のマスターとして働き
、フィーチャーの拡散および望まれるフィーチャー分解能で制限される。工程５．アレイのフィーチャー同定理想的には、フィーチャー同定は前記の方法により生成された組の第一のアレ
イで実施される；しかしながら、生成系列中のその位置に関係なく、組の任意の
アレイを用いて行われる。フィーチャーはシークエンシング−バイ−ハイブリダ
イゼーション（ＳＢＨ、シークエンシング−バイ−ハイブリダイゼーション−ツ
ウ−アン−オリゴヌクレオチド−マトリックスまたはＳＨＯＭとも呼ばれる；Ｄ
ｒｍａｎａｃｅｔａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０（５１１４）
：１６４９−５２；Ｋｈｒａｐｋｏ，ｅｔａｌ．１９９１，前記文献；Ｍｕｇ
ａｓｉｍａｎｇａｌａｍｅｔａｌ．，１９９７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ｓＲｅｓ．，２５：８００−８０５）で記載されている様にある長さのすべて
の配列（例えば、すべての４０９６ヘキサマー）を示している蛍光標識オリゴマ
ーへのハイブリダイゼーションにより配列決定される。工程５の配列決定は、も
しフィーチャー長が短いならば（例えば、ＳＢＨで使用されたｄｓ−３００−ｍ
ｅｒよりも大きなものよりもむしろｓｓ−２５−ｍｅｒ）、もしゲノム配列が既
知であるならば、またはもしフィーチャーの前もっての選択が使用されているな
らば、通常のＳＢＨよりもかなり容易である。

【００８４】ＳＢＨは重複ブロック読み取りの戦略を含んでいる。それは支持体上の特異的
位置に固定されたある種の長さの固定化オリゴヌクレオチドの完全な組とのＤＮ
Ａのハイブリダイゼーションに基づいている。ＳＢＨの効率は不完全である（即
ち、塩基対不適正を含んでいる）二重鎖から効果的に完全二重鎖を選り分ける能
力に依存している。このことは、完全オリゴヌクレオチド二重鎖の標準融解曲線
とＤＮＡおよび各々の固定化されたオリゴヌクレオチド間で形成された二重鎖の
温度依存性曲線を比較することにより達成される。

【００８５】ハイブリダイゼーションおよび融解曲線を得るためには、³²Ｐ標識ＤＮＡ断片
（３０，０００ｃｐｍ、３０ｆｍｏｌｅ）を含む１μｌのハイブリダイゼーショ
ン緩衝液（１ＭＮａＣｌ；１０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０；０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ）を固定化されたオリゴヌクレオチドの点を覆うように乾燥プレート上
へピペッティングする。ハイブリダイゼーションは０℃で３０分実施された。支
持体は０℃にて２０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液で、続いて同一の緩衝
液で１０回洗浄する（各々の洗浄は前の洗浄よりも５℃高い温度で１分間行う）
。残っている放射活性を各々の洗浄後に、計数積算器をさらに備えたミニモニタ
ー（例えば、ミニモニター１２５；Ｖｉｃｔｏｒｅｅｎ）により、鉛スクリーン
の５ｍｍのすき間を通して測定する。残存放射活性（加えたものの％）を洗浄温
度に対して対数スケールでプロットする。

【００８６】蛍光標識プローブとのハイブリダイゼーションでは、アレイを被覆するのに十
分な容量のハイブリダイゼーション溶液が使用され、それは２ｆｍｏｌｅ／０．
０１μｌの濃度でプローブ断片を含んでいる。ハイブリダイゼーション反応液は
１７℃で５．０時間インキュベートし、０℃でハイブリダイゼーション緩衝液に
て洗浄する。ハイブリダイズした信号が観察され、カメラを備えた蛍光顕微鏡で
写真に撮る（例えば、Ｌｅｉｔｚ”Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ”、入力フィルター５
１０−５６０、出力フィルター５８０ｎｍ）。ＡＳＡ２５０フィルムを用い、約
３分間露光する。

【００８７】ＳＢＨのための一つの適した固定化支持体はガラスに共有結合で結合された３
０μｍ厚のポリアクリルアミドゲルである。この方法でプローブとして使用され
るべきオリゴヌクレオチドは科学的に合成される（例えば、固相ホスホラミダイ
ト法、水酸化アンモニウム中、５５℃１２時間で脱保護され、変性条件下のＰＡ
ＧＥにより精製される）。使用に先立ち、プライマーはＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて［γ−³²Ｐ］ＡＴＰで５’末端（約１０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌの
比活性まで）、または蛍光標識、例えば、末端トランスフェラーゼ（Ａｌｅｋｓ
ａｎｄｒｏｖａｅｔａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｋ．Ｂｉｏｌｏｇｉａ［
Ｍｏｓｃｏｗ］，２４：１１００−１１０８）による塩基を経てｄＵＴＰに結合
され、さらにＰＡＧＥで精製されたテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）で３’末
端が修飾される。

【００８８】配列決定の別の方法には、配列が決定されるべき標的ポリヌクレオチドへ標識
プローブを段階的に結合および切断することを連続的に行う方法がある（Ｂｒｅ
ｎｎｅｒ，米国特許第５，５９９，６７５号）。この方法に従うと、配列決定さ
れるべき核酸は”付着末端”、別の言葉では、一本鎖末端オーバーハング（オー
バーハングは調製する分子間で一様であり、典型的には４から６塩基の既知の長
さである）を持つ二本鎖ＤＮＡ分子として調製される。これらの分子は次に、一
本鎖領域、典型的には末端塩基中に存在する特定の塩基の同一性を決定するため
に探査される。この方法で使用されるプローブは（ｉ）ヌクレアーゼのための認
識部位を含み、および（ｉｉ）典型的には標的ポリヌクレオチドの相補的突き出
し鎖と二重鎖を形成できる突き出し鎖を持つ二本鎖ポリヌクレオチドである。各
々の配列決定サイクルにおいて、その突き出し鎖が標的ポリヌクレオチドの突き
出し鎖と完全に一致した二重鎖を形成するプローブがハイブリダイズし、標的ポ
リヌクレオチドの末端に結合される。プローブ分子は４つの集団に分割され（こ
こで各々のそのような集団は決定されるべき位置に４つの可能なヌクレオチドの
１つを含んでいる）、各々が異なった蛍光色素で標識される。二重鎖形成領域の
残りの位置は、どのマルチマーでもその領域の長さが示されるように無作為化さ
れた非標識塩基で占められる；従って、各々のプール中のプローブ分子のあるパ
ーセントは標的ポリヌクレオチドの一本鎖領域と相補的である；しかしながら、
１つのプールのみがハイブリダイズするであろう標識プローブ分子を持っている
。

【００８９】非結合プローブを除去した後、プローブを認識するヌクレアーゼが標的ポリヌ
クレオチドに沿って結合部位から一つまたはそれ以上のヌクレオチド部位で結合
複合体を切断し、結合および切断の次のサイクルに関与できる末端（通常は突き
出し末端）を残す。ヌクレアーゼの重要な特性は、その認識部位がその切断部位
から離れていることである。結合および切断のそのようなサイクルの過程におい
て、標的ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドが同定される。前記のように、そ
のような種類の酵素は、認識部位から２０塩基対以上離れた切断部位を持つタイ
プＩＩｓ制限酵素類である；認識部位から３０塩基対以上離れた所を切断するそ
のような酵素が存在するであろうことが考えられる。

【００９０】理想的には、その同一性が決定されるのは末端塩基であり（標識されているプ
ローブの二本鎖領域に最も近い塩基）、この塩基のみがタイプＩＩｓ酵素により
切断して除かれる）。切断されたプローブ分子は回収され（例えば、ビーズまた
は他の支持マトリックス上に固定化されている相補的配列へのハイブリダイゼー
ションにより）、それらの蛍光発光スペクトルが蛍光光度計または他の集光装置
により測定される。試験分子からのプローブ切断の前にも蛍光は測定できること
に注意されたい；しかしながら、蛍光の定量分析に先立った切断は第一の配列決
定された塩基の同一性の決定が進行している間に次回の配列決定を始めることを
可能にする。切断に先立った検出は、例えば、別々の磁気ビーズ、または本発明
の複製可能アレイのような他の型の固相支持体に結合されて、多数の配列で平行
して配列決定が実施されている場合に好適である（単一の標的ポリヌクレオチド
なたは多数の全体で異なった標的ポリヌクレオチドセグメントの両方で）。天然
のタンパク質エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼとして使用される場合はいつも
、標的ポリヌクレオチドに偶然に位置している内部認識部位での偽の切断を防止
するために、本方法はさらに配列決定操作の開始時に標的ポリヌクレオチドをメ
チル化する工程が含まれることに注意されたい。

【００９１】この方法により、近接したサイズのＤＮＡ断片の電気泳動的分離（自動化する
のが困難なゲルに基づいた分離）、標的ポリヌクレオチドのぴったり重なる欠失
の必要性がなくなった。加えて、信号雑音比がより好ましいヌクレオチド−ヌク
レオチドに基づいているので検出および分析がより単純化され、より小さい試料
サイズを用いることを可能にしている。蛍光に基づいた検出スキームについては
、蛍光標識された異なったヌクレオチドは、空間的に重複したバンドよりむしろ
均一な溶液で別々に検出されるので分析をさらに簡略化している。

【００９２】暗に言及されたように、標的ポリヌクレオチドは磁気粒子、ポリマー性マイク
ロスフェアー、フィルター材料などのような固相支持体に繋がれているので、複
雑で時間がかかる精製工程なしで試薬の連続的応用を可能にしている。標的ポリ
ヌクレオチドの長さは広範囲に変化できる；しかしながら、調製の都合のために
は、通常の配列決定で使用されている長さが好適である。例えば、数百塩基対（
２００−３００）から１から２キロ塩基対の範囲の長さが最もしばしば使用され
る。

【００９３】本方法で使用されるプローブは、放射性残基、蛍光性残基、発色性残基などの
直接または間接結合を含む種々の方法により標識できる。ＤＮＡを標識するため
のおよびＤＮＡプローブを構築するための方法論に関する、多くの包括的な総説
がプローブの構築に応用可能な手引きを提供している（Ｍａｔｔｈｅｗｓｅｔ
ａｌ．，１９８８，ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１６９：１−２５；Ｈａｕｇ
ｌａｎｄ，１９９２，ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒ
ｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；ＫｅｌｌｅｒａｎｄＭ
ａｎａｋ，１９９３，ＤＮＡＰｒｏｂｅｓ，２ｎｄＥｄ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，１９９ｌ，Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ：ＡＰｒａｃｔ
ｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＭＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）；
Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２６：２２
７−２５９を参照されたい）。さらにより特別の標識方法論が本分野では知られ
ている（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，１９８７，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ￣Ｒｅｓ．，
１５：３１３１−３１３９，Ｇｉｂｓｏｎｅｔａｌ．１９８７，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１５：５４５５−６４６７；Ｓｐｏａｌｅｔ
ａｌ．，１９８７，ＮｎｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１５：４８３７−
４８４８；Ｆｕｎｇｅｔａｌ．，米国特許第４，７５７，１４１号；Ｈｏｂ
ｂｓ，ｅｔａｌ．，米国特許第５，１５１，５０７号；Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎ
ｋ，米国特許第５，０９１，５１９；［レポーター基付属物のための機能化オリ
ゴヌクレオチドの合成］；Ｊａｂｌｏｎｓｋｉｅｔａｌ．，１９８６，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１４６１１５−６１２８［酵素／オリゴ
ヌクレオチドコンジュゲート］；およびＵｒｄｅａｅｔａｌ．，米国特許第
５，１２４，２４６［分岐ＤＮＡ］を参照されたい）。標識残基結合部位の選択
は、そのような標識が結合および切断工程を妨害しない限り、標的ポリヌクレオ
チド中のヌクレオチドを同定するために与えられる標識プローブの能力には有意
には影響しない。特に、色素はプローブを作り上げている鎖の３’および５’末
端の両方で、標的ポリヌクレオチドから離れたプローブの末端に都合よく結合さ
れる、例えば、エクスタイン（前に引用）、フング（前に引用）など。いくつか
の場合、塩基内部またはヌクレオシド間結合へ標識残基を結合させることが望ま
しい。

【００９４】前記のように、４つの組の混合プローブが、標的ポリヌクレオチドへの付加の
ために提供される（各々は識別可能標識で標識されている）。典型的には、プロ
ーブはＭｅｎｃｈｅｎｅｔａｌ，米国特許第５，１８８，９３４号；Ｂｅｇ
ｏｔｅｔａｌ．ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５号に開示されてい
るような一つまたはそれ以上の蛍光色素で標識されている。４つの分光学的に分
離可能な蛍光標識の各々は、例えば、ＡｍｉｎｏｌｉｎｋｅｒＩＩ（すべてＡ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃ
ａｌｉｆ．から入手可能）の方法により結合される；これらはＴＡＭＲＡ（テト
ラメチルローダミン）、ＦＡＭ（フルオレセイン）、ＲＯＸ（ローダミンＸ）お
よびＪＯＥ（２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロフルオレセイン）
を含んでおり、オリゴヌクレオチドへのそれらの結合はＦｕｎｇｅｔａｌ．
，米国特許第４，８５５，２２５に記載されている。

【００９５】典型的には、本発明で用いられるヌクレアーゼは（ｉ）その認識部位がその切
断部位から離れている、および（ｉｉ）切断が標的ポリヌクレオチド上の突き出
し鎖で起こる天然のタンパク質エンドヌクレアーゼである。用いられるであろう
クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼは以前に記載されている（Ｓｚｙｂａｌｓ
ｋｉｅｔａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１００：１３−２６；Ｒｏｂｅｒｔ
ｓｅｔａｌ．，１９９３，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１：
３１２５−３１３７；ＬｉｖａｋａｎｄＢｒｅｎｎｅｒ，米国特許第５，０
９３，２４５号）。クラスＩＩｓヌクレアーゼの例にはＡｌｗＸＩ、ＢｓｍＡＩ
、ＢｂｖＩ、ＢｓｍＦＩ、ＳｉｓＩ、ＨｇａＩ、ＢｓｃＡＩ、ＢｂｖＩＩ、Ｂｃ
ｅｆＩ、Ｂｃｅ８５Ｉ、ＢｃｃＩ、ＢｃｇＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｐＭＩ
、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＥａｒＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、
ＧｓｕＩ、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮ
Ｉ、ＴａｑＩＩ、Ｔｔｈ１１１ＩＩ、Ｂｃｏ５Ｉ、ＢｐｕＡＩ、ＦｉｎＩ、Ｂｓ
ｒＤＩおよびそれらのアイソシゾマーが含まれる。好適なヌクレアーゼはＦｏｋ
Ｉ、ＨｇａＩ、ＥａｒＩおよびＳｆａＮＩである。反応は特に指示しない限り、
一般には５０μＬの製造元（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）が推薦
している酵素のための緩衝液を使用して実施された。標準緩衝液はまたＳａｍｂ
ｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９、前記文献、にも記載されている。

【００９６】通常のリガーゼが使用される場合、プローブの５’末端はリン酸化されている
であろう。５’一リン酸は化学的にまたはキナーゼで酵素的に第二のオリゴヌク
レオチドへ結合できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９、前記文献
、を参照されたい）。化学的リン酸化はＨｏｒｎａｎｄＵｒｄｅａ，１９８
６，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎｎＬｅｔｔ．，２７：４７０５に記載されており
、開示されているプロトコールを実施するための試薬は市販品として入手可能で
ある（例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｎｅｓ；Ｐａｌｏ，Ａｌｔ
ｏ，Ｃａｌｉｆ．からの５１リン酸−ＯＮＴｍ）。

【００９７】化学的結合法は本分野ではよく知られている、例えば、Ｆｅｒｒｉｓｅｔ
ａｌ．，１９８９，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，８
：４０７−４１４；Ｓｈａｂａｒｏｖａｅｔａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９：４２４７−４２５１。典型的には、結合反
応は標準プロトコールでリガーゼを使用して酵素的に実施される。多くのリガー
ゼが知られており、本発明での使用に適している（Ｌｅｈｍａｎ，１９７４，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，１８６：７９０−７９７；Ｅｎｇｌｅｒｅｔａｌ．，１９８
２，”ＤＮＡリガーゼ”，Ｂｏｙｅｒ，ｅｄ，ＴｈｅＥｎｚｙｍｅ，Ｖｏ１５
Ｂｐｐ．３−３０，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。
好適なリガーゼとしてはＴ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌
ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、ＰｆｕリガーゼおよびＴｔｈリガーゼが挙げ
られる。それらの使用のためのプロトコールはよく知られている（例えば、Ｓａ
ｍｂＴｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９．前記文献；Ｂａｒａｎｙ，１９９１，
ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：５−１６；
Ｍａｒｓｈｅｔａｌ．，１９９２，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５：７３−７６
）。一般にリガーゼは、隣接する鎖の３’ヒドロキシルへの結合のために５’リ
ン酸基が存在することを必要とする。このことは５’リン酸を残すヌクレアーゼ
を選択することにより（例えば、ＦｏｋＩ）、標的ポリヌクレオチドの少なくと
も一つの鎖へ都合よく提供される。

【００９８】ヌクレアーゼ切断工程に先立って（通常配列決定操作の開始時に）、標的ポリ
ヌクレオチドを処理して用いられているヌクレアーゼの認識部位および／または
切断部位が遮断される。このことは、標的ポリヌクレオチド中の内部位置に偶然
存在する認識部位のための、標的ポリヌクレオチドの望まれない切断を防止する
。遮断はメチル化および配列特異的アプタマー、ＤＮＡ結合タンパク質、または
三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドによる処理を含む種々の方法で達成できる
。天然のタンパク質エンドヌクレアーゼが用いられる場合はいつでも、認識部位
は標的ポリヌクレオチドを使用されているヌクレアーゼのいわゆる”同種の”メ
チラーゼでメチル化することにより都合よく遮断できる；ほとんどの（必ずしも
ではないが）タイプＩＩ細菌制限エンドヌクレアーゼは対応する認識部位をメチ
ル化する同種メチラーゼが存在する。多くのそのようなメチラーゼが本分野で知
られており（Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，１９９３，前記文献；Ｎｅｌｓｏ
ｎｅｔａｌ．，１９９３，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２１：
３１３９−３１５４）、種々の販売元、特にＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌ
ａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）から入手可能である。

【００９９】本方法は、非結合プローブが標的ポリヌクレオチドから洗浄された後の随意の
キャッピング工程を含んでいる。キャッピング工程において、ポリヌクレオチド
合成と同じく（例えば、Ａｎｄｍｓら、米国特許第４，８１６，５７１号）、プ
ローブと結合されなかった標的ポリヌクレオチドは、続いてのサイクルでのさら
なる結合工程では不活性なようにされる。この様式で、”その段階から外れた”
偽の信号が防止される。ヌクレアーゼが標的ポリヌクレオチド上に５’突き出し
鎖を残した場合、キャッピングは未反応標的ポリヌクレオチドを４つのジデオキ
シヌクレオシド三リン酸の混合物、または他の鎖終結ヌクレオシド三リン酸およ
びＤＮＡポリメラーゼに暴露することにより通常達成される。ＤＮＡポリメラー
ゼは未反応標的ポリヌクレオチドのＹ鎖を一つの鎖終結ヌクレオチド（例えば、
ジデオキシヌクレオチド）で伸長し、それにより続いてのサイクルでプローブと
結合できないようにする。

【０１００】もしくは、定量的増加蛍光ヌクレオチド付加配列決定（ＱＩＦＮＡＳ）を含む
単純な方法が用いられ、そこでは各々のクローンオリゴヌクレオチドの各々の末
端が核酸ポリメラーゼ（例えば、ＫｌｅｎｏｗまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ^TM；Ｕ
．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および１つのヌクレオチド（追跡可能なレベ
ルの対応する蛍光性ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを持っている、例えば、１００マイ
クロモルｄＣＴＰおよび１マイクロモルフルオレセイン−ｄＣＴＰ）による一度
でのプライマー伸長により配列決定される。これは連続的に、例えば、ｄＡＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ以下同様、蛍光の増加的変化が前の
サイクルからの蓄積的総量の有用な区別に十分であるパーセント以下になるまで
行われる。そのようにして決定された配列の長さは、アレイおよびすでに得られ
た配列を用いる合成の再開始からの発生期の核酸分子または発生期の核酸鎖の変
性で蓄積された蛍光標識の周期的光脱色または切断により伸長される。

【０１０１】組の第一のアレイでフィーチャーが同定された後、続いて生成される組のアレ
イがそれに整列される目標を提供することが望ましく、それにより問題とするフ
ィーチャーに作用物を位置させることを可能にする。本発明の方法により生成さ
れた組の第一のアレイは、本来、出発プールの核酸分子はそれらの配列の知識に
基づいて特異的または前もって規則正しいパターンで置かれていないということ
で無作為であるため、このことは重要である。

【０１０２】いくつかの型の目標付けが本分野で利用可能な技術に従って行われる。例えば
、選択されたフィーチャーはレーザー切除により除去されるか（Ｍａｔｓｕｄａ
ａｎｄＣｈｕｎｇ，１９９４，ＡＳＡＩＯＪｏｕｒｎａｌ，４０（３）：
Ｍ５９４−７；Ｊａｙ，１９８８，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵ
．Ｓ．Ａ．，８５：５４５４−５４５８；Ｋｉｍｂｌｅ，１９８１，ＤｅｖＢ
ｉｏｌ，８７（２）：２８６−３００）またはレーザー促進切除によりアレイの
コピー上に選択的に複製される（Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋｅｔａｌ，１９９
６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４（５２８９）：９９８−１００１）。これらの方法
は隣接するフィーチャーにより妨害される核酸フィーチャーを除去するため、ま
たは整列させるソフトウェアーのためよりも容易なパターンを作製するために使
用される。

【０１０３】レーザー切除は以下のように実施される：ＫｒＦ励起レーザー、例えば、Ｈａ
ｍａｍａｔｓｕＬ４５００（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）（パルス波長
、２４８ｎｍ；パルス幅、２０ｎｓ）が光源として使用された。レーザービーム
は、レーザー用ＵＶ石英集光レンズを通して収束され、パルス当たり３．０８Ｊ
／ｃｍ²の最大フルエンスが得られた。マトリックスおよび下のガラス表面の切除はこの方法により達成された。ガラス表面内へのエッチングの深さはリアルタ
イム走査型レーザー顕微鏡を用いて決定され（Ｌａｓｅｒｔｅｃ１ＬＭ２１Ｗ
，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）、深さのプロフィールが決定された。

【０１０４】レーザー捕捉微量剥離によるフィーチャーの選択的移動は以下のように進行し
た：平らなフィルム（１００μｍ厚）を平坦なシリコンまたはポリテトラフルオ
ロエチレン表面上に融解したサーモプラスティック材料、例えば、エチレンビニ
ル酢酸ポリマー（ＥＶＡ；ＡｄｈｅｓｉｖｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｈａ
ｍｐｔｏｎ，ＮＨ）を広げることにより作製した。光学的に透明な薄いフィルム
を本発明のアレイの頂上に置き、アレイ／フィルムサンドイッチは倒立顕微鏡（
例えば、ＯｌｙｍｐｕｓモデルＣＫ２；Ｔｏｋｙｏ）を用いて１００ｘの倍率で
（１０ｘ対物レンズ）観察された。パルス化された二酸化炭素レーザービームは
ＥＶＡフィルムの上部表面を照射するように、集光光学路と同軸の小さな表面鏡
を通して導入される。二酸化炭素レーザー（ＡｐｏｌｌｏＣｏｍｐａｎｙモデ
ル５８０，ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ，かまたはＣａｌｉｆｏｒｎｉａＬａｓｅ
ｒＣｏｍｐａｎｙモデルＬＳ１５０，ＳａｎＭａｒｃｏｓ，ＣＡ）は調節可
能な長さおよびパワーの個々のエネルギーパルスを提供する。ＺｎＳｅレンズは
レーザービームを調節可能なアレイ上のスポットサイズで標的に焦点を合わせる
。１５０μｍ直径のスポットの移動のためには、６００ミリ秒パルスで２５−３
０ｍＷがフィルムへ照射される。パワーはアレイ上に焦点を合わされたレーザー
スポットの直径に大体比例して増加または減少された。ＥＶＡフィルムの吸収係
数は（Ｆｏｕｒｉｅｒ透過により測定された）、１０．６μｍのレーザー波長で
２００ｃｍ^-1である。＞９０％のレーザー照射がサーモプラスティックフィルム
に吸収されるので、直接的加熱はほとんど起こらない。半固体支持体が載せられ
ているガラスプレートまたはチップは、アレイの領域を標的とするサーモプラス
ティック材料の全厚過渡的焦点融解を制限する熱溜めを提供する。焦点が融解し
たプラスチックは標的化組織を湿らせる。冷却および再結晶化後、フィルムは、
半固体支持体媒質への親和性を媒介される付着力よりも強く標的化核酸分子へ結
合された局所表面を形成する。フィルムおよび標的化核酸はアレイから除去され
、フィルム表面への標的化核酸の焦点微量移動が生じる。

【０１０５】切除のため、この方法によりアレイからの分子の除去が実施されたら、この方
法は完了する。もし望むなら、これらの分子は実施例７に記載したように増幅お
よびクーロン化される。

【０１０６】お互いに関係するアレイの組の核酸分子の容易な配向付けのために本発明で提
供される方法は”アレイ鋳型化”である。一本鎖ＤＮＡ分子の最初のライブラリ
ーの均一溶液を、ライブラリーメンバーに含まれる配列がアレイのメンバー分子
へハイブリダイズするようになるような条件下で光リソグラフによる全１０−ｍ
ｅｒｓｓ−ＤＮＡオリゴマー上に広げ、アレイ化されたライブラリーを形成す
る（ここで配位物ははアレイにより定義されるような配列の順である）。例えば
、３’固定化１０−ｍｅｒ（上の鎖）は以下に示すように２５−ｍｅｒライブラ
リーメンバー（下の鎖）を結合する：５’−ＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴ−３’ ［配列ＩＤ番号：２］３’−ＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＡＣＧＴＡＡＣＧＴＡＣＧＡＴＡ−５’ ［配列Ｉ
Ｄ番号：３］２５−ｍｅｒ配列の支持体への共有結合、増幅およびレプリカプリンティングは
前記の方法で実施された。必要なら、さらなる特徴付けがＳＢＨ、蛍光ｄＮＴＰ
伸長または本分野で知られているような核酸アレイに応用可能な他の配列決定法
により実施される。このことは、続いての応用に有用なアレイを作製するため、
複製されたアレイ中のオリゴマーフィーチャーの十分な数の配列を同定する能力
を非常に高めている。実施例２本発明に従った規則正しい染色体アレイ直接インサイチュ単一コピー（ＤＩＳＣ）−ＰＣＲは分裂中期染色体に直接用
いる、スライド上でのＰＣＲのための独特の配列を定義している二つのプライマ
ーを使用する方法である（Ｔｒｏｙｅｒｅｔａｌ．，１９９４ａ，Ｍａｍｍ
ａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ，５：１１２−１１４；Ｔｒｏｙｅｒｅｔ．ａｌ．，
１９９７，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ７１：ＰＲｌＮＳａ
ｎｄＩｎＳｉｔｕＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊ．Ｒ．Ｇｏｄｓｅｎ，
ｅｄ．，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ．７
１−７６に概説されている）。それは特異的部位でのＰＣＲ生成物の指数的蓄積
を可能にし、本発明に従った使用に適用できるであろう。

【０１０７】ＤＩＳＣ−ＰＣＲ法は１００−３００ｂｐほどの短い配列を哺乳類染色体へ局
在化させるために使用されている（Ｔｒｏｙｅｒｅｔａｌ．，１９９４ａ，
上記文献；Ｔｒｏｙｅｒｅｔａｌ．，１９９４ｂ，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃ
ｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，６７（３），１９９−２０４；Ｔｒｏｙｅｒｅｔ
ａｌ．，１９９５，Ａｎｉｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６（１）；５１
−５８；およびＸｉｅｅｔａｌ．，１９９５，ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎ
ｏｍｅ６：１３９−１４１）。それはマイクロサテライトのような物理的帰属
配列がタグ付けされた部位（ＳＴＳ）に特に適しており（ＬｉｔｔａｎｄＬ
ｕｔｙ，１９８９，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，４４：３９７−４０１；Ｗ
ｅｂｅｒａｎｄＭａｙ，１９８９，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４４
，３３８−３９６）、その多くは迅速配列決定のための小挿入物ライブラリーか
ら単離されているので、インサイチュハイブリダイゼーションにより帰属できな
い。それはまた発現された配列タグ（ＥＳＴ）の物理的地図作製にも利用できる
（Ｔｒｏｙｅｒ，１９９４ａ，上記文献；Ｓｃｈｎｌｕｔｚｅｔａｌ．，１
９９６，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．ＣｅｌｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，７２：３２−３９
）。ＤＩＳＣ−ＰＣＲは、ＰＣＲプライマーを合成するには十分な配列情報を持
つ必要はあるが、クローン化遺伝子を研究者が手に持つ必要性をなくしている。
本発明の方法によると、標的特異的プライマーさえも利用する必要はなく、必要
とされるものは、一方の末端に半固体支持体へ固定化されまたは加えられた、制
限エンドヌクレアーゼ切断またはオリゴヌクレオチド分子へのハイブリダイゼー
ションのような操作に適した”万能性”配列を持ち、他方の末端に、染色体のイ
ンサイチュ増幅を開始するであろう無作為配列を雑多に取りそろえたもの（例え
ば、すべての可能なヘキサマー）を持つメンバーを含むプライマーの混合プール
が全てである。前記のように、プライマーはそれらを移動後にアレイの半固体支
持体へ結合するための末端架橋基を含むか、もしくは、それらはそのような要素
が欠けていてもよいが、新しく合成された鎖が永久にアレイに結合されるように
なるような紫外線架橋によりまたは相補的固定化プライマーへのハイブリダイゼ
ーションおよび続いてのプライマー伸長により支持体へ固定化される。ＤＩＳＣ
−ＰＣＲ法は以下のように簡単に要約される：ガラススライドへ繋ぎ止められた分裂中期染色体は、エタノールで前もって洗
浄され糸くずを出さないガーゼを用いて乾燥されたスライドを使用し、標準技術
により調製された（Ｈａｌｎａｎ，１９８９，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆ
Ａｎｉｍａｌｓ，Ｃ．Ｒ．Ｅ．Ｈａｌｎａｎ，ｅｄ．，ＣＡＢＩｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，ｐｐ．４５１−４５６）
。染色体が広げられたスライドは、リン酸緩衝液（ＰＢＳ；８．０ｇのＮａＣｌ
、１．３ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄および４ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄を脱イオン水に溶解し、容
量を１リットルおよびｐＨを７．４に調整する）で１０分間洗浄し、一連のエタ
ノール処理により脱水する（７０、８０、９５および１００％）。ある場合には
中性緩衝化ホルマリン中での一夜の固定化、続いてのペプシノーゲン（２ｍｇ／
ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）による１５分の消化が増幅効率を促進する。

【０１０８】各々のスライドのため、以下の溶液を微量遠心管に用意する：各々２００μＭ
のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；全てのデオキシヌクレオチド
は凍結して保存される、緩衝化１０ｍＭ貯蔵溶液または乾燥形で、および多くの
供給源から乾燥形または溶液で入手される（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ
，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）。各々のスライドのための反応混合物
は１．５μＭの各々のプライマー（２０μＭ貯蔵液から）、２．０μＬ１０Ｘ
Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣ１，ｐＨ８．３，５００ｍ
ＭＫＣｌ，１５ｍＭＭｇＣｌ₂，０．１％ＢＳＡ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、２．５単位ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）
を含み、脱イオンＨ₂０で２０μｌの最終容量とする。市販品として供給されているＴａｑポリメラーゼ緩衝液は普通は十分である；しかしながら、Ｏｐｔｉ−
ＰｒｉｍｅｒＰＣＲキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ
）のような最適化キットが使用される場合は［ＭｇＣｌ₂］またはｐＨの調整が必要である。前記の反応混合物は分裂中期染色体上にピペッティングし、２２ｘ
５５ｍｍのカバースリップで覆い、その境界線を透明なマニキュア液で封じる。
全ての空気の泡（最も小さいものも、加熱により拡大し、反応を阻害する）を封
じる前に除去する。特に好適なマニキュア液はＨａｒｄＡｓＮａｉｌｓ（Ｓ
ａｌｌｙＨａｎｓｅｎ）であり；この爪エナメルは漏出に抵抗性であることが
観察されており、もし漏出が起こると、反応条件の完全性を危うくし、染色体Ｄ
ＮＡ配列の増幅を阻害する。１回の多めの被覆で十分である。エナメル液を室温
で放置して乾燥した後、スライドの端をシリコングリス（ＤｏｗＣｏｒｎｉｎ
ｇＣｏｒｐｏｒａｌｉｏｎ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）で被覆する。スライドは
以下のプロフィールを用い、適したサーマルサイクラー（即ち、ＢｉｏＯｖｅｎ
ＩＩＩ；ＢｉｏｔｈｅｒｍＣｏｒｐ．，Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＡ、のようなス
ライド上ＰＣＲのために設計されたもの）中で処理する：ａ．９４℃で３分。

【０１０９】ｂ．１分のプライマーのアニーリング温度。

【０１１０】ｃ．７２℃で１分。

【０１１１】ｄ．９２℃で１分。

【０１１２】ｅ．工程ｂへさらに２４回循環、（総計で２５回）ｆ．３−５分の最終伸長工程。

【０１１３】熱循環が完了した後、シリコングリースをティッシュで除き、スライドを１０
０％エタノールに沈める。鋭いかみそり刃を用いてマニキュア液を切断し、カバ
ースリップをゆっくり持ち上げて取り除く。過剰な緩衝液をスライド端からゆっ
くりと吸い取るけれども、この時点からスライドを決して乾燥させないことが重
要である。スライドは素早く４ＸＳＳＣに沈め、続いての使用に先立って、過
剰のマニキュア液をスライドの端からかき落とす。

【０１１４】スライドは増幅された核酸分子を移すため、直ちに半固体支持体と接触させる
；もしくは、スライドは最初に、半固体支持体マトリックスに浸透する（即ち、
その孔中に存在する）ものと等張であるか、または理想的には同一である液体媒
質で平衡化する。この時点から、アレイは実施例１に示した方法に従って調製さ
れたものと同等に取り扱われる。フィーチャー同定（前に記載されている）は鋳
型染色体の長さに沿って、遺伝子要素の大体の位置の決定を可能にする。染色体
が直線的に伸長される（伸ばされる）調製試料においては、遺伝子順序付けの正
確性は促進される。このことは、古典的または分子遺伝学研究でそのような情報
が知られていない例、さらに全く特徴付けが行われていない染色体の極端な場合
でさえも特に有用である。この方法により、以前に遺伝子地図作製が行われてい
ないにしても、問題とする種間での相同性染色体の比較研究が実施できる。その
ようにして得られた情報は種間の進化的関係の測定に関して価値があり、その場
合、大きなおよび小さな染色体転位が明らかにされる。単一種（例えば、ヒト検
体）の異なった個体間の表現型相違の遺伝子的基礎がこの方法により研究できる
。鋳型染色体が凝集されている（コイルを巻いている）場合、遺伝子要素間のイ
ンビボ空間的関係に関するより多くの情報が得られる。このことは細胞型特異的
遺伝子転写活性の点で意味を持っているであろうし、同一の生物体の異なった組
織の細胞から採られた凝集染色体を含む試料から発生するアレイの比較が手がか
りとなるであろう。

【０１１５】組織学的試料が調製され、ＰＣＲが実施されおよび染色体アレイの第一のコピ
ーが発生される方法は時間がかかるが、前記実施例１および他の本発明に従うと
、容易にアレイの多コピーが生成される。独特のアレイを再生する本発明の能力
は、科学者が同等の試料に対して平行して仕事する力を持ち、または異なった型
の分析を実施する有用な道具を提供する。加えて、そのようなアレイからいつで
も誘導されるデータの組を確認または拡張することを欲している他の研究者への
配分するためのアレイのさらに多くのコピーの発生を可能にする。

【０１１６】本発明の使用の変形は染色体鋳型化である。ＤＮＡ（例えば、全染色体）が伸
ばされ、表面上に固定される（ＺｉｍｍｅｒｒｎａｎｎａｎｄＣｏｘ，１９
９４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２２（３）：４９２−４９７）
。そのような固定化ＤＮＡのセグメントはエキソヌクレアーゼ、化学的変性（例
えば、ホルムアミド）および／または熱により一本鎖にされる。一本鎖領域は無
作為化配列の領域を持つ一本鎖ＤＮＡ分子アレイの種々の部分にハイブリダイズ
され、それによりフィーチャーの配位が直線状に伸ばされた染色体上のそれらの
順序に対応するアレイを形成する。もしくは、細胞中の種々の核酸成分の折り畳
まれたまたは部分的に折り畳みがほぐれた状態を複製する伸ばされ方が少ない構
造は、伸ばされたよりもむしろ凝集した（コイルに巻かれた）染色体を使用する
ことにより作製される。実施例３ＲＮＡ局在化アレイ前記実施例２に記載した方法は、細胞のＲＮＡ分子の空間的分布の二次元表示
を提供するアレイの発生に成功裡に等しく応用される。この方法は、前記実施例
２に記載されている染色体の散布どうりに調製された”押しつぶされた”細胞性
物質に応用される；もしくは、ガラス表面に固定化された切片化された組織試料
が使用される。パラフィン、プラスチックまたは凍結（Ｓｅｒｒａｎｏｅｔ
ａｌ．，１９８９，Ｄｅｖ．Ｂｉｏ１．１３２：４１０−４１８）切片が後者の
場合に使用される。

【０１１７】組織試料は通常の試薬を使用して固定された；ホルマリン、等張緩衝液に溶解
した４％パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド（その各々は試料中の核酸分
子に対するＲＮＡａｓｅ耐性の尺度を与える）またはＦＡＡＧ（８５％エタノー
ル、４％ホルムアルデヒド、５％酢酸、１％ＥＭ用グルタルアルデヒド）のよう
な多成分固定剤がこの方法で適用される。包埋されるまで組織が暴露される溶液
の水性成分の調製に使用される水はＲＮＡａｓｅを含んでいない；即ち、０．１
％ジエチルプロカルボナート（ＤＥＰＣ）を用いて一夜室温にて処理し、続いて
１．５から２時間オートクレーブにかける。試料ローラーまたはロッキングプラ
ットホーム上で固定剤が試料の中心に到達するように組織を４℃で１２から４８
時間固定する。包埋に先立って、試料から固定剤を追い出し、脱水する；これは
高濃度のエタノールを増加させる一連の２から３分の洗浄（６０％から始めて９
５％での２回の洗浄で終わり、さらに１００％エタノールで２回）、続いてのキ
シレン中での２回の１０分間洗浄により達成される。試料は種々の切片化支持体
、例えば、パラフィン、プラスチックポリマーまたは混合パラフィン／ポリマー
媒質（例えば、Ｐａｒａｐｌａｓｔ^R Ｐｌｕｓ組織包埋媒質、ＯｘｆｏｒｄＬａｂｗａｒｅから供給される）に包埋する。例えば、固定され、脱水された組
織は２回目のキシレン洗浄から約５８℃の液相のパラフィン／ポリマー樹脂へ移
され、残留キシレンを希釈して除くため約３時間の間に３から６回置き換え、組
織内への包埋媒質の浸透を最適化するために続いて真空下で一夜インキュベーシ
ョンを行った。次の日、５８℃で２０分から１時間間隔でさらに数回媒質を交換
し、組織試料を切り出し型に入れ、型を氷水で包んで媒質を固める。６μｍ厚の
切片を切り出し、接着を促進するためにタンパク質性基質物質（通常ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ））で被覆されているサブベッドスライドへ固定する。固定化
および包埋の他の方法も本発明の方法に従った使用に応用可能である；これらの
例は、Ｈｕｍａｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．，１９７９，ＡｎｉｍａｌＴｉｓｓｕｅＴ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４ｔｈｅｄ．（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，
ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）に凍結切り出し法として見ることができる。

【０１１８】押しつぶされたまたは切り出された組織の調製に続き、試料のＲＮＡ分子がイ
ンサイチュで逆転写された。スライドで反応を行うため、組織試料をガラス顕微
鏡スライドを収容するために設計された加熱ブロックを持つスライドサーマルサ
イクラー（例えば、ＴｅｍｐｃｙｃｌｅｒＩＩ；ＣＯＹＣｏｒｐ．，Ｇｒａ
ｓｓＬａｋｅ，ＭＩ）に置いた。約０．８ｃｍ（内径）ｘ１．０ｃｍ（高さ）
のステンレス鋼またはガラス（ＢｅｌｌｃｏＧｌａｓｓＩｎｃ．；Ｖｉｎｅ
ｌａｎｄ，ＮＪ）組織培養クローニング環を組織切片の頂に置いた。透明マニキ
ュア液が組織切片に対する環の底部を封じるのに使用され、逆転写および続いて
のインサイチュ増幅（ＬＩＳＡ）反応（Ｔｓｏｎｇａｌｉｓｅｔａｌ，１９
９４，上記文献）のための容器を形成させた。

【０１１９】逆転写は逆転写酵素（例えば、鳥類の骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、ＡＭＶ
−ＲＴ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬまたはモロ
ネイマウス白血病ウイルス逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用い、使用説明書の反応条件下
で実施した。例えば、組織試料は酵素を除いた逆転写反応混合物で再水和し、そ
れは５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオスレイトール、各々１．０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧ
ＴＰおよび０．４ｍＭのオリゴ−ｄＴ（１２−から１８−ｍｅｒ）を含んでいる
。組織試料は随意にＲＮＡを含まないＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８
．３および１ｍＭＥＤＴＡ）で再水和し、反応緩衝液の添加に先立って十分に
排水する。変性ＲＮＡ分子（いくらかの二本鎖二次構造が形成されている）に対
し、プライマーアニーリングを容易にするため、スライドは１分間６５℃に加熱
し、急速に３７℃に冷却する。２分後、５００単位のＭ−ＭＬＶ−ＲＴを混合物
に加え、総反応容量を１００μｌとした。反応液は３７℃で１時間インキュベー
トし、蒸発を避けるため、反応容器は顕微鏡カバースリップで覆った。

【０１２０】逆転写後、試薬を封じ込め環構造物からピペットで除き、得られたｃＤＮＡ分
子増幅の準備のためにＴＥ緩衝液で十分に洗浄する。

【０１２１】増幅反応は全量２５μｌで実施され、それは７５ｎｇの順および逆プライマー
（例えば、実施例６の混合プライマープール１および２）および０．６ＵのＴａ
ｑポリメラーゼを反応溶液に含んでおり、リットル当たり：２００ｎｍｏｌの各
々のデオキシヌクレオチド三リン酸、１．５ｍｍｏｌのＭｇＣｌ₂、６７ｍｍｏｌのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍｍｏｌの２−メルカプトエタノール
、１６．６ｍｍｏｌの硫酸アンモニウム、６．７μｍｏｌのＥＤＴＡおよび１０
μｍｏｌのジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰから成っている。反応混合物はクロ
ーニング環の中心に加えられ、スライドをスライドサーマルサイクラーへ戻す前
に、蒸発を避けるために鉱油を層積する。ＤＮＡは増幅２分前に９４℃にてイン
サイチュで変性させる。ＬＩＳＡは各々１分のプライマーアニーリング工程（５
５℃）、１．５分の伸長工程（７２℃）および１分の変性工程（９４℃）を２０
回繰り返すことにより達成された。これらの増幅サイクルプロフィールは最適な
組織形態、それ故スライド上の逆転写酵素およびそれらの増幅生成物、を保存す
るために試験管増幅で使用されたものとは異なっている。

【０１２２】増幅後、油層および反応混合物を組織試料から除去し、次にキシレンで洗浄す
る。封じ込め環をアセトンで除き、増幅されたｃＤＮＡを含んでいる組織は１０
０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）および１５０ｍＭＮａＣｌを含んでいる約
０．５ｍｌの緩衝液での３回の洗浄により再水和される。本発明の固定化核酸ア
レイは増幅された核酸分子と半固体支持体を接触させ、前記の任意の方法により
共有結合でそれに架橋でさせる。

【０１２３】フィーチャーが前記のようにＳＢＨを使用して同定され、細胞中のｍＲＮＡ分
子の位置と相関させる。実施例４サイズ分類ゲノムアレイ前に説明したように、全、あるいは生きている細胞さえも包埋された支持マト
リックスを調製することが可能である。そのようなプロトコールは（カプセル化
、移植可能細胞に基づいた薬剤送達担体−それらがどのように呼ばれたかを調べ
られたい）（プロトコール引用で前に掲げた目的）のような種々の目的のため、
およびパルス化フィールドゲル電気泳動に必要とされるような（Ｓｃｈｗａｒｔ
ｚａｎｄＣａｎｔｏｒ，１９８４，Ｃｅｌｌ，３７：６７−７５）非常に大
きい剪断されていないＤＮＡ分子の電気泳動的マトリックスへの送達に開発され
た。本発明のアレイは出発材料として生物体の細胞からのゲノムＤＮＡを用いて
構築され、電気泳動マトリックス内へ包埋されており、無傷な核酸分子が支持マ
トリックス環境に放出されるようにインサイチュで溶解される。もし、大きな分
子のコピーに基づいているとしたら、実施例２に記載された染色体要素順列化ア
レイと類似した様式で使用され、低パーセントアガロースゲルが支持体として使
用される。溶解に続いて（何の方法−パルスフィールド参照を必要とする）、得
られる大きな分子はインサイチュＰＣＲ増幅および支持体への結合（両方とも前
に説明されている）に先だって、電気泳動的にサイズ分類される。もし、アガロ
ース以外の支持体上にアレイを保存することが望まれるならば（ゲルは大きいの
で取り扱いが困難である）、アレイは結合に先立ってナイロンまたはニトロセル
ロース膜のような第二の支持体上へエレクトロブロッティングにより移される。

【０１２４】もし、遺伝子結合基のメンバー間の会合を保存する必要がないとしたら（最も
洗いレベルの分解能、染色体）、電気泳動に先立って核酸分子は機械的、化学的
または酵素的に切断される。より平均した核酸の分布が支持体上で得られ、お互
いの間の個々の要素の物理的分離が改良される。そのような場合、アガロースよ
りもむしろポリアクリルアミドゲルマトリックスが支持体として使用される。こ
の方法で生成されたアレイは、ある程度、配列決定ゲルに似ており；例えば、第
二の制限酵素またはその組み合わせによる電気泳動されたアレイの切断、続いて
の第二の次元での電気泳動は個々の核酸配列の分解能をお互いに、改良する。そ
のようなアレイは所望のサイズに構築される。大きなゲルを（例えば、４０ｃｍ
の長さ）を高い分解能で走査するのが現在容易になった。加えて、ゲル技術論の
進歩により、現在４ｃｍ長のゲルで配列決定を行うことが可能であり（通常のゲ
ルの１０分の１）、それは小さなゲルもまた本発明に従って有用であることを示
している。実施例５スプレイで描かれたアレイ（インクジェット）固定化核酸分子は、もし望むなら、支持体上に核酸合成化合物の焦点のあった
破裂を浴びせる装置（例えば、市販品として入手可能なインクジェットプリンタ
ー、それは実質的に修飾されない形で使用されるであろう）を使用して生成され
る（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，１９９７，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．，７：９４３−
９７６を参照されたい）。そのような方法はＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌｓおよびＲｏｓｅｔｔａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．で現在実
際的であり、後者は最小の改良しかしていないＥｐｓｏｎインクジェットカート
リッジ（ＥｐｓｏｎＡｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．；Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）を
用いている。インクジェット沈着法は圧電効果に依存しており、問題とする液体
（この場合、オリゴヌクレオチド合成試薬）を含んでいる狭いチューブが加減装
置で取り囲まれている。加減装置を経て送られた電気荷電はチューブと異なった
比で加減装置を拡大させ、ホスホロアミダイト化学試薬を含んでいる液体の小滴
をチューブから被覆スライドまたは他の支持体へ吹き付ける。

【０１２５】各々の領域がアレイのフィーチャーを形成するように、試薬は支持体の別々の
領域に沈着される；本分野で知られている他の方法でそうであるように、所望の
核酸配列は各々の位置で一滴ごとに合成される。もし、試薬の分散角度が狭いな
ら、多くのフィーチャーを含むアレイを作ることが可能である。もしくは、もし
、核酸合成試薬を広い角度で分散するように、スプレイ装置がより広く焦点を合
わされていると、全支持体が各々の時点で覆われ、各々のメンバーが同一の配列
を持つアレイが生成される（即ち、アレイは単一のフィーチャーのみを持つ）。

【０１２６】両方の型のアレイが本発明で使用され；インクジェット法で生成された多フィ
ーチャーアレイは前記のようにアレイ鋳型化に使用され；アレイと核酸分子を含
む組織試料を接触させることにより、またはアレイを染色体アレイ（実施例２）
またはＲＮＡ局在化アレイ（実施例３）のような別のアレイと接触させることに
より、核酸分子の無作為ライブラリーが核酸分子の混合プールを含んでいる均一
溶液としてそのようなアレイ上に広げられる。

【０１２７】もしくは、インクジェット法により生成された単一フィーチャーアレイが、天
然に存在する問題の配列（例えば、調節モチーフ）またはここにまたは下記実施
例６に記載したようなライブラリーの全てまたはサブセットにより含まれるオリ
ゴヌクレオチドプライマー配列を持っているにせよ、共通配列を含むライブラリ
ーの核酸分子を固定化するために同一の方法で使用される。

【０１２８】規則正しいインクジェットアレイにより固定化された核酸分子は（そのような
アレイが一つまたは多数のオリゴヌクレオチドフィーチャーを含んでいようと）
インサイチュで増幅され、半固体支持体へ移され、その上で固定化されて第一の
無作為パターンの固定化核酸アレイを形成し、それは続いて本発明に従ったその
ようなアレイの組を生成するための鋳型として使用される（全て前に説明されて
いる）。実施例６本発明のアレイからのフィーチャーの単離（方法１）／不均一アレイ実施例１に記載したように、もし望むなら、各々のフィーチャーの末端に連結
された制限部位を持つオリゴヌクレオチド配列を取り込むように、本発明に従っ
てアレイの組が生成される。このことは各々のフィーチャーが異なった組のプラ
イマー対を持っている、インサイチュ増幅のためのプライマー対の空間的に独特
なアレイを作り出す方法を提供する。万能プライマーの一つまたは両方はタイプ
ＩＩＳ配列のような制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいる（例えば、２
０ｂｐ離れた所を切断するＥｃｏ５７ＩまたはＭｍｅＩ）。全二本鎖アレイを対
応する酵素で処理し、続いて融解および非固定化鎖の洗い流しにより、明確な３
’末端を持つ所望のプライマー対が作られる。もしくは、二本鎖アレイの二本鎖
特異的３’エキソヌクレアーゼ処理を用いると、生じる一本鎖３’末端は正確な
終止点は異なっているであろう。プライマーの３’末端は例えば、診断における
変異配列のインサイチュ増幅に使用される。この方法は（独特のプライマー対の
アレイが生成される）、プライマーの各々の単一対が人の手により構築されおよ
び置かれるＡｄａｍｓａｎｄＫｒｏｎ（１９９７，上記文献）の方法の前進
を提供する。与えられたアレイのフィーチャーのクローニングは以下の様に行わ
れる：ＭｍｅＩはその認識部位ＴＣＣＧＡＣから離れた部位を切断する特性を持って
いる制限エンドヌクレアーゼである。プライマーの不均一プールは（５’から３
’へ）プールの全てのメンバーにより共有されている配列、ＭｍｅＩ制限部位お
よび変異領域を含むように構築される。変異領域は完全に無作為の配列（全ての
可能なヘキサマー）または選択されたプールの配列（例えば、特定のタンパク質
結合または他の機能性配列モチーフ上の変異）を含んでいる。もし変異配列が無
作為であるならば、無作為化された配列決定基の長さがプールの配列複雑性を決
定する。例えば、プライマーの３’末端でのヘキサマー配列の無作為化は、４０
９６の異なった配列組み合わせを含んでいるプールを生じる。オリゴヌクレオチ
ドの２つのそのような混合集団の例（この場合，３２−ｍｅｒ）は下記のプライ
マープール１および２である：プライマー１（４０９６のプール３２−ｍｅｒ）：５’ｇｃａｇｃａｇｔａｃｇａｃｔａｇｃａｔａＴＣＣＧＡＣｎｎｎｎｎｎ３’
［配列ＩＤ番号：４］プライマー２（４０９６のプール３２−ｍｅｒ）：５’ｃｇａｔａｇｃａｇｔａｇｃａｔｇｃａｇｇＴＣＣＧＡＣｎｎｎｎｎｎ３’ ［配列ＩＤ番号：５］核酸調製物はプライマー１を用いて無作為に開始する配列の合成で増幅される
。出発核酸分子はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであり、実質的に全体のまたはよ
り小さな種に分けられた分子を含んでいる。多くのＤＮＡ切断法が本分野で知ら
れている。機械的な切断は超音波処理、皮下注射針を通した繰り返しの通過、煮
沸、急速凍結および融解の繰り返しを含むいくつかの方法により達成される。化
学的切断は、酸または塩基加水分解、またはＤＮＡ配列決定で使用されるような
塩基特異的切断基質による切断（ＭａｘａｍａｎｄＧｉｌｂｅｒｔ，１９７
７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４：５６０−５
６４）が含まれるが、これらに制限されるわけではない。もしくは、部位特異的
であり、制限エンドヌクレアーゼにより媒介されるような、またはもっと一般的
にエキソーまたはエンドヌクレアーゼ、例えば、ＥｘｏＩＩＩ、ムングビーンヌ
クレアーゼ、ＤＮＡａｓｅＩ、または、特別の緩衝液条件下のＴ４のようなＤＮ
Ａポリメラーゼ（プルーフリーディング能力でのかみもどしまたは内部的切断Ｄ
ＮＡ）により媒介される酵素的切断が実施される。もし出発核酸分子が（さらに
ＲＮＡを含んでいても良い）が全体（閉環または染色体性）というよりむしろ断
片化されていると、開始された合成以外の手段により第二の配列が結合される遊
離末端を持つように、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼまたは末端デオキシヌク
レオチドトランスフェラーゼを用いてＭｍｅＩ認識部位が出発分子に結合される
。これらの酵素のための反応条件は、製造元により推薦されている（例えば、Ｎ
ｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡまたはＢｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａ
ｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。もし用いるならＰＣＲは鋳型ＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ；
通常はそれ以上，１−１，０００ｎｇ）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴ
ヌクレオチドプライマー；プライマー濃度の上限は凝集のため約１０μｇ／ｍｌ
と定めされる、を用いて実施される。典型的な反応混合物には：２μｌのＤＮＡ
、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０ｘＰＣＲ緩
衝液１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）、０．４
μｌの１．２５μＭｄＮＴＰ、０．１５μｌ（または２．５単位）のＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃ
Ａ）および総量を２５μｌにするための脱イオン水が含まれている。鉱油を層積
し、ＰＣＲはプログラム可能なサーマルサイクラーを用いて実施された。ＰＣＲ
サイクルの長さおよび温度、ならびにサイクルの数は、事実上のストリンジェン
シー要求に従って調整される。鋳型分子の最初の変性は通常９２℃から９４℃の
間を４分間で起こり、変性（９４−９９℃で１５秒から１分）、アニーリング（
温度は以下に議論されるように決定される、１−２分）および伸張（７２℃で１
分）から成るサイクルを２０−４０回続ける。最終伸張は一般に７２℃で４分行
い、４℃での不定の（０−２４時間）工程が続く。

【０１２９】アニーリング温度および時間はプライマーが鋳型へアニールすると期待される
効率および許容せねばならない不適正の程度の両方により決定される。分子の混
合集団を増幅する試みにおいて、それらの標的配列以外の配列へのプライマーの
でたらめなアニーリングに対する、ストリンジェント（高温）アニーリング条件
下で低い融解点を持つ標的配列を持っている分子の潜在的損失は偏っている。フ
ィーチャー損失の許容に対する偽の増幅生成物の包含の制限を判断する能力は普
通の当業者の知識内である。３０℃から６０℃の間の温度が使用される。４０９
４プライマー１の中の一つのプライマーの例、一つのプライマー（プライマー１
ｅｘ）が以下に示されており、プライマー１ｅｘで調製されたＤＮＡ配列は、無
作為な位置に高い３’末端相補性を持っている。開始部位は両方の核酸分子で下
線が付けられている。プライマー１ｅｘ［配列ＩＤ番号：７；塩基１−３２］：５’−ｇｃａｇｃａｇ
ｔａｃｇａｃｔａｇｃａｔａＴＣＣＧＡＣｃｔｇｃｇｔ−３’ ゲノムＤＮＡ［配列ＩＤ番号：６］：３’−ｔｔｔｃｇａｃａｃａｔｃｇｃｇｔ
ｇｃａｔｇｇｃｃｃｃａｔｇｃａｔｃａｇｇｃｔｇａｃｇａｃｃｇｔｃｇｔａｃ
ｇｔｃｔａｃｔｃｇｇｃｔ−５’ 開始後、鋳型上のポリメラーゼ伸張は次の配列を生じた：［配列ＩＤ番号：７］
５’−ｇｃａｇｃａｇｔａｃｇａｃｔａｇｃａｔａＴＣＣＧＡＣｃｔｇｃｇｔｇ
ｔａｇｃｇｃａｃｇｔａｃｃｇｇｇｇｔａｃｇｔａｇｔｃｃｇａｃｔｇｃｔｇｇ
ｃａｇｃａｔｇｃａｇａｔｇａｇｃｃｇａ−３’ ４０９６プライマー２のプールの中で、伸張プライマー１ｅｘＤＮＡ中の無作為
位置に高い３’末端相補性を持つ一つのプライマーがプライミングのためのポリ
メラーゼにより選択された（プライミング部位はボールド体（下線）である）：［配列ＩＤ番号：７］５’−ｇｃａｇｃａｇｔａｃｇａｃｔａｇｃａｔａＴＣ
ＣＧＡＣｃｔｇｃｇｔｇｔａｇｃｇｃａｃｇｔａｃｃｇｇｇｇｔａｃｇｔａｇｔ
ｃｃｇａｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｃａｔｇｃａｇａｔｇａｇｃｃｇａ３’ プライマー２ｅｘ［配列ＩＤ番号：８；塩基１−３２］：３’−ｇａｃｇａｃＣ
ＡＧＣＣＴｇｇａｃｇｔａｃｇａｔｇａｃｇａｔａｇｃ−５’ プライミングおよび合成後、生じた第二の鎖は次のものである：［配列ＩＤ番号：８］３’−ｃｇｔｃｇｔｃａｔｇｃｔｇａｔｃｇｔａｔＡＧ
ＧＣＴＧｇａｃｇｃａｃａｔｃｇｃｇｔｇｃａｔｇｇｃｃｃｃａｔｇｃａｔｃａ
ｇｇｃｔｇａｃｇａｃＣＡＧＣＣＴｇｇａｃｇｔａｃｇａｔｇａｃｇａｔａｇｃ
−５’ 以下に示されるプライマー３は２６−ｍｅｒであり、プライマー１ｅｘの定常領
域と同一である：［配列ＩＤ番号：７；ヌクレオチド１−２６］５’−ｇｃａｇｃａｇｔａｃｇａ
ｃｔａｇｃａｔａＴＣＣＧＡＣ−３’ それは５’アクリリル基によりガラススライド上のポリアクリルアミド層に固定
化される。下記プライマー４は２６−ｍｅｒであり、プライマー２ｅｘの定常領域と同一で
ある：［配列ＩＤ番号：８；ヌクレオチド１−２６］５’−ｃｇａｔａｇｃａｇｔａｇ
ｃａｔｇｃａｇｇＴＣＣＧＡＣ−３’ それは随意に５’アクリリル基によりポリアクリルアミド層に固定化される。

【０１３０】混合プライマー１および２による本来の核酸調製試料の連続的プライミングで
誘導される、１ｅｘ／２ｅｘプライミングおよび伸張の生成物を含んでいる増幅
された分子のプールは固定化されたプライマー３および４とハイブリダイズされ
た。インサイチュウＰＣＲは前記のように実施され本発明による核酸分子の第一
の無作為固定化アレイが得られる。このアレイは本発明に従う、多数のそのよう
なアレイを作るため、実施例１に記載した方法によりレプリカとされた。

【０１３１】プライマー３および４を用いるインサイチュウＰＣＲ後：５’− ｇｃａｇｃａｇｔａｃｇａｃｔａｇｃａｔａＴＣＣＧＡＣｃｔｇｃｇｔｇｔａｇ
ｃｇｃａｃｇｔａｃｃｇｇｇｇｔａｃｇｔａｇｔｃｇｔｃｇｔｃａｔｇｃｔｇａ
ｔｃｇｔａｔＡＧＧＣＴＧｇａｃｇｃａｃａｔｃｇｃｇｔｇｃａｔｇｇｃｃｃｃ
ａｔｇｃａｔｃａ３’− ｃｃｇａｃｔｇｃｔｇＧＴＣＧＧＡｃｃｔｇｃａｔｇｃｔａｃｔｇｃｔａｔｃｇ
−３ ’［配列ＩＤ番号：９］ｇｇｃｔｇａｃｇａｃＣＡＧＣＣＴｇｇａｃｇｔａｃｇａｔｇａｃｇａｔａｇｃ
−５’ ［配列ＩＤ番号：８］ＭｍｅＩで切断し、非固定化鎖が除去された後：［配列ＩＤ番号：９；塩基１−４６］５’− ｇｃａｇｃａｇｔａｃｇａｃｔａｇｃａｔａＴＣＣＧＡＣｃｔｇｃｇｔｇｔａｇ
ｃｇｃａｃｇｔａｃｃ−３’ （プライマー１に基づいた、クローン特異的オリゴヌクレオチド）［配列ＩＤ番号：８；塩基１−４６］３’− ｃｃａｔｇｃａｔｃａｇｇｃｔｇａｃｇａｃＣＡＧＣＣＴｇｇａｃｇｔａｃｇａ
ｔｇａｃｇａｔａｇｃ−５’ （プライマー２に基づいた、クローン特異的オリゴヌクレオチド）本来の調製試料の核酸配列を示しているオリゴヌクレオチドプライマーの生じ
た無作為アレイはいくつかの方法で有用である。上記のプライマー対のような特
定のフィーチャーは、第二の核酸試料からの介在配列を選択的に増幅するために
使用される（この場合、チップまたはレプリカの各々の使用のために本来の４２
ｂｐの２つの中心ｂｐクローン化セグメントが捕捉される）。このことは溶液中
またはインサイチュウで、前記のようにアレイのフィーチャー同定後に遊離、合
成プライマーを使用して実施される。望むなら、対立遺伝子特異的プライマー伸
張または続いてのハイブリダイゼーションが実施される。

【０１３２】重要な点は、この技術は本発明に従った第二の細胞株、組織、生物体または種
からの対応する、または相同的な核酸アレイを得る手段を提供することである。
異なった起源に由来する対応する遺伝子配列を比較できる能力は多くの実験およ
び臨床状態で有用である。”対応する遺伝子配列”とは、単一生物体の異なった
組織または組織培養細胞株の核酸内容物を意味している。そのような配列は、遺
伝子制御またはｍＲＮＡプロセッシングの細胞型特異性を研究するため、または
別の組織というより一つの組織で生じるであろう染色体転位を観察するために比
較される。もしくは、本用語は異なった個体から採られたk核酸試料を意味し、その場合、得られた遺伝子またはその調節が試料間で比較される。そのような比
較は法医学技術および集団遺伝子研究においての、疾患の遺伝子的基礎を決定す
るために設計された連鎖研究に使用される。最後に、重要な（従って保存されて
いる）配列を目立たせるため、第一の生物体の特定の核酸配列および時間の長さ
が変化してそれから進化的に分かれた一つまたはそれ以上の生物体における相同
体の特徴付けおよび比較は、進化の速度を見積もりおよび／または種間の系統発
生的関係を確立する。本発明は多数の固定化された核酸アレイを発生する方法を
提供し、各々のアレイの多数は異なった組織、個々の生物体または生物体種から
の核酸分子のコピーを含んでいる。

【０１３３】もしくは、与えられた核酸試料のメンバーに独特の配列を持つ、オリゴヌクレ
オチドプライマーの第一のアレイは前記のようなプライミング合成以外の手段に
よっても調製される。これを行うには、核酸試料は第一の組織、細胞株、個体ま
たは種から得られ、クローニング部位の両側に、ベクターとの結合部に十分に近
いタイプＩＩＳ酵素認識部位、および両方の部位を認識するタイプＩＩＳ酵素に
よる切断が少なくとも６から１０、好適には１０から２０塩基対、結合部位から
離れて挿入配列内で起こるプラスミドまたは他の複製可能ベクター内へクローン
化する。タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼ活性が結合部位から３０塩基対ま
で離れていることも企図される。核酸分子はベクターからプライマーおよびオリ
ゴヌクレオチド配列の両外側を切断する制限酵素を用いて切断され、前に説明し
た任意の方法により本発明に従って半個体支持体上に固定化され、そこでは、支
持体への分子の共有結合はそれらの５’末端で起こっているが、内部塩基では起
こっていない。固定化された配列特異的オリゴヌクレオチドを得るためのタイプ
ＩＩＳ酵素（ＭｍｅＩのような）による切断はこの実施例の前の方で説明したよ
うに実施される。

【０１３４】前記のように、支持体上にプライマー４を固定化する必要はない。もしプライ
マー４が遊離のまま残されたら、インサイチュウＰＣＲ生成物は変性により上の
（プライマー１誘導）鎖を与える。［配列ＩＤ番号：９］５’− ｇｃａｇｃａｇｔａｃｇａｃｔａｇｃａｔａＴＣＣＧＡＣｃｔｇｃｇｔｇｔａｇ
ｃｇｃａｃｇｔａｃｃｇｇｇｇｔａｃｇｔａｇｔｃｃｇａｃｔｇｃｔｇＧＴＣＧ
ＧＡｃｃｔｇｃａｔｇｃｔａｃｔｇｃｔａｔｃｇ−３’ この配列はｍＲＮＡ定量または遺伝子型決定のための蛍光標識ＤＮＡまたはＲＮ
Ａへのハイブリダイゼーションのために入手可能である。実施例７本発明のアレイからのフィーチャーの単離（方法２）前記のように、レーザー捕捉微量切除が、本発明に従って生成されるアレイの
組を使用している研究者を助けて方向付けするために、またはそれらから望まし
くないフィーチャーを除去するために実施された。もしくは、この方法は問題と
するアレイの選択されたフィーチャーのクローニングを容易にするために用いら
れた。与えられたフィーチャーまたはアレイからのフィーチャーの群の核酸分子
のＥＶＡの薄いフィルムまたは他の熱感受性接着物質への輸送は前に説明したよ
うに実施された。これらの工程に従うと、以下のように本分子が増幅されクロー
ン化される：輸送フィルムおよび接着細胞は直ちに４０μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡおよび１％Ｔｗｅｅｎ−２０に再懸濁し、試験管
（例えば、ポリプロピレン微量遠心管）中で一夜３７℃でインキュベートする。
次に混合物を１０分間煮沸する。遠心管を軽く遠心して（１０００ｒｐｍ、１分
）フィルムを除き、０．５μｌの上清液をＰＣＲで使用する。典型的には、アレ
イに最初に適用した輸送フィルムのシートは小さな円盤（直径０．５ｃｍ）であ
る。ＬＣＭ輸送後のより有効な溶出のため、４０μｌの抽出緩衝液を含んでい
る９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル内へ円盤を置く。問題とする配
列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは前記の任意の方法で設計および調
製される。ＰＣＲを前記の実施例で説明したように標準法に従って実施する。

【０１３５】本発明は、第一のアレイからの無作為にパターン化された、固定化（従って再
利用できる）核酸アレイの多数のコピーを各々が含むアレイの組を発生させるた
めに有用であり、それにより核酸プールの分子が迅速に、安価に無作為的に位置
され、生物試料のような核酸分子の独特のプールが形成される。本発明に従って
生成されるアレイの組、そのような組のメンバーは発現分析（Ｓｃｈｅｎａ，ｅ
ｔａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．
，９３：１０６１４−１０６１９；Ｌｏｃｋｈａｒｔ，ｅｔａｌ．，１９９６
，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０）お
よび遺伝多型検出（Ｃｈｅｅｅｔａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７
４（５２８７）：６１０−６４）に有用である。これらはまた、ＤＮＡ／タンパ
ク質結合アッセイおよびより一般的なタンパク質アレイ結合アッセイにも使用さ
れる。他の実施態様他の実施態様は当業者には明らかであろう。以上の説明は明快さのために提供
されており、単なる例示であることを理解しなければならない。本発明の精神お
よび範囲は上記の実施例で制限されるわけではなく、以下の請求の範囲により包
含されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＦ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の核酸アレイを製造する方法であって、ａ）支持体に付けられた核酸分子のプールを含む、第１のランダムにパターン化
された、固定化された核酸アレイの核酸分子をインサイチオで増幅し、そしてｂ）前記増幅により生成した核酸分子の少なくとも１つのサブセットを第２の支
持体に移し、そしてｃ）そのように移された前記サブセットを前記第２の支持体に付けて、第２のラ
ンダムにパターン化された、固定化された核酸アレイを形成し、ここで、前記第
２のアレイの核酸分子は、前記第１のアレイ上のそれらが増幅されて前記複数を
生成した元の前記核酸分子の位置に対応する位置を占める、の各工程をこの順序で含むことを特徴とする方法。
【請求項２】工程ｂ）の後に工程ｂ）およびｃ）を繰り返す工程をさらに
含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】工程ｂ）またはその繰り返しの後に工程ａ）を繰り返す工程
をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】工程ｂ）の後に、前記第２の支持体に移された分子の少なく
とも１つのサブセットを第３の支持体に移して付ける工程をさらに含む、請求項
１記載の方法。
【請求項５】前記第２のアレイの前記核酸分子を増幅する工程をさらに含
む、請求項１記載の方法。
【請求項６】核酸分子の前記プールがＲＮＡまたはＤＮＡから調製される
、請求項１記載の方法。
【請求項７】核酸分子の前記プールがｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む
、請求項６記載の方法。
【請求項８】前記核酸分子の前記プールがライブラリである、請求項１記
載の方法。
【請求項９】核酸分子の前記プールが、ａ）ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを核酸ベクターのクローニング部位中にクロー
ニングし、そしてｂ）次に前記核酸分子を前記ベクターから切断し、ここで、前記クローニング部
位は、工程ｂ）の前記切断の後に前記核酸分子に結合したままでいるであろうオ
リゴヌクレオチド配列によりいずれかの側で隣接されている、ことにより調製される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】前記オリゴヌクレオチド配列が制限酵素の認識部位を含む
、請求項９記載の方法。
【請求項１１】前記部位が結合している前記ライブラリの核酸分子の前記
酵素による続く切断により、前記ライブラリの各メンバーのいずれかの末端に独
特の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの対が放出される、請求項１０記
載の方法。
【請求項１２】前記認識部位がタイプＩＩＳ制限酵素の認識部位である、
請求項１０記載の方法。
【請求項１３】前記支持体が半固体である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】前記半固体支持体が、ポリアクリルアミド、セルロース、
ポリアミド（ナイロン）および架橋アガロース、架橋デキストランおよび架橋ポ
リエチレングリコールを含む群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】工程ａ）の核酸分子の前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）により行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１６】前記付加が酸化３−メチルウリジン、アクリリル基および
ヘキサエチレングリコールを含む群より選択される共有結合リンカーを用いて実
施される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】前記付加が、前記プールのメンバーの、共有結合的に前記
支持体に結合している核酸分子に対するハイブリダイゼーションにより行われる
、請求項１記載の方法。
【請求項１８】前記支持体に結合している前記核酸分子が合成オリゴヌク
レオチドである、請求項９記載の方法。
【請求項１９】工程ｂ）の前記移動が、前記第１のアレイを、工程ａ）の
前記増幅により生成した前記核酸分子の少なくとも１つのサブセットが前記支持
体に移されるように、支持体と接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】工程ｂ）の前記移動が、ｉ）前記第１のアレイを、工程ａ）の前記増幅により生成した前記核酸分子の少
なくとも１つのサブセットが前記担体に移されるように、円筒形ローラー、スタ
ンピング装置、膜および支持体を含む群より選択される担体と接触させ、そして
ｉｉ）次に前記担体を支持体と接触させる、の各工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】複数の核酸アレイであって、ａ）支持体上にランダムに固定化された核酸分子の核酸アレイのプールを含む、
ランダムにパターン化された、固定化された第１のテンプレート、およびｂ）第２のランダムにパターン化された、固定化された核酸アレイ、ここで、前
記第２のアレイの核酸分子は前記プールの核酸増幅生成物であり、前記第２のア
レイの前記核酸分子は、前記第２のアレイ上で、前記第１のアレイ上のそれらが
増幅された元の前記核酸分子の位置と対応する位置を占める、を含む複数の核酸アレイ。
【請求項２２】固定化された核酸アレイを提供することを含む、染色体上
の遺伝的要素の連続順序を決定する方法であって、ａ）固定化された染色体を提供し、ｂ）前記染色体の核酸配列を増幅し、ｃ）前記増幅された配列を、前記増幅により生成した核酸分子のサブセットが支
持体により保持されるように前記支持体と接触させ、ｄ）そのように保持された前記核酸分子を前記支持体に共有結合的に付けて、第
１の固定化された核酸アレイを生成し、ここで、前記アレイのメンバーの位置は
、前記染色体上のそれらが増幅された元のＤＮＡ配列の位置に対応しており、そ
してｅ）前記染色体上の遺伝的要素の順序を決定し、ここで、前記順序決定は、前記
アレイの特徴を同定することを含み、かつ前記アレイ上の第２の特徴の位置に対
する第１の特徴の位置は、前記染色体上の第２の遺伝的要素の位置に対する第１
の遺伝的要素の位置に対応する、の各工程を含む方法。
【請求項２３】前記増幅がＰＣＲにより実施される、請求項２２記載の方
法。
【請求項２４】前記同定が、ハイブリダイゼーションによる配列決定（Ｓ
ＢＨ）、定量的増加蛍光ヌクレオチド付加配列決定（ＱＥＦＮＡＳ）または段階
的ライゲーションおよび切断による配列決定を用いて実施される、請求項２２記
載の方法。
【請求項２５】固定化された核酸アレイを提供することを含む、細胞また
は組織切片中におけるＲＮＡ分子の位置を決定する方法であって、ａ）固定化された細胞または組織切片を提供し、ｂ）前記細胞または前記組織切片のＲＮＡ分子を逆転写して、逆転写産物を含む
特徴のアレイを生成し、ｃ）前記逆転写産物の少なくとも１つのサブセットが前記支持体により保持され
るように、前記アレイを支持体と接触させ、そしてｄ）前記逆転写産物を前記支持体に共有結合的に付けて、固定化された核酸アレ
イを生成し、そしてｅ）前記ＲＮＡ分子の位置を決定し、これは前記アレイの前記特徴を同定するこ
とを含み、ここで、前記アレイ上の前記特徴の位置は、前記細胞または前記組織
切片中の前記ＲＮＡ分子の位置に対応する、の各工程を含む方法。
【請求項２６】工程ｂ）の後に前記逆転写産物を増幅する工程をさらに含
む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】前記増幅がＰＣＲにより実施される、請求項２６記載の方
法。
【請求項２８】前記同定がハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢ
Ｈ）、定量的増加蛍光ヌクレオチド付加配列決定（ＱＩＦＮＡＳ）または段階的
ライゲーションおよび切断を用いて実施される、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】工程ｃ）の後に、ｉ）ＰＣＲにより前記第１のアレイの分子を増幅し、そしてｉｉ）前記第１のアレイを、前記増幅された核酸分子の少なくとも１つのサブセ
ットが前記支持体に移されるように、第２の支持体と接触させ、そしてｉｉｉ）前記核酸分子を前記第２の支持体に共有結合的に付けて、第２の固定化
された核酸アレイを生成し、ここで前記第２のアレイのメンバーの位置は、前記
第１のアレイ上のそれらが増幅された元の前記分子の位置に対応する、の工程をさらに含む、請求項２２および２５のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】複数の固定化された核酸アレイを得る方法であって、ここ
で、複数のアレイは異なる核酸プールに由来するものであり、ａ）前記酵素による前記プールの核酸分子の切断により、前記プールの各メンバ
ーのいずれかの末端に独特の配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーの対が放
出されるように、それぞれ制限酵素認識部位を含むオリゴヌクレオチド配列の両
方の末端に連結された核酸分子の第１のプールを含む第１の固定化された核酸ア
レイを提供し、ｂ）前記アレイの核酸分子をＰＣＲにより増幅し、ｃ）前記増幅により生成した核酸分子の少なくとも１つのサブセットが前記支持
体に移されるように、前記第１の固定化された核酸アレイを支持体と接触させ、ｄ）前記核酸分子を前記支持体に共有結合的に付けて前記第１の固定化された核
酸アレイのレプリカを生成し、ここで、前記レプリカ上の前記核酸分子の位置は
、それらが増幅された元の前記第１のアレイの前記核酸分子の位置に対応してお
り、ｅ）前記レプリカの前記核酸分子を前記制限酵素で切断し、このことにより前記
第１の核酸アレイの各特徴のいずれかの末端に独特の配列を含む、固定化された
オリゴヌクレオチドプライマーのアレイを生成し、ｆ）前記切断により前記オリゴヌクレオチドプライマーから放出された核酸フラ
グメントを前記オリゴヌクレオチドプライマーから洗浄し、ｇ）前記プライマーを、前記オリゴヌクレオチドプライマーと前記第２の核酸プ
ールの核酸分子との間にハイブリダイゼーションが生ずるように、相補的な核酸
分子のハイブリダイゼーションが可能な条件下で、核酸分子の第２のプールと接
触させ、ｈ）前記プライマーにそのようにハイブリダイズした前記第２のプールの核酸分
子を増幅し、ここでこれらがハイブリダイズした前記固定化されたオリゴヌクレ
オチドプライマーは前記増幅をプライミングするよう働き、このことにより前記
第２のプールの核酸分子の固定化されたアレイを生成する、の各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】前記増幅がＰＣＲにより実施される、請求項３０記載の方
法。
【請求項３２】前記工程ｃ）からｈ）のサイクルが繰り返される、請求項
３０記載の方法。
【請求項３３】工程ｄ）とｅ）との間に、ｉ）前記レプリカの核酸分子をインサイチオで増幅し、そしてｉｉ）前記レプリカを、前記増幅により生成した核酸分子の少なくとも１つのサ
ブセットが前記第２の支持体に移されるように、第２の支持体と接触させ、ｉｉｉ）前記核酸分子の末端を前記第２の支持体に共有結合的に付けて前記第１
の固定化された核酸アレイの第２のレプリカを形成し、ここで、核酸分子の前記
第２のレプリカ上の位置は、それらが増幅された元の前記レプリカの核酸分子の
位置に対応する、の工程をさらに含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】前記異なる核酸プールが、個々の生物の異なる組織から得
られたものである、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】前記異なる核酸プールが、１つの種の異なる個々の生物か
ら得られたものである、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】前記異なる核酸プールが、異なる種の生物から得られたも
のである、請求項３０記載の方法。
【請求項３７】核酸分子の前記第１のプールおよび第２のプールがライブ
ラリである、請求項３０記載の方法。