KR100235575B1 - Dna-결합 분자의 검출을 위한 스크리닝 분석 - Google Patents

Dna-결합 분자의 검출을 위한 스크리닝 분석 Download PDF

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신티아에이.에드워드
찰스알.칸토르
베드엠.앤드류스
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프랭크 쿵; 멜린다 그리피스, 데자딘스 캐서린 엠
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Abstract

본 발명은 특정한 DNA 시험 서열에 결합되는 능력에 대해 합성 화합물 또는 생물학적 화합물의 라이브러리를 스크리닝하는데 유용한 분석에 관한 것이다.
분석은 또한 특정한 DNA 서열에 대한 DNA-결합 분자의 상대적인 DNA-결합 친화도 및 서열 특이성을 결정하는데 유용하다.
분석은 경쟁 분석으로서, DNA 시험 서열에 대한 시험 분자의 결합은 그 결합 서열에 대한 DNA-결합 단백질의 결합 특성을 변화시킨다.
그러한 시험 분자가 시험 서열에 결합한 경우, DNA:단백질 복합체의 평형이 파괴도어, 미결합 DNA 및 DNA:단백질 복합체의 비율이 변화된다.
시험 서열을 한정된 단백질 결합 DNA 스크리닝 서열에 인접하여 위치시킴으로써 시험 서열이 시험되는 경우에 분석이 가능하다.

Description

[발명의 명칭]
DNA-결합 분자의 검출을 위한 스크리닝 분석
[도면의 간단한 설명]
제1a도는 스크리닝 서열에 결합하는 DNA-결합 단백질을 예시하는 도면이다. 제1b도 및 1c도는 입체 장애(1B) 또는 작은 분자에 의해 DNA에서 유도된 형태적(알로스테릭) 변화때문에 DNA-결합 단백질이 두가지 다른 기작을 통해 작은 분자에 의해 결합이 방해되거나 치환되는 방식을 예시하는 도면이다.
제2도는 DNA-결합 단백질이 그의 결합 위치에 결합하는 것을 선택적으로 방해하는 능력에 근거하여 억제성 분자를 검출하는 분석을 예시하는 도면이다. 억제제(X)의 존재하에서 단백질(0)은 DNA(/)로부터 치환된다. 두 선택적인 포획/검출 시스템인 미결합 DNA의 포획 및 검출 또는 DNA:단백질 결합체의 포획 및 검출이 예시되어 있다.
제3도는 단백질이 DNA에 결합되어 있는 경우, 스트랩타비딘에 의한 인식으로부터 올리고뉴클레오티드 서열에 공유결합한 비오틴 잔기를 보호할 수 있는 DNA-결합 단백질을 보여주는 도면이다.
제4a도는 본 발명의 분석에 이용하기 위한 전형적인 올리고뉴클레오티드 분자로의 비오틴 및 디곡시게닌(digoxigenin)의 삽입을 보여주는 도면이다. 올리고뉴클레오티드는 밑줄친 UL9 단백질의 결합 서열(즉, 스크리닝 서열) 및 스크리닝 서열의 옆에 위치하는 시험 서열을 포함한다.
제4b도는 디곡시게닌 또는32P로 말단-표지된 이중 스트랜 드올리고뉴클레오티드의 제조를 보여주는 도면이다.
제5도는 서열-특이성 작은 분자의 결합을 위해 본 발명의 분석에서 시험한 일련의 서열을 나타내는 도면이다.
제6도는 서열-특이성 DNA-결합 능력을 보유하는 UL9 단백질의 끝이 잘린 형태(UL9-COOH)의 발현 벡터내로의 클로닝을 나타내는 도면이다.
제7도는 전체길이의 UL9 단백질 코딩 서열을 포함하는 pVL1393 바큘로바이러스(baculovirus)벡터를 보여주는 도면이다.
제8도는 (i) 정제된 UL9-COOH/글루타티온-S-트랜스퍼라제 융합 단백질 및 (ii) UL9-COOH 폴리펩티드를 나타내는 SDS-폴리아크릴아미드 겔의 사진을 보여주는 도면이다.
도면에서 UL9-COOH 폴리펩티드를 화살표로 표시하였다.
제9도는 UL9-스크리닝 서열의 옆에 위치하는 시험 서열의 변화가 UL9-COOH 결합에 미치는 효과를 보여주는 도면이다. 데이타는 밴드 이동 겔에 나타나 있다.
제10a도는 다른 시험 서열을 이용하여 여러 농도의 디스타마이신(Distamycin) A를 DNA:단백질 분석 반응물에 첨가하는 것의 효과를 보여주는 도면이다.
제10b도는 다른 시험 서열을 이용하여 악티노마이신(Actinomycin) D를 DNA:단백질 분석 반응물에 첨가하는 것의 효과를 보여주는 도면이다.
제10c도는 다른 시험 서열을 이용하여 독소루비신(Doxorubicin)을 DNA:단백질 분석 반응물에 첨가하는 것의 효과를 보여주는 도면이다.
제11a도는 비오틴 및 스트렙타비딘 피복 자성 비드(bead)를 이용한 본 발명의 DNA 포획 시스템을 예시하는 도면이다. DNA의 존재는 화학발광 생성물을 산출하는 알칼리성-포스파타제 기질을 이용하여 탐지된다.
제11b도는 교대로 포획된 DNA에 결합하는, 스트렙타비딘에 결합된 비오틴 피복아가로스 비드를 이용하는 유사한 반응을 보여주는 도면이다.
제12도는 DNA:단백질-결합 데이타에 근거한 시험 매트릭스를 예시하는 도면이다.
제13도는 분석에서 정해진 세트의 정열된 시험 서열(n 염기를 갖는 스크리닝 서열로 n=4 이다)로 사용될 수 있는 모든 가능한 4 염기쌍 서열의 상부 스트랜드(5'-3')를 열거한 도면이다.
제14도는 서열 5'-GATC-3'과 동일한 염기 조성을 갖는 모든 가능한 4 염기쌍 서열의 상부 스트랜드(5'-3')를 열거한 도면이다.
제15도는 스크리닝 서열의 옆에 위치하는 시험 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 분자의 예를 보여주는 도면이다.
이 분자의 서열은 SEQ ID NO:18로 제시되어 있는 바, 제15도의 ＂X＂는 SEQ ID NO:18에서 N이다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 정해진 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 분자의 확인을 위한 방법, 시스템 및 키트(kit)에 관한 것이다.
[발명의 배경]
이중 스트랜드 DNA와 상호작용하는 여러 종류의 작은 분자가 확인되었다.
이들 작은 분자중에서 많은 것이 중요한 생물학적 효과를 갖는다. 예를 들면, 많은 아미노아크리딘 및 디환식의 탄화수소는 DNA에 결합하며 돌연변이유발성, 4 분체유발성 또는 발암성이다.
DNA에 결합하는 다른 작은 분자에는 악티노마이신 D, 에키노마이신(echinomycin), 디스타마이신, 및 칼리케아미신(calicheamicin)을 포함하여 일부가 항생제 또는 항종양제로 이용되는 생물학적 대사산물; 에티듐 및 아크리딘 오렌지 등의 평면 염료; 및 강력한 항종양제인 시스플라틴(cisplatin)등의 중금속 함유분자가 있다.
대부분의 공지된 DNA-결합 분자는 공지된 서열 결합 선택성을 가지지 않는다. 그러나 몇가지의 작은 DNA-결합 분자는 특정한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 결합하는데, 예를 들면 에키노마이신은 서열 [(A/T)CGT]/[ACG(A/T_]에 선택적으로 결합하고(Gilbert et al.); 시스플라틴은 두개의 인접한 데옥시구아노신의 N7 원자 사이의 백금 분자에 교차결합하고(Sherman et al.); 및 칼리케아미신은 서열 TCCT/AGGA에 선택적으로 결합하여 절단한다(Zein et al).
대부분의 치료를 위한 DNA-결합 분자에 의해 일어나는 생물학적 반응은 독성을 지니며, 이들 분자가 다른 세포보다 더욱 활성적으로 DNA를 복제하거나 또는 전사하는 세포에 선택적으로 영향을 미치는 경우에만 특이적이다.
표적화 특이성 위치는 단순히 DNA의 가능한 결합위치의 수를 감소시킴으로써 현저히 감소시킬 수 있다. 긴 서열에 대한 특이성이 얻어짐에 따라, DNA-결합에 의한 비특이적 독성 효과는 감소할 것이다.
생물학적 스크리닝의 치료활성에 근거하여 초기에 확인된 많은 치료용 DNA-결합 분자는 DNA에 결합하는 것으로 후에 밝혀졌다.
그러므로 DNA-결합 분자의 스크리닝에 유용한 생체외 분석이 요구되고 있다. 또한 그러한 분자의 서열 결합 선택성을 구별하는 분석도 요구되고 있다.
부가하여, 다른 DNA 서열에 대한 DNA-결합 분자의 상대적인 친화도를 구별하는 분석도 요구되고 있다. 마지막으로, 특정 DNA 서열에 결합하는 치료용 분자도 요구되고 있다.
[발명의 개요]
본 발명은 이중 스트랜드 DNA의 선택된 시험 서열에 결합할 수 있는 분자 또는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다.
방법은 스크리닝할 분자, 또는 그 분자를 함유하는 혼합물을 시험 시스템에 첨가하는 것을 포함한다. 시험 시스템은 결합서열에 인접한 서열 (이들 인접서열은 시험 서열로 언급되어 있다)에 선택적이고 본질적으로 독립적인 DNA 결합 단백질의 동족 결합 위치 등의 스크리닝 서열에 효과적으로 결합하는 DNA 결합 단백질을 포함한다.
그러나, DNA 결합 단백질은, 시험 서열이 스크리닝 서열에 인접해 있는 경우, 그러한 시험 서열에 대한 분자의 결합에 민감하다. 시험 시스템은 더나아가서 서로 인접한 스크리닝 및 시험 서열을 갖는 이중 스트랜드 DNA를 포함한다.
또한, 결합 단백질은 이중 스트랜드 DNA의 스크리닝 서열을 포화시킬 수 있는 양으로 존재한다. 시험 분자는 시험되는 분자가 이중 스트랜드 DNA의 시험 서열에 결합하기에 충분한 기간동안 시험 시스템과 접촉되어 배양된다.
이중 스트랜드 DNA에 결합된 결합 단백질의 양은 시험 분자 또는 혼합물의 첨가 전과 후에 비교된다.
서열/결합 단백질의 스크리닝용 후보물질은 다음 그룹으로부터 선택될 것이다 : EBV 복제 개시점/EBNA, HSV 복제 개시점/UL9, VZV 복제 개시점/UL9-유사물, HPV복제 개시점/E2, 인터루킨 2 인핸서/NFAT-1, HIV-LTR/NFAT-1, HTV-LTR/NFKB, HBV 인핸서/HNF-1, 피브리노겐 프로모터/HNF-1, 람다 oLoR/ c r o, 및 본질적인 다른 모든 DNA:단백질 상호작용물.
본 발명의 바람직한 구체예는 UL9 단백질, 또는 그것에서 유도한 DNA-결합 단백질, 및 그의 동족 결합 서열 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:17, 또는 SEQ ID NO:15를 이용한다.
시험 서열은 관심있는 서열의 결합체일 수 있다.
서열은 쇼트-건 어프로치 스크리닝(shot-gun approach screening)를 위해 무작위로 만들어질 수 있으며 또한 특정 서열이 선택될 수도 있다. 의학적으로 중요한 일부 특정 서열은 DNA:단백질 상호작용에 관련된 다음 서열을 포함한다 : EVB 복제 개시점, HSV 복제 개시점, VZV 복제 개시점, HPV 복제 개시점, 인터루킨2 인핸서, HIV-LTR, HBV 인핸서, 및 피브리노겐 프로모터. 더욱이, 주어진 길이의 모든 가능한 서열로 이뤄진 한 세트의 분석 시험 서열이 시험될 수 있다. (예컨대, 모든 4 염기쌍 서열).
위의 방법에서, 자유 DNA에 대한 단백질-결합 DNA의 비교는 모든 검출방법, 바람직하게, 겔 밴드-이동 분석, 필터-결합 분석, 또는 포획/검출 분석을 이용하여 달성될 수 있다.
단백질에 결합되지 않은 DNA가 포획을 DNA 포획/검출 분석의 한가지 구체예에서, 포획 시스템은 (i) 스크리닝 서열에 결합할 수 있는 단백질의 능력을 제거하지 않고, (ii) 스트렙타비딘에 결합할 수 있고, 및 (iii) 단백질이 스크리닝 서열에 결합되어 있는 경우, 비오틴 잔기가 스트렙타비딘과의 상호작용으로부터 보호되는 스크리닝 서열내의 뉴클레오티드의 비오티닐화를 포함한다.
DNA 포획/ 검출 분석의 다른 한가지 구체예에서, DNA:단백질 복합체가 포획되는 포획 시스템은 단백질-결합 DNA는 포획하는 반면에 비-단백질-결합 DNA는 필터를 통과시키는 저염 조건하에서 니트로셀룰로스 필터를 이용하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 이중스트랜드 DNA 서열의 시험 서열에 결합할 수 있는 분자를 확인하는 스크리닝 시스템을 포함한다.
시스템은 스크리닝 서열에 인접한 시험 서열과 본질적으로 무관한 결합 친화도로 이중스트랜드 DNA의 스크리닝 서열에 효과적으로 결합하는 DNA 결합 단백질을 포함한다. 그러나 DNA 단백질의 결합은 시험 서열이 스크리닝 서열에 인접한 경우 시험 서열에 대한 분자의 결합에 민감하다.
시스템은 서로 인접한 스크리닝 및 시험 서열을 갖는 이중스트랜드 DNA를 포함한다. 전형적으로, 결합 단백질은 이중스트랜드 DNA의 스크리닝 서열을 포화시키는 양으로 존재한다.
시스템은 또한 DNA에 결합한 결합 단백질의 양측 측정하는 수단을 포함한다.
상기한 바와 같이 시험 서열은 모든 수의 관심있는 서열인 것이다.
스크리닝 서열/결합 단백질은 본 명세서의 기준 및 지침을 이용하여 공지된 DNA:단백질 상호작용으로부터 선택될 수 있다.
그것은 또한 후에 발견되는 DNA:단백질 상호작용에 적용될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 시스템의 바람직한 구체예는 UL9 단백질, 또는 그것에서 유도된 DNA-결합 단백질(예컨대, UL9-COOH로 명명된 끝이 잘린 UL9 단백질)을 포함한다.
이 구체예에서 이중스트랜드 DNA는 (i) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:17 및 SEQ ID NO:15로 이루어진 그룹에서 선택되는 스크리닝 서열, 및 (ii) 스크리닝 서열에 인접한 시험 서열을 가지며, UL9는 스크리닝 서열을 포화시킬 수 있는 양으로 존재한다.
게다가 시스템은 밴드-이동 분석, 필터-결합 분석, 및 포획/검출 분석을 포함하여, DNA에 결합한 UL9의 양을 측정하는 수단을 포함한다.
본 명세서에는 본 발명의 스크리닝 분석의 이용에 대해 DNA:단백질 상호작용의 안정성을 시험하는데 필요한 방법이 개시되어 있다.
본 발명은 더나아가서 DNA 포획 시스템 및 검출 시스템에 대해서 명시하고 있다. 몇가지 방법이 기재되어 있다.
필터 결합 분석은 DNA:단백질 복합체를 포획하는데 이용되거나, 또는 선택적으로 단백질에 결합되지 않는 DNA는 하기 방법으로 포획될 수 있다.
이 시스템의 제1부분에서, DNA-결합 단백질의 동족 DNA 결합 부위는 검출 잔기, 예컨대 비오틴 또는 디곡시게닌으로 변형된다.
변형은 다음와 같은 방식으로 그 부위에서 이뤄진다 : (i) 동족결합서열에 결합하는 단백질의 능력을 제거하지 않고, (ii) 잔기는 단백질에 결합하지 않은 DNA의 포획제(capturing agent)(예를 들어, 비오틴의 경우는 스트렙타비딘)에 근접해 있으며, (iii) 잔기는 단백질이 스크리닝 서열에 결합한 경우 포획제와의 상호작용으로부터 보호된다.
이 시스템의 제2부분에서, 표적 올리고뉴클레오티드는 검출이 가능하도록 표지된다. 표적 올리고뉴클레오티드의 표지는 방사성표지 등의 표준기법을 이용하여 수행할 수 있다. 선택적으로 디곡시게닌등의 잔기는 표적 올리고뉴클레오티드에 삽입되고, 이어서 이 잔기는 포획후에 검출될 수 있다.
본 명세서에 기재된 포획/검출 시스템의 3가지 구체예는 다음과 같다 :
(i) 표적 올리고뉴클레오티드 (예를 들어 스크리닝 및 시험 서열 포함)-- 비오틴을 이용한 동족 결합부위의 변형 및 디곡시게닌 또는 방사능(예컨대35S 또는32P)의 삽입: 교체 지지체에 결합한 스트렙타비딘을 이용한 표적 올리고뉴클레오티드의 포획; 및 표지달린 항-디곡시게닌 항체 또는 방사능 측정법(예컨대 자동방사선사진법, 신틸레이션 플루오르(scintilation fiuor)에서의 카운팅(counting), 또는 포스포이미저(phosphoimager)를 이용)을 이용한 표적올리고뉴클레오티드의 검출.
(ii) 표적 올리고뉴클레오티드 -- 디곡시게논을 이용한 동족 결합부위의 변형 및 비오틴 또는 방사능의 삽입; 고체 지지체에 결합한 항-디곡시게닌 항체를 이용한 표적 올리고뉴클레오티드의 포획; 및 표지달린 스트랩타비딘 또는 방사능 측정법을 이용한 표적 올리고뉴클레오티드의 검출.
(iii) 단백질: DNA 복합체는 니트로셀룰로스에 유지되는 반면에 비-단백질 결합 DNA는 니트로셀룰로스를 통과하는 조건하에서 분석 혼합물을 니트롤셀룰로스 필터를 통과시켜 단백질에 결합하지 않은 표적 올리고뉴클레오티드로부터 단백질에 결합한 표적 올리고뉴클레오티드의 분리;방사능, 표지달린 항-디곡시게닌; 디곡시게닌 상호작용, 또는 표지달린 스트렙타비딘: 비오틴 상호작용을 이용한 표적 올리고뉴클레오티드의 검출.
[발명의 상세한 설명]
[정의]
인접한은 두인접 DNA 부위사이의 지지관계를 기술하는데 이용된다.
인접한 부위는 20 또는 그 이하의 bp 떨어진, 또는 좀더 바람직하게, 10 또는 그 이하의 bp 떨어진, 또는 훨씬 더 바람직하게, 5 또는 그 이하의 bp 떨어진, 또는 가장 바람직하게 서로 직접 인접되어 있는 것을 나타낸다.
＂옆에 위치한＂은 인접한의 동의어이다.
결합한 DNA는, 본 명세서에서, 분석에 사용된 단백질, 예컨대 본 명세서의 실시예에 있는 UL9 단백질이 결합한 DNA를 가리킨다.
해리는 두 분자가 상호작용을 중지하는 과정이다: 그 과정은 특이한 물리적 조건하에서 정해진 평균속도로 일어난다.
기능적 결합은 단백질 또는 작은 분자와 DNA 분자의 비공유 결합이다.
본 발명의 분석에서, 단백질의 스크리닝 서열(예컨대, 동족 DNA 결합 부위)에 대한 기능적 결합은 필터 결합 또는 겔 밴드-이동 실험을 이용하여 평가되고 있다.
이형분자는 적어도 다른 2가지 종류의 분자로 이뤄진 분자이다: 예를 들어, 적어도 2가지의 작은유기성 DNA-결합분자 (예컨대, 디스타마이신, 악티노마이신 D, 또는 아크리딘)간의 공유결합 또는 그러한 DNA-결합 분자(들)의 DNA-결합 중합체(예컨대 디옥시올리고뉴클레오티드)에 대한 공유 결합.
온-레이터(On-rate)는 본 명세서에서 두 분자가 정상상태의 결합체(예를 들면 DNA:단백질 결합체)에 도달하는데 필요한 시간으로 정의되어 있다.
오프-레이트(off-rate)는 본 명세서에서 결합된 복합체, 예컨대 DNA:단백질 복합체의 절반이 헤리하는데 필요한 시간으로 정의되어 있다.
서열-특이성 결합은 강한 DNA 서열 결합 선택성을 가지는 DNA 결합 분자를 가리킨다. 예를 들면, 제한효소 및 표I에 열거된 단백질은 전형적인 서열-특이성 DNA-결합을 예시하고 있다.
서열-선택성 결합은 일반적으로 DNA에 결합하나, 다른 DNA 서열에 대해 일부 DNA 서열에 선택적으로 결합하는 DNA 결합 분자를 가리킨다. 서열-선택성 결합은 본 명세서중의 시험된 몇가지 작은 분자, 예컨대 디스타마이신 등에 의해 유형화된다.
서열-선택성 및 서열 특이성-결합은 제12도에 나타낸 바와 같이 시험 매트릭스를 이용하여 평가할 수 있다. 주어진 DNA-결합 분자에 대해, 비-서열-특이성(선택성의 검출이 불가능함) 내지 서열 선택성 내지 완전한 서열 특이성(예컨대, 많은 제한 엔도뉴클레아제의 경우에서와 같이, 모든 가능한 서열중에서 오직 하나인 서열만 인식) 범위의 다른 DNA 서열에 대해 다른 친화도의 스팩트럼이 존재한다.
스크리닝 서열은 DNA 결합 단백질에 대한 동족 결발 부위를 한정하는 DNA 서열이다: UL9의 경우, 스크리닝 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO:1이다.
작은 분자는 약제 운반과 관련된 몇가지 이유에서 치료법으로 바람직하다:(i)
그것들은 일반적으로 10 K 분자량보다 작다; (ii) 그것들은 세포에 대해 투과성이다;
(iii) 팹티드 또는 올리고뉴클레오티드와 달리, 그것들은 많은 세포 기작에 의한 분해의 영향을 덜 받는다; 및 (iv) 그것들은 면역반응을 일으키지 않는다.
많은 제약회사는 본 발명의 분석으로 스크리닝하기에 바람직한 화학적 및/ 또는 생물학적 혼합물, 대개 균류, 박테리아, 또는 조류 추출물의 광범위한 라이브러리를 갖고 있다. 작은 분자는 생물학적 또는 합성 유기화합물이거나, 또는 무기 화합물 (예컨대 시스플라틴(cisplatin)일 수 있다.
시험 서열은 스크리닝 서열에 인접한 DNA 서열이다.
본 발명의 분석은 시험 서열에 결합한 DNA-결합 단백질과 그것의 동족 결합 부위(예컨대, 스크리닝 서열)에 영향을 미치는 분자를 스크리닝한다.
시험 서열은 스크리닝 서열의 한쪽 또는 양쪽 발단에 인접하여 위치할 수 있다. 전형적으로 시험 서열에 대한 분자의 결합은 DNA-결합 단백질의 스크리닝 서열에 결합하는 것을 방해한다. 그러나 이들 서열에 결합하는 일부 분자는 역효과를 가지고 있어, 스크리닝 서열에 대한 DNA-결합 단백질의 결합 친화도를 증가시킨다. 일부 분자는 서열 특이성 또는 서열 선택성 방식으로 결합하지만 분석에는 영향을 미치지 않는다.
미결합 DNA(Unbound DNA)는 본 명세서에서 분석에 사용된 단백질(예컨대, 본 명세서 실시예중의 UL9 단백질)이 결합하지 않은 DNA를 가리킨다.
[분석]
본 발명의 한가지 특징은 의학적으로 중요한 DNA 표적 부위에 서열-특이성 방식으로 결합할 수 있는 작은 분자를 확인하는 분석을 제공하는 것이다.
분석은 특정한 DNA 기능, 예컨대 중요한 DNA:단백질 상호작용을 방해함으로써 효력을 나타내는 새로운 제약 분야의 발생을 촉진한다.
DNA-결합 분자를 검출하고 서열 특이성 친화도를 결정하는, 민감하고 잘 조절된 분석이 개발되었다. 분석은 큰 생물학적 또는 화학적 라이브러리를 스크리닝하는데 이용될 수 있다; 예컨대, 분석은 발효액 또는 각종 미생물으로부터 추출물에 존재하는 서열-특이성 DNA-결합 분자를 검출하는데 이용될 것이다.
더나아가서, 분석의 다른 이용은 서열 특이성 및 다른 DNA 서열에 대한 공지된 DNA-결합 약제 (및 다른 DNA-결합 분자)의 상대적인 친화도를 결정하는 것이다.
항암 치료법에 주로 사용되는 약제는 전적으로 여러 의약 분야에서 약제가 치료제 또는 치료제 전구체의 후보물로 사용가능한, 이전에 미확인된 활성을 가질 것이다.
스크리닝 분석은 기본적으로 각종 시험 부위를 통해 한쪽 또는 양쪽면에 위치한 DNA-결합 단백질을 인식하는 서열을 포함하는 짧은, 합성된 이중스트랜드 올리고뉴클레오티드에 대한 결합에 대해 DNA-결합 단백질과 경쟁하는 분자의 능력을 시험하도록 계획된 경쟁 분석이다. 각종 시험 부위는 DNA-결합 분자에 대한 적절한 인식 서열을 제공하는 어떤 DNA 서열을 포함할 것이다.
시험 부위에 결합하는 분자는 용이하게 검출할 수 있는 방식으로 단백질의 결합 특성을 변화시킨다; 그러한 분자가 단백질의 결합 특성을 변화시킬 수 있는 범위는 DNA 시험 부위에 대한 시험 분자의 친화도에 직접적으로 비례한다.
시험 서열에 존재하는 친화도는 각 올리고뉴클레오티드에 있어서의 DNA:단백질 상호 작용에 대한 그 효과를 조사함으로써 결정된다.
DNA-결합 분자에 대해 높은 친화도를 갖는 DNA 결합 부위의 결정은 약제 개발을 위한 특정 표적 서열의 확인을 가능하게 한다.
[일반적인 고려사항]
본 발명의 분석은 용액에서 특정한 DNA 분자의 하나의 단백질 분자로부터 다른 하나의 동일한 단백질로의 이동속도에 영향을 미치는 시험 분자 또는 화합물을 검출하기 위해 고안되었다.
DNA 및 단백질의 혼합물은 용액에서 제조된다. 단백질의 농도는 DNA의 농도보다 높아서 실제적으로 모든 DNA는 DNA:단백질 복합체로 발견된다.
DNA는 특정한 DNA-결합 단백질에 대한 인식서열(예컨대, 스크리닝 서열)을 포함하는 이중스트랜드 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 분석에 사용되는 단백질은 올리고뉴클레오티드내의 서열에 특이적으로 결합되는 DNA-결합 도메인(domain)을 포함한다.
용액의 물리적 조건 (예컨대, pH, 염농도, 온도)은 복합체의 반감기가 분석의 수행에 알맞게(5 내지 30분의 반감기가 가장 적당함), 바람직하게는 정상적인 생리조건에 일치하도록 조절된다. 하나의 DNA:단백질 복합체가 해리됨에 따라, 방출된 DNA는 재빨리 용액내의 다른 단백질과 복합체를 형성한다.
단백질은 DNA에 비해 과량으로 존재하기 때문에 한 복합체의 해리는 항상 DNA의 다른 DNA:단백질 복합체로의 빠른 재결합을 야기시킨다.
평형에서는, 아주 소수의 DNA 분자만이 미결합 상태로 존재할 것이다.
분석의 최소 바탕은 주어진 측정시간동안에 측정되는 미결합 DNA의 양이다.
짧은 측정기간 및 검출 시스템의 민감성은 바탕 DNA의 하한을 한정한다.
제1도는 그러한 단백질이 어떻게 그의 동족 결합 부위로부터 치환되는지 또는 단백질이 어떻게 그의 동족 결합 부위에 결합하는 것이 방해되는지, 또는 DNA:단백질 상호작용의 동역학이 어떻게 변하는지를 예시하고 있다.
선택적으로, 분자는 DNA의 형태 변화는 유도하여 DNA:단백질 결합 상호작용을 방해한다. 각 경우에 있어서, 올리고뉴클레오티드에 결합하는 시험분자가 단백질의 결합을 방해할 경우, 한 단백질으로부터 다른 단백질로의 DNA의 이동속도는 감소할 것이다.
이것은 미결합 DNA 양의 실질적인 증가를 야기시킨다.
바꾸어말하면, 미결합 DNA 양의 증가 또는 미결합 DNA 양의 감소는 억제제가 존재함을 가리킨다.
선택적으로, 분자는 분리될 수 있고, DNA에 결합되어 있는 경우 DNA-결합 단백질의 그 동족 부위에 대한 친화도를 증가시킨다.
이 경우, 미결합 DNA 양(분자의 첨가후 주어진 측정시간동안 측정)은 섹션 II에 기재된 포획/검출 시스템으로 검출되는 바와 같이 반응 혼합물에서 감소할 것이다.
[기타 방법]
주어진 DNA-결합 단백질과 그의 결합 서열(동족 부위)의 상호작용을 특이적으로 억제하는 작은 분자를 조사하는데 이용되는 몇가지 방법이 있다.
한가지 방법은 하나의 특정한 DNA:단백질 상호작용의 결합을 선택적으로 방해하나 다른 것은 방해하지 않는 능력에 대해 생물학적 또는 화학적 화학물을 시험하는 것이다.
그러한 분석은 일반적인 DNA-결합 분자(헤파린 등의 다가양이온 또는 에티듐 등의 삽입제(intercalatng agent) 및 한 시스템에서는 단백질/동족 결합 부위에는 영향을 미치나 다른 것에는 영향을 미치지 않는 서열 결합 선택성을 갖는 DNA-결합 분자간의 구별을 위한 대조표준을 확립하기 위해 적어도 2가지, 바람직하게는 3가지의 DNA:단백질 상호작용 시스템의 개발에 의존할 것이다.
이러한 시스템이 이용되는 한가지 예시는 다음과 같다. 각 동족 부위는 5'에 리포터(reporter) 유전자 (β-갈락토시드 또는 루시퍼라제(luciferase)를 암호화한 유전자 따위)가 위치하므로 단백질의 동족 부위에 대한 그러한 결합은 리포터 유전자의 전사를 증가시킬 것이다. DNA:단백질 상호작용을 방해하는 서열-특이성 DNA-결합 약제의 존재는 리포터 유전자 발현의 증가를 감소시킬 것이다.
몇가지 DNA 인핸서(enhancer)는 리포터 유전자에 결합되어, 각 구조는 작은 DNA-결합 시험 분자의 존재 또는 부재시에 다른 하나에 비교된다.
다수의 단백질/동족 결합 부위가 스크리닝에 이용되는 경우, 하나의 상호작용은 방해하나 다른 것은 방해하지 않는 경쟁적 억제제는 트랜스펙션된 세포주에서 또는 생체외 분석에서 리포터 유전자의 전사의 결여에 의해 확인될 것이다.
관련 단백질의 특이한, 단지 하나의 그러한 DNA-결합 서열은 각 분석 시스템으로 스크리닝될 것이다.
이 방법은 제한된 시험 능력을 포함하여 많은 제한 및 관련된 각 다른 단백질/동족 부위에 대한 적절한 리포터 시스템을 제조해야하는 필요성을 지닌다.
[적절한 DNA-결합 단백질의 선택 및 시험]
본 발명에 따라 수행된 시험은 서열-선택성 DNA-결합을 가지는 분자를 확인하는 제2 방법을 한정하였다.
이 방법에서, 동족 결합 서열에 인접한 서열에 결합하는 작은 분자는 단백질/동족 DNA 상호작용을 억제할 수 있다. 이 분석은 어떤 서열을 실질적으로 인식하는 서열-특이성 또는 서열-선택성 DNA 결합 분자를 스크리닝하기 위해 하나의 DNA: 단백질 상호작용을 이용하기 위해 고안한 것이다.
DNAase I 보호(Galas et al.) 또는 메틸화 방해(Siebenlist et al.)에 의해 연구된 바와 같이, DNA-결합 인식 서열은 대개 매우 작지만(4-17bp), 결합 단백질에 의해 보호되는 서열은 보다 크다(대개 인식서열의 각 측면에서 5bp 또는 그 이상).
본 발명에 따라 수행된 실험은 하나의 단백질 및 그 동족 DNA-결합 서열이 동족 부위에 인접한 관련서열의 대체를 통해 어떤 DNA 서열을 실질적으로 분석하는데 이용될 수 있음을 실증하였다: 인접한 부위에 결합한 작은 분자는 그의 동족 부위에 결합하는 단백질의 결합 특성을 변화시켜서 검출할 수 있다. 그러한 변화는 단백질의 해리를 일으키는 입체장애, 또는 동족 부위에 대한 단백질의 결합을 증가시키거나 감소시키는, 단백질에 대한 인식 서열의 유도된 형태 변화를 통해 일어난다.
1) 적절한 DNA-결합 단백질의 선택 기준.
다음을 포함하여 본 발명의 분석에 이용되는 DNA:단백질 복합체의 선택에는 몇가지 고려사항이 있다:
a) 오프-레이트(＂정의＂ 참조)는 적합한 시간에 분석을 수행하도록 충분히 빨라야 한다.
일부 단백질과 DNA에 존재하는 동족 부위의 상호작용은 분이 아닌 일로 측정될 것이다: 그와 같이 강하게 결합된 복합체는 분석을 수행하는데 걸리는 시간을 불편하게 늘린다.
b) 오프-레이트는 적절한 시간에 미결합 DNA의 측정이 가능하도록 충분히 느려야 한다. 예를 들면, 자유 DNA의 수준은 자유 DNA를 측정하는데 필요한 시간 및 측정시간동안 오프-레이트에 기인하여 자연적으로 나타나는 자유 DNA 양 사이의 비로 나타내어진다.
상기의 두가지 고려사항에 있어서, 실제적으로 유용한 DNA:단백질 오프-레이트는 약 2분 내지 몇일의 범위에 속하지만, 보다 짧은 오프-레이트가 보다 빠른 장치에 의해 수용되고, 보다 긴 오프-레이트가 분석에 대한 결합 조건의 불안정화에 의해 수용될 수 있다.
(c) 다른 한가지 고려사항은 DNA:단백질 복합체의 동력학적 상호작용이 인식 서열의 옆에 위치한 뉴클레오티드 서열에 상대적으로 무감각하다는 것이다. 많은 DNA-결합 단백질의 친화도는 인식서열에 인접한 서열의 차이에 의해 영향을 받는다.
이러한 현상의 가장 분명한 예는 선택적 결합 및 옆에 위치한 다른 서열을 지닌 몇개의 동일한 인식서열의 선택을 위한 제한 효소의 절단이다(Polinsky et al.).
만일 오프-레이트가 측면 서열에 의해 영향을 받는 경우, 각 측면 올리고뉴클레오티드 서열간의 비교 결합 데이타의 분석은 가능하다.
2) 분석에 이용되는 DNA:단백질 상호작용의 시험.
본 발명에 따라 수행된 실험을 통해 상기 분석에 특히 유용한 DNA:단백질 상호 작용을 확인하였다: 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) UL9 단백질은 HSV 복제 개시점(oriS)에 결합한다. UL9 단백질은 매우 엄격한 서열 특이성을 지닌다.
oriS에는 UL9에 대한 3개의 결합부위, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:17이 있다.
(Elias,P.et al.,Stow et al.). 하나의 서열(SEQ ID NO:1)은 제2 서열(SEQ ID NO:2)보다 적어도 10배 높은 친화도로 결합한다:아래에 기재된 구체예는 보다 높은 친화도 결합 부위(SEQ ID NO:1)를 이용한다.
DNA:단백질 결합 반응은 용액에서 수행된다.
DNA:단백질 복합체는 여러 방법중의 한가지 방법으로 자유 DNA에서 분리될 수 있다. DNA:단백질 상호작용의 초기 연구에 특히 유용한 한가지 방법은 밴드 이동 겔을 이용하여 결합 결과를 시각화하는 것이다(실시예 3A).
이 방법에서, DNA:단백질 결합 반응은 폴리아크릴아미드/TBE 겔에 적용되며 표지된 복합체 및 표지된 자유 DNA는 전기이동을 통해 분리된다.
이들 겔은 고정되고, 건조되고, 및 X-선 필름에 노출된다.
얻어진 자동방사선 사진에서 DNA:단백질 복합체로부터 독립적으로 이동한 자유 프로브의 양을 조사하였다. 이들 분석은 (i) 단지 표지된 자유 프로브만 포함하는 레인(lane), 및 (ii) 과량의 결합 단백질의 존재시에 샘플이 포지된 프로브인 레인을 포함한다.
밴드 이동 분석은 DNA:단백질 복합체 및 자유 프로브간의 비를 시각화하는 것을 가능하게 한다.
그러나, 겔의 로딩(loading) 및 성분의 전기이동분리 사이의 지체시간때문에 속도-결정실험용 필터 결합 분석보다 정확하지 않다.
필터 결합 방법은 단백질:올리고뉴클레오티드 복합체에 대한 오프-레이트의 결정에 특히 유용하다(실시예 3B). 필터 결합 분석에서, DNA:단백질 결합체는 필터에 잔류하는 반면에 자유 DNA는 필터를 통과한다.
이 분석 방법은 자유 프로브로부터 DNA:단백질 복합체의 분리가 매우 빠르므로 오프-레이트 결정에 대해 보다 정확하다. 필터 결합의 단점은 DNA:단백질 복합체의 특성이 직접 시각화되지 않는 것이다. 그래서 만약, 예를 들어, 경쟁 분자도 DNA 분자의 결합 부위에 대해 경쟁하는 단백질인 경우, 필터 결합 분석은 두 단백질의 결합을 구별할 수 없으며 하나 또는 두 단백질이 결합하는지에 대한 정보를 제공하지 못한다.
(i) 표1에 열거된 DNA 단백질 상호작용. (ii) 박테리아, 효모, 및 파지 시스템 예컨대 람다 oL- oR/ c r o, 및 (iii) 변형된 제한 효소 시스템(예컨대 2가 양이온의 부재시 단백질 결합)을 포함하여 본 발명의 실시에 유용한 많은 공지된 DNA:단백질 상호작용이 있다. 특정 인식서열에 결합하는 모든 단백질이 본 발명에 유용하다.
한가지 불가피한 인자는 그 인식 서열에 대한 단백질의 친화도에 관한 바로 인접한 서열(시험 서열)의 영향이다.
동족 부위에 대한 단백질의 친화도에 영향을 미치지 않는 DNA:단백질 상호작용이 가재된 분석에 유용하다;그러나, 다른 결합을 나타내는 (시험 서열-의존성) DNA:단백질 상호작용은 알고리듬이 다른 친화도를 보상하는 경우에도 유용할 것이다.
간단히 말하자면, 보다 짧은 인식 서열과 단백질에 대한 결합의 동력학은 측면 서열 효과로부터 변화를 받기 쉬운 반면에 보다 긴 인식 서열과 단백질에 대한 결합의 동력학은 측면 서열 조성에 영향을 받지 않는다.
본 발명은 스크리닝 분석에 있어서 UL9 oriS 결합 부위 상호작용 이외의 DNA:단백질 상호작용의 유용성을 시험하기 위한 방법 및 지침을 제공한다.
[완전한 길이의 UL9 및 UL9-COOH 폴리펩티드의 제조]
UL9 단백질은 많은 재조합 기술로 제조되어 왔다(실시예 2).
완전한 길이의 UL9 단백질은 바큘로바이러스(baculovirus)로 감염된 곤충 배양물으로부터 제조되어 왔다(실시예 3A, B, 및 C).
더욱이, DNA-결합 도메인(UL9-COOH)을 포함하는 UL9 단백질의 일부는 박테리아 발현백터에 클로닝되어 박테리아 세포에 의해 생산된다(실시예 3D 및 E). UL9의 DNA-결합 도메인은 단백질의 C-말단 317 아미노산내에 포함되어 있다(Weir et al.).
UL9-COOH 폴리펩티드는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(gst) 단백질과 함께 발현 벡터에 삽입된다.
gst/UL9 융합 단백질은 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제되었다(실시예 3E).
백터는 또한 두 폴리펩티드의 접합부에 트롬빈 절단 부위를 포함하였다.
그러므로, 일단 융합 단백질이 분리되면(제8도,레인2)트롬빈으로 처리되어 UL9-COOH/get 융합 단백질이 get 폴리펩티드로부터 절단된다(제8도,레인3).
쿠마이시(Coomaisie) 염색으로 결정한 결과 UL9-COOH-set 융합 단백질은 95% 이상의 단백질 순도로 얻어졌다.
다른 혼성 단백질이 관련된 DNA-결합 단백질의 제조에 이용될 수 있다.
예를 들어 DNA-결합 단백질 코딩 서열을 트롬빈 부위 암호화 서열과 융합시키는 것 및 β-갈락토시드 코딩 서열과 유합시키는 것이 있다.
그러한 혼성 단백질은 친화 또는 면역친화 컬럼으로 분리될 수 있다(Maniatis et al.; Pierce, Rockford IL).
더욱이, DNA-결합 단백질은 그들의 동족 DNA 결합 부위와 상호작용하는 능력에 근거한 친화 크로마토크래피로 분리될 수 있다. 예를 들어, UL9-DNA-단백질 부위(SEQ ID NO:1)를 고체 지지체(예컨대, CnBr-활성화 세파로스 4B 비드, Pharmacia, Piscataway NJ)에 공유 결합시키고, 추출물을 지지체를 통과시킨 후, 지지체를 세척하고, 염 구배를 이용하여 DNA-결합을 지지체에서 분리될 수 있다(Kadonaga).
선택적으로, 이 분석에 이용할 DNA-결합 단백질을 적절한 수준으로 발현시키기 위해 박테리아, 효모, 곤충세포 또는 포유동물 세포의 다른 발현 시스템을 이용할 수 있다.
끝이 잘린 UL9 단백질의 DNA-결합 능력에 대해 하기에 제시된 결과는 완전한 길이의 DNA-결합 단백질은 본 발명의 DNA:단백질 분석에 필요하지 않으며, 단지 동족 부위 인식기능을 포함하는 단백질의 일부만이 필요함을 시사한다.
DNA-결합에 요구되는 DNA-결합 단백질의 부분은 기능적 결합 분석(실시예 4A)을 이용하여 결정될 수 있다(실시예 4A).
해리속도를 결정하여 완전한 길이의 DNA-결합 단백질의 속도와 비교할 수 있다.
그러나 끝이 잘린 또는 완전한 길이의 DNA-결합 팹티드는 I.C.I, ＂적절한 DNA-결합 단백질의 선택 기준＂에 일부 언급된 기준을 만족하는 경우 분석에 이용될 수 있다. 이것은 DNA-결합 단백질의 끝이 잘린 형태가 완전한 길이의 DNA-결합 단백질과 동일한 친화도를 지니거나 지니지 않거나에 관계없이 들어맞는다.
[기능적 결합 및 헤리 속도]
완전한 길이의 UL9 및 정제된 UL9-COOH 단백질을 ＂밴드 이동＂ 분석 (실시예 4A 참조) 으로 기능적 활성에 대해 시험하였다. UL9-COOH 폴리펩티드를 이용하여 DNA-단백질-결합에 대한 완충액 조건은 최적화하였다(실시예 4C).
이들 DNA-결합 조건은 또한 완전한 길이의 UL9 단백질에도 적합하다.
11bp UL9 DNA-결합 인식 서열(SEQ ID NO:1)을 포함하는 방사성표지 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO:14)는 적절한 결합 완충액에서 각각의 UL9 단백질과 혼합되었다.
반응물은 실온에서 10분간 배양되고(결합은 2분 이내에 일어난다) 생성물은 비-변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기이동으로 분리되었다. (실시예 4A).
DNA:단백질-결합 정도는 DNA:단백질 복합체에 존재하는 표지된 프로브 대 자유 프로브로 존재하는 것의 비로부터 결정될 수 있다. 이 비는 전형적으로 자동방사선 사진의 광학 스캐닝 및 밴드 강도의 비교를 통해 결정되었다.
다른 표준방법, 예컨대 절단된 밴드의 신틸레이션 계수가 이 결정에 이용될 수 있다.
각각의 완충액 조건에서, UL9-COOH 폴리펩티드 및 완전한 길이의 UL9 폴리펩티드는 표적 올리고뉴클레오티드에 동일하게 잘 결합하였다.
해리 속도는 경쟁 분석을 이용하여 결정되었다.
UL9 결합 부위를 포함하는 과량의 올리고뉴클레오티드가 각 반응에 첨가되었다.
이 미표지된 올라고뉴클레오티드는 특정한 억제제로 작용하여 표지된 올리고뉴클레오티드로부터 해리되는 UL9 단백질을 포획한다(실시예 4B). 밴드-이동 분석으로 결정된, 완전한 길이의 UL9 및 UL9-COOH의 해리 속도는 4℃에서 약 4시간 또는 실온에서 약 10분이었다. 비-특이성 올리고뉴클레오티드(10,000-배 과량)과 절단된 청어 정자 DNA(100,000-배 과량)는 UL9 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 결합에 대해 경쟁하지 않았다.
[oriS 측면 서열 변화]
위에 언급된 바와 같이, 본 발명의 분석에 사용되는 DNA:단백질-결합 시스템의 한가지 특징은 DNA:단백질 상호작용이 DNA-결합 부위에 인접한 부분의 뉴클레오티드 서열에 의해 영향을 받지 않는다는 것이다.
어떤 DNA:단백질-결합 반응의 측면 서열의 조성에 대한 민감도는 위에 기재된 기능적 결합 분석 및 해리 분석으로 결정될 수 있다. oriS SEQ ID NO:1 서열에 결합하는 UL9에 대한 측면 서열 변화의 효과를 시험하기 위애, 올리고뉴클레오티드는 UL9 결합 부위의 5' 및 3' 측면에 위치한 20 내지 30의 다른 서열 (예컨대 시험 서열)로 만들어졌다.
게다가, 올리고뉴클레오티드는 UL9 결합 부위내의 몇개 위치에서 점돌연변이를 지닌체로 제조된다.
결합 부위내의 점돌연변이는 인식을 못하게 한다. 몇가지 변화는 인식을 파괴하지 않으며, 이들은 3가지 결합 부위(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:17)간의 다른 위치에서의 변화를 포함한다:제2 UL9 결합 부위(SEQ ID NO:2)는 제1서열에 비해 10배 감소한 UL9:DNA 결합 친화도(Elias et al.)를 나타낸다.
반면에 스크리닝 부위(제5도, 실시예 5)에 인접한, 시험 부위(시험 서열이라고도 불림)에서의 서열 변화하는 결합 또는 해리속도에 실질적으로 영향을 미치지 않는다.
스크리닝 부위의 측면에 위치한, 시험 부위의 뉴클레오티드 서열이 시험한 모든 올리고뉴클레오티드의 UL9 결합의 동력학에 영향을 미치지 않았음을 실증하는 결과는 중요한 결과다. 이것은 다른 시험 서열을 포함하는 DNA-결합 분자의 효과를 직접적으로 비교하는 것을 가능하게 한다.
시험 올리고뉴클레오티드간의 유일한 차이는 시험 부위에 위치한 뉴클레오티드 서열의 차이이고, 시험 부위에 위치한 뉴클레오티드 서열은 UL9 결합에 영향을 미치지 않으므로 DNA-결합 분자에 대한 반응에서 두 시험 올리고뉴클레오티드간에 관찰된 어떤 다른 효과는 오로지 DNA-결합 분자와 시험 서열의 특이한 상호작용에 기인한다.
UL9 결합 부위의 측면에 위치한 시험 서열에 대한 UL9의 무감각성은 이러한 방식으로 결과의 상호작용을 크게 촉진한다.
각 시험 올리고뉴클레오티드는 다른 모든 시험 올리고뉴클레오티드에 대해 대조표준 샘플로 작용한다.
이것은 특히 배열된 세트의 시험 서열이 시험되는 경우(모든 256 네개염기쌍 서열(제13도)을 단일 약제에 대한 결합에 시험)에 들어맞는다.
상기 실험은 UL9-COOH 폴리펩티드가 (i)적절한 강도, (ii) 적합한 해리시간, 및 (iii) 분석(결합) 부위의 옆에 위치한 뉴클레오티드 서열에 대한 무차별성을 동반하여 SEQ ID NO:1 서열에 결합한다는 것을 지지한다.
이 들특징은 UL9/oriS 시스템이 모든 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하여 작은 분자/DNA-결합의 검출을 위한 넓은 용도의 분석을 제공할 수 있음을 시사한다.
상기 실험은 본 분석에서의 유용성을 결정하기 위해 다른 DNA:단백질 상호작용을 검색하는데 이용될 수 있다.
[서열-특이성 경쟁 억제제로서의 작은 분자]
본 분석 시스템의 유용성을 시험하기 위애, 서열 선택성(예컨대 GC-풍부 서열보다 AT-풍부 서열에 대한 선택성)을 가지는 몇가지 작은 분자가 시험되었다.
디스타마이신 A는 비-교대성 AT-풍부 서열에 대한 선택성을 가지고 DNA에 상대적으로 약하게(KA=2 ×105M-1)이 결합한다(Jain et al, ; Sobell; Sobell et al.). 악티노마이신 D는 디스타마이신 A보다 강하게(KA=7.6 ×10-7M-1) DNA에 결합하며 디뉴클레오티드 dGdC에 대해 상대적으로 강한 선택성을 가진다. (Luck et al. ; Zimmer; Wartel).
이들 분자의 각각은 분석에 대해 엄격한 시험을 요구한다.
디스타마이신 A는 상대적으로 약한 결합때문에 분석의 민감도를 시험한다.
UL9 인식 서열은 dGdC 뉴클레오티드를 포함하므로 악티노마이신 D는 측면 서열을 이용하는 능력을 변화시킨다. : 그러므로, 분석 부위의 옆에 위치한 시험 서열과 관계없이 모든 올리고뉴클레오티드는 악티노마이신 D에 의해 동일하게 영향을 받을 것으로 예상된다.
부가하여, 공지된 항암제로서, 서열-선택성 방식으로 DNA에 결합하는 독소루비신(Chen, K-X, et al.)이 본 발명의 분석을 이용하여 선택적 DNA 서열 결합에 대해 시험되었다.
악티노마이신 D, 디스타마이신 A. 및 독소루비신은 UL9 결합 부위의 측면에 위치한 다른 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 대한 UL9의 결합을 선택적으로 억제하는 능력에 대해 시험되었다 (실시예 6. 제5도).
결합 분석은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행되었다. 이들 연구는 UL9가 DNA보다 과량으로(예컨대, 대부분의 DNA가 복합체로 존재한다) 존재하는 조건하에서 완결되었다.
디스타마이신 A는 UL9의 스크리닝 서열의 옆에 위치한 5개의 시험 서열로 시험되었다:SEG ID NO: 5 내지 SEQ ID NO:9.
제10a도에 나타낸 결과는 디스타마이신 A가 선택적으로 시험 서열 UL9 폴리 T, UL9 폴리 A, 및 UL9 ATAT(보다 적은 정도)에 결합하는 것을 방해함을 실증한다.
또한 제10a도는 디스타마이신 A의 억제효과의 농도 의존성을 보여준다: 1μM 디스타 마이신 A에서 대부분의 DNA:단백질 복합체는 UL9 폴리 T 및 UL9 폴리 A 레인에 나타나 있는 자유 프로브와 함께 본래 상태(상부 밴드)로 존재하고, 일부 자유 프로브는 UL9 ATAT 레인에 나타나 있으며; 4μM에서 자유 프로브는 UL9 폴리 T 및 UL9 폴리 A 레인에 나타나 있고; 16μM에서 자유 프로브는 UL9 폴리 T 및 UL9 폴리 A 레인에 나타나 있으며 ; 40μM에서 폴리 T, UL9 폴리 A 및 UL9 ATAT의 DNA:단백질은 거의 완전의 파괴된 반면에 다른 레인에 있는 일부 DNA:단백질은 계속 존재한다.
이들 결과는 비-교대성 AT-풍부 서열에 대한 디스타마이신 A의 공지된 결합 선택성과 의지한다.
악티노마이신 D는 UL9 스크리닝 서열의 옆에 위치한 8개의 다른 시험 서열로 시험되었다: SEQ ID NO:5 내지 SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:11 내지 SEQ ID NO:13.
제10b도에 나타낸 결과는 악티노마이신 D가 올리고뉴클레오티드 UL9 CCCG(SEQ ID NO:5) 및 UL9 GGGC(SEQ ID NO:6)에 대한 UL9-COOH의 결합을 선택적으로 파괴함을 실증한다.
이들 올리고뉴클레오티드는 dGdC 디뉴클레오티드외에 3개 또는 5개의 dGdC 디뉴클레오티드를 UL9 인식 서열내에 가지고 있다.
이 결과는 디뉴클레오티드 서열 dGdC에 대한 악티노마이신 D의 공지된 결합 선택성과 일치한다. 분명히 상기와 같이 스크리닝 서열(oriS,SEQ ID NO:1)내에 존재하는 가능한 표적 부위는 분석 기능을 방해하지 않는다.
독소루비신은 UL9 스크리닝 서열의 옆에 위치하는 8개의 시험 서열로 시험되었다: SEQ ID NO:5 내지 SEQ ID NO:9, 및 SEQ NO:1 내지 SEQ ID NO:13.
제10c도에 나타낸 결과는 독소루비신이 oriEco2와는 단지 하나의 염기만 다른 시험 서열인 oriEco3에 대한 결합을 선택적으로 파괴함을 실증한다(SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:13)을 비교하라).
또한 제10c도는 독소루비신의 억제효과의 농도 의존성을 나타낸다: 15μM 독소루비신에서, 스크리닝 서열에 대한 UL9 결합은 oriEco3의 시험 서열인 경우 강하게 영향을 받으며, 폴리 T, UL9 GGGC, 또는 oriEco2가 시험 서열인 경우는 보다 덜 영향을 받고; 및 35μM 독소루비신에서 대부분의 DNA:단백질 복합체는 거의 완전의 파괴되며, UL9 폴리 T 및 UL9 ATAT 경우 일부 DNA는 계속 단백질과 복합체를 이룬다.
또한 15μM에서 관찰된 것과 유사한 효과가 150nM의 독소루비신을 이용한 경우에도 관찰되었으나, 보다 뒤의 시점에서 관찰되었다.
어느 약제와 더 배양한 경우 결합의 추가적인 파괴가 일어났다. 상기 분석의 한 시간의 배양시간이 DNA:단백질 복합체의 몇가지 반감기와 동일한 것으로 보아 결합의 추가적인 파괴는 약제에 대한 온-레티트가 상대적으로 낮음을 시사한다.
낮은 서열-특이성을 지니는 약한 DNA-결합 분자(예컨대 디스타마이신A)를 이용하여 서열 결합 선택성을 구분하는 분석 능력을 엄격한 시험이다.
따라서 본 분석은 보다 좋은 서열 특이성 및/또는 보다 높은 서열 결합 친화도를 갖는 분자의 확인에 매우 적합한 것으로 생각된다.
더욱이, 결과는 공지된 항암제 독소루비신과의 서열 선택성 결합을 실증한다.
이 결과는 분석이 서열-특이성 결합뿐만 아니라 항암제 활성에 대해서도 추가로 시험할 수 있는 유사한 특성을 나타내는 분자에 대해 혼합물을 스크리닝하는데 이용될 수 있음을 나타낸다.
본 DNA:단백질 시스템의 시험 및 선택적인 DNA:단백질 시스템의 한정에 적합한 다른 화합물에는 다음과 같은 것이 있다:서열(A/T) CGT에 선택적으로 결합하는 에키노마이신(echinomycin) (Quigley et al.); 반복되는 GC 서열을 포함하는 부분에서 Z-DNA 형성을 유도하는 것으로 공지된 작은 무기 분자, 예컨대 코발트 헥사민(Gessner et al.); 및 다른 DNA-결합 단백질, 예컨대 제한 엔도뉴클레아제인 EcoR1,
[분석 성분의 농도에 대한 이론적 고려사항]
분석에는 두가지 성분, 시험 서열(올리고뉴클레오티드) 및 UL9의 DNA-결합 도메인이 있으며, 다음에 기재되어 있다.
많은 이론적 고려사항이 본 발명의 분석 시스템을 확립하는데 이용되었다.
본 발명의 한가지 구체예에서, 분석은 매스-스크리닝(mass-screening) 분석으로 이용된다. 이 용적에서는 적은 부피 및 농도가 바람직하다.
전형적인분석은 15 내지 20㎕ 반응 부피에 DNA 0.1ng(대략 0.3nM)을 사용한다.
단백질 농도는 과량으로 존재하며, 분석의 민감도를 증가 또는 감소시키기 위해 다양화될 수 있다. 가장 간단한 시나리오에서 작은 분자는 입체 장애를 통해 경쟁 억제제로 작용하며, 시스템 동력학은 하기식으로 기술될 수 있다 :
D + P ↔ D : P, 여기서 Kfp/ Kbp= Keq,p= [D:P]/[D][P]
및
D + X ↔ D : X, 여기서 Kfx/Kbx=Keq,x= [D:X]/[D][X]
D=DNA, P-단백질, X-DNA-결합분자, Kfp및 Kfx는 DNA: 단백질 상호작용 및 DNA: 약제 상호작용에 대한 정반응 속도를 각각 나타내고, Kbp및 Kbx는 각 상호작용에 대한 역반응 속도이다. 괄호, [ ],는 성분의 몰 농도를 나타낸다.
분석에서, 단백질, P, 및 DNA-결합 분자 즉 약제, X는 둘다 DNA에 대하여 경쟁한다. 만약 입체 장애가 억제 기작인 경우, 두 분자가 동일한 부위에 대해 경쟁한다는 가정이 생길 수 있다.
DNA 농도가 DNA:약제 또는 DNA:단백질 복합체의 농도와 같을 경우, 평형결합상수, Keq는 단백질 농도의 역수(1/[P])와 같다.
UL9에 대해 계산된 Keq, UL9=2.2 X 109M-1이다.
모든 3개의 성분이 서로 혼합되어 있는 경우, 약제 및 단백질간의 관계는 하기와 같을 것이다:
Keq,p= Z(Keq,x)
상기에서 ＂z＂는 P 및 X 간의 DNA에 대한 친화도의 차이를 나타낸다. 예를 들면, z=4인 경우, 약제의 친화도는 DNA 분자에 대한 단백질의 친화도보다 4배 낮다.
그러므로 X의 농도는 P의 농도보다 4배 높아야 DNA 분자에 대해 동일하게 경쟁한다.
따라서, UL9의 평형 친화 상수는 약제의 농도 및/ 또는 친화도에 대해 최소의 검출 수준을 나타낸다. 낮은 친화도 DNA-결합 분자는 단지 고농도에서만 검출될 것이다: 마찬가지로, 높은 친화도 분자는 상대적으로 낮은 농도에서 검출된다.
어떤 시험 서열에서는, 이들 분석에 의해 나타난 것보다 현저히 낮은 농도에서 UL9 결합의 완전한 억제가 관찰되는데, 아마도 실행가능성 연구를 위해 선택된 것중에서 어떤 부위는 이전에 공개된 것보다 높은 친화도를 갖고 있음을 나타내는 것이다.
공지된 약제의 상대적으로 높은 농도는 서열 특이성 시험에 이용될 수 있음에 주의하라. 부가하여, UL9의 결합 상수는 만약에 저농도에서 발견되는 분자를 스크리닝하는 경우에 바람직한 경우, 분석시에 pH 또는 염농도를 변화시켜 용이하게 감소시킬 수 있다(예컨대, 발효액 또는 추출물에서).
위에 기재된 것과 같은 분석은 억제가 입체 장애에 의한 경쟁이 아니고 알로스테릭(비-경쟁적 억제)한 경우 더욱 복잡하다.
그럼에도 불구하고 다른 시험 서열에 대한 상대적인 효과가 그외 다른 서열에 대한 상대적이고 특정한 친화도에 기인한다는 확률이 아주 높다.
이것은 특히 정렬된 세트내의 모든 서열(예컨대, 주어진 길이의 가능한 서열 또는 어떤 염기 조성분 및 정해진 길이의 모든 가능한 변형물)이 시험되는 분석에 잘 들어맞는다.
간단히 말해서, 분석에서의 억제효과가 단일 서열에 대해서 특히 강한 경우, 억제제는 다른 서열의 것 보다 높은 친화도를 가진 특정 서열에 결합하기 쉽다.
더욱이, 억제제의 절대적인 친화도를 결정하는 것은 어렵지만, 상대적인 친화도는 매우 정확한 높은 확률을 가진다. 이 정보는 예를 들어 분자 모델링 시스템의 정제를 용이하게 하는 데 가장 유용할 것이다.
[높은 단백질 농도의 조건하에서의 분석의 이용]
스크리닝 단백질이 매우 높은 농도로 분석 시스템에 첨가되는 경우, 단백질은 스크리닝 서열이외에 올리고뉴클레오티드의 비-특이성 부위에도 결합한다.
이 효과는 밴드 이동 겔을 이용하여 실증되었다: 특히, 연속 희석액이 UL-9 단백질로 만들어지고 희석액이 올리고뉴클레오티드의 고정된 농도로 혼합되는 경우, 결합(밴드 이동으로 나타남)은 매우 낮은 희석액(예컨대 1:100,000)에서 관찰되고, 단일 밴드 이동은 적당한 희석액(예컨대, 1:100)에서 관찰되며, 적당한 희석액에서 관찰된 단일 밴드보다 높은 이들을 나타내는 도말은 높은 단백질 농도(예컨대, 1:10)에서 관찰되었다. 밴드 이동 분석에서 도말은 혼합된 복합체 집단을 나타내며, 추측상 모두 높은 친화도( 예컨대, UL9에 대해 K2=1.1 x 109M-1)로 스크리닝 서열에 결합하는 스크리닝 단백질을 가질 것이나, 그외 현저히 낮은 친화도로 결합한 다수의 단백질도 가질 것이다.
낮은 친화도 결합 단백질의 일부는 시험 서열에 결합되어 있다.
본 발명에 따라 UL9 및 글루타티온-S-트랜스파라제를 이용하여 수행된 실험에서, 낮은 친화도 결합 단백질은 UL9와 같고, 글루타티온-S-트랜스퍼라제와는 약간 다른데, 그 이유는 이들이 단지 분석 혼합물에서 단백질이기 때문이다.
이들 낮은 친화도 결합 단백질은 두가지 이유에서 시험 서열에 결합한 분자에 의한 방해에 더 현저히 민감하다.
첫째 방해는 십중팔구 직접적인 입체 장애에 의한 것이며 DNA의 유도된 형태 변화와는 관계없다; 둘째, 시험 부위에 결합한 단백질은 낮은 친화도 결합단백질인데 그 이유는 시험 부위가 동족-결합 서열이 아니기 때문이다. UL9의 경우, 낮은 친화도 결합 및 높은 친화도 결합간의 친화도 차이는 적어도 크기의 2차수이다.
본 발명에 따라 수행된 실험은 보다 많은 단백질이 DNA에 결합되어 있는 경우 필터 결합 분석은 보다 많은 DNA:단백질 복합체를 포획함을 실증하였다.
관련 결과는 정확하나, 적당한 단백질 농도에서, 올리고뉴클레오티드당 하나 또는 그 이상의 DNA:단백질 복합체( 예컨대, UL9의 경우 하나이상의 UL9:DNA 복합체)가 존재하지 않으면 결합한 모든 DNA가 (밴드 이동 분석에서 실증된 바와 같이) 필터에 결합하지는 않을 것이다. 이것은 높은 단백질 농도의 조건하에서 분석을 매우 민감하게 만든다.
예를 들면, 악티노마이신이 올리고뉴클레오티드당 하나의 DNA:UL9 복합체가 존재하는 조건하에서 DNA의 시험 부위에 결합하는 경우, GC-풍부한 올리고뉴클레오티드에 대한 특이한 결합 효과가 관찰되었다(실시예 6 참조).
높은 단백질 농도의 조건하에서, 하나 이상의 DNA:UL9 복합체가 올리고뉴클레오티드당 존재하는 경우, 악티노마이신의 특이한 효과는 훨씬 더 나타난다.
이들 결과는 단백질이 약하게 결합하는 시험 서열에 대한 악티노마이신 D의 효과가 인접 한스크리닝 서열에 대한 악티노마이신 D의 효과보다 더 용이하게 검출될 수 있음을 시사한다.
그러므로 높은 단백질 농도를 이용하는 것을 분석의 민감도를 증가시킬 것이다.
[포획/검출 시스템]
위에 기재된 밴드 이동 겔 및 필터 결합 분석에 대한 선택적 방도로서, 시험 분자 또는 혼합물의 존재하에서의 미결합 DNA 수준 또는 시험 분자 또는 혼합물의 존재시에 잔류하는 DNA:단백질 복합체의 수준을 측정하여 억제제의 양을 조사하였다.
측정은 평형에서, 또는 동력학 분석에서는 평형에 도달하기전의 시간에 하였다.
측정의 유형은 평형이 도달하는 시간 등의 실제적인 인자에 의해 지시되며, 그것은 DNA:단백질 상호작용의 동력학 및 DNA:약제 상호작용의 동력학에 의해 결정될 것이다.
결과(예컨대, DNA-결합 분자의 검출 및/ 또는 그 서열 선택성의 결정)는 이용한 측정 유형(동력학 또는 평형)에 따라 다양해서는 안 된다.
제2도는 DNA-결합 단백질의 결합을 선택적으로 방해하는 능력에 근거하여 억제분자를 검출하는 발생을 예시한다. 억제 분자(X)의 존재시에, DNA-결합 단백질 및 그 결합 부위(스크리닝 서열)간의 평형이 깨어진다.
DNA-결합 단백질(0)은 억제제(X)의 존재시에 DNA(/)로부터 치환되고, 이어서 단백질이 없는 DNA 또는, 선택적으로 DNA:단백질 복합체는 포획되고 검출될 수 있다.
민감도를 극대화하기 위해, 미결합 DNA 및 DNA:단백질 복합체는 효과적이고 신속한 방식으로 서로 격리되어야 한다. DNA 포획 방법은 DNA:단백질 복합체를 포함하는 단백질-풍부 혼합물으로부터 미결합 DNA가 신속히 제거되는 것을 가능하게 한다.
시험 분자가 DNA와의 상호작용에 특이적인 경우조차도 그들은 상대적으로 낮은 친화를 가지며 아울러 비-특이성 DNA의 약한 방해제이거나 또는 낮은 농도에서 DNA와 비-특이성 상호작용을 한다. 어느 경우에나, 그들의 DNA에 대한 결합은 단지 일시적이며, 용액내 단백질의 일시적 결합과 매우 유사하다.
따라서, 분석의 한가지 특징은 표적/분석 DNA, 및 억제성 시험 분자를 함유하는 용액의 평형 상태에서 스냅사진을 찍는 것이다. 억제제의 존재시에, 단백질에 결합하지 않은 DNA의 양은 억제제의 부재시에 많을 것이다. 마찬가지로, 억제제의 존재시에 단백질에 결합한 DNA의 양은 억제제의 부재시에 더 적을 것이다.
미결합 DNA로부터 DNA:단백질 복합체를 분리하는 모든 방법은 신속해아 되는데, 그 이유는 포획 시스템이 용액에 적용되는 경우(포획 시스템이 비가역적인 경우), DNA:단백질 복합체에 대한 미결합 DNA의 비는 순전히 DNA:단백질 복합체의 오프-레이트에 근거하여 예비결정된 속도에서 변할 것이다.
그러므로 이 단계는 배경의 한계를 결정한다.
단백질 및 억제제와 달리, 포획 시스템은 신속하고 단단하게 DNA 또는 DNA:단백질 복합체에 결합해야 한다.
포획 시스템이 용액내 미결합 DNA 및 DNA:단백질 복합체의 전체 혼합물과 오래 접촉하면 할수록 억제제의 존재 또는 부재와 관계없이 배경은 높아진다.
두가지의 전형적인 포획 시스템이 본 발명에의 이용을 위해 다음에 기재되어 있다. 하나의 포획 시스템이 미결합 DNA를 포획하기 위해 고안되었다(II. A 부분).
DNA:단백질 복합체를 포획하기 위한 다른 시스템이 고안되었다(II. B 부분)
두 시스템은 높은 처리량의 스크리닝 분석에 알맞다. 동일한 검출방법이 어느 하나의 포획 시스템을 이용하여 포획된 분자에 적용될 수 있다(II. C 부분).
[미결합 DNA의 포획]
본 발명에 따라 수행된 실험의 진행시에 개발된 한가지 포획 시스템은 미결합 DNA, DNA:단백질 복합체, 과량의 단백질 및 시험 분자 또는 시험 혼합물을 함유하는 단백질-풍부한 혼합물로부터 미결합 DNA를 신속히 포획하기 위해 스트랩타비딘/비오틴 상호작용을 이용한다.
스트렙타비딘은 아주 높은 친화도를 비오틴에 결합하므로(Kd=10-15M)(Chaiet et al.; Green), 스트렙타비딘/비오틴 시스템의 두가지 장점은 분자간의 결합이 빠르다는 것과 상호작용이 가장 강한 공지된 비-공유 상호작용이라는 것이다.
이 검출 시스템에서, 비오틴 분자는 올리고뉴클레오티드 스크리닝 서열(예컨대, DNA-결합 단백질의 결합 부위)에 공유결합된다.
이 결합은 DNA-결합 단백질과 DNA의 결합이 파괴되지 않는 대상으로 수행된다.
더욱이, 단백질이 비오티닐화 서열에 결합되어 있는 경우, 단백질은 스트랩타비딘이 비오틴에 결합하는 것을 방해한다. 바꾸어말하면 DNA-결합 단백질은 비오틴이 스트렙타비딘에 의해 인식되는 것을 방해할 수 있다.
이 DNA:단백질 상호작용은 제3도에 예시되어 있다.
포획 시스템은 위에 기재된 UL9/oriS와 이용되기 위해 여기에 기재되어 있다.
그러나 다음의 일반적인 시험원리는 다른 DNA:단백질 상호작용의 분석에 적용될 수 있다.
이 시스템의 유용성은 특정한 DNA:단백질 상호작용의 생물리학적 특성에 의존한다.
1) 비오틴을 이용한 단백질 인식 서열의 변형.
UL9(koff et al.) 단백질의 결합을 위한 인식 서열은 제4도의 밑줄친 부분이다. UL9 결합부위 및 결합부위내에 부위-특이적으로 비오티닐화된 많은 위치를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 합성되었다(SEQ ID NO:14; 실시예 1, 제4도).
다음에 이들 비오티닐화 올리고뉴클레오티드는 UL9 단백질의 올리고뉴클레티드에 대한 결합능력을 결정하는 밴드 이동 분석에 이용되었다.
비오티닐화 프로브 및 대조표준인 비-비오티닐화 프로브를 이용한 이들 실험은 하부 스트랜드의 #8-T(비오티닐화 데옥시우리딘)위치에서의 비오틴의 존재는 위에 기재된 요구사항에 부합된다: 하부 스트랜드의 #8 위치에 존재하는 비오틴 잔기는 UL9의 인식부위에 대한 특이성에 현저한 영향을 미치지 않는다; 더욱이, 결합한 UL9의 존재시, 스트랩타비딘은 올리고뉴클레오티드에 존재하는 비오틴 잔기를 인식하지 못한다.
다른 A 또는 T 위치의 비오티닐화는 두가지 필요한 특성(예컨대, 스트렙타비딘으로부터 UL9 결합 및 보호): 상부 스트랜드의 위치 #8에 존재하는 아테노신의 비오티닐화는 UL9의 결합을 방해한다; 위치 #3, 34, #10, 또는 #11에 존재하는 아데오신 또는 티미딘(상부 또는 하부 스트랜드)의 비오티닐화는 동남아 UL9의 결합을 허용하였으나, 각 경우에 스트랩타비딘은 또한 UL9의 존재시에 비오틴 잔기의 존재를 인식함으로써 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있었다.
메틸화 방해 데이타(Koff et al.)는 인식 서열의 #7 및 #9 위치(비오티닐화 데옥시 우리딘의 한쪽면)에서의 데옥시구아노신 잔기의 메틸화가 UL9 결합을 방해함을 시사하였기 때문에 상기 결과(인식 서열내에 비오틴을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 결합하여 스트렙타비딘으로부터 비오틴을 보호하는 UL9의 능력)는 예상되지 않았다.
이들 메틸화 방해 실험에서, 구아노신은 데옥시우리딘이 비오티닐화된 피리미딘 고리의 5-위치에 구조적으로 대응하는 N7위치에서 디메틸 술페이트에 의해 메틸화된다.
이들 잔기는 모두 DNA의 대홈으로 뻗어있다. 메틸화 방해 데이타는 #7 및 #9 위치 데옥시구아노신이 UL9에 대한 접촉점임을 시사하므로, 그들 사이의 비오틴 잔기의 존재는 결합을 방해하지 않을 것이라고는 예상되지 않았다.
완전한 길이를 가진 단백질의 결합은 UL9 결합부위내의 위치 #8에 존재하는 비오틴에 의해 상대적으로 영향을 받지 않는다.
해리속도는 비오티닐화되거나 비오티닐화되지 않은 올리고뉴클레오티드를 지닌 완전한 길이의 UL9에 대해 동일하다.
그러나, 절단된 UL9-COOH 폴리펩티드의 해리속도는 비오티닐화되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드의 경우가 더 빠른데, 그것은 어느 하나의 DNA를지닌 완전한 길이의 단백질의 것에 필적하는 속도이다.
비오티닐화 올리고뉴클레오티드로부터 절단된 UL9의 오프-레티트가 5 내지 10분이 되도록 결합 조건은 UL9-COOH에 대해 최적화되었으며(최적화된 조건은 실시예 4에서 제시되어 있다), 속도는 매스 스크리닝 분석과 양립한다.
본 발명의 DNA:단백질 분석을 수행하기 위한 다중-윌 폴레이트(multi-wall plate)의 이용은 매스 스트리닝에 대한 한가지 방법이다.
2) 부위-특이성 비오티닐화 올리고뉴클레오티드의 포획.
스트랩타비딘:비오틴 상호작용을 DNA, 단백질, 및 시험 분자 또는 혼합물을 포함하는 용액으로부터 미결합 DNA를 분리하는 몇가지 다른 방법에 이용될 수 있다.
스트렙타비딘이 공유결합하거나 또는 공유결합된 비오틴을 통해 결합하는 자성 폴리스티렌 또는 아가로스 비드(bead)는 단기간동안 용액에 노출될 수 있으며, 다음에 자석 또는 망상조직을 이용하여 각각 제거될 수 있다.
자성 스트렙타비딘화 비드는 최근에 선택되는 방법이다.
스트렙타비딘은 많은 이들 많은 실험에 이용되며, 아비딘도 동등에 관한 이용된다.
미결합 DNA의 제거를 위한 제2방법의 예는 맨처음 비오틴을 필터내 연결시키고, 스트렙타비딘을 결합시키고, 이어서 알부민 등의 비특이성 단백질로 필터의 비특이성 단백질 결합부위를 방해하여 스트렙타비딘을 필터에 결합시키는 것이다. 다음에, 혼합물이 필터를 통과시키면서 미결합 DNA는 포획되고 결합된 DNA는 필터를 통과한다.
포획 DNA를 격리시키는 한가지 편리한 방법은 실시예 7에 기재된 바와 같이 스트렙타비딘-결합의 폴리스티렌 비드를 이용하는 것이다.
이들 비드는 분석 혼합물에 가해져서 미결합 DNA를 포획한다.
DNA가 포획된 후, 비드는 반응 튜브를 자성 선반에 놓음으로써 회수될 수 있으며, 그것은 반응 챔버 벽에 있는 비드를 격리시키며, 분석 혼합물은 제거되고 비드는 세척된다. 이어서 포획된 DNA는 다음에 기재된 몇가지 DNA 검출 시스템중 하나를 이용하여 검출된다.
선택적으로, 아비딘-피복의 아가로스 비드가 사용될 수 있다.
비오티닐화 아가로스 비드(고정화 D-비오틴, Pierce)는 아비딘에 고정되어 있다. 아비딘은 스트렙타비딘과 같이 비오틴에 대한 4개의 결합 부위를 갖고 있다.
이들 결합부위중 하나는 아비딘을 16 원자 스페이서 아압을 통해 아가로스 비드에 결합된 비오틴에 결합시키기 위해 이용된다: 다른 비오틴 결합 부위는 유용한 상태로 남아 있다. 비드는 결합 혼합물과 혼합되어 비오티닐화 DNA를 포획한다(실시예 7).
가재된 비드 포획 방법에 대한 선택적 방법은 다음의 스트렙타비딘화 또는 아비딘화 지지체를 포함한다: 저-단백질-결합 필터 또는 96-웰(well) 플레이트.
[DNA:단백질 복합체의 포획]
억제성 분자의 존재하에 분석 혼합물에 잔류하는 DNA:단백질 복합체의 양이 또한 억제성 분자의 상대적인 효과의 크기로서 결정된다.
시험 분자에 대한 DNA:단백질 복합체 양의 순수한 감소는 억제제가 존재함을 나타낸다. 단백질에 결합한 DNA 분자는 니트로셀룰로스 필터에 포획될 수 있다.
낮은 염 조건하에서, 단백질에 결합한 DNA는 필터를 자유로이 통과한다.
따라서, 분석 혼합물을 니트로셀룰로스 필터에 신속히 통과시킴으로써, DNA:단백질 복합체 및 미결합 DNA 분자가 신속히 분리될 수 있다. 이것은 진공 필터 장치를 이용한 니트로셀룰로스 디스크 또는 슬로트 블로트(slot blot)또는 도트(dot) 블로트 장치에서 수행되어 왔다(이들 전부는 Schleicher and Schuell, Keene, NH에서 구입할 수 있다).
분석 혼합물은 진공 조건하에서 습윤 니트로셀룰로스에 적용된 후 신속히 통과된다. 자유 DNA는 필터를 통과시키는 반면 단백질은 잔류시키는 니트로셀룰로스 필터 또는 다른 필터를 이용하는 장치가 이 시스템에 적합하다.
[검출 시스템]
위의 포획 방법중 어느 것에 대해, 포획되는 DNA의 양이 정량되었다.
정량방법은 DNA의 제조방법에 의존한다.
만약 DNA가 방사성으로 표지되는 경우, 비드는 신틸레이션 카운터에서 계수되거나, 또는 건조된 겔 또는 니트로셀룰로스 필터의 자동방사선사진이 얻어질수 있다.
후자의 경우, DNA의 양은 온도계(Molecular Dynamics, Sunnyvalem CA)로 정량되어 왔다;선택적으로, 방사성 표지된 샘플을 포함하는 필터 또는 겔은 포스포이미저(phosphoimager)(Molecular Dynamics)를 이용하여 정량될 수 있다.
포획된 DNA는 또한 화학발광 또는 비색측정 검색 시스템을 이용하여 검출될 수 있다.
방사성 표지 및 화학발광은 (i) 매우 민감하여 올리고뉴클레오티드의 서브-팸토몰(sub-femtomole)의 검출도 가능하며, (ii) 잘 확립된 기술을 이용한다. 화학발광 검출의 경우, 매스-스크리닝 분석의 요구사항을 수용하기 위한 방법이 고안되었다.
비-동위원소성 DNA 검출기술은 검출가능한 표지로서 기질을 생성물로 많이 전환시키고 화학발광 및 착색된 생성물은 산출하는 기질의 유용성을 제공하는 효소의 능력을 지닌 알칼리성 포스파타제를 주로 삽입시켰다.
1) 방사성 표지.
UL9 DNA:단백질 결합 연구에 대해 위에 기재된 많은 실험은 방사성-표지 올리고뉴클레이티드를 이용하였다. 올리고뉴클레오티드의 방사성 표지에 관련된 기술에서 위에서 논의되었다. DNA ㎍당 108-109dpm의 특정 활성도가 통상적으로 표준방법(예컨대, γ-[32P]-5' 트리포스페이트 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 이용한 올리고 뉴클레오티드의 말단-표지)을 이용하여 달성된다. 이 수준의 특정 활성도는 필름에 노출된 겔 또는 필터의 자동방사선사진을 이용하여 또는 신틸레이션 용액에서 샘플의 직접적인 카운팅을 이용하여 소량의 DNA를 측정하는 것을 가능하게 한다.
2) 화학발광 검출.
화학발광 검출를 위해, 디곡시게닌-표지 올리고뉴클레오티드(실시예1)는 Tropix, Inc.가 개발한 화학발광 검출시스템 ＂SOUTHERN LIGHT＂를 이용하여 검출될 수 있다. 검출 시스템을 제11A 및 11B도에 모식도로 나타냈다.
그 기술은 비드, 필터, 또는 용액중에 포획된 DNA를 검출하는데 적용할 수 있다.
알칼리성 포스파타제는 포획 시스템을 방해하지 않으면서 포획된 DNA에 결합한다.
이를 수용하기 위해, 일반적으로 이용되는 ELISA(Harlow et al.; Pierce, Rockford IL) 기술에서 비롯된 몇가지 방법이 이용될 수 있다.
예를 들어, 항원성 잔기가 (i) DNA:단백질 상호작용, (ii) DNA:약제 상호작용, 또는 (iii) 포획 시스템을 방해하지 않는 위치에서 DNA에 삽입된다.
UL9 DNA:단백질/비오틴 시스템에서, DNA는 디곡시게닌-11-dUTP (dig-dUTP) 및 말단 트랜스파라제를 이용하여 말단-표지된다(실시예 1,제4도). DNA가 포획되어 DNA:단백질 혼합물에서 제거된 후, 항체에 결합된 항-디곡시게닌-알칼리성 포스파타제는 디국시게닌을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 반응하였다(Boehringer Mannheim, Indianapolis IN).
항원성 디곡시게닌 잔기는 항체-효소 콘쥬게이트에 의해 인식되었다. dig-dUTP의 존재는 oriS SEQ ID NO:1을 포함하는 DNA에 결합하는 UL9-COOH 단백질의 능력과 삽입된 비오틴에 결합하는 스트렙타비딘의 능력을 변화시키지 않았다.
포획된 DNA는 하기와 같이 디곡시게닌에 대한 알칼리성 포스파타제-결합된 항체를 이용하여 검출되었다.
알칼리성 포스파타제에 대한 한가지의 화학발광 기질은 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3＂-포스포릴옥시) 페닐-1,2-디옥세탄 디소디움 염(AMPPD)이다(실시예 7).
AMPPD의 탈인산화는 불안정한 화합물을 만들며, 그것은 477nm의 빛을 일정하게 지속적으로 방출하면서 분해된다. 광측정은 매우 민감하여 미량의 DNA(예컨대 102내지 103몰)를 검출할 수 있다(실시예 7).
알칼리성 포스파타제 시스테에 대한 비색측정기질도 또한 시험하였고 본 분석시스템에 사용가능하다.
상기 비오틴 포획시스템에 대한 대안은 분석부위에서 DNA-결합 단백질에 의해 보호된 부위에서 올리고뉴클레오티드를 변형시키기 위해 비오틴의 대신에 디곡시게닌을 사용하는 것이다.
즉, 비오틴은 상기한 검출시스템에서 디곡시게닌 잔기를 대치하기 위해 사용된다. 이 배열에서 결합된 단백질이 없을 때 올리고뉴클레오티드 프로브를 포힉하기 위해 항-디곡시게닌 항체가 사용된다. 그러면 알칼리성 포스파타제에 결합된 스트랩타비딘이 포획된 올리고뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 사용된다.
[DNA-결합 단백질의 그것의 동쪽 부위에 대한 친화도를 증가시키는 분자들을 검출하는 또다른 방법]
스크리닝 서열에 대한 DNA-결합 단백질의 감소된 친화도의 원인이 되는 분자 또는 화합물을 확인하는 것외에, 단백질의 그것의 동족결합부위에 대한 친화도를 증가시키는 분자들을 확인할 수도 있다. 이 경우에, 미결합된 DNA에 대한 포획시스템을 증가된 양의 시간동안 분석과 접촉해 두는 것은 DNA:단백질 상호작용(예를 들면 SEQ ID NO:1/UL9)에 대한 고정된 오프-레이트의 확립을 허용한다. 안전화 분자의 존재하에, 포획 시스템시간 시점들에 의해 검출된 바와 같이 오프-레이트는 감소될 것이다.
스크리닝 서열에 대한 DNA-결합 단백질의 친화도를 증가시키는 분자들을 검출하기 위해 DNA:단백질 복합체에 대한 포획 시스템을 사용하는 것은 UL9 결합부위(시험 서열이 아님)을 함유하는 과량의 비표지된 올리고뉴클레오티드를 분석화합물에 첨가하는 것을 요한다. 이것은 사실상 오프-레이트 실험이다.
이 경우에, 대조표준샘플(시험분자 또는 첨가된 혼합물이 아님)은 고정된 오프-레이트를 나타낼 것이다. (즉, 샘플은 니트로셀룰로오스에 적용된, 비표지된 경쟁 DNA 분자의 첨가후 고정된 간격으로 취해질 것이며 감소된 양의 방사성 포지된 DNA: 단백질 복합체가 관찰될 것이다).
UL9의 결합을 향상시킨 DNA-결합 시험분자의 존재하에 오프-레이트는 감소될 것이다(즉, 관찰된 방사성 표지된 DNA:단백질 복합체의 양은 대조표준샘플에서 만큼 빠르게 고정된 시간 시점에서 감소하지 않을 것이다.)
[용도]
[서열-특이적 DNA-결합 분자의 유용성]
본 발명은 서열결합선택성을 갖는 DNA-결합분자의 존재에 대한 생물학적 또는 화학적 혼합물의 큰 라이브러리를 시험하는 높은 처리량의 생체외 스크리닝 분석을 정의한다. 분석은 또한 기지의 DNA-결합분자 또는 정제된 미지의 DNA-결합분자의 서열-특이성 및 상대 친화도를 결정할 수 있다.
서열-특이적 DNA-결합분자는 몇가지 이유들로 특별한 흥미가 있으며 이유들을 여기에 열거한다. 이들 이유는 부분적으로 치료제로서 DNA-결합분자의 유용성을 결정하는 이론적 근거를 개설한다:
1) 일반적으로, 주어진 DNA:단백질 상호작용에 대해, DNA에 결합하는 단백질 분자보다 셀당 수천개 더 적은 표적 DNA-결합서열이 있다.
따라서, 분명이 독성인 분자들이라도 표적 DNA 서열에 결합함으로써 생물학적 효과에 영향을 미치기에 충분히 낮은 농도에서 전달될 수 있다.
2) DNA는 RNA 또는 단백질과 비교하여 비교적 더 잘 정의된 구조를 갖는다. DNA의 일반적 구조는 3차 구조상의 변동을 적게 갖기 때문에, 특이적 결합분자를 확인 또는 고안하는 것은 RNA나 단백질에 대해서 보다 DNA에 대해 더 용이해야 한다. 이중스트랜드 DNA는 서로 위에 쌓여 선형 나선상 구조를 형성하는 반복구조의 데옥시리보뉴클레오티드이다.
이 방법으로, DNA 분자 모델링 정교함 및 이에 의한 약제 고안 및 개발에 특별의 순응성이 되게 하는 규칙적으로 반복하는 ＂격자＂구조는 갖는다.
3) 많은 ＂단일-카피＂ 유전자들(이들중 셀에는 단지 1 또는 2 카피가 있다)은 다수의, 잠재적으로 수천의 RNA 분자들로 전사되는데, 이들 각각은 많은 단백질들로 번역될 수도 있다.
따라서, 어떤 DNA 부위를 표적하는 것은 그것이 규칙적 서열이든지 아니면 코딩 또는 비코딩 서열이든지 RNA 또는 단백질을 표적하는 것보다 훨씬 더 낮은 약제 투여량을 요할 수도 있다.
단백질들(예를 들면, 효소, 수용체, 또는 구조적 단백질들)은 현재 대부분의 치료제의 표적들이다.
더 최근에, RNA 분자는 안티센스 또는 리보자임 치료분자에 대한 표적이 되어왔다.
4) 단백질을 코드화하는 RNA의 기능 또는 해당 단백질이 몇가지 새로 유전자들을 조절할 때 이 단백질의 기능을 차단하는 것은 유해한 효과를 가질 수도 있는데, 특히 만일 조절된 유전자중 어떤 것이 세포의 생존을 위해 중요하다면 그럴 수가 있다. 그러나 이러한 단백질에 의해 조절된 단일유전자에 특이적인 DNA-결합부위를 차단하는 것은 감소된 독성을 가져온다.
예로든 상황(4)은 B형 감염 바이러스(HBV)에 HNF-1 결합하고 있다.
즉, HNF-1은 HBV 인핸서 서열을 결합하며 UBV 유전자의 전사를 자극한다(Chang et al.). 정상세포 HNF-1은 많은 유전자들, 특히 간 특이적 유전자들에 중요한 것으로 나타나는 핵 단백질들이다(Courtois et al.). 만일 HNF-1의 DNA-결합영역에 특이적으로 결합하는 분자들이 분리된다면, HNF-1에 의해 조절된, 바이러스 및 세포 유전자를 둘다 포함하는 모든 유전자들을 하향-조절된 것이다.
이러한 약제는 HNF-1에 의해 조절된 많은 유전자들은 간 기능에 필요할 수도 있다.
그러나, 본 발명의 분석은 예를 들어서 분자를 스크리닝할 때 다양한 측면 서열을 포함시킴으로써 세포 HNF-1 부위로부터 B형 간염 바이러스 DNA의 HNF-1의 결합영역을 구별할 수 있는 분자에 대해 스크리닝하는 능력을 제공한다.
이러한 분자는 세포 유전자 발현에 영향을 미치지 않고 HBV 발현을 특이적으로 차단할 것이다.
[분석의 일반적 이용분야]
분석의 일반적 이용은 서열-특이성 DNA-결합분자에 대한 비특성화된 화합물들( 예를 들면, 생물학적, 화학적 또는 합성화합물들)의 라이브러리를 스크리닝하는 것(III.B.1 부분); DNA-결합분자의 서열-특이성 또는 선택성 및/ 또는 상대 친화도를 결정하는 것(III.B.2 부분); 그리고 변경된 특이성 또는 친화도에 대한 DNA-결합 분자의 변형된 유도체의 시험(III.B.3 부분)을 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
특히, 이러한 시험화합물은 4N까지의 서열들에 대해 스크리닝되기 때문에 (여기서 N은 시험 서열에서 염기쌍의 수임). 이 방법은 인접서열에 단백질 결합에 의해 증거되는 바와 같이 화합물 구조와 결합활성간의 관계를 분석하기 위한 4N까지의 구조/ 활성데이터 지점을 발생시킬 것이다.
1) 서열-특이적 DNA-결합분자의 존재에 대한 라이브러리의 대량-스크리닝.
많은 기관들 (예를 들면, the National Institutes of Health, pharmaceutical and chemical corporations)이 여전히 미확인된 DNA-결합분자로서 함유될 수도 있는 합성과정들, 발효육즙 또는 추출물으로부터의 화학적 또는 생물학적 화합물들의 큰 라이버러리를 갖는다. 본 발명의 분석의 한가지 용도는 DNA-결합분자를 함유하는 특정 샘플들을 검출하는 다른 육즙, 추출물 또는 혼합물의 이들 라이브러리의 대량-스크리닝에 분석 시스템을 적용하는 것이다.
일단 DNA-결합분자를 함유하는 특정 혼합물이 확인되면, 미정제 혼합물으로부터 DNA-결합분자의 정제에 도움을 주는데에 또한 유용성을 갖는다.
정제계획은 혼합물에 적용되기 때문에 분석은 DNA-결합활성에 대해 분율들을 시험하기 위해 사용될 수록 있다. 분석은 높은 처리량에 순응할 수 있다(예를 들면, 반자동 플레이트-판독밀도계, 광도계, 또는 인영상화제를 사용하는 검출로 Beckman Biomek workstation [Beckman, Palo Alto, CA]와 같은 로봇 공학장치에서 자동화된 96-웰 플레이트 포맷).
2) 본 발명의 분석은 또한 DNA-결합분자로서 문헌에 현재 기술되어 왔으나 불확정한 DNA 결합서열 특이성을 갖는 (즉, 특이적 DNA 서열에 결합을 위한 잘-정의된 선택성을 갖거나 아니면 모든 가능한 DNA 결합서열에 대해 상대적인 선택성을 정의하지 않고 일정한 높은 친화도 결합부위를 갖는)스크리닝 분자에 또한 유용하다. 분석은 DNA-결합 분자에 높은, 낮은, 또는 중간 친화도를 가지고 결합하는 서열의 모든 가능한 선택중에서 DNA-결합 분자에 대한 특이적 결합부위를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
악티노마이신 D, 디스타마이신 A, 및 독소루비신(실시예 6)은 모두 이들 결합방식을 갖는 분자의 예들을 제공한다. 독소루비신(실시예 6 참조)와 같은 많은 항암제는 일정한 확인된 DNA 서열에 대해 결합 선택성을 나타내나, 절대적인 최고 및 최저 특이성 서열은 아직 결정되지 않았는데, 본 발명이 여기에 기술되기까지 어떤 약제에 대한 차별 친화도 DNA-결합부위를 검출하기 위한 방법들(Salas,X. and Portugal,J.; Celliname, C. and Phillips, D.R.; Phillips, D.R.,; and Phillips, D.R. et al.)이 제한되었기 때문이다.
독소루비신은 현재 이용가능한 가장 널리 사용하는 항암제중 하나이다.
실시예 6에서 보여지는 것처럼, 독소루비신은 우선적으로 어떤 서열에 결합하는 것이 알려졌다. 그러한 서열결합선호의 또다른 실례는 다우노루비신인데(Chen 등) 이것은 구조에서 독소루비신과 약간 다르다(Goodman 등).
다우노루비신과 독소루비신은 안트라사이클린 항생제 족의 일원이다: 이 족의 항생제 및 그것의 유도체는 중요한 항종양제이다(Goodman 등).
본 발명의 분석은 DNA-결합분자의 서열 선택성 또는 특이성이 결정되게 한다.
서열 선택성 또는 특이성이 결정될 수 있는 DNA-결합분자는 아미노아크리딘 따위의 작은 분자 및 폴리환식 탄화수소, 평면의 염료, 다양한 DNA-결합 항생제 및 항암제, 뿐만 아니라 핵산에 결합하는 팹티드 및 중합체 따위의 DNA-결합 고분자(예컨대, DNA 나선에 결합하는 DNA와 DNA의 유도체화된 동족체)를 포함할 수 있다.
서열 신호/특이성 및 다른 DNA 부위에 대한 상대적인 친화성에 대한 검사에서 시험할 수 있는 분자는 대홈 및 소홈 결합제 뿐만 아니라 삽입 및 비-삽입 DNA 결합제를 포함한다.
3) 본 발명의 검사는 공지된 DNA-결합 분자에서 유도된 분자에 의한 다른 결합활성의 확인을 촉진한다. 하나의 실례는 본 발명의 검사를 이용하여 DNA-결합 활성에 대해 이 유도체를 확인하고 시험하는 것이다.
그 다음엔 DNA-결합 활성을 갖는 유도체가 예컨대 미국 국립 암 연구소(Bathesda MD) 에 의해 수행되는 일련의 검사를 통해서 항암 활성에 대하여 시험된다.
더욱 본 발명의 검사는 DNA-결합 활성 및 특이성에 대한 변형(메틸화, 에틸화 및 다른 유도체화 따위)의 효과를 조사하기 위하여 공지된 항암제의 유도체를 시험하는데 이용할 수 있다. 이 검사는 (i) 공지된 약제의 보다 나은 치료 유도체의 고안에 대한 초기의 스크리닝 및 (ii) 그러한 치료 유도체의 작용 방식에 대한 나은 이해를 제공하는 방법을 제공한다.
4) 이 검사의 스크리인능력은 개별적인 동족 DNA-결합 단백질로 각 별도의 DNA 서열의 스크리닝하는 것보다 더 크다.
개별적인 리셉터:리간드 복합체(예컨대 특정 DNA:단백질 복합체)를 포함하는 직접적인 경쟁 검사는 매스스크리닝 노력에 가장 흔히 이용되지만, 각 검사는 검사성분의 확인, 분리, 정제, 및 생성을 필요로 한다. 본 발명의 검사를 이용하면, 합성 화합물 또는 생물학적 분자의 라이브러리는 단일 검사 시스템을 이용하여 실질적으로 어떤 특정화된 DNA 서열에 우선적 결합을 하는 분자를 검출하는데 스크리닝할 수 있다.
특정 DNA:단백질 상호작용을 포함하는 이차 스크리닝은 검사에서 검출된 억제분자가 생물학적 시스템에 대해서 직접 시험될 수 있기 때문에 (예컨대, 조직배양 또는 동물 모델에서 바이러스 복제를 파괴하는 능력) 필요하지 않을 수도 있다.
[검사에 의해 표적화된 서열]
본 발명의 DNA: 단백질 검사는 길이에서 뿐만 아니라 복잡성에서 다양한 전 범위의 DNA 서열에 결합하는 화합물들에 대해서 스크리닝하도록 고안되었다.
이 검사에 의해 발견된 서열-특이적인 DNA-결합 분자는 분자시약, 치료제, 또는 치료제 전구물질로서 가능한 유용성을 가진다. 표I은 여러 가지 가능한 특정시험서열을 나열한다.
서열-특이적인 DNA-결합 분자는 어떤 식으로 DNA를 포함하는 본질적으로 어떤 질병 또는 상태에 대한 잠재적으로 강력한 치료제이다.
이 검사의 시험 서열의 실례는 하기를 포함한다: a) 전염성 병원체, 특히 바이러스, 세균, 효모 및 다른 균류의 유지 또는 증식에 포함된 인자의 결합서열, b) 어떤 세포 유전자의 부적합한 발현을 일으키는 서열, 및 c) 빠르게 생장하는 세포의 복제에 포함된 서열.
더욱, 유전자 발현 또는 복제가 특정 단백질의 결합을 차단함으로써 반드시 파괴될 필요는 없다. 유전자(예컨대 발암유전자)의 코딩부위내의 특정서열은 이 서열에 대한 작은 분자의 결합이 극부위의 전사 및/ 또는 복제를 혼란시키는 것같기 때문에 동일하게 유효한 시험서열이다.
마지막으로, 어떤 서열 특이성으로 DNA에 결합하는, 즉 하나의 특별한 시험 서열만에 결합되지는 잃는 어떤 분자는 여전히 항암제로서 유용할 수 있다.
어떤 서열 선호를 갖는 여러 가지의 작은 분자는 이미 항암치료제로서 이용된다. 본 검사에 의해 확인된 분자는 다른 특이성 또는 다른 친화성을 갖는 동일 종류(즉, 다른 특이성을 갖는 분자의 화학적 유도체)의 개발을 위한 선도 화합물로서 특히 가치 있을 수 있다.
본 발명의 한 이점은 이 검사가 어떤 DNA 서열에 대해 편향된 결합 활성에 대해서 스크리닝할 수 있다는 것이다.
그러한 서열은 의학적으로 중요한 표적서열(이 섹션의 파트 1의 의학적으로 중요한 표적 부위 참조), 스크램블 또는 임의로 생성된 DNA 서열, 또는 잘 정의되고 정연한 세트의 DNA 서열(이 섹션의 파트 2의 정연한 세트의 시험 서열 참조)일수 있는데, 이것은 많은 수의 다른 서열 사이의 상대적인 친화성을 결정하고 및/ 또는 최고의 결합 친화성을 갖는 서열을 결정하기 위해서 서열 우선적 결합을 나타내는 분자(독소루비신 같은)에 대해 스크리닝하는데 이용할 수 있다.
새로운 치료제를 검출 및/ 또는 고안하는데 어느 방법을 취하여도 유용성이 있다. 이 섹션의 파트 3인 표적 서열을 선택하기 위한 이론적 고려사항은 생물학적 시스템에서 DNA 표적부위를 선택하기 위한 이론적 고려사항을 개관한다.
1) 의학적의로 중요한 표적서열
몇가지 효과적인 바이러 스치료제가 현재 이용가능하다; 항바이러스 DNA-결합 약제에 대한 몇가지의 가능성있는 표적서열이 잘 특정화되었다.
더욱 바이러스 게놈, 세포상 게놈, 병원체 게놈(세균, 균류, 진핵성 기생균 등)을 포함하는 모든 생물학적 시스템에 대한 서열 데이타의 축적과 함께, DNA-결합 약제의 표적부위의 수가 장래에는 크게 증가될 것이다.
의학적으로 중요한 표적부위는 유전물질의 발현복제에 필요한 짧은 DNA 서열(대략 4-30 염기쌍)로서 정의될 수 있다.
예컨대, 전사 또는 복제 인자인 조절인자들에 결합하는 서열은 유전자 또는 바이러스 발현을 변경시키기 위한 이상적인 표적부위일 것이다.
두번째로 코딩서열은 유전자 기능을 파괴시키기 위한 적당한 표적부위일수 있다. 세번째로 비-코딩, 비-조절서열 조차도 표적부위(예컨대, 복제과정을 파괴시키거나 또는 증가된 돌연변이 빈도를도입하기 위한)로서 흥미있을 수 있다.
의학적으로 중요한 표적부위의 일부 특이적인 실례가 표1에 보여진다.
[표 1]
의학적으로 중요한 DNA-결합 서열
(약자: EBV, 엡스타인-바르 바이러스;EBNA, 엡스타인-바르 바이러스 핵 항원;HSV, 헤르페스 심플렉스 바이러스;VZV, 베리셀라 조스터 바이러스; HPV, 인간 파필로마 바이러스; HIV LTR, 인간면역결핍 바이러스 롱 터미날 리피트(long terminal repeat); NFAT, 활성 T 세포의 핵인자; NFKB, 핵인자 KappaB; AIDS, 후천성면역결핍증; ARC, AIDS 연관 증후군; HVB, B형 간염 바이러스; HNF, 간 핵 인자).
복제 개시점 결합단백질, 엡스타인 바르 바이러스 핵 항원(EBNA-1)(Ambinder, R.F.등; Reisman, D. 등). E2(인간 파필로마 바이러스에 의해 암호화됨)(Chin, M.T. 등). UL9(헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 1에 의해 암호화됨)(mcGeoch, D.J. 등). 및 베리셀라 조스터 바이러스(VZV)의 상동단백질(Stow, N.D. 및 Davison, A.J.)은 바이러스 게놈내에 짧은, 잘 정의된 결합부위를 가지며 따라서 경쟁적 DNA-결합 약제의 탁월한 표적 부위이다.
유사하게 전사 조절인자로서 작용하는 DNA- 결합 단백질의 인식서열은 항 바이러스 DNA-결합약제의 양호한 표적부위이다.
실례는 인간 B형 간염 바이러스(HBV)의 발현에 필요한 간 핵 인자(HNF-1)의 결합부위(Chang, H.-K.), 및 인간면역결핍 바이러스(HIV) 롱 터미날 리피트(LTR)의 NFkB 및 NFAT-1 결합부위로서 이것 중 하나 또는 둘다 바이러스의 발현에 포함될 수 있다(Greene, W.C).
DNA-결합 약제의 비-바이러스 DNA 표적의 실례가 또한 표1에서 보여지는데, 이것은 서열-특이적인 DNA-결합 분자에 대한 넓은 범위의 가능한 적용을 예시한다.
예컨대, 활성 T 세포의 핵 인자(NFAT-1)는 항원 리셉터로부터의 시그날에 대한 반응으로 인터루킨 2(IL-2) 유전자의 유도발현에 중요한 조절인자인데, 이것은 T 세포 활성화동안 분자적 사건의 캐스케이드에 필요하다(Edwards, C,A. 및 Crabtree, G.R. 참조).
두 면역억제시약인 시클로스포린 A 및 FK506의 작용기작은 NFAT-1의 유도 발현을 차단한다고 생각된다(Schmidt, A. 등 및 Banerji, S.S. 등).
그러나 이러한 약제의 효과는 NFAT-1에 특이적이지는 않다; 따라서 IL-2 인핸서의 NFAT-1 결합부위에 특이적으로 표적화된 약제가 개선된 면역억제제로서 바람직할 것이다.
DNA-결합 단백질(아마도 현재의 면역억제제의 표적)에 영향을 주는 약제로 표적화하는 것보다 DNA-결합약제로 DNA 부위에 표적화하는 것이 적어도 두가지 이유때문에 유용하다: 첫번째, 특정 단백질보다 특정 DNA 서열에 훨씬 더 적은 표적 부위가 있고(예컨대, 글루코코르티코이드 리셉터의 경우에는 각 세포에서 소수의 DNA-결합부위 대 약 50,000단백질 분자), 두번째, 단백질-결합약제는 단백질의 모든 세포기능을 무력하게 하는 반면에, DNA-결합약제에 의해서는 단지 표적화된 유전자만 영향을 받게될 필요가 있다.
후자의 요점의 실태는 인간 피브리노겐 프로모터에서 HNF-1의 결합부위이다.
피브리노겐 수준은 심장혈관질환과 가장 높게 연관된 인자중 하나이다.
피브리노겐 프로모터의 HNF-1 또는 HNF-1 결합부위에 표적화된 약제는 피브리노겐의 과잉 발현때문에 질환에 대한 높은 위험상태인 환자에게 피브리노겐 발현을 감소시키는데 이용될 수 있다.
그러나, HNF-1은 많은 정상 간 유전자의 발현에 필요하기 때문에, HNF-1 단백질을 차단하는 것은 간 기능에 유독할 것이다.
반대로, 부분적으로 HNF-1 결합부위로 이뤄지고 부분적으로 분기를 위한 측면부 서열에 의해 이뤄지는 DNA 서열을 차단함으로써 피브리노겐 유전자는 정상적인 세포상 HNF-1 기능에 해를 끼치지 않고 높은 수준의 선택성으로 표적화될 수 있다.
이 검사는 실질적으로 어떤 DNA 서열도 스크리닝하도록 고안되었다.
상기에서 기술한 대로, 의학적 중요성을 갖는 시험 서열은 바이러스 또는 미생물 병원체 게놈서열 및 발암유전자 또는 다른 부적합하게 발현되는 세포상 유전자의 발현을 조절하는 또는 내부의 서열을 포함한다.
가능성있는 항바이러스 악제의 검출뿐만 아니라, 본 발명의 검사는 또한 (i) 다른 전염성 병원체의 대사를 파괴시키고, (ii) 부적합하게 발현되는 새포상 유전잦(발암유전자 또는 어떤 유전적장애와 연관된 유전자 따위)의 전사를 차단 또는 감소시키는 가능성있는 약제의 검출, 및 (iii) 어떤 세포상 유전자의 발현의 강화 또는 변경을 위한 가능성 있는 약제의 검출에 적용할 수 있다.
2) 한정된 세트의 시험 서열
상기 섹션에서 기술된 방법은 특정한 의학적으로 중요한 DNA 표적 서열에 대해서 많은 수의 발효육즙, 추출물, 또는 다른 미지물의 혼합물을 스크리닝하는 것을 기재하고 있다. 이 검사는 또한 모든 가능한 한정된 특정 서열에 대한 단일의 약제의 상대적인 친화성을 결정하기 위해서 공지된 DNA-결합약제에 대해서 많은 수의 DNA 서열을 스크리닝하는데 이용될 수 있다.
예컨대, n=서열내의 뉴클레오티드의 수이면, 4n개의 가능한 서열이 있다. 따라서 43=64개의 다른 3 염기쌍 서열, 44=256개의 다른 4 염기쌍 서열, 45=1024개의 다른 5염기쌍 서열 등이 있다.
이러한 서열이 시험 부위인 스크리닝 서열에 인접한 부위(본 발명에서 사용된 실시예는 UL9결합 부위이다)내에 위치된다면 다른 시험 서열의 각각이 많은 다른 DNA-결합 분자에 대해서 스크리닝될 수 있다.
시험 서열은 스크리닝 서열의 한쪽 또는 양쪽에 위치할 수 있고, 시험 서열의 다른 쪽의 측면부 서열은 이중체를 안정화하고 맨위 가닥의 3' 말단에서 프라이머에 대한 어닐링 부위로서 작용하기 위한 고정된 서열이다(실시예 1 참조).
예컨대 올리코뉴클레오티드 서열은 제15도(SEQ ID NO:18)에서 보여지는대로 제조될 수 있다. 제15도에서 시험 서열과 스크리닝 서열이 표시되어 있다.
그러한 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 제조는 실시예1에서 기술되었고 제4A도 및 제4B도에서 예기되었다.
제15도에서 X:Y(X=A,C,G, 또는 T 그리고 Y=상보 서열인 T,G,C, 또는 A)로서 표시한 시험 서열은 제13도에서 보여지는 256개의 다른 4염기쌍 서열중 어떤 것일 수 있다.
모든 가능한 4 염기쌍 서열을 포함하는 한 세트의 시험 올리고뉴클레오티드가 합성되면(실시예 1 참조). 이 세트는 어떤 DNA-결합 약제로 스크리닝될 수 있다.
각 올리고뉴클레오티드 검사시스템에 대한 약제의 상대적인 효과는 시험 서열에 대한 약제의 상대적인 친화성을 반영할 것이다.
각 특별한 DNA 서열에 대한 친화성의 전체 스펙트럼에 따라서 어떤 특정한 DNA-결합 약제에 대해서 정의될 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 얻은 데이타는 분자모형제조 프로그램을 촉진하는데 이용되고 및/ 또는 직접적으로 증가된 친화성과 특이성을 갖는 새로운 DNA-결합분자를 고안하는데 이용될 수 있다.
스크리닝에 유용한 올리고뉴클레오티드의 정열된 세트의 다른 한가지 종류는 고정된 염기 조성을 갖는 스크램블(scrambled) 서열로 이뤄진 세트이다.
예를 들어, 단백질에 대한 인식서열이 5'-GATE-3'이고 라이브러리가 이 서열을 인식한 DNA-결합 분자에 대해 스크리닝되는 경우, 분석용 대조표준 서열과 동일한 크기 및 염기조성의 서열을 스크리닝하는 것이 바람직하다.
가장 정확한 실험은 모든 가능한 4bp 서열이 스크리닝되는 것이다. 이것은 44=256개의 다른 시험 서열을 나타내며, 이 수가 모든 상황에서 실행가능한 것은 아니다.
그러나 동일한 염기 조성을 가진 보다 적은 다수의 4bp 서열( 이러한 특정 염기 조성을 가진 염기 1G, 1A, 1T, 1C; n!=24의 다른 4bp 서열을 이용)이 있어서, 다수의 서열을 스크리닝하지 않아도 되는 우수한 대조표준을 제공한다.
3) 생물학적 표적 부위를 선택하는데 있어서의 이론적인 고려사항: 특이성 및 독성.
본 발명의 분석을 이용하여 스크리닝하는 서열의 선택시 한가지 고려사항은 시험 서열 접근성, 즉, 생체외 결합분자에 대한 가능한 노출이다. 세포의 DNA는 염색질에 패키징(packed)되어 있어, 대부분의 서열에 접근하는 것이 상대적으로 어렵다.
활동적으로 전사되는 서열, 특히 자연상태에서 조럴하는 서열은 덜 보호되어 단백질 및 작은 분자 둘다에 접근하기가 더욱 쉽다.
이 관찰은 뉴클레아제 및 작은 분자를 이용한 DNAase I 과민성, 푸트프린팅(footprinting) 연구에 관한 많은 문헌, 및 구조에 대한 일반적인 연구에 의해 입증되었다(Tullius).
조절서열의 상개적인 접근성은, DNAase I 과민성에 의해 결정된 바와 같이 세포 게놈의 불활성 부위보다 몇배 크다. 이러한 이유로 인해서, 세포 유전자의 조절 서열 뿐만 아니라 바이러스의 조절 또는 복제 서열도 본 발명의 분석을 이용하여 특정한 억제성 작은 분자를 식별하기 위해 선택되는 유용한 부분이다.
본 발명의 분석은 이용하여 스크리닝되는 서열의 선택에 있어서의 다른 한가지 고려사항은 가능한 시험 서열의 유일성이다.
핵 단백질 HNF-1에 대해 위에 논의된 바와 같이, 작은 억제분자는 최소 교차 반응성으로 그들의 표적서열에 특이적인 것이 바람직하다.
서열조성 및 길이는 둘다 서열 유일성에 영향을 미친다.
더욱이, 어떤 서열은 다른 유기체, 예를 들어 포유동물 바이러스의 게놈에서 보다 사람 게놈에서 더욱 낮은 빈도로 발견된다. 염기 조성 및 코돈 활용이 다르기 때문에, 바이러스 서열은 포유동물 서열과 현저히 다르다.
한가지 언급에서, 디뉴클레오티드 CG는 디뉴클레오티드 GC보다 포유동물에서 훨씬 낮은 빈도로 발견된다; 더욱이, 포유동물 바이러스인 SV40의 경우, 서열 AGCT 및 ACGT는 각각 34 및 0번이 나타난다. 이 바이어스(bias)를 명심하여 특이한 바이러스 조절 서열이 시험 서열로 선택될 수 있다. 그러한 시험 서열에 결합하는 확인된 작은 억제성 분자는 세포 기능을 덜 방해할 것이다.
사람 게놈에는 약 3 x 109염기쌍(bp)이 있다.
결정학상 데이타가 있는 대부분의 공지된 DNA-결합 약제는 2 내지 5 bp 서열에 결합한다. 44-256의 다른 4염기 서열이 존재한다; 그러므로, 평균에서 하나의 4 bp 위치가 사람 게놈에서 약 1.2 x 107번 발견된다.
각 8 염기 위치는 게놈에서 평균 약 50,000번 발견될 것이다.
표면성, 8 bp 위치에 표적화된 약제는 많은 결합 부위가 나아가재하기 때문에 세포에 해로울 것으로 보인다: 그러나, 몇가지 다른 고려사항도 알아야 한다.
첫째, 대부분의 DNA는 염색체 단백질에 단단히 싸여있어 핵에 존재하는 염색질의 비특이성 핵산내부 가수분해 소화에 의해 실증되었듯이 들어오는 DNA-결합분자에 결합하는 것이 상대적으로 어렵다(Edwerds, C.A. 및 Firtel, R.A).
활성 전사 단위는 염색체 단백질에 결합된 DNA보다 접근하기가 더 쉬우나, 염색질의 DNA에서 가장 많이 노출된 부분은 조절인자에 결합하는 부위이다.
DNAase I 과민성에 의해 실증되었듯이(Gross, D.S. 및 Garrard, W. T.).
조절 부위는 염색질 덩어리보다 핵산내부가수분해 공격에 100 내지 1000배 더 민감할 것이다.
이것은 DNA-결합 약제로 조절서열을 표적화하는 한가지 이유에 해당한다.
둘째, 2,3, 또는 4bp 서열에 결합하는 몇가지 항암제가 약제로 사용될 수 있을 만큼 충분히 낮은 독성을 가진다는 주장은, 만일 공지된 약제에 대한 높은 친화도 결합 부위가 특정한 바이러스 표적 서열과 결합되는 경우, 최근의 유용한 약제를 현재 이용되는 농도보다 낮은 농도에서 항바이러스제로 사용함과 동시에 독성을 낮출 수 있음이 가능함을 나타낸다.
[시험 매트릭스의 이용 및 데이타 분석을 위한 패턴 매칭(Pattern Matching)]
본 명세서에 기재된 분석은 단일 DNA;단백질 상호작용을 이용하여 특정 서열을 실질적으로 인식할 수 있는 서열-특이성 또는 서열-선택성 DNA-결합 분자를 스크리닝 하기 위해 고안되었다.
단일 DNA:단백질 상호작용에 대한 인식부위의 옆에 위치한 서열을 이용하여 아주 많은 수의 다른 서열이 시험되었다.
그러한 실험에서 얻어진 데이타의 분석을 매트릭스로 나타냈으며 패턴 맷칭 기술은 이용한 분석은 DNA 서열의 연관성에 대한 정보를 제공할 것이다.
본 발명 DNA:단백질 분석의 배경이 되는 기본원리는 분자가 특정 단백질에 대한 인식 서열의 측면에 있는 DNA 서열에 결합할 때는 그 단백질의 결합이 방해받는다는데 있다. 단백질 결합 방해는 다음 두가지 기작중의 어느 하나(또는 둘)에 의해 똑 일어나는 것 같은 것으로, 즉 1) 직접 공간장애에 의해서, 또는 2) DNA 분자를 통해 인식서열에 간접적으로 섭동이 전달되어 곧 일종의 알로오스테리 섭동에 의해 일어난다.
이들 두 기작은 거리영향(거리효과)을 나타내는 것 같다.
직접 공간 장애에 의한 억제에 관해서는 대단히 작은 분자에 대한 직접적 데이타는 메틸화 및 에틸화 간섭연구로부터 얻어질수 있다.
이들 데이타는, 메틸 및 에틸부분에 대해서는 공간영향이 거리영향에 의해 4-5염기쌍에 한정한다는 것을 암시한다.
그렇지만 이들 대단인 작은 분자에 대해 이론적으로 시험될 수 있는 상이한 서열의 수는 여전히 대단히 많다( 즉 5염기쌍 조합은 총계 45(=1024) 상이한 서열이 된다.
실제로는 시험된 서열의 크기는 크기가 다른 시험 DNA-결합 분자에 대해 실험적으로 탐구될 수 있다. 서열 복잡도를 증가시키면서 다양한 종류의 서열을 통상적으로 조사할 수 있다. 이것은, 올리고 뉴클레오티드를 합성하고 분석관점에서 올리고뉴클레오티드를 다중화시킴으로써 (즉 단일 분석에 일군의 상이한 올리고뉴클레오티드를 사용하여) 또는 시험 메트릭스내에 통합된 서열을 사용함으로써 효율적으로 행해질수 있다.
상기를 고려할 때, 특정 단백질 및 그 단백질에 대한 특정 인식부위를 갖고 있고 인식부위의 어느 쪽에는 다른 서열이 옆으로 위치해 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 분석을 사용하여, 개별적 서열 또는 관련서열쪽에 대한 결합 선호성을 가진, 소분자를 포함하는 많은 상이한 분자들을 동시에 스크리닝할 수 있다.
제12도는 시험 매티릭스의 분석으로 경쟁서열 특이성의 성질에 대한 정보를 얻는 방법을 예시한다. 예로서, 256개의 가능한 테트라 뉴클레오티드 서열의 각각을 우선적으로 인식할 수 있는 분자들을 스크리닝하기 위해서(제13도), 각 구성체에서 동일한, UL9 oriS의 11 bp 인식서열(SEQ ID NO. 15)에 바로 인접해 있는 이들 256 서열을 갖고 있는 올리고뉴클레오티드를 구성할 수 있을 것이다.
제12도에서 ＂+＂는 혼합물이 용액내에서 DNA: 단백질 복합체를 형성하는 것을 지연 또는 저지시키는 것을 표시하고 ＂-＂ 는 혼합물이 DNA:단백질 상호작용에 별 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 제12도로부터의 시험결과는 다음표에 요약되어 있다.
[표 2]
이들 결과는 어떻게 그런 매트릭스가 시험혼함물내에 있어 서열특이성 결합활성의 존재에 관한 데이타를 제공하고 또한 비특이 결합에 대해 본질적 통제력을 제공하는가를 보여준다. 예컨대 여러시험 분석에 대한 시험혼합물 #8의 영향을 시험 혼합물은 서열 CCCT를 갖는 올리고 뉴클레오티드에 우선적으로 영향을 미친다는 것을 밝혀준다. 시험혼합물 #8이 영향을 나타내기 위해서 서열이 반드시 시험부위내에 있을 필요가 없다는 것을 유의해야 할 것이다. 데이타를 매트릭스로 나타냄으로서 다른 시험혼합물에 의해 영향을 받은 서열의 분석이 용이해진다.
[다른 응용]
서열-특이성 DNA-결합 분자에 대한 잠재적 약제 용도는 항 바이러스제, 항균제, 항박테리아제, 항 종양제, 면역억제제 및 심장혈관 약제를 포함하여 광범하다. 서열-특이성 DNA-결합분자는 예컨대 특이 서열 프로브와 같은 분자 시약으로서도 유용하다.
더 많은 분자가 검출됨에 따라, DNA- 결합분자의 성질에 관한 정보가 수집될 것이고, 결국은 상이한 또는 특수한 활성을 가진 새로운 분자의 설계 및/또는 변형이 용이해질 것이다.
서열-특이성 DNA-결합 분자의 검출에 관해 분석을 설명하였지만, 팹티드 서열특이성 단백질 결합 억제제를 찾기 위해 단백질에 과잉의 DNA를 가함으로써 역 분석이 수행될 수도 있다.
다음의 예는 본발명을 예시하지만 결코 발명을 제한한다는 것은 아니다.
[재료 및 방법]
시판품인 자동 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 합성뉴클레오티드를 제조했다. 다른 방법으로는, 더불어 신테틱 제네틱스사(Synthetic Genetics, San Diego, CA)로부터 주문설계된 합성 올리고뉴클레오티드를 구입할 수도 있을 것이다.
상보적 스탠랜드들을 어닐링하여 이중 스트랜드 올리고뉴클레오티드를 만들었다.
제한효소는 Boehringer Mannheim (Indianapolis IN) 또는 New England Biolabs (Beverly MA)로부터 얻어 제조자 지시대로 사용했다.
디스타마이신 A 및 독소루비신은 Sigma(St. Louis, Mo)로부터 구득했다. 악티노마이신 D는 Boehringer Mannheim 또는 Sigma로부터 구입했다.
[실시예1]
[스크리닝 서열을 포함하고 있는 올리고뉴클레오티드의 제조]
이 실시예는 스크리닝 서열 및 선정된 시험서열을 가진, (i) 비오티닐화/디곡시기닌/방사성표지된 올리고뉴클레오티드 및 (ii) 방사성표지된 이중 스트랜드 올리고뉴클레오티드의 제조를 설명한다.
[비오티닐화]
상기와 같이하여 올리고 뉴클레오티드를 제조했다.
HSV로부터 얻어진, UL9 결합 부위를 위한 야생형 대조서열은 제4도에 표시되어 있다. 스크리닝 서열 즉 UL9 결합서열은 CGTTCGCACTT (SEQ ID No:1) 이며 제4A도에 밑줄처져 있다. 전형적으로는, 스크리닝 서열에 대한 서열 5' 및/ 또는 3'는 선정된 시험 서열에 의해 대치되었다. (제5도).
부위 특이적으로 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드의 한 제조실시예가 제4도에 약시되어 있다. 스크리닝 서열-함유 올리고뉴클레오티드의 3'서열에 상보적인 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 합성했다. 이 올리고 뉴클레오티드는 스크리닝 서열의 위치9에 있는 C에 해당하는 잔기에서 끝났다.
스크리닝 서열을 가진 올리고 뉴클레오티드에 프라이머 올리고뉴클레오티드를 혼성화시켰다. 비오틴-11-dUTP(Bethesda Research Laboratories(BRL), Gaithersburg MD) 및 클레노우 효소를 이 복합체에 가하고(제4도), 제작자의 지시대로 사전 제작된 G-25 Sephadex 회전칼럼(Pharmacia, Piscataway NJ) 또는 ＂NENSORB＂칼럼(New England Nuclear)를 사용하여 위에서 얻어진 부분적으로 이중 스트랜드화된 비오티닐화 복합체를 통합되지 않은 뉴클레오티드로부터 분리했다.
남는 단일 스트랜드 구역을, DNA 폴리머라제 1 클레노우 단편 및 dNTP를 사용하여 이중 스트랜드로 변경시켜, 전체가 이중 스트랜드인 올리고뉴클레오티드를 얻었다.
두번째의 G-25 Sephadex 칼럼을 사용하여 이중 스트랜드의 올리고 뉴클레오티드를 정제했다. 올리고 뉴클레오티드를 10mM Tris-HCL, pH 7.5, 50mM NaCl 및 1mM EDTA 중에 희석 또는 현탁시키고 -20℃에 저장했다.
복합체를 방사성 표시하기 위해, 이중 스트랜드 완성단계를 위해 dCTP를32P-알파-dCTP(New England Nuclear, Wilming, DE)로 대치시켰다.
그와는 달리, γ-32P-ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나제(NEB, Beverly, MA)로 상부 스트랜드, 프라이머 또는 완전 이준 스트랜드 올리고 뉴클레오티드를 방사성 표지했다. 예비 연구에서는 방사성표지된, 이중 스트랜드 올리고뉴클레오티드를 사용했다.
올리고뉴클레오티드는, 프라이머를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 γ-32P-ATP로 방사성표지하고, ＂상부＂ 스트랜드 전장 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 클레노우 단편 및 3인산 데옥시뉴클레오티드로 채워 제조한다. 포스포릴화 및 두번째 스트랜드 합성후, G-25 Sephadex 예비성형 회전칼럼(IBI 또는 Biorad)을 사용하여 완충액 및 비 삽입된 삼인산염으로부터 올리고뉴클레오티드를 분리했다.
이 공정은 제4B도에 대략 표시되어 있다. 모든 상기 클레노우 반응에 대한 반응 조건은 다음과 같다: 10mM Tris-HCL, pH 7.5, 10mM MgCℓ, 50mM NaCℓ, 1mM 디티오에리트리톨, 0.33-100μM 데옥시트르포스페이트, 2 단위 클레노우 효소(Boehringer- Mannhiem, Indianapois in), 클레노우 반응은 25℃에서 15분 내지 1시간동안 유지시켰다.
폴리뉴클레오티드 키나제 반응은 37℃에서 30분 내지 1시간동안 유지시켰다.
[디곡시게닌으로서 말단 표지]
비오티닐화된, 방사성표지된 올리고뉴클레오티드 또는 방사성표지된 올리고뉴클레오티드를 상기와 같이 단리하고, 0.2M 카코딜산 칼륨(pH=7.2). 4mM MgCℓ 2, 1mM 2-메르캅토 에탄올 및 0.5 mg/㎖소혈청 알부민중에 재현탁했다.
이 반응혼합물에 디곡시게닌-11-dUTP(11-원자 스페이서 아암을 경유하여 테곡시게닌에 결합된 dTTP)의 동족체인 2'-데공시-우리딘-5' 트리포스페이트(Boehringer Mannheim, Indianapolis IN) 및 말단 데옥시 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(GIBCO BRL, Gaithersburgm MD)를 가했다. 이 방법을 사용하여 통합된 Dig-11-dUTP의 수는, 처리된 단편의 폴리아크릴아미트겔에 대한 전기영동적 이동성을 길이가 알려진 올리고 뉴클레오티드와 비교하여 판단했을 때 5이하(아마 단지 1이나 2)인것 같았다.
비오티닐화 또는 비 비오티닐화된, 디곡시게닌을 함유하는, 방사성표지된 올리고 뉴클레오티드를 상기와 같이 단리하고, 결합 분석에 사용하기 위해 10mM Tris-HCℓ, 1mM EDTA, 50mM NaCℓ, pH 7.5중에 재현탁했다.
제4도에 표시된 것에 상보적인 스크리닝 서열과 그 분자의 3' 말단에 상보적인 프라이머를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 사용하여 다른 스트랜드를 비오티닐화하기 위해서도 상기 과정을 사용할 수 있다.
비오티닐화를 행하기 위해 비오틴-11-dUTP를 비오틴-7-dATP로 대치했다.
비오티닐화는, 화학적 합성법, 예컨대 활성화된 뉴클레오티드를 올리고 뉴클레오티드내에 통합하고 이어서 활성기가 NHS-LC-Biotin 과 반응되게 함으로써도 수행될 수 있다. 다른 비오틴 유도체도 사용될 수 있다.
[올리고 뉴클레오티드의 방사성표지]
대체적으로 각각 감마-32P-ATP 또는 알파-32P-데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 또는 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편으로 올리고 뉴클레오티드를 방사성표지했다. 표지반응은, 완충액내에서 또한 제작자(New England Biolabs, Beverly MA; Bethesda Research Laboratories, Gaithersuburg MD; 또는 Boehringer/ Mannheim, Indianapolis IN)가 추천한 방법으로 행하였다.
올리고뉴클레오티드는, 제작자의 지시에 따라 G-25 Sephadex 예비성형 회전칼럼(IBI, New Haven, CT; 또는 Biorad, Richmond, CA)또는 ＂NENSORB＂ 예비성형칼럼(New England Nuclear, Wilmington, DE)을 사용하여, 완충액 및 비 삽입된 삼임산염으로 부터 분리했다.
두번째 스트랜드를 효소적으로 합성해야 할 몇가지 이유가 있다.
그 두 가지 주 이유는, 과잉 프라이머의 사용에 의해 두번째 스트랜드 합성은 거의 완성에 이를 수 있어 거의 모든 상부 스트랜트들이 하부 스트랜드에 어닐링하고, 이에 의해 상부의 단일 스트랜드들이 뒤로 접어져 추가의 무관한 이중 스트랜드 구조를 형성하는 것이 방지될 수 있는 것이 첫째 이유이고, 두번째로는 모든 올리고뉴클레오티드가 공통 프라이머로 프라이밍되기 때문에, 프라이머는 말단 표지를 가질 수 있어 모든 올리고뉴클레오티드가 정확하게 같은 특히 활성으로 표지될 수 있다는데 있다.
[실시예 2]
[UL9 단백질의 제조]
[pAC 373 내에 UL9 코딩서열의 클로닝]
전장 UL9 단백질을 발현하기 위해 바큘로 바이러스 발현 시스템을 사용했다. Herpes Simplex 바이러스의 UL9 코딩영역의 서열은 McGeoch 등에 의해 개시되었고 EMBL 핵산서열로서 이용가능하다. UL9 코딩 서열을 함유한 재조합 바큘로 바이러스 AcNPV/UL9는 Mark Challnerg (National Institutes of Health, Bethesda MD)로부터 얻었다.
이 벡터의 구조는 그 전에 기재되었다(Olivo등(1988, 1989)). 간단히 말하면, Nar I/EcoRV 단편은 pMC160 로부터 유도되었다(Wu 등). 모든 네 dNTP 및 DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편(Boehringer Mannheim, Indianapolis IN)을 사용하여 상기 단편에 블런트 말단을 만들어 말단 돌출부(오버행)을 메꾸었다. 얻어진 단편을 바큘로바이러스 벡터 pAC3T3의 유일한 BamHI 부위에 블런트-말단 연결했다(Summers등).
[pVL1393내에 UL9코딩서열의 클로닝]
UL9 코딩영역을 두번째 바큘로바이러스 백터 pVL1393내에 클로닝했다(Luckow 등).
UL9 유전자를 함유하는 3077 bp NarI/EcoRV 단편을 벡터 pEcoD( Eye Research Institute, Boston, MA의 Bing Lan Rong로부터 얻음)로부터 절제했는데, 플라스미드 pEcoD 는, UL9 유전자를 지닌 HSV-I로부터 유도된 16.2 kb EcoRI 단편을 함유한다(Goldin등).
상기와 같이 UL9를 함유하는 단편에 블런트 말단을 만들었다.
EcoRI 링커(10 량체)를 블런트-말단의 NarI/ EcoRV 단편에 블런트-말단 연결했다(Ausubel 등; Sambrook등).
벡터 pVL1393(Luckow 등)을 EcoRI으로 소화시키고 선형화된 벡터를 단리했다. 이 벡터는 폴리링커 클로닝 부위의 상류 폴리헤드론 유전자의 코딩 구역에 5'말단의 35 뉴클레오티드를 함유한다. 기능성 ATG를 가진 코딩서열을 함유하지 않은 재조합 클론에서의 변역개시를 방지하기 위해, 폴리헤드론 유전자 ATG를 ATT로 돌연변이시켰다. EcoRI/UL9 단편을 선형화된 백터내에 연결하고 연결혼발물은 E. coli로 형질전환시키고 암피실린 저항성 클론을 선별했다.
클론으로부터 회수된 플라스미드를 제한소화에 의해 분석하고, 아미노 말단 UL9 코딩 서열이 폴리헤드론 유전자의 5' 말단으로 배향된 삽입체를 가진 플라스미드를 선별했다. 이 플라스미드가 소화된 pVL1393/UL9 이었다. (제7도).
pVL1393/UL9를 야생형 바큘로바이러스 DNA(AcMNPV; Summers등)와 함께 SF9 (Spodoptera frudiperda) 세포내에 코트랜드펙션시켰다(Summers등).
재조합 바큘로바이러스로 감염된 sf9 세포를 확인하고 클로닝적으로 정제했다(Summers등).
[UL9 단백질의 발현]
재조합 바큘로바이러스 가염 Sf9 세포의 클론 단리물을 Summers 등이 기술한 대로 Grace의 배지에서 생장시켰다. 세포를 조직배양판으로부터 긁어내어 원심분리(2,000 rpm, 5분간, 4℃에 의해 수집했다.
그런 다음 인산염 완충염수(PBS_로 세포를 한번 세척했다(Maniatis 등). 세포 펠렛을 -70℃에서 동결시켰다. 용해를 위해, 세포를 pH 7.5 10% 글리세롤, 1.7M NaCℓ, 0.5mM EDTA, 1mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.5 mM 플루오르화 페닐메틸술포닐(PMSF)의 1.5체적의 20mM HEPES 내에 재현탁했다.
세포 용해질을 초원심분리(Beckman 탁자형 원심분리기, TLS 55 회전자, 34krpm, 1시간, 4℃)에 의해 맑게 했다. 상징액을 4℃에서 하룻밤동안 2리터 투석완충액(20mM HEPES, pH7.5, 10% 글리세롤, 50mM NaCℓ, 0.5mM EDTA, 1mM att, 및 0.1mM PMSF)에 대해 투석했다.
이들 부분 정제된 추출물을 제조하고 DNA:단백질 결합 실험에 사용했다. 필요에 따라 ＂CENTRICON 30＂ 여과장치(Amicon, Danvers MA)를 사용하여 추출물을 농축했다.
[절단된 UL9 단백질의 클로닝]
UL9의 C말단 삼분의 일 및 3' 측방 서열을 코드하는 서열, 약 1.2kb 단편을 박테리아 발현벡터 pGEX-2T 내에 서브클론했다(제6도).
pGEX-2T는 스미드등의 pGEX-1 백터의 변형체로 그 변형은 트롬빈 절단서열 인프레임(내골격)에 글루타티온-S-트란스페라지 단백질(gst)를 삽입하는 것을 포함한다.
UL9의 C말단 317 아미노산을 암호화하는 951 bp 영역 및 3' 비번역된 영역을 포함하는 pEcoD 의 1,194bp BamHI/EcoRV 단편을 단리했다.
이 BamHI/EcoRV UL9 카르복시-말단(UL9-COOH)를 함유하는 단편을 블런트 말단시키고 EcoRI 링커를 상기와 같이 가하였다.
EcoRI 링커는, UL9 코딩서열이 gst-트롬빈 코딩서열에 인프레임 융합될 수 있게 하도록, 설계했다. 링커연결된 단편을 단리하고 EcoRI로 소화했다.
pGEX-2T 벡터를 EcoRI로 소화하고 송아지 장 알칼리성 포스파타제(CIP)로 처리하고 선형벡터를 단리했다. EcoRI 연결된 UL9-COOH 단편을 선형벡터에 연결했다(제6도).
연결 혼합물을 E.coil로 형질전환시키고 암피실린 저항성 집락을 선별했다.
플라스미드를 암피실린 저항성 집락으로부터 분리시키고 제한효소 소화에 의해 분석했다. 프레임 융합에서 gst/트롬빈/UL9-COOH를 생성시킨 플라스미드를 확인하고 (제6도) pGEX-2T-UL9-COOH로 명명했다.
[절단된 UL9-단백질의 발현]
E. coil 균주 JM 109를 pEGX-2T/UL9-COOH로 형질전환하고 하룻밤동안 포화밀도가 되도록 37℃에서 성장시켰다.
얻어진 배양물을 암피실린을 함유하는 LB 배지와 1:10 희석하고 30℃에서 1시간동안 생장시켰다. 최종농도가 0.1 mM이 되도록 IPTG(이소프로필티오-β-갈락토시드)(GIBCO-BRL)를 가하고 2-5시간동안 배양을 계속했다.
플라스미드를 함유하는 박테리아 세포를 온도변화 및 IPTG 조건에 놓여지게 했고 이로 인해 tac 프로모터로부터의 전사가 유기되었다.
원심분리에 의해 세포를 수득하고 배양물 체적의 1/100의 MTPBS (150mM NaCℓ, 16mM Na2HPO4, 4mM NaH2PO4)내에 재현탁했다. 세포를 초음파에 의해 용해시키고 용해질을 원심분리에 의해 세포찌꺼기가 없도록 깨끗이 했다.
스미드등이 상세히 설명한 방법으로 융합 단백질을 글루타티온 아가로오스 친화 컬럼상으로 정제했다. 융합단백질을 글루타티온이 감소된 친화 칼럼으로로 용출하고, UL9 투석 완충액(20mM HEPES pH 7.5, 50mM Nacℓ, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 0.1 mM PMSF)에 대해 투석하고 트롬빈(2 ng/융합단백질 ㎍)으로 절단했다.
pGEX-2T/C-UL9-COOH 함유 세포의 IPTG-유기 배양물으로부터 얻어진 상징액의 일부 및 친화-정제된, 트롬빈-절단된 단백질의 일부를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석했다. 이 분석의 결과는 제8도에 나타나 있다.
63킬로 달톤 GST/C-UL9 융합 단백질이 GST-UL9로 표시된 레인(레인2)에서 가장 큰 밴드(띠)이다. 첫째 레인은 표준 단백질 크기를 포함하고 있다.
UL9-COOH 단백질 밴드(레인 GST-UL9 + 트롬빈, 제8도, 레인3)는 30과 46 kD 사이에 위치한 밴드로서, 글루타티온 트랜스퍼라제는 30kD 크기표준 바로 아래에 위치해 있다. 별도의 실험에서는 비유기된 배양물을 사용하여 유사한 분석을 했는데, 크기에 있어 융합 단백질에 대응하는 단백질은 나타나지 않았다.
추출물은 사용하기전에 투석했다. 또한 필요에 따라 대체로 ＂CENTRION 30＂ 필터를 사용하여 여과함으로써 추출물을 농축했다.
[실시예 3]
[결합분석]
[밴드 이동겔]
표지된 착체 및 유리 DNA를 함유하는 DNA: 단백질 결합 반응물을 4-10% 폴리아크릴 아미드/ 트리스-붕산염-EDTA(TBE)겔상에서 전기영동적으로 분리했다(Freid 등; Garner 등).
그런 다음 겔을 고절하고 건조하고 X-선 필름에 노출시켰다.
겔의 오오토라디오그램(방사선 사진)을 밴드이동 패턴에 관해 조사했다.
[필터 결합분석]
특히 단백질:올리고뉴클레오티드 착체에 대한 오프-레이트(off-rate)를 구하는데 사용되는 두번째 방법은 필터 결합법이다(Woodbury 등).
결합완충액(다음을 보라) 내에 담구어 두었던 니트로셀룰로오스 디스크(Schieicher & Schuell, BA85 필터)를 진공필터 장치위에 올려 놓았다.
DNA:단백질 결합반응물(하기 참조:일반적으로 15 내지 30 ㎕)을 결합 완충제(이것은 복합체를 해리시키지 않으며 성분의 농도를 희석한다)를 사용하여 0.5㎖로 희석시키고 사용되는 진공상태에서 디스크를 사용한다.
저염상태하에서 DNA:단백질 복합체는 필터에 부착되며 유리된 DNA는 통과된다.
디스크를 신틸레이션 계수유체(New England Nuclear)에 넣고 cpm은 신틸레이션 계수기를 사용하여 결정된다.
이 기술은 (i) 반응희석액과 세척부피가 감소되고 (ii) 필터를 통한 흐름속도는 진공 압력을 조정함으로써 통제된다는 것을 제외한 상기 프로토콜을 사용하는 96-/ 웰과 72-슬로트 니트로셀룰로스 릴터 플레이트에 적합하였다.
이 방법은 분석될 수 있는 분석샘플에 널리 이용된다.
방사성 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 샘플을 니트로셀룰로스 필터에 사용하고, 이 필터를 X선 필름에 노출시키고 나서, 분자역한 스케닝 농도계를 사용하여 분석한다.
이 시스템은 분석 및 그래프 작도를 위해 분석 소프트웨어 프로그램(예, Excel)에 직접적으로 이동시킬 수 있다.
[실시예 4]
[기능 UL9 결합분석]
[기능적 DNA-결합 활성도 분석]
정제된 단백질을 밴드-이동분석을 사용하여 기능적 활성도에 대해 검사하였다.
11 bp 인지서열을 함유하는 방사성표지된 올리고뉴클레오티드(실시예 1B 에서 제조됨)를 결합 완충제중에서 UL9 단백질과 함께 혼합시켰다(최적반응상태: 0.1 ng32P-DNA, 1㎕ UL9 추출물, 20mM HEPES, pH 7.2, 50mM KCℓ 및 1mM 및 1mM DTT). 반응물을 실온에서 10분동안 배양(결합은 2분 미만에서 발생한다) 시키고 나서 4-10% 비변성 폴리아크릴 아미드겔에서 전기영동으로 분리한다. 올리고뉴클레오티드에 대한 UL9-이 결합은 UL9 단백질의 존재하에서 겔에서 올리고뉴클레오티드의 움직임을 이동시킴으로써 나타내나 이것의 결여시에는 그렇지 않다.
(+) UL9 단백질을 함유하나 (-) UL9단백질과 친화성으로 정제된 UL9단백질이 없는 박테리아 추출물이 이 분석에서 검사되었다. UL9 또는 친화성으로 정제된 UL9 단백질을 함유하는 박테리아 추출물만이 겔 밴드-이동표시 단백질 결합을 발생시킨다.
올리고뉴클레오티드에 상대적으로 과량인 UL9 단백질을 획득하기 위해서 반응혼합물에 부가되어지는데 요구되는 추출물의 정도는 각각의 단백질 제조물/추출물에 대해서 경험적으로 결정되었다. 분별된 제조물을 반응혼합물에 부가하고 상기처럼 처리하였다. DNA:단백질 복합체에서 나타나는 다량의 표지된 올리고뉴클레오티드에서 추출물의 양은 밴드-이동 또는 필터 결합분석으로서 측정되었다.
이 분석은 단백질의 최소량이 대부분의 DNA에 결합되는 조건에서 매우 민감하다. 과량의 단백질은 분석의 민감성을 감소시킬 수 있다.
[해리속도]
해리속도는 경쟁분석을 사용하여 결정된다.
UL9(SEQ ID NO: 14)에 대한 결합부위를 함유하는 제4도에 나타낸 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드는32P-ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나제로 방사성표지되었다.
(Betheda Research Laboratoriors). 경쟁자 DNA는 UL9에 대한 결합부위를 함유하는 17 염기쌍 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO:16)였다.
경쟁분석에서 결합반응물(실시예 4A)은 각각의 올리고뉴클레오티를 회합시켰고 얼음위에 놓여졌다. 비료지된 올리고뉴클레오티드(1㎍)를 8% 폴리아크릴아미드겔에서 반응물을 로딩하기전에 1,2,4,6 또는 21시간 부가하여(TBE 완충제에서 실시한다(Maniatis et al.)) 반응물 성분을 분리시켰다. 이 상태하에서 절단된 UL9(UL9-COOH)와 보통의 길이 UL9에 대한 해리속도는 4℃에서 대략 4시간이다. 게다가 UL9 결합서열과 절단변형된 청어정자 DNA(100,000배 초과량)를 함유하지 않는 랜덤 올리고뉴클레오티드(10,000배 초과량)를 검사하였다: 이 대조표준 DNA 의 어느 것도 UL9 결합부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드와의 결합에 경쟁하지 않았다.
[UL9 결합분석의 최적화]
[박테리아 표시시스템으로부터 절단된 UL9]
결합에서 다음 성분의 효과 및 이것의 동족결합부위를 가지는 UL9-COOH의 해리속도는 검사 및 최적화되었다:
완충상태(pH, 완충제의 종류, 및 완충제의 농도로 이루어짐);1가 양이온의 종류 및 농도; 2가 양이온 및 중금속의 존재; 온도; 다른 농도에서 여러 가지 다가 양이온; 및 다른 농도에서 다른 산화환원 시약. 주어진 성분의 효과는 상기 주어진 반응 상태로 출발하여 실시예 4B 에 기술된 해리반응에 근거를 두고 측정되었다.
HSV ori 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO:1)에 대해 박테리아 추출물에 함유된 UL9-COOH의 결합(실시예 2E)를 위해 사용된 최적화된 상태는 다음과 같다 :
20mM HETES, pH 7.2, 50mM KCℓ, 1mM DTT, 0.005-0.1ng 방사상표지된(특정활성도, 대략 108cpm/ ㎍) 또는 디곡시진화된, 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드로 4℃에서 약 4시간이고 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드로 5-10분의 해리속도를 가진다.
UL9-COOH의 해리속도는 다른 물리적 상태하에서 두드러지게 변한다.
일반적으로 UL9 단백질 제조물의 활성도는 겔-밴드-이동분석을 사용하여 평가되었고 표분방법으로서 추출물의 전체 단백질 함유량에 관계가 있었다.
실험결합분석에서 사용된 UL9의 순도에 의존하는 청어정자 DNA의 부가물은 5-30분동안 25℃에서 배양하였다.
[간상형 바이러스 시스템으로부터 보통의 길이 UL9 단백질]
보통의 길이 간상형 바이러스-생성된 UL9 폴리팹티드에 대한 결합반응 상태도 또한 최적화되었다. 전류분석에 대한 최적상태는 다음처럼 결정되었다:
20mM Hepes; 100 mM NaCℓ; 0.5mM 디티오트레이톨; 1mM DETA, 5% 글리세롤; 절단된 청어정자 DNA의 0 내지 104배 초과량;0.005-0.1 ng 방사성표지된(특정 활성도, 대략 108cpm/㎍) 또는 디곡시진화된, 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 5-10 ㎍ 미정제 UL9 단백질 제제. 완전한 길이의 단백질도 또한 절단된 UL9-COOH 단백질에 대해 수립된 최적상태하에서 웰에 결합한다.
[실시예 15]
[UL9 단백질의 오프-레이트(Off-Rate)에서 검사서열변화의 효과]
제5도에 나타낸 올리고뉴클레오티드는 상기 기술된 것으로서 방사성 표지되었다. 경쟁분석은 UL9-COOH를 사용하여 실시예 4B 에서 기술된 것으로서 수행되었다.
방사성표지된 올리고뉴클레오티드를 결합완충제중에서 UL9-COOH 단백질과 함께 혼합하였다(전형적인 반응: 0.1ng 올리고뉴클레오티드32P0DNA, 1㎕ UL9-COOH 추출물, 20mM HETES, pH 7.2, 50mM HCℓ, 1mM DETA, 및 1mM DTT).
반응물을 10분동안 실온에서 배양하였다.
그리고나서 제로타임 포인트 샘플(aero time point sample)을 넣고 8% 폴리아크릴아미드겔에 로드하였다(TBE를 사용하여 실시한다).
비표지된 17 bp 경쟁 DNA 올리고뉴클레오티드 1㎍(SEQ ID NO:16) (실시예 4B)를 겔에 반응물 샘플을 로딩하기전에 5,10,15,20 또는 60분에 부가하였다.
이 분석의 결과는 제9도에 나타났다: UL9 결합부위 측면에 위치하는 스크리닝 서열(SEQ ID NO: 5-SEQ ID NO:13)은 매우 다르나 UL9의 오프-레이트에서 약간의 영향를 미친다. 따라서, 이 결과는 UL9 DNA 결합 단백질이 적당한 스크리닝 서열에 위치된 검사 서열에 실질적으로 독립적인 결합 친화성을 가지는 이중 DNA 에서 스크리닝 서열에 효과적으로 결합한다는 것을 나타낸다.
필터 결합 실험도 같은 결과를 준다.
[실시예 6]
스크리닝 서열에 결합하는 UL9에서 악티노마이신 D, 이스타마이신 A. 및 독소루비신의 효과는 특이검사서열에 의존하다.
여러 가지 올리고뉴클레오티드, 검사서열(SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 13)에 의해서 5' 및 3' 측면에 위치된 스크리닝서열(SEQ ID NO:1)이 함유된 것의 각각은 UL9-COOH 결합에서 디스타마이신 A, 악티노마이신 D, 및 독소루비신의 효과에 대해서 측정되었다.
결합분석은 실시예5에 기술된 것처럼 수행되었다.
이 분석에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 제5도에 나타난다.
이 분석 혼합물은 약품을 부가시키기 전에 실온에서 15분동안 사전 평형시켰다. 디스타마이신 A의 농축된 용액을 dH20에서 제조하여 다음 농도로 결합반응물에 부가하였다: 0.1μM, 4μM, 16μM, 및 40μM.
약품을 부가하고 1시간동안 실온에서 배양시켰다.
그리고나서 반응혼합물을 8% 폴리아크릴아미드겔에 로드하였고(실시예 5) 성분을 전기영동으로 분리시켰다. 이 겔의 방사성 사진을 제10A도에 나타낸다.
검사된 검사서열은 다음과 같았다: UL9 폴리 T, SEQ ID NO:9; UL9 CCCG, SEQ ID NO: 5; UL9 GGGC, SEQ ID NO: 6; UL9 폴리A, SEQ ID NO: 8; 및 UL9 ATAT, AEQ ID NO:7.
이 결과는 디스타마이신 A가 UL9 폴리T, UL9 폴리A 및 UL9 ATAT 결합을 우선적으로 분리시킨다고 설명한다.
악티노마이신 D의 농축용액을 dH20에서 제조하고 다음 농도로 결합반응물에 부가하였다: 0 μM 및 50μM 약품을 부가하고 1시간동안 실온에서 배양시켰다.
dH20의 등량부피를 통제샘플에 부가하였다.
그리고나서 반응혼합물을 8% 폴리아크릴아미드겔에 로드하였고(실시예5), 성분을 전기영동으로 분리하였다. 이 겔의 방사성 사진은 제10B도에 나타낸다.
디스타마이신 A로 상기 검사된 검사 서열에다가 다음의 검사서열도 또한 악티노마이신 D로 검사되었다: AToriℓ, SEQ ID NO:11; oriEco2, SEQ NO:12, 및 ori Eco3, SEQ ID NO: 13, 이 결과는 악티노마이신 D가 올리고뉴클레오티드 UL9 CCCG 및 UL9 GGGC에 대하여 UL9의 결합을 우선적으로 분리시킨다고 설명한다.
독소루비신의 농축용액을 dH20중에서 제조하고 다음농도로 결합반응물에 부가하였다: 0 μM, 15 μM, 35μM. 약품을 부가하고 1시간동안 실온에서 배양시켰다. dH20의 등량부피를 통제 샘플에 부가하였다.
그리고나서 반응혼합물을 8% 폴리아크릴아미드겔에 로드하고 성분을 전기영동으로 분리시켰다. 이 젤의 방사선 사진을 제10C도에 나타낸다.
동일 검사서열을 악티노마이신 D로서 검사하였다. 이 결과는 독소루비신이 올리고뉴클레오티드 UL9 폴리 T, UL9 GGGC, oriEco2, 및 oriEco3에 대한 UL9의 결합을 우선적으로 분리시킨다고 설명한다.
특히 독소루비신은 검사서열 oriEco3가 사용될 때 UL9:스크리닝 서열 상호작용을 붕괴시키는 것으로 나타난다. oriEco2가 oriEco3에 대한 시험서열의 서열은 하나의 염기만 다니다: 위치 12에 삽입된 추가 T 잔기이며, SEQ, ID NO:12와 SEQ ID NO:13을 비교하라.
[실시예 7]
[비오틴/스트렙타비딘 리포터 시스템의 사용]
[단백질이 없는 DNA의 포획]
여러 가지 방법이 DNA:단백질 복합체로부터 비결합된 DNA를 고립시키는데 사용되었다.
[마그네틱 비드]
스트렙타비딘-컨쥬게이트된 수퍼파라마그네킥 폴리스티렌 비드(다이나비드 M-280 스트렙타비딘, Dynal AS, 6-7 x 108비드/㎖)를 결합 완충제로 세척하고나서 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드를 포획하는데 사용하였다(실시예 1).
비드를 결합 완충제와 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 15㎕결합 반응 혼합물에 부가한다. 비드/올리고뉴클레오티드 혼합물을 반응혼합물로 시간의 길이를 변화시키면서 배양시켜 단백질이 없는 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드의 포획을 최대로 하는 배양시간을 결정한다. 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드를 포획한 후, 비드를 마그네틱 랙중의 반응튜브에 위치시킴으로써 회수할 수 있다(96-웰 플레이트 마그네트는 Dynal에서 시중 구입할 수 있다). 그리고나서 비드를 세척한다.
[아가로오스 비드]
비오티닐화된 아가로오스 비드(고정된 D-비오틴, Pierce, Rockford, IL)를 4℃에서 밤새도록 결합완충제에서 50 ㎍/㎕ 아비딘으로 비드를 처리함으로써 아비딘에 결합시킨다. 이 비드를 결합 완충제에서 세척하고 비오티닐화된 DNA를 포획하는데 사용한다. 비드를 결합혼합물로 혼합하여 비오티닐화된 사용한다. 비드를 결합혼합물로 혼합하여 비오티닐화된 DNA를 포획한다.
이 비드를 비-결합 필터 디스크에서 원심분리 또는 수집으로써 제거한다. 상기 방법 어느 하나의 경우, 올리고뉴클레오티드의 존재의 수량화는 올리고뉴클레오티드를 표지화하는 방법에 의존한다. 올리고뉴클레오티드를 방사능으로 표지한 경우:
(i) 비트 및 상청액을 폴리아크릴아미드겔에 로드하여 전기영동과 수행된 방사선 사진으로써 비드: DNA 복합체로부터 단백질:DNA 복합체를 분리시킬 수 있다:
(ii) 비드를 신틸레이션 유체에 위치시켜 신틸레이션 계수기에서 계산할 수 있다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드의 존재는 화학발광 또는 비색정량 검출시스템을 사용하여 결정할 수 있다.
[단백질이 없는 DNA의 검출]
DNA는 디곡시게닌-11-dUTP로 말단 표지된다(실시예1).
항원성 디곡시게닌 부분을 항체-효소 컨주게이트, 항-디곡시게닌-알칼리 포스파타아제(Boehringer Mannheim Indianapolis IN)로서 인지시킨다.
그리고나서, DNA/ 항원-효소 컨쥬게이트를 선택된 기질에서 노출시킨다.
dig-dUTP의 존재는 DNA를 결합시키는데 대한 단백질에 능력 또는 비오틴을 결합시키는데 대한 스트렙타비딘의 능력을 변화시키지 않는다.
[화학발광의 검출]
디곡시게닌-표지된 올리고뉴클레오티드를 Tropix, Inc. (Bedford, MA)에 의해서 개발된 화학발광 검출시스템 ＂SOUTHRN LIGHTS＂를 사용하여 검출한다.
이 검출시스템의 사용은 제11A 도 및 제11B도에 설명한다.
이 기술을 비드 또는 필터중의 하나에 포획되어 있는 DNA를 검출하는데 사용할 수 있다.
말단 디곡시게닌을 함유하는 잔사(실시예1)을 가지는 비오티닐화된 올리고뉴클레오티드를 상기 기술된 것처럼 마그네틱(제11A)도 또는 아가로오스 비드(제11B도)로 포획한다.
이 비드를 고립시키고 실온에서 30분동안 I-빛 차단 완충제(Tropix)로 배양시킴으로써 비특이 결합을 차단시키도록 처리한다. 올리고뉴클레오티드의 존재를 디곡시게닌에 대해 알칼리 포스파타아제-컨쥬게이트된 항체를 사용하여 검출한다.
항-디곡시게닌-알칼리 포스파타아제(anti-dig-AP, 0.75 단위/㎕의 1:5000 희석, Boehringer Mannheim)를 30분동안 샘플로 배양시키고, 옮기고 그리고 샘플을 100 mM Tris-HCℓ, PH 7.5, 150mM NaCℓ로 세척한다. 샘플을 50mM 중탄산 나트륨, pH 9.5, 1M MgCℓ2로 2회 세척하여 사전 평형시키고 나서 실온에서 5분동안 0.25 mM 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3'-포스포릴록시)페닐-1,2-디옥시에탄 2나트륨염(AMPPD)을 함유하는 동일 완충제에서 배양시킨다. AMPPD를 탈인산화할때 결과화합물은 477nm에서 빛의 지속적, 안정된 방사를 방출하면서 분해한다.
과량의 액체를 필터로 제거하고 알칼리 포스파타아제에 의한 AMPPD의 탈인산화의 결과로서 발생하는 빛의 방사는 X선 필름에 노출시키거나 발광계로 검출에 의해 측정될 수 있다.
용액에서, 비드-DNA-anti-dig-AP를 ＂SOUTHERN LIGHT＂분석 완충제와 AMPPD에서 재현탁시키고 발광계로 직접 측정한다. 대규모 스크리닝 발생을 96-웰 플레이트-표시도수 발광계를 사용하여 수행한다(Dynatech Laboratories, Chantilly, VA).
DNA의 서브피코그램양(102내지 103아토몰(1 아토몰은 10-18mole) 이다)은 플레이트-표시도수 발광계와 연결된 Tropix 시스템을 사용하여 검출될 수 있다.
[비색적량 검출]
표준 알칼리 포스파타아제 비색정량기질도 또한 상기 검출반응에 대해 적당하다. 일반적으로 기질은 인산 4-니트로패닐(Boehringer Mannheim)로 이뤄진다.
비색정량분석의 결과는 플레이트-표시도수 분광측광기(Molecular Devices, Menlo Park CA)를 사용하여 멀티웰 플레이트(상기처렴)로 측정된다.
빛 방사시스템의 사용은 비색정량 시스템보다 더 민감하다.
본 발명이 특정방법 및 구체예를 참조로하여 기술되었지만, 이것은 여러 가지 수정 및 변화가 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 수성될 수 있음을 이해하여야 할 것이다.
[서열 목록]
(1) 일반정보:
(i) 출원인: 신티아 에이, 에드워드
찰스 알, 칸토르
베드 엠, 엔드류스
(ii) 발명의 명칭: DNA-결합 분자의 검출을 위한 스크리닝 분석
(iii) 서열 수:18
(iv) 통신 주소:
(A) 수취인:피터 제이. 델린저 법률사무소
(B) 거리 : 피. 오. 박스 60850
(C) 시: 팔토 앙토
(D) 주: 캘리포니아
(E) 국가: 미합중국
(F) 우편번호: 94306
(v) 컴퓨터 판독형식:
(A) 매체종류:플로피 디스크
(B) 컴퓨터:IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템:PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어:파덴틴 릴리스 #1.0 버전 #1.25
(vi) 현재 출원 데이타:
(A) 출원번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(vii) 선출된 데이타:
(A) 출원번호:07/723,618
(B) 출원일:1991년 6월 27일
(C) 분류:
(viii) 변리사/대리인 정보:
(A) 게리 알. 파비안
(B) 등록번호: 33,875
(C) 증명서/인가증 번호: 4600-0075.41
(ix) 전기통신 정보:
(A) 전화:(415)323-8302
(B) 전화팩시밀리:(415)323-8306
(2) SEQ ID NO:1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:11 염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체: UL9 결합 부위, HSV oriS, 보다 높은 친화도
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:1:
CGTTCGCACT T
(2) SEQ ID NO:2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:11 염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii)분자 종류;DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체: UL9 결합 부위, HSV oriS, 보다 높은 친화도
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:2:
TGCTCGCACT T
(2) SEQ ID NO: 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:30염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:UL9Z1 시험 서열, /UL9 분석서열.
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:3:
GCGCGCGCGC GTTCGCACTT CCGCCGCCGG
(2) SEQ ID NO:4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:30염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:UL9 CCCG 시험서열. /UL9 분석 계열.
(xi) 서열 기술:SEQ ID NO:4:
GGCGCCGGCC GTTCGCACTT CGCGCGCGCG
(2) SEQ ID NO:5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체: UL9 CCCG 시험서열./UL9 분석 서열.
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:5:
GGCCCGCCCC GTTCGCACTT CCCGCCCCGG
(2) SEQ ID NO: 6에 대한 정보:
(I) 서열 특성:
(A) 길이:30염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체l UL9 GGGC 시험서열./UL9 분석 서열.
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:6:
GGCGGGCGCC GTTCGCATT GGGCGGGCGG
(2) SEQ ID NO: 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii)분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체: UL9 ATAT 시험서열./UL9 분석 서열.
(xi) 서열 기술:SEQ ID NO:7:
GGATATATAC GTTCGCACTT TAATTATTGG
(2) SEQ ID NO:8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:30염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:UL9 폴리A 시험서열./UL9 분석 서열.
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:8:
GGAAAAAAAC GTTCGCACTT AAAAAAAAGG
(2) SEQ ID NO:9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:30염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:UL9 폴리T 시험서열. /UL9 분석 서열.
(xi) 서열 기술:SEQ ID NO:9:
GGTTTTTTTC GTTCGCATT TTTTTTTTGG
(2) SEQ ID NO:10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:30염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:UL9 GCAC 시험서열. /UL9 분석 서열.
(xi) 서열 기술:SEQ ID NO:10:
GGACGCACGC GTTCGCATT GCAGCAGCGG
(2) SEQ ID NO:11에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:31염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:UL9 ATori-1 시험서열. /UL분석 서열.
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:11:
GCGTATATAT CGTTCGCACT TCGTCCCAAT
(2) SEQ ID NO:12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:31염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:oriECO2 시험서열. /UL9 분석 서열.
(xi) 서열 기술:SEQ ID NO:12:
GGCGAATTCG ACGTTCGCAC TTCGTCCCAA T
(2) SEQ ID NO:13에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:32염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체: oriECO3 시험서열. /UL9 분석 서열.
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:13:
GGCGAATTCG ATCGTTCGCA CTTCGTCCCA AT
(2) SEQ ID NO:14에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:36염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체: ISOLATE:야생형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:14:
AAGTGAGAAT TCGAAGCGTT CGCACTTCGT CCCAAT
(2) SEQ ID NO:15에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:9염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:끝이 잘린 UL9 결합 부위, SEQ ID NO:1과 비교할것
(xi) 서열 기술:SEQ ID NO:15:
TTCGCACTT
(2) SEQ ID NO:16에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:17염기쌍
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:HSVB1/4, 경쟁 DNA 분자의 서열
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:16:
GGTCGTTCGC ACTTCGC
(2) SEQ ID NO:17에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:11염기상
(B) 종류:핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체:UL9 결합부위, HSV oriS
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO:17:
CGTTCTCACTT
(2) SEQ ID NO:18에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이:37염기쌍
(B) 종류: 핵산
(C) 가닥수:이중
(D) 형태:선형
(ii) 분자 종류:DNA(게놈)
(iii) 가정:없음
(iv) 안티-센스:없음
(vi) 원래 출처:
(C) 개개의 분리체(UL9 분석서열, 제15도
(xi) 서열 기술:SEQ ID NOl18:
GCGTAANNNNCGTTCGCACTTNNNNCTTCGTCCCAAT

Claims (34)

  1. 이중스트랜드 DNA에서 선택된 시험서열에 결합할 수 있는 분자들에 대해 스크리닝하는 방법에 있어서, (i) (a) 스크리닝 서열에 인접한 상기 시험서열과 실질적으로 무관한 결합 친화도를 갖는 이중스트랜드 DNA에서 스크리닝 서열에 결합하기에 효과적인 DNA 결합 단백질, 그러나 여기서 상기 결합단백질은 이러한 시험서열에의 분자의 결합에 민감하며, (b) 서로 인접한 상기 스크리닝 서열과 시험서열을 갖는 이중스트랜드 DNA, 여기서 결합단백질은 이중스트랜트 DNA에서 존재하는 스크리닝 서열보다 몰 과량으로 존재하며, 이들로 구성된 시험 시스템에 스크리닝할 분자를 첨가하는 단계, (ii) 이중스트랜드 DNA에서 시험서열에 시험하는 화합물의 결합을 허용하기에 충분한 기간동안 시험시스템에서 분자를 배양하는 단계, (iii) 상기 첨가전과 후에 이중스트랜드 DNA에 결합된 결합단백질의 양을 검출하는 단계로 이뤄지는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 스크리닝 서열/결합 단백질은 복제의 EBV 개시점/EBNA, 복제의 HSV 개시점/UL9, 복제의 VZV 개시점/UL9-유사, 복제의 HPV 개시점/E2, 및 람다 oL- oR/ c r o로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, DNA 스크리닝 서열은 복제의 HSV 개시점으로부터이며 결합단백질은 UL9인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, DNA 스크리닝 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:17로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법
  5. 제1항에 있어서, 상기 검출은 겔 밴드-이동분석 아니면 여과-결합분석을 사용하여 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 시험서열은 복제의 EBV 개시점, 복제의 HSV 개시점, 복제의 VZV 개시점, 복제의 HPV 개시점, 인터루킨 2, 인핸서, HIV-LTR, HBV 인핸서, 및 피브리노겐 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 시험서열은 정의된 세트의 핵산서열으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 정의된 세트의 DNA 서열은 [XN]N조합을 가지며, 여기서 그림2은 데옥시리보뉴클레오티드의 서열이며 각 서열에서 데옥시리보뉴클레오티드의 수는 N이고 N은 3과 같거나 3보다 큰 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, N은 3-20인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, N은 4-10인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, N은 4이고 조합들의 수는 256인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 검출은 결합된 단백질이 없는 DNA를 포획하는 포획시스템의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 포획시스템은 (i) 단백질의 스크리닝 서열에 결합하는 능력을 제거하지 않은, (ii) 스크렙타비딘을 결합할 수 있는, 스크리닝 서열내에 뉴클레오티드의 비오티닐화와, 그리고 (iii) 여기서 비오틴 잔기는 단백질이 스크리닝 서열에 결합될 때 스트렙타비딘과의 상호작용으로부터 보호되는 것을 수반하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 결합단백질은 이중스트랜드 DNA에 존재하는 스크리닝 서열의 몰 농도와 같거나 또는 보다 적은 몰 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제7항에 있어서, 상기 정의된 세트의 핵산서열은 많은 데옥시리보뉴클레오티드, N의 모든 가능한 연속조합인데, 여기서 N은 2보다 크고 20보다 작은 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, N은 2보다 크고 10보다 적은 것을 대표로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, N은 4인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 서로 인접한 스크리닝 서열과, 시험서열을 갖는 이중스트랜드 DNA, 스크리닝 서열에 민감한 상기 시험서열과 실질적으로 무관하나 상기 시험서열에의 분자의 결합에 민감한 결합친화도를 가지고 이증스트랜드 DNA에서 상기 스크리닝 서열에 결합하기에 효과적인 DNA 결합단백질, 여기서 결합단백질은 이중스트랜드 DNA에서 존재하는 스크리닝 서열보다 몰 과량으로 존재하며, 그리고 DNA에 결합된 결합단백질의 양을 검출하는 수단으로 이뤄지는 표적 이중스트랜드 DNA 서열에서 시험서열에 결합할 수 있는 분자를 확인하기 위한 스크리닝 시스템.
  19. 제18항에 있어서, 시험서열은 복제의 EBV 개시점, 복재의 HSV 개시점, 복제의 VZV 개시점, 복제의 HPV 개시점, 인터루킨 2 인핸서, HIV-LTR 인핸서, 및 피브리노겐 프로모터로 구성되는 건으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  20. 제18항에 있어서, 시험서열은 정의된 세트의 핵산서열으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 상기 정의된 세트의 DNA 서열은 [XN]N조합을 갖는데, 여기서 그림2은 데옥시티보뉴클레오티드의 서열이며 각 서열에서 데옥시리보뉴클레오티드의 수는 N이며, N은 3과 같거나 3보다 더 큰 것을 특징으로 하는 시스템.
  22. 제21항에 있어서, 상기 데옥시리보뉴클레오티드는 데옥시리보아데노신, 데옥시리보구아노신, 데옥시리보시티딘, 및 데옥시리보티미딘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  23. 제21항에 있어서, N은 3-20인 것을 특징으로 하는 시스템.
  24. 제23항에 있어서, N은 4-10인 것을 특징으로 하는 시스템.
  25. 제24항에 있어서, N은 4이며 조합의 수는 256인 것을 특징으로 하는 시스템.
  26. 제18항에 있어서, 스크리닝 서열/결합단백질은 복제의 EBV 개시점/EBNA, 복제의 HSV 개시점/UL9, 복제의 VZV 개시점/UL9-유사, 그리고 복제의 HPV 개시점/E2, 및 람다 oL- oR/ c r o로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  27. 제26항에 있어서, DNA 스크리닝 서열은 복제의 HSV 개시점으로부터이며 결합단백질은 UL9인 것을 특징으로 하는 시스템.
  28. 제27항에 있어서, DNA 스크리닝 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NOl17로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  29. 제28항에 있어서, DNA 스크리닝 서열은 SEQ ID NO:1인 것을 특징으로 하는 시스템.
  30. 제29항에 있어서, 위치 8에서 U 잔기는 비오티닐화되어 있는 것을 특징으로 하는 시스템.
  31. 제30항에 있어서, 상기 검출수단은 스트렙타비딘을 포함하며 스트랩타비딘은 고체지지물에 결합되어 있는 것을 대표로 하는 시스템.
  32. 제31항에 있어서, 스트렙타비딘은 그것이 결합된 단백질이 없을 때 이중스트랜드 DNA를 포획하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  33. 화합물을 스크리닝 서열에 인접한 시험서열을 함유하는 이증스트랜드 DNA와 접촉시키는 단계로 이뤄지며 여기서 DNA 결합단백질은 상기 시험서열과 실질적으로 무관한 결합친화도로 스크리닝 서열에 결합하기에 효과적이며, 또한 상기 화합물의 시험서열에의 결합은 단백질의 스크리닝 서열에의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 DNA-결합단백질의 이중스트랜드 DNA에의 결합을 억제하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 화합물은 N-염기쌍을 갖는 염기쌍의 서열에 4N 가능한 순열의 서열들중 하나로 구성되는 시험서열을 각각 함유하는 일련의 이중스트레스 핵산 단편을 제조하는 단계, 여기서 상기 시험서열은 스크리닝 서열에 인접해 있으며, 화합물의 존재하에 핵산단편 시리즈 각각에 DNA 결합단백질의 결합친화도를 측정하는 단계, 그리고 화합물을 그것이 스크리닝 서열에 대한 DNA 결합단백질의 결합친화도를 낮춘다면 선택하는 단계들에 의해 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
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