JP5437790B2 - 膜貫通薬物送達システムに適用するためのプロサポシン由来の融合タンパク質又はポリペプチドを含む組成物 - Google Patents

Description

本発明は、生体膜を通して薬学的因子又は治療的因子を送達する方法であって、当該因子がリン脂質膜内に含有又は挿入され、膜融合タンパク質によって送達が容易になる、生体膜を通して薬学的因子又は治療的因子を送達する方法に関する。より具体的には、本発明は、皮膚膜及び粘膜又は血液脳関門を通る、且つ／又はこれら内での薬学的因子の薬学的因子の輸送及び送達を促進する方法であって、当該薬学的因子がリポソーム内に含有され、リポソームと結び付くサポシンＣを用いて送達が容易になる、皮膚膜及び粘膜又は血液脳関門を通る、且つ／又はこれら内での薬学的因子の輸送及び送達を高める方法に関する。

本発明は、米国立衛生研究所によって与えられた認可番号ＲＯ１ＤＫ５７６９０−０１下で一部政府の支援を受けた。政府は本発明に対する一定の権利を有し得る。

［関連出願の相互参照］
本願は、２００６年４月２８日に出願された米国特許仮出願第６０／７４５，９６９号（その全体が参照により本明細書に援用される）の利益を主張する。

薬学的因子又は治療的因子の治療的有効性は、作用部位への適切な用量の薬学的因子の送達に依存する。例えば、腸内（経口）、非経口（筋肉内、静脈内、皮下）及び局所投与を含む多くの送達形態が開発されている。ほとんどの場合、投与システムは、信頼性が高い用量送達及び利便性に関して選択される。

典型的に、非経口投与は、患者に調合薬を送達するのに最も信頼性が高い手段である。Goodman他著「治療学のグッドマン及びギルマンの薬理学的基礎（Goodman and Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics）」, Pergamon Press, Elmsford, N. Y. （1990）、及びPratt他著「薬物作用の原理：薬理学の基礎（Principles of Drug Action: The Basis of Pharmacology）」, Churchill Livingstone, New York, N. Y.（1990）を参照されたい。それぞれの非経口機構は、規定用量の薬学的因子を身体の体液区分に挿入することを確実にし、それを輸送させることができる。これらの送達形態の欠点は、それらが侵襲的手法を必要とすることである。投与の侵襲性質は不都合なことに痛みを伴い、感染性の汚染を受けやすい。

腸内及び局所投与はより好都合であり、一般的に無痛性であり、感染しやすくはないが、両方とも有用性が限定されている。胃腸及び皮膚表面は輸送するのが困難なバリアを示し、したがって薬学的因子によってはこれらの表面を通しては吸収されないこともある。患者指向性の投与形態（腸内、局所及び皮下）の別の欠点はコンプライアンスである。半減期が短い薬学的因子は数日の投与を必要とする。投与回数が増えると、患者のコンプライアンス及び治療効果が減少する。単純で且つ／又は頻度の低い投与スケジュールは、患者のコンプライアンスを最適化するのを助けることができる（Wilson他（1991）著「内服薬のハリソン原理（Harrison's Principles of Internal Medicine）」, 12th Ed., McGraw-Hill, Inc., New York, N.Y.）。

皮膚は、水溶性の物質の浸透に対し効果的なバリアであり、薬学的因子の経皮吸収速度は主に作用因子の脂溶性、水溶性及び極性によって決定する。極性の高い又は水溶性の薬学的因子は、皮膚によって効果的に遮断される。非常に脂溶性な薬学的因子であっても細胞膜を通る浸透速度に比べて、非常にゆっくりと皮膚に浸透する。上記のPratt他を参照されたい。

より効果的で且つ好都合な薬学的投与形態を開発する努力によって、経皮送達システムが開発された。多くの現行の薬学的因子の経皮送達システムは、不活性担体と混合する際に吸収される薬学的因子に依存する。Cooper他（1987）著「浸透促進剤（Penetration Enhancers）」, Transdermal Delivery of Drugs, Vol. II, Kyodonieus他編, CRC Press, Boca Raton, Flaを参照されたい。ほとんどの薬学的因子がこのプロファイルに適合せず、適合しても常に予測通りに吸収されるわけではない。或る特定の治療的因子と物理的に混合して経皮輸送を改善し、より予測通りの吸収を与えるために、様々な形態の化学促進剤（例えば脂溶性を高めるもの）が開発されている。例えば、米国特許第４，６４５，５０２号、同第４，７８８，０６２号、同第４，８１６，２５８号、同第４，９００，５５５号、同第３，４７２，９３１号、同第４，００６，２１８号、及び同第５，０５３，２２７号を参照されたい。また、細胞内輸送を促進するために、薬学的因子に担体を連結させた。Ames他（1973） Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70:456-458及び（1988） Proc. Int. Symp. Cont. Rel. Bioact. Mater., 15:142を参照されたい。

調合薬の経皮送達における固有の課題と類似して、血液脳関門は、ＣＮＳ薬物送達の障害となる。実際、血液脳関門は、脳薬物の開発における「ネック（bottleneck）」であると考えられ、おそらく将来の神経治療の成長に対する単一の最も重大な制限である（Pardridge, W.M.著「血液脳関門：脳薬物開発におけるネック（The Blood-Brain Barrier: Bottleneck in Brain Drug Development）」, The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics, Vol 2, 3-14, Jan, 2005.、Pardridge, W.M.著「脳薬物標的化：脳薬物開発の将来（Brain drug targeting: the future of brain drug development）」. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2001）。ＢＢＢは、脳血管内皮によって形成され、約１００％の巨大分子（例えばモノクローナル抗体、組み換えタンパク質、アンチセンス又は遺伝子治療薬）、及び９８％超の全ての低分子薬物の脳への輸送を防ぐ。ＣＮＳ活性薬の平均分子量は３５７ダルトンであるが、ヒスタミン等のさらに小さい１００ダルトンの分子は、マウスに注入する際にＢＢＢを通過せず、３０分にわたって広がる。事実、総合医薬品化学（Comprehensive Medicinal Chemistry）データベースの総説によって、７０００個超の低分子薬物の中で、５％だけがＣＮＳを治療し、その内の５％だけがうつ病、統合失調症及び不眠症を治療することが示される。

したがって、ほとんどの薬物がＢＢＢを通らない。不運なことに、中枢神経系（ＣＮＳ）の多くの障害が、ＣＮＳに対する改善された薬物治療の恩恵を受けることができる。ＢＢＢを通ることが知られている作用因子に関する研究は比較的にほとんど行われていないが、ＣＮＳへの送達の成功する見込みがあると予測される特徴はある。これらは、１）閾値分子量４００ダルトン〜５００ダルトン、及び２）高い脂溶性である。現在、ＣＮＳ障害の４つのカテゴリー（情動障害、慢性疼痛及び癲癇を含む）だけがこのような分子に応答する。偏頭痛はＣＮＳ障害であると考えられ、これもこのカテゴリーに含まれ得る。対して、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、Ａ．Ｌ．Ｓ．、多発性硬化症、ニューロ−ＡＩＤＳ、脳腫瘍、脳梗塞、脳損傷又は脊髄損傷、自閉症、リソソーム貯蔵障害、脆弱性Ｘ症候群、遺伝性運動失調、及び盲目等の疾患患者は、薬学的治療に対する選択肢が非常に制限されている（パーキンソン病患者におけるＬ−ＤＯＰＡ治療による幾つかの成功例が存在し、多発性硬化症は末梢免疫系で作用するサイトカインで治療することができる）（一般的に上記のPartridgeを参照されたい）。

上で列記した障害の多くにおいて、ＢＢＢを通る送達が、遺伝子治療又は酵素補充療法における律速課題である。これらの障害の多くは、薬物、酵素又は既に発見された遺伝子によって治療することができる。しかし、これらの薬物はＢＢＢを通過せず、この理由から治療的使用を考慮することはできない。ＢＢＢの不浸透性のために、ＣＮＳへの薬物送達に対して他のアプローチを用いなければならない。これらとしては、低分子の使用、経頭蓋脳薬物送達、及びＢＢＢ破壊が挙げられる。しかし、これらのアプローチは、大多数の患者で実際に行うことができる、ＢＢＢの課題に対する解決策は与えない（Pardridge, W.M.著「血液脳関門（The Blood-Brain Barrier）」）。

小さい（約８０個のアミノ酸）熱安定糖タンパク質ファミリーであるサポシンは、スフィンゴ糖脂質の異化経路における幾つかのリソソーム酵素のｉｎ ｖｉｖｏ加水分解活性に必須である（Grabowski, G.A., Gatt, S.,及びHorowitz, M.（1990） Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25, 385-414；Furst, W.,及びSandhoff, K.,（1992） Biochim. Biophys. Acta 1126, 1-16；Kishimoto, Y., Kiraiwa, M.,及びO'Brien, J.S.（1992） J. Lipid. Res. 33, 1255-1267を参照されたい）。サポシンファミリーの４つの成員（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）は、単一の前駆体タンパク質であるプロサポシンからタンパク質加水分解される（Fujibayashi, S., Kao, F.T., Hones, C., Morse, H., Law, M.,及びWenger, D.A.（1985） Am. J. Hum. Genet. 37, 741-748；O'Brien, J.S., Kretz, K.A., Dewji, N., Wenger, D.A., Esch, F.,及びFluharty, A.L.（1988） Science 241, 1098-1101；Rorman, E.G.,及びGrabowski, G.A.（1989） Genomics 5, 486-492；Nakano, T., Sandhoff, K., Stumper, J., Christomanou, H.,及びSuzuki, K.（1989） J. Biochem.（Tokyo） 105, 152-154；Reiner, O., Dagan, O.,及びHorowitz, M.（1989） J. Mol. Neurosci. 1, 225-233を参照されたい）。サポシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの完全なアミノ酸配列、並びにプロサポシンのゲノム構成及びｃＤＮＡ配列が報告されている（Fujibayashi, S., Kao, F. T., Jones, C., Morse, H., Law, M.,及びWenger, D. A.（1985） Am. J. Hum. Genet. 37, 741-748；O'Brien, J. S., Kretz, K. A., Dewji, N., Wenger, D. A., Esch, F.,及びFluharty, A. L. （1988） Science 241, 1098-1101；Rorman, E. G.,及びGrabowski, G. A.（1989） Genomics 5, 486-492を参照されたい）。開始コドンの突然変異によるプロサポシンの完全な欠乏によって、複合リソソームヒドロラーゼ欠乏に類似した複数のスフィンゴ糖脂質基質の貯蔵が起こる（Schnabel, D., Schroder, M., Furst, W., Klien, A., Hurwitz, R., Zenk, T., Weber, J., Harzer, K., Paton, B.C., Poulos, A., Suzuki, K.,及びSandhoff, K. （1992） J. Biol. Chem. 267, 3312-3315を参照されたい）。

サポシンはスフィンゴ脂質活性化タンパク質又は補酵素として定義される。構造的に、サポシンＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、配置が同一の３つのドメイン内ジスルフィド架橋を形成する６つの厳密に保存されたシステイン残基（Furst, W.,及びSandhoff, K.（1992） Biochim. Biophys. Acta 1126, 1-16）を含み、類似性が約５０％〜６０％である（Vaccaro, A.M., Salvioli, R., Barca, A., Tatti, M., Ciaffoni, F., Maras, B., Siciliano, R., Zappacosta, F., Amoresano, A.,及びPucci, P.（1995） J. Biol. Chem. 270, 9953-9960を参照されたい）。全てのサポシンは、Ｎ末端配列の半分において保存的配置で１つのグリコシル化部位を含有するが、グリコシル化はこれらの活性に必須というわけではない（Qi. X.,及びGrabowski, G.A.（1998） Biochemistry 37, 11544-11554；Vaccaro, A.M., Ciaffoni, F., Tatti, M., Salvioli, R., Barca, A., Tognozzi, D.,及びScerch, C.（1995） J. Biol. Chem. 270, 30576-30580を参照されたい）。さらに、サポシンＡは、Ｃ末端の半分において第２のグリコシル化部位を有する。

全てのサポシン並びにサポシン様タンパク質及びドメインは、溶液中にある場合に「サポシンフォールド（saposin fold）」を含有する。このフォールドは、３つの保存的なジスルフィド構造及び幾つかの両親媒性ポリペプチドを特徴とする、複数のα−へリックス束モチーフである。溶液中のこの共有サポシンフォールド構造にもかかわらず、サポシン及びサポシン様タンパク質は、特異的なヒドロラーゼによるリソソームのスフィンゴ脂質（ＳＬ）及びスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）の分解促進における多様なｉｎ ｖｉｖｏ生物学的機能を有する。これらの役割のために、サポシンはリソソームのスフィンゴ脂質及びスフィンゴ糖脂質の代謝制御における中心的な位置を占める（Kishimoto, Y., Kiraiwa, M.,及びO'Brien, J.S.（1992） J. Lipid. Res. 33, 1255-1267；Fujibayashi, S., Kao, F.T., Hones, C., Morse, H., Law, M.,及びWenger, D.A.（1985） Am. J. Hum. Genet. 37, 741-748； O'Brien, J.S., Kretz, K.A., Dewji, N., Wenger, D.A., Esch, F.,及びFluharty, A.L.（1988） Science 241, 1098-1101を参照されたい）。

これらのサポシンの構造的特徴は、活性化の多様な機構に非常に重要である。これらのタンパク質全てが高い配列類似性を有するが、脂質膜による作用機構が異なるので、サポシン及びサポシン様タンパク質の特異的な生物学的機能は、生体膜環境との異なる相互作用の結果であることを推測することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、サポシンＡは、μＭ濃度で酸β−グルコシダーゼ活性を高めるが、サポシンＣの欠乏がグルコシルセラミドの貯蔵及び「ゴーシェ病様」表現型を引き起こす（Schnable, D., Schroder, M.,及びSandhoff, K.（1991） FEBS Lett. 284, 57-59；Rafi. M.A., deGala, G., Zhang, X.L., 及びWenger, D.A.（1993） Somat. Cell Mol. Genet. 19, 1-7を参照されたい）。サポシンＢの活性化は、スフィンゴ糖脂質基質をリソソーム酵素に可溶化及び提示させることによって行われる（Furst, W.及びSandhoff, K.,（1992） Biochim. Biophys. Acta 1126, 1-16を参照されたい）。

サポシンＣは、酸性ｐＨで酵素構造変化を誘導することによって酸β−グルコシダーゼ活性を促進する（Berent, S.L.,及びRadin, N.S.（1981） Biochim. Biophys. Acta 664, 572-582；Greenberg, P., Merrill, A.H., Liotta, D.C.,及びGrabowski, G.A.（1990） Biochim. Biophys. Acta 1039, 12-20；Qi. X.,及びGrabowski, G.A.（1998） Biochemistry 37, 11544-11554を参照されたい）。サポシンＣと酵素とのこの相互作用は、負に荷電したリン脂質表面上で起こる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで、サポシンＡ及びＤはそれぞれ、ガラクトシルセラミド及びセラミド／スフィンゴミエリンの分解を促進するように機能する（Harzer, K., Paton, B.C., Christomanou, H., Chatelut, M., Levade, T., Hiraiwa, M.及びO'Brien, J.S.（1997） FEBS Lett. 417, 270-274；Klien, A., Henseler, M., Klein., C, Suzuki, K., Harzer, K.,及びSandhoff, K.（1994） Biochem. Biophys. Res. Commun, 200, 1440-1448を参照されたい）。個々にサポシンＢ及びＣが欠乏した患者はそれぞれ、様々な形態の大脳白質萎縮症及びゴーシェ病を示した（Wenger, D.A., DeGala, G., Williams, C., Taylor, H.A., Stevenson, R.E., Pruitt, J.R., Miller, J., Garen, P.D.,及びBalentine, J.D.（1989） Am. J. Med. Genet. 33, 255-265を参照されたい）（Christomanou, H., Aignesberger, A.,及びLinke, R.P.（1986） Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, 879-890を参照されたい）。

サポシンＣの主な生理学的機能は、このタンパク質が欠乏した患者におけるニューロン障害性の「ゴーシェ病」に類似したスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）貯蔵疾患によって定義されている。サポシンＣは、リソソーム酵素である酸β−グルコシダーゼに対する必須の生理学的活性因子である。酸β−グルコシダーゼによってグルコシルセラミドの分解を刺激することに加えて、サポシンＣは、幾つかの他の潜在的な役割を有する。これらとしては、ガングリオシド及びＧＳＬの膜間輸送、リン脂質含有膜の再構築及び不安定化、並びに酸リン脂質小胞融合が挙げられる（Hiraiwa, M.,及びSoeda, S.他（1992） Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11254-11258；You, H. X.,及びYu, L.他（2001） FEBS Lett. 503, 97-102; You, H.X.及びQi, X.他（2003） Biophys. J. 84, 2043-2057；Vaccaro, A.M.,及びTatti, M.他（1994） FEBS Lett. 349, 181-186；Wang, Y.,及びGrabowski, G.他, Biochem. Biophys., 415: 43-53；Qi, X.及びChu, Z., （2004） Arch. Biochem. Biophys., 424: 210-218を参照されたい）。サポシンＣは、そのアミノ末端及びカルボキシル末端のへリックスを膜の外葉に包埋することによって、ホスファチジルセリン（ＰＳ）膜と結び付く（Qi, X及びGrabowski, G.A.,（2001） J. Biol. Chem., 276, 27010-27017を参照されたい）。証拠が増えることによって、サポシンと適切な膜との相互作用が、これらの特異性及び活性に必須であることが示される。

さらに、サポシンの前駆体であるＰＳＡＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経突起生成特性、ｉｎ ｖｉｖｏで神経成長促進特性、及びアポトーシス保護特性を有する神経向性因子である（Qi, X.及びQin, W. 他（1996） J. Biol. Chem, 217, 6874-6880；O'Brien, J.S.及びCarson, G.S.他（1994） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9593-9596；Qi, X.及びKondoh, K.他（1999） Biochemistry 38, 6284-6291；Kotani, Y.S.及びMatsuda, S.他（1996） J. Neurochem. 66, 2019-2025；Koani, Y.及びMatsuda, S.他（1996）J. Neurochem. 66, 2197-2200；Tsuboi, K.及びHiraiwa, M.他（1998） Brain Res. Dev. Brain Res. 110, 249-255を参照されたい）。このような神経向性機能は、サポシンＣのＮＨ_２末端の半分の配列で媒介される（Qi, X.及びQin, W.他（1996） J. Biol. Chem. 271, 6874-6880；O'Brien, J.S.及びCarson, G.S.他（1995） FASEB J. 9, 681-685を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経向性活性に必要な最小配列は、ヒト及びマウスにおいて、サポシンＣの２２〜３１番目のアミノ酸残基に広がる。ＰＳＡＰ及びサポシンＣの神経機能は、多くの神経膠由来細胞におけるＧタンパク質関連細胞膜受容体によるＭＡＰＫ経路での酵素の活性化によって媒介される（Campana, W.M.及びHiraiwa, M.他（1996） Biochem. Biophys. Res. Commun. 229, 706-712；Hiraiwa, M.及びCampana, W.M.他（1997） Biochem. Biophys. Res. Commun. 240, 415-418を参照されたい）。

ヒト及びマウスのＰＳＡＰ遺伝子の欠失によって、サポシン全体が欠乏する（Harzer, K. 及びPaton, B.C.他（1989） Eur. J. Pediatr. 149, 31-39；Hulkova, H.,及びCervenkova, M.他（2001） Hum. Mol. Genet. 10, 927-940；Fujita, N.及びSuzuki, K.他, Hum. Mol. Genet. 5, 711-725を参照されたい）。ＰＳＡＰ欠乏患者由来の皮膚線維芽細胞で観察されたように、この欠乏によって多小胞体（ＭＶＢ）が異常に集積し得る（Harzer, K.及びPaton, B.C.他（1989） Eur. J. Pediatri. 149, 31-39；Burkhardt, J. K.及びHuttler, S.他（1997） Eur. J. Cell Biol. 73, 10-18を参照されたい）。さらに、ＰＳＡＰ欠乏患者由来の肝臓における類洞細胞は、多小胞体で埋め尽くされることが観察された（Sandhoff, K.及びKolter, T.他（2000） 著「遺伝性疾患の代謝的及び分子的基礎（The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease）」, 3371-3388；Harzer, K.及びPaton, B.C.他（1989） Eur. J. Pediatr. 149, 31-39を参照されたい）。同様のＭＶＢ構造が、サポシンＣ欠乏患者由来の線維芽細胞でも見出された（Pampols, T.及びPineda, M.他（1999） Acta Neuropathol. 97, 91-97を参照されたい）。ＰＳＡＰ−／−（ダブルノックアウト）マウスでは、多くの同心円層状体及び高密度粒状構造から成る封入体が様々な組織及び細胞で言及された（Oya, Y.,及びNakayasu, H.他（1998） Acta Neuropathol 96, 29-40を参照されたい）。マウスのＰＳＡＰ−／−細胞の薄片によって、電子顕微鏡法によるＭＶＢの選択的集積が示された（Morales, C.,R.及びZhao, Q.他（1999） Biocell 23, 149-160を参照されたい）。

後期エンドソームのサブセットであるＭＶＢは、トランス−ゴルジネットワークと、原形質膜と、リソソーム／液胞オルガネラとの間の小胞輸送による伝達において必須の役割を有する（Katzman, D.J.及びOdorizzi, G.他（2002） Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 893-905を参照されたい）。ＭＶＢの１つの機能は、神経の発達及び成長に必要な細胞の恒常性を維持することである。仮説的な「シグナル伝達エンドソーム」モデルによって、エンドソームシグナル伝達プラットフォーム上のリガンド−受容体複合体が、反対に遠位の軸索から細胞体へと輸送され、遺伝子発現及びニューロンの生存を促進することが説明される（Ginty, D.D.及びSegal, R.A.（2002） Curr. Opin. Neurobiol. 12, 268-274を参照されたい）。ＰＳＡＰ−／−マウスのニューロンにおける異常なＭＶＢ構造によって、小胞シグナル伝達輸送によるニューロトロフィンの逆行が妨げられ、ＣＮＳにおける神経細胞の発達が損なわれる可能性がある。

ＰＳＡＰ欠乏患者由来の培養線維芽細胞の培地に外因性ＰＳＡＰ又はサポシンＣを導入することによってＭＶＢの蓄積異常が逆転し、このことは、サポシンＣがＭＶＢ形成において鍵となる調節分子であることを示唆している（Burkhardt, J.K.及びHuttler, S.他（1997） Eur. J. Cell Biol. 73 10-18；Chu, Z.,及びWitte, D.P.他（2004） Exp. Cell Res.を参照されたい）。

ＭＶＢ形成を媒介することに加えて、サポシンは膜融合に関与する。膜融合は、生体系由来の分泌、エンドサイトーシス、エキソサイトーシス、細胞内輸送、受精及び筋肉の発達における主要な事象である（Christomanou, H., Chabas, A., Pampols, T.,及びGuardiola, A.（1989） Klin, Wochenschr. 67, 999-1003を参照されたい）。本発明者によって求められた近年の実験的証拠によって、サポシン−脂質膜の相互作用が脂質のサポシン媒介性膜融合に必須の役割を果たし、それによってこれらの生体膜を通る活性剤の輸送を容易にすることが示されている。

本発明は、サポシンＣ含有リポソームを用いて、血液脳関門を含む細胞膜を通して画像化因子を投与する方法にも関する。非侵襲的な画像化技法を用いて、リポソーム送達システムの分布及び有効性をモニタリングすることによって、リポソームを用いた遺伝子治療又は治療的処理の評価及び臨床的適用を評価することができる。画像化因子は、検出手段として、磁気共鳴、蛍光、又はＣＴ／ＰＥＴを用い得る。しかし、リポソームの送達をモニタリングするための画像化因子使用の成功の鍵となる障害は、検出の容易性、関連技術の利用可能性、並びに送達の容易性及び有効性である。

画像化因子を送達するのにリポソームを用いることに関して、脂溶性分子が一般的には適切であるが、本発明はこのような分子の使用に限定されない。理論による限定の意図はなく、脂溶性色素又は脂溶性部を含有する色素は、リポソーム膜に挿入され得るか、又はリポソーム構造の脂質コアに再構築され得る。当該技術分野で既知のこのような色素の例は、インドカルボシアニン色素ＤｉＩである。ＤｉＩは、脂質膜を標識するのに通常用いられる蛍光カルボシアニン色素である。他の同様の色素は、Honig, M.G.他著「ＤｉＩ及びＤｉＯ：ニューロン標識及び経路追跡用の多用途の蛍光色素（DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labeling and pathway tracing）」（Trends Neurosci. 12:333-335, 340-331, 1989）に記載されたようなＤｉＡ又はＤｉａＯである。本発明で用いられ得る他の脂溶性色素としては、Fritzsch他著「３つの新規の脂溶性トレーサーであるＮｅｕｒｏＶｕｅ Ｍａｒｏｏｎ、ＮｅｕｒｏＶｕｅ及びＮｅｕｒｏｖｕｅ Ｇｒｅｅｎの拡散及び画像化特性並びにニューロンプロファイルの二重及び三重標識のためのこれらの使用（Diffusion and Imaging proerties of Three New Lipophilic Tracers, NeuroVue Maroon, NeuroVue and Neurovue Green and their use for Double and Triple Labeling of Neuronal Profile）」（写本）に記載されたようなＰＫＨ２、ＮｅｕｒｏＶｕｅ Ｇｒｅｅｎ、ＰＫＨ２６、ＮｅｕｒｏＶｕｅ Ｒｅｄ、及びＮｅｕｒｏＶｕｅ Ｍａｒｏｏｎが挙げられる。これらの色素のいずれかが単独で又は組合せて、本明細書に記載された本発明で用いられ得る。

２つ以上の画像化特性を有する画像化因子も当該技術分野で用いられ、本発明に適している。このような因子によって、研究者又は臨床医が、投与された画像化因子を検出するのに複数の画像化方法を用いることが可能になる。このような作用因子の例は、Li, H.他著「低濃度のリポタンパク質受容体のＭＲ及び蛍光画像化（MR and Fluorescent Imaging of Low-Density Lipoprotein Receptors）」（Acad Radiol. 2004; 11 : 1251-1259）（参照により本明細書に援用される）に記載されたようないわゆるＰＴＩＲ色素である。これらの色素は、磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）又は共焦点蛍光顕微鏡法（microsopy）によって検出することができるフルオロフォア及びＧｄ（ＩＩＩ）部分の両方を含有する。脂溶性側鎖が、色素のリン脂質単層への挿入を容易にする。したがって、これらの色素が、本明細書で記載されるようなリポソーム送達システムで用いるのに適切である。

プロトンＭＲ画像化によって、非侵襲性、断面撮影及び高解析度という利点が与えられる。近年、磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）は、非侵襲性であり、被験者の正確なボリュームレンダリングが得られることから、医療現場（clinical settings）における効果的なツールとして浮上している。概して、米国特許第６，９６２，６８６号（Kayyem他、表題「細胞特異的な遺伝子送達ビヒクル（Cell-specific gene delivery vehicles）」を参照されたい。これらの利点のために、ＭＲＩは、医学的画像化及び生物学的実験に用いる画像化ツールとして選択される技法となる。色素又は蛍光色素の使用に基づく光学顕微鏡画像化技法とは異なり、ＭＲＩは有毒な光退色副産物を生じない。さらに、光学顕微鏡とは異なり、ＭＲＩは、光散乱又は他の光学収差によって、表面がわずか約１００μｍ以下の細胞に限定されない。上記のようなＭＲＩ特性を有する作用因子が本発明で用いられ得る。

したがって、生体膜（血液脳関門を含む）を通る（across or through）薬学的因子又は画像化因子の送達又は輸送を改善することができる非毒性因子に対して重大な必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たす。

本発明は、生体膜を通して作用因子（例えば薬学的因子又は治療的因子）を送達する方法であって、作用因子は、リン脂質膜内に含有又は挿入され、膜融合タンパク質によって送達が容易になる、生体膜を通して作用因子（例えば薬学的因子又は治療的因子）を送達する方法に関する。さらに具体的には本発明は、皮膚膜及び粘膜又は血管脳関門を通る、且つ／又はこれら内での作用因子の輸送及び送達を促進する方法であって、作用因子がリポソーム内に含有され、リポソームと結び付くサポシンＣを用いて送達が容易になる、皮膚膜及び粘膜又は血管脳関門を通る、且つ／又はこれら内での作用因子の輸送及び送達を促進する方法に関する。

本明細書に記載されるように、本発明は、生体膜（血液脳関門及び細胞膜を含む）を通して薬学的因子を送達する方法であって、中性リン脂質を有する又は有しないアニオン性リン脂質と、リン脂質内に含有された安全で且つ効果的な量の薬学的因子と、薬学的に許容可能な担体におけるプロサポシンに由来する融合タンパク質又はポリペプチドとを含む組成物を膜に適用することを含む、生体膜（血液脳関門及び細胞膜を含む）を通して薬学的因子を送達する方法を含む。

一実施の形態において、アニオン性リン脂質膜は小胞である。別の実施の形態では、小胞はリポソームである。リポソームは、ナノコンテナ（nanocontainer）形態であり、ナノコンテナ（例えばナノ粒子又はリポソーム）は薬物の封入に一般的に用いられる。得られるリポソームの全体の電荷が負であれば、カチオン性リン脂質を用いてもよい。

本発明の別の実施の形態において、タンパク質−脂質組成物のｐＨは酸性である。本発明の別の実施の形態では、組成物のｐＨは、約６．８〜２である。本発明の別の実施の形態では、組成物のｐＨは、約５．５〜２である。別の実施の形態では、ｐＨは約５．５〜約３．５である。

別の実施の形態において、タンパク質及び脂質組成物は、乾燥形態（例えば粉末）で与えられる。別の実施の形態では、乾燥形態のタンパク質及び脂質組成物は、酸で処理される。一実施の形態では、酸は酸性緩衝液又は有機酸である。別の実施の形態では、タンパク質の少なくとも一部分にプロトンを付加するのに十分なレベルで酸が添加され、組成物のｐＨは約５．５〜約２である。別の実施の形態では、タンパク質に実質的にプロトンを付加するのに十分なレベルで酸が添加され、組成物のｐＨが約５．５〜約２である。

さらなる実施の形態において、その後、タンパク質の少なくとも一部分にプロトンを付加するのに十分、酸で処理された、乾燥粉末のタンパク質及び脂質組成物のｐＨを実質的に中性にする。一実施の形態では、ｐＨは、中性ｐＨ緩衝液で中性にする。一実施の形態では、ｐＨは、得られるリポソームのサイズを制御するのに十分、中性ｐＨ緩衝液で中性にする。別の実施の形態では、ｐＨは、得られるリポソームのサイズを制御して、平均直径が約２００ｎｍのリポソームを提供するのに十分、中性ｐＨ緩衝液で中性にする。別の実施の形態では、リポソームの平均直径は、約５０ｎｍ〜３５０ｎｍである。別の実施の形態では、リポソームの平均直径は、１５０ｎｍ〜２５０ｎｍである。別の実施の形態では、ｐＨが約５〜約１４、好ましくは約７〜１４、より好ましくは約７〜約１２、より好ましくは約７〜約１０、及びさらにより好ましくは約８〜約１０の最終組成物を提供するように、緩衝液が組成物に添加される。

本発明の一実施の形態において、短鎖脂質が用いられる。概して、融合タンパク質又はポリペプチドの濃度は、薬学的因子を膜内に及び／又はこれらを通して送達するのに十分な量である。別の実施の形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの膜におけるリン脂質の濃度は、融合タンパク質又はポリペプチドの濃度に対してモル比で少なくとも５倍過剰である。別の実施の形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの膜におけるリン脂質の濃度は、融合タンパク質又はポリペプチドの濃度に対してモル比で少なくとも１０倍過剰である。別の実施の形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの膜におけるリン脂質の濃度は、融合タンパク質又はポリペプチドの濃度に対してモル比で少なくとも１５倍過剰である。一実施の形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの膜におけるリン脂質の濃度は、融合タンパク質又はポリペプチドの濃度に対してモル比で少なくとも２０倍過剰である。別の実施の形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏの膜におけるリン脂質の濃度は、融合タンパク質又はポリペプチドの濃度に対してモル比で約１０倍〜約５０倍過剰又は約２０倍〜約３０倍過剰である。

一実施の形態において、ｉｎ ｖｉｖｏ又は細胞膜システムにおけるリン脂質の濃度は、融合ペプチドの濃度に対してモル比で少なくとも１倍過剰である。一実施の形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ又は細胞膜システムにおけるリン脂質の濃度は、融合ペプチドの濃度に対してモル比で少なくとも２倍過剰である。別の実施の形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ又は細胞膜システムにおけるリン脂質の濃度は、融合ペプチドの濃度に対してモル比で少なくとも３倍過剰である。別の実施の形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ又は細胞膜システムにおけるリン脂質の濃度は、融合ペプチドの濃度に対してモル比で約１倍〜約１０倍過剰又は約３倍〜７倍過剰である。

決して理論によって拘束されることなく、膜融合タンパク質は、静電気的な疎水性（hydrophobic and hydrophobic）相互作用によってリン脂質膜と結び付き、脂質組成物の全体の電荷が負であると考えられる。

本発明によれば、標的生体膜としては、皮膚膜、粘膜、血液脳関門及び細胞膜が挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい膜融合タンパク質としては、サポシンＣ、及び他のタンパク質、ポリペプチド類似体、又はサポシンＣ、配列番号１〜配列番号１３のいずれかに由来するポリペプチド、並びにこれらの混合物が挙げられる。

一実施の形態において、膜融合タンパク質は、サポシンＣ、配列番号１及び配列番号２から選択される配列を有する、少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、又は２４個以上の連続アミノ酸を含む。一実施の形態では、膜融合タンパク質は、式：ｈ−ｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−ｈ−ｈ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−ｕ−Ｌｙｓ−ｈ−ｈ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−ｈ−Ａｓｐ−ｈ−ｈ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ｈ−Ｃｙｓ−ｕ−Ｌｙｓ−ｈ−ｈ（式中、ｈ＝疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、及びＡｌａを含む）、ｕ＝非荷電極性アミノ酸（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、及びＡｓｎを含む））のペプチド及びこれらの混合物を含む。

別の実施の形態では、膜融合タンパク質は、他のタンパク質、ポリペプチド類似体、又はサポシンＣ、配列番号１、配列番号２のいずれかに由来するポリペプチドから選択される１つ又は複数のタンパク質を含み、下記式のポリペプチド及びこれらの混合物が用いられ得る：
ｈ−ｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−ｈ−ｈ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−ｕ−Ｌｙｓ−ｈ−ｈ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−ｈ−Ａｓｐ−ｈ−ｈ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ｈ−Ｃｙｓ−ｕ−Ｌｙｓ−ｈ−ｈ（式中、ｈ＝疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、及びＡｌａを含む）、ｕ＝非荷電極性アミノ酸（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、及びＡｓｎを含む））。

一実施の形態において、膜融合タンパク質は、以下の配列を有する少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又は３０個以上の連続アミノ酸配列を含む：Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ。膜融合タンパク質は、以下の配列を有する少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、又は３０個以上の連続アミノ酸配列を含む：Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ。

別の実施の形態において、膜融合タンパク質は以下の配列を含む：Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ。別の実施の形態では、膜融合タンパク質は以下の配列を含む：Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ。別の実施の形態では、膜融合タンパク質は以下の配列を含む２２−ｍｅｒである：ＣＥＦＬＶKＥＶＴＫＬＩＤＮＮＫＴＥＫＥＩＬ。

別の実施の形態において、膜融合タンパク質はサポシンＣを含む。別の実施の形態では、膜融合タンパク質は、既知の方法での修飾による酸化形態、アセチル化（例えばホルミル化及びアセチル化）形態、アセトアセチル化形態又はラクトシル化形態のサポシンＣを含む（特に、J. M. Shaw, op. cit；Basu他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 3178-3182（1976）；J. Steinbrechert, Biol. Chem. 262, 3703（1987）を参照されたい）。

一実施の形態において、リン脂質膜は、薬学的因子を含有するアニオン性リポソームである。別の実施の形態では、リポソームは、アニオン性長鎖脂質を含有する任意の脂質混合物から作製される。別の実施の形態では、リポソームは、アニオン性長鎖脂質と、中性長鎖脂質と、中性短鎖脂質とを含有する混合物から作製され、得られるリポソームの全体の電荷は負である。

本発明で用いられるリポソームを調製するのに脂質を選択する際、多種多様の脂質がこれらの構築に好適であることが見出される。リポソーム調製に好適であるとして当業者に知られている任意の材料又はその組合せが特に有用である。用いられる脂質は、天然起源、合成起源又は半合成起源のものであり得る。

別の実施の形態において、リポソームは、１つ又は複数の生体適合性脂質から作製される。別の実施の形態では、生体適合性脂質は、脂肪酸、リゾ脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルリノシトール、スフィンゴ脂質、糖脂質、グリコ脂質、スルファチド、スフィンゴ糖脂質、ホスファチジン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、ポリマーを有する脂質、スルホン化単糖を有する脂質、スルホン化二糖を有する脂質、スルホン化オリゴ糖を有する脂質、スルホン化多糖を有する脂質、コレステロール、トコフェロール、エーテル結合脂肪酸を有する脂質、エステル結合脂肪酸を有する脂質、重合脂質、リン酸ジアセチル、リン酸ジセチル、ステアリルアミン、カルジオリピン、６〜８炭素長の脂肪酸を有するリン脂質、不斉アシル鎖を有する合成リン脂質、セラミド、非イオン性脂質、ステロール脂肪酸エステル、糖酸のステロールエステル、糖酸のエステル、糖アルコールのエステル、糖のエステル、脂肪酸のエステル、サポニン、ジラウリン酸グリセロール、トリラウリン酸グリセロール、ジパルミチン酸グリセロール、グリセロール、グリセロールエステル、１０〜３０炭素長のアルコール、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラクトシルジグリセリド、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド、１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカン酸、Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチル−アミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸、コレステリル（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノエート、Ｎ−スクシニルジオレオイルホスファチジルエタノール−アミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール、１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール、１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミン、パルミトイルホモシステイン、カチオン性脂質、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（trimethylammoium）塩化物、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、リゾリン脂質、リゾビスホスファチジン酸（ＬＢＰＡ）、ｓｅｍｉ−リゾビスホスファチジン酸（ｓｅｍｉ−ＬＢＰＡ）、カルジオリピン、カチオン性ポリマーを有する脂質、ホスホン酸アルキル、ホスフィン酸アルキル、及び亜リン酸アルキルから成る群から選択される。

一実施の形態において、ホスファチジルコリンは、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンから成る群から選択され、ホスファチジルエタノールアミンは、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから成る群から選択され、スフィンゴ脂質はスフィンゴミエリンであり、糖脂質は、ガングリオシドＧＭ１及びガングリオシドＧＭ２から成る群から選択され、ポリマーを有する脂質におけるポリマーは、ポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸及びポリビニルピロリドンから成る群から選択され、ステロール脂肪酸エステルは、硫酸コレステロール、酪酸コレステロール、イソ酪酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、酢酸ラノステロール、パルミチン酸エルゴステロール、及びｎ−酪酸フィトステロールから成る群から選択され、糖酸のステロールエステルは、コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７−デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、グルコン酸コレステロール、グルコン酸ラノステロール、及びグルコン酸エルゴステロールから成る群から選択され、糖酸のエステル及び糖アルコールのエステルは、ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、グルコン酸ラウリル、グルコン酸ミリストイル、及びグルコン酸ステアロイルから成る群から選択され、糖のエステル及び脂肪酸のエステルは、ラウリン酸スクロース、ラウリン酸フルクトース、パルミチン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、グルクロン酸、グルコン酸、サッカリン酸（accharic acid）、及びポリウロン酸から成る群から選択され、サポニンは、サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、及びジギトキシゲニンから成る群から選択され、グリセロールエステルは、トリパルミチン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、トリステアリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロール、トリミリスチン酸グリセロール（glycerol and trimyristate）から成る群から選択され、１０〜３０炭素長のアルコールは、ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、及びｎ−オクタデシルアルコールから成る群から選択され、カチオン性ポリマーを有する脂質におけるカチオン性ポリマーは、ポリリシン及びポリアルギニンから成る群から選択される。

別の実施の形態において、脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、及びジパルミトイルホスファチジン酸から成る群から選択される。

別の実施の形態において、リポソーム内に含有された薬学的因子は、生体分子及び／又は有機分子を含む。この技術は、皮膚膜、粘膜、血液脳関門、又は細胞膜等の膜を通して活性剤を送達することが目的である美容用途及び医学用途の両方に用いることができる。

本発明は、血液脳関門を通して、遺伝子、タンパク質、及び他の生体分子若しくは有機分子等の高分子を輸送することによって疾患を治療する方法にも関し、この方法は、短鎖脂質を有する又は有しないアニオン性リポソームと、リポソーム内に含有された安全で且つ効果的な量の高分子治療的因子と、サポシンＣとを含む組成物の投与を含む。

さらなる実施の形態において、本発明は、サポシン融合膜若しくはリポソームと混合するか、又は複合体形成するか、又は結合する、小核酸分子（例えば低分子干渉（short interfering）核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））を含む組成物を特徴とする。

本発明は、神経芽細胞腫、脳炎症、異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）、ニーマン・ピック病、脳梗塞、パーキンソン病、アルツハイマー病、脱髄病、レチナールニューロパシー、ハンチントン病、Ａ．Ｌ．Ｓ．、多発性硬化症、ニューロ−ＡＩＤＳ、脳腫瘍、脳又は脊髄損傷、自閉症、リソソーム貯蔵障害、脆弱性Ｘ症候群、遺伝性運動失調、及び盲目を治療することができる方法にも関し、この方法は、リポソームが、中性長鎖脂質及び中性短鎖脂質を付加した若しくは付加しない酸性長鎖脂質、サポシンＣ、プロサポシン、並びに他のタンパク質、ポリペプチド類似体、又はサポシンＣ若しくはプロサポシンに由来するポリペプチドから成る、リポソーム送達システムを作製する工程を含む。リポソームは、抗炎症剤、抗アポトーシス剤及び神経保護剤、若しくは酵素、タンパク質、又はこれらの疾患で欠失しているとして同定された遺伝子に対応する遺伝子、ＤＮＡ配列若しくはＲＮＡ配列等の治療的因子を含有し得る。

一実施の形態において、融合アニオン性リン脂質膜若しくはリポソーム、プロサポシンに由来する融合タンパク質若しくはポリペプチド、及び薬学的に許容可能な担体と組合せて、ポリヌクレオチド又はその前駆体を含む組成物及びそれを用いる方法が提供される。

一実施の形態において、融合アニオン性リン脂質膜若しくはリポソーム、プロサポシンに由来する融合タンパク質若しくはポリペプチド、及び薬学的に許容可能な担体と組合せて、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）又はその前駆体を含む組成物及びそれを用いる方法が提供される。本発明の新規の組成物中で、ｓｉＮＡは、プロサポシンに由来する融合タンパク質若しくはポリペプチドを有する融合アニオン性リン脂質膜又はリポソームと混合する、又は複合体形成するか、又は結合して、ｓｉＮＡの細胞内送達を促進する組成物を形成し得る。

本発明は、ゴーシェ病を治療する方法も含み、この方法は、アニオン性リポソーム、リポソーム内に含有された、安全で且つ効果的な量の酸βグルコシダーゼ、及び全てが薬学的に許容可能な担体に含有されたサポシンＣを含む組成物の投与を含み、組成物のｐＨは、約７、６．８、６．５、６、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、又は５．０以下であり、サポシンＣは、静電気的な疎水性相互作用によってリポソーム表面と結び付く。概して、リポソームの濃度は、サポシンＣの濃度に対して約１倍〜１０倍過剰である。一実施の形態では、組成物のｐＨは約６．８未満である。別の実施の形態では、組成物のｐＨは約６．０未満である。別の実施の形態では、組成物のｐＨは約５．５未満である。別の実施の形態では、組成物のｐＨは約５．０未満である。

本発明は、パイヤー斑、腸間膜リンパ節、気管支リンパ節を治療する方法にも関し、この方法は、アニオン性長鎖脂質、中性長鎖脂質及び／又は中性短鎖脂質、安全で且つ効果的な量の脂質、ＤＮＡ若しくはタンパク質抗原、サポシンＣ、プロサポシン、及び他のタンパク質、ポリペプチド類似体、又はサポシンＣ若しくはプロサポシンに由来するポリペプチドを含む組成物の投与を含む。

本発明は、組織及び細胞を画像化する方法にも関し、組成物は、サポシンＣ含有リポソーム、及びＭＲＩ検出剤、蛍光剤、ＣＴ／ＰＥＴ検出剤、複数の検出特性を有する作用因子又はそれらの組合せから成る群から選択される検出可能な画像化因子から成る。作用因子は、脂質膜に挿入するか、又はリポソーム内に封入することができる。本発明の別の実施の形態では、サポシンＣリポソームの単回投与に複数の異なる検出方法を用いることができるように、サポシンＣリポソーム複合体は、異なる画像化特性を有する１つ、２つ又は３つの異なる作用因子を組み込むことができる。

他の補助因子としては、フルオロフォア（例えばフルオレセイン、ダンシル、及び量子ドット等）が挙げられ、赤外色素又は金属は、光学的画像化又は光画像化（例えば共焦点顕微鏡法及び蛍光画像化）に用いられ得る。

別の実施の形態において、組成物は、放射性核種、キレート剤、ビオチン、フルオロフォア、抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ナノ粒子、量子ドット、抗癌剤のナノ液滴（nanodroplets）、抗癌剤若しくは化学療法剤、リポソーム薬、サイトカイン又はそれと結合する低分子トキシンをさらに含む。

別の実施の形態において、画像化部は、放射性核種、ビオチン、フルオロフォア、抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ナノ粒子、量子ドット、検出可能な抗癌剤のナノ液滴、リポソーム薬、及びサイトカインから成る群から選択される。

当業者は、放射性核種、キレート剤、及びキレート剤−リンカー抱合体を本発明のリガンドと結合する方法に精通している。特に、放射性核種、キレート剤、及びキレート剤−リンカー抱合体と本発明のリガンドとの結合は、例えば化合物上の不干渉位置に存在する官能基と結合し、さらに、例えば放射性核種、化学療法剤、抗癌剤、ナノ粒子、量子ドット、抗癌剤のナノ粒子、又は低分子トキシンと連結することができる市販の二官能性連結基（一般的にはヘテロ二官能性連結基）を用いて好都合に達成することができる。このように、本発明の化合物を用いて、標的部位、一般的に腫瘍又は癌性細胞を有する器官若しくは組織に好適な作用因子を運ぶことができる。別の実施の態様では、ビオチニル化リガンドをストレプトアビジンＱｄｏｔ６０５（Quantum Dot Corp.、カリフォルニア州ヘーワード）とインキュベートすることによって、リガンドＱｄｏｔ複合体が調製される。

本発明の一実施の形態において、追跡可能な画像化因子を含有するリポソームを用いて、神経芽細胞腫等の腫瘍を標的化することができ、これによって、腫瘍のサイズ、成長、位置又は転移の測定が可能になる。

本発明の上記の要約は、本発明のそれぞれの実施形態又はあらゆる実施態様を説明するように意図されない。本発明のより完全な理解と共に、利点及び到達点（attainments）が、添付の図面と共に以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参照することによって明らかになり、理解されるようになる。

本明細書を通して、別途に記述がない限り、全ての温度は摂氏温度で与えられ、全てのパーセントは重量パーセントである。本明細書で言及される全ての刊行物は、今回記載された本発明に関連して用いられ得る刊行物に記載される組成物及び方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に援用される。本明細書で示される刊行物は、本願の出願日前にこれらの開示に対して単独で提示される。本発明が、先行発明によってこのような開示を先行する権利を有するものであることを認めるものは本明細書中にはない。

特許請求の範囲で規定されるように、本発明は、添付の図面を参照してより良好に理解することができる。図面は必ずしも同じ縮尺ではないが、その代わり本発明の原理を明確に示すこと重視している。

例示的な実施形態の以下の記載において、本明細書の一部を成し、本発明が実施され得る様々な実施形態を例示目的で示す、添付の図面が参照される。他の実施形態を利用してもよく、本発明の範囲から逸脱することなく、構造的及び機能的な変更を行ってもよいことを理解されたい。

本発明の組成物及び方法を説明する前に、本発明は、特定の方法論、デバイス及び製剤に限定されず、当然のように変化してもよいことを理解されたい。本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態だけを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するように意図されないことも理解されたい。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられるような単数形「或る（ａ）」、「或る（and）」、及び「その（the）」は、別途にはっきりと指示されない限り、複数形を含むことに留意されたい。別途に定義されない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法、デバイス及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、より好ましい方法、デバイス及び材料がこれより記載される。

定義
「投与される」及び「投与」という用語は一般的に、例えば脂質及び／又は小胞組成物及びフラッシュ剤を含む生体適合性材料の患者への投与を表す。したがって、「投与される」及び「投与」は例えば、脂質及び／又は小胞組成物及び／又はフラッシュ剤の血管への注射を表す。「投与される」及び「投与」という用語は、脂質及び／又は小胞組成物及び／又はフラッシュ剤の対象の領域への送達も表すことができる。

本明細書で用いられるように「アミノ酸」又は「アミノ酸配列」という用語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質配列、又はこれらのいずれかの断片を表し、また天然分子又は合成分子を表す。「アミノ酸配列」が天然タンパク質分子のアミノ酸配列を表すように本明細書で言及される場合、「アミノ酸配列」等の用語は、このアミノ酸配列を、言及されるタンパク質分子に関する完全に天然のアミノ酸配列に限定する意味はない。

「両親媒性脂質」という用語は、親水性の「頭部」基と、疎水性の「尾部」基とを有し、膜形成能がある分子を意味する。

本明細書で用いられるように、「アニオン性リン脂質膜」及び「アニオン性リポソーム」という用語は、脂質成分を含有し、生理学的ｐＨで全体的に負電荷を有するリン脂質膜又はリポソームを表す。

「アニオン性リン脂質」は、リン酸塩、硫酸塩及びグリセロールベースの脂質を含む、負電荷を有するリン脂質を意味する。

「生体活性剤」は、実際に治療的又は診断的な用途で（例えば患者の疾患の有無を診断する方法で及び／又は患者の疾患を治療する方法で）用いられ得る物質を表す。本明細書で用いられるように、「生体活性剤」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで生物学的効果を示すことができる物質も表す。生体活性剤は、中性でも、正又は負に荷電してもよい。好適な生体活性剤の例としては、診断剤、調合薬、薬物、合成有機分子、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ステロイド及び遺伝物質（ヌクレオシド、ヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含む）が挙げられる。

「（内）に含有される（contained （with）in）」という用語は、薬学的因子が、外部環境から保護されるように、リン脂質膜内に包まれていることを表す。この用語は、「封入される」と交換可能に用いられ得る。

本明細書で用いられるように「欠失」という用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基又はヌクレオチドを失うアミノ酸又はヌクレオチド配列の変化を表す。

本明細書で用いられるように「誘導（derivative）」という用語は、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の化学修飾を表す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾としては、例えば水素のアルキル基、アシル基又はアミノ基への置換が挙げられ得る。誘導ポリヌクレオチドは、天然分子の少なくとも１つの生物学的機能を維持するポリペプチドをコードする。誘導ポリペプチドは、例えばグリコシル化、又は誘導されたポリペプチドの少なくとも１つの生物学的機能を維持する任意の他のプロセスによって修飾されるものである。

本明細書で用いられるように「融合タンパク質又はポリペプチド」という用語は、２つの単離二重層の膜に加えられると、単一膜へと融合することができるタンパク質又はペプチドを表す。融合タンパク質によって、細胞膜又はモデル膜が密接に接触し、これらが融合される。

本明細書で用いられるように「挿入」又は「付加」という用語は、天然分子中に見出される配列へのそれぞれ１つ又は複数のアミノ酸残基又はヌクレオチドの付加をもたらす、アミノ酸又はヌクレオチド配列の変化を表す。

「脂質」及び「リン脂質」という用語は交換可能に用いられ、脂質が水性懸濁液中でとることが知られている様々な異なる構造配置を含む、脂質、リン脂質、又はその誘導体を含有する構造を表す。これらの構造としては、脂質二重層小胞、ミセル、リポソーム、エマルション、小胞、脂質リボン又はシートが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、脂質はアニオン性リポソームである。脂質は、単独で、又は当業者が特定用途に望ましい特性を与えると理解する任意の組合せで用いられ得る。さらに、脂質構築及びリポソーム形成の技術的側面は、当該技術分野で既知であり、この分野で一般的に実施される任意の方法が本発明で用いられ得る。

「脂質組成物」は、典型的に水性媒体中で脂質化合物を含む組成物を表す。脂質組成物の例としては、懸濁液、エマルション及び小胞組成物が挙げられる。「脂質製剤」は、生体活性剤も含む脂質組成物を表す。

「リポソーム」は、一般的に１つ又は複数の同心円層（例えば二重層）の形態の、両親媒性化合物（脂質化合物を含む）の略球状のクラスター又は凝集体を表す。これらは、本明細書で脂質小胞とも称され得る。

「長鎖脂質」という用語は、炭素鎖長が約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４である脂質を表す。一実施形態では、炭素鎖長は、１８、１９、又は２０の鎖長から選択される。本発明で用いられ得る脂質の例は、www.avantilipids.comのウェブサイトで入手可能である。本発明で用いられ得る長鎖脂質の代表例としては、以下の脂質が挙げられるが、これらに限定されない：
１４：０ ＰＳ １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＭＰＳ）、１６：０ ＰＳ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＰＰＳ）、１７：０ ＰＳ １，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、１８：０ ＰＳ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＳＰＳ）、１８：１ ＰＳ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＤＯＰＳ）、１８：２ ＰＳ １，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、２０：４ ＰＳ １，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、２２：６ ＰＳ １，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、１６：０−１８：１ ＰＳ １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（ＰＯＰＳ）、１６：０−１８：２ ＰＳ １−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、１６：０−２２：６ ＰＳ １−パルミトイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、１８：０−１８：１ ＰＳ １−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、１８：０−１８：２ ＰＳ １−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、１８：０−２０：４ ＰＳ １−ステアロイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、１８：０−２２：６ ＰＳ １−ステアロイル−２−ドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、１６：０ ＰＣ １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１７：０ ＰＣ １，２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１８：０ ＰＣ １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１６：１ ＰＣ（シス） １，２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１６：１ トランスＰＣ １，２−ジパルミテライドイル（Dipalmitelaidoyl）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１８：１ ＰＣ デルタ６（シス） １，２−ジペトロセリノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１８：２ ＰＣ（シス） １，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１８：３ ＰＣ（シス） １，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、２０：１ ＰＣ（シス） １，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、２２：１ ＰＣ（シス） １，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、２２：０ ＰＣ １，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、２４：１ ＰＣ（シス） １，２−ジネルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１６：０−１８：０ ＰＣ １−パルミトイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１６：０−１８：１ ＰＣ １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１６：０−１８：２ ＰＣ １−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１８：０−１８：１ ＰＣ １−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１８：０−１８：２ ＰＣ １−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１８：１−１８：０ ＰＣ １−オレオイル−２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１８：１−１６：０ ＰＣ １−オレオイル−２−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１８：０−２０：４ ＰＣ １−ステアロイル−２−アラキドニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１６：０−１８：１ ＰＧ １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（ＰＯＰＧ）、１８：１ ＰＧ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（ＤＯＰＧ）、１８：１ ＰＡ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（モノナトリウム塩）（ＤＯＰＡ）、１８：１ ＰＩ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール（アンモニウム塩）、１６：０（Ｄ３１）−１８：１ ＰＩ １−パルミトイル（Ｄ３１）−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホイノシトール（アンモニウム塩）、１８：１ ＰＥ １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１８：２ ＰＥ １，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン。

本明細書で用いられるように「核酸」又は「核酸配列」という語句は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はそれらの任意の断片を表す。「核酸」は、一連の（a string of）少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組合せを表す（ポリヌクレオチドは、１２０個超のモノマー単位を含有することでオリゴヌクレオチドと区別される）。ヌクレオチドは、核酸ポリマーのモノマー単位である。この用語は、オリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、アンチセンス、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの一部分、又はウイルス由来の遺伝物質の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。アンチセンスは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの機能を妨げるポリヌクレオチドである。核酸という用語は、一連の少なくとも２つの塩基−糖−リン酸塩の組合せを表す。天然核酸はリン酸骨格を有し、人工核酸は他の種類の骨格を含有してもよいが、同じ塩基を含有してもよい。ヌクレオチドは、核酸ポリマーのモノマー単位である。この用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉リボ核酸）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子（small nuclear）ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、及びリボザイムの形態であり得る。ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、若しくは染色体ＤＮＡ、又はこれらの群の誘導体の形態であり得る。さらに、これらの形態のＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖、二本鎖、三本鎖又は四本鎖であり得る。この用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ｓｉＮＡ（低分子干渉核酸）、ホスホロチオエート、及び天然核酸のリン酸骨格の他の変異型も含む。

本明細書で用いられるように「ヌクレオチドベースの薬学的因子」又は「ヌクレオチドベースの薬物」という用語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核酸を含む薬学的因子又は薬物を表す。

「患者」又は「被験者」は、動物（哺乳動物を含む）、好ましくはヒトを表す。

本明細書で用いられるように「薬学的因子又は薬物」は、患者に適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる、任意の化学的な又は生物学的な材料、化合物又は組成物を表す。幾つかの薬物は、ｉｎ ｖｉｖｏで薬学的活性を有する代謝産物に変換される不活性形態で販売されている。本発明のために、「薬学的因子」及び「薬物」という用語は、不活性薬物及び活性代謝産物の両方を包含する。

「薬学的又は治療的に有効な用量又は量」という語句は、所望の生物学的結果を誘導するのに十分な用量レベルを表す。この結果は、薬学的因子の送達、疾患の兆候、症状若しくは病因の軽減、又は生体系の任意の他の所望の変化である可能性があり、活性剤の正確な量は、患者の身体的状態、治療される病気の進行等に依存する。

本明細書に用いられるように「サポシン」という用語は、プロサポシン由来のタンパク質及びポリペプチドのファミリーを表し、天然のサポシンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ、並びに合成サポシン由来タンパク質及びペプチド、並びに融合活性を示すペプチド類似体を含むが、これらに限定されない。サポシンＣ及びこれに由来するポリペプチドは、本発明の一実施形態で用いられ得る。

「短鎖脂質」という用語は、炭素鎖長が４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２の脂質を表す。一実施形態では、炭素鎖長は６、７、８、９又は１０である。一実施形態では、炭素鎖長は６、７又は８である。陰性短鎖脂質の例は、www.avantilipids.comのウェブサイトで入手可能である。本発明で用いられ得る短鎖脂質の例としては、０６：０ ＰＳ（ＤＨＰＳ） １，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、０８：０ ＰＳ １，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）、０３：０ ＰＣ １，２−ジプロピオノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、０４：０ ＰＣ １，２−ジブチロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、０５：０ ＰＣ １，２−ジバレロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、０６：０ ＰＣ（ＤＨＰＣ） １，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、０７：０ ＰＣ １，２−ジヘプタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、０８：０ ＰＣ １，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、０９：０ ＰＣ １，２−ジノナノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、０６：０ ＰＧ １，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）、０８：０ ＰＧ １，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−１−グリセロール）］（ナトリウム塩）、０６：０ ＰＡ １，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（モノナトリウム塩）、０８：０ ＰＡ １，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（モノナトリウム塩）、０６：０ ＰＥ １，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、０８：０ ＰＥ １，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に用いられるように「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」、又は「化学修飾低分子干渉核酸分子」という用語は、例えば配列特異的にＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は遺伝子サイレンシングを媒介することによって、遺伝子発現又はウイルス複製を阻害又は下方調節することが可能な任意の核酸分子を表す。例示的な実施形態内では、ｓｉＮＡは、自己相補的なセンス領域と、アンチセンス領域とを含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり、アンチセンス領域は、発現を下方調節するのに標的となる核酸分子におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又はその一部分を含み、センス領域は、標的核酸配列に対応する（すなわち、標的核酸配列と実質的に配列同一性である）ヌクレオチド配列、又はその一部分を含む。「ｓｉＮＡ」は、短い二本鎖核酸（又は任意でそれより長い前駆体）であり、標的細胞では許容できない毒性ではない低分子干渉核酸（例えばｓｉＲＮＡ）を意味する。或る特定の実施形態では、本発明内で有用なｓｉＮＡの長さは、約２１ｂｐ〜２３ｂｐ長が最適である。しかし、有用なｓｉＮＡ（ｓｉＲＮＡを含む）の長さは特に限定されない。例えば、ｓｉＮＡは、標的細胞への送達時に、又は送達後に存在し、且つ遺伝子のサイレンシング活性を示す、ｓｉＮＡの最終又は処理形態とは実質的に異なる前駆体形態で最初に細胞に提示することができる。前駆体形態のｓｉＮＡは、例えば送達時に又は送達後に処理、分解、改変、又は切断され、細胞内で活性なｓｉＮＡを得て、遺伝子サイレンシングを媒介する、前駆体配列因子を含み得る。したがって、或る特定の実施形態では、本発明内で有用なｓｉＮＡの前駆体の長さは、例えば約１００塩基対〜２００塩基対、５０塩基対〜１００塩基対、又は約５０塩基対未満であり、標的細胞内で活性な処理ｓｉＮＡが得られる。他の実施形態では、有用なｓｉＮＡ又はｓｉＮＡ前駆体は、約１０ｂｐ〜４９ｂｐ、１５ｂｐ〜３５ｂｐ、又は約２１ｂｐ〜３０ｂｐ長である。

「小胞」は、１つ又は複数の内部空隙（voids）を形成する１つ又は複数の壁又は膜の存在を一般的に特徴とする球状体（entity）を表す。小胞は、例えば、脂質（本明細書に記載される様々な脂質を含む）、タンパク質性材料、ポリマー材料（天然、合成及び半合成ポリマーを含む）又は界面活性剤から作製され得る。好ましい小胞は、脂質から作製された壁又は膜を含むものである。これらの好ましい小胞では、脂質は、単層又は二重層形態であってもよく、単層又は二重層の脂質を用いて、１つ又は複数の単層又は二重層を形成し得る。２つ以上の単層又は二重層の場合、単層又は二重層は同心円状であり得る。脂質を用いて、単ラメラ（unilamellar）小胞（１つの単層又は二重層から成る）、オリゴラメラ（oligolamellar）小胞（約２つ又は約３つの単層又は二重層から成る）、又は多重ラメラ（multilamellar）小胞（約３つを超える単層又は二重層から成る）を形成し得る。同様に、タンパク質又はポリマーから調製される小胞は、１つ又は複数の同心壁又は膜を含み得る。タンパク質若しくはポリマーから調製される小胞の壁若しくは膜は実質的に固体（均一）であり得るか、又はこれらは多孔質若しくは半多孔質（semi-porous）であり得る。本明細書で記載される小胞は、例えば一般的に、リポソーム、ミセル、気泡、微小気泡、ミクロスフェア、脂質被覆、ポリマー被覆、タンパク質被覆及び／又は界面活性剤被覆気泡、微小気泡及び／又はミクロスフェア、微小中空球、エアロゲル、及びクラスレート結合小胞等と呼ばれるような球状体を含む。必要に応じて、小胞の内部空隙は、液体（例えば水性液体を含む）、気体、気体前駆体、及び／又は固体又は溶質材料（例えば標的リガンド及び／又は生体活性剤を含む）で充填され得る。

融合タンパク質又はポリペプチド
一実施形態において、本発明は、１つ又は複数のリソソーム融合タンパク質又はポリペプチドを含むリン脂質膜を提供する。別の実施形態では、１つ又は複数のリソソーム融合タンパク質又はポリペプチドが、アニオン性リポソーム内に含有される。別の実施形態では、アニオン性リポソームは薬学的因子をさらに含む。

本発明で用いるのに好適なリソソーム融合タンパク質及びポリペプチドとしては、サポシンファミリーのタンパク質（例えばサポシンＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。サポシンＣの相同体も含まれ、この相同体は、サポシンＣ並びにサポシンＣと同程度の生体活性を有するポリペプチド及びペプチド類似体をコードする遺伝コードの縮重のために、少なくとも８０％の配列相同性を有する。

ペプチド又はペプチド類似体の例としては、
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（配列番号１）、
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（配列番号２）、並びにその誘導体、類似体、相同体、断片及び混合物が挙げられる。式：
ｈ−ｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−ｈ−ｈ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−ｕ−Ｌｙｓ−ｈ−ｈ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ｈ−ｈ−Ａｓｐ−ｈ−ｈ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ｈ−Ｃｙｓ−ｕ−Ｌｙｓ−ｈ−ｈ
（式中、ｈ＝疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、及びＡｌａを含む）、ｕ＝非荷電極性アミノ酸（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、及びＡｓｎを含む））のポリペプチドも含まれる。

本発明で用いるのに好適なリソソーム融合タンパク質及びポリペプチドとしては、サポシンファミリーのタンパク質、好ましくはサポシンＣが挙げられるが、これに限定されない。サポシンＣの相同体も含まれ、この相同体は、サポシンＣ並びにサポシンＣと同程度の生体活性を有するポリペプチド及びペプチド類似体をコードする遺伝コードの縮重のために、少なくとも８０％の配列相同性を有する。

本明細書で用いられるように「ペプチド類似体」という用語は、保存的アミノ酸置換（例えばＶａｌからＬｅｕへの置換又はＬｙｓからＡｒｇへの置換等）によって、或いはペプチドの生体活性（この場合、ペプチドの融合特性）を破壊しない場所に位置する１つ又は複数の非保存的なアミノ酸置換、欠失、又は挿入によってのみ、アミノ酸配列が天然ペプチドとは異なるペプチドを表す。本明細書で用いられるようなペプチド類似体は、この配列の一部分又は全てとして、１つ又は複数のアミノ酸類似体、アミノ酸の構造を模倣する分子、及び／又はペプチド若しくはペプチド類似体以外の分子中で見出される天然アミノ酸も含み得る。

「類似体」とは、本発明のペプチドのアミノ酸配列の置換体又は改変体を意味し、置換又は改変はペプチドの融合特性に悪影響を及ぼさない。したがって、類似体は、配列番号１及び配列番号２として本明細書で与えられるペプチドと実質的に同一なアミノ酸配列を有し、１つ又は複数のアミノ酸残基が化学的に類似のアミノ酸に保存的に置換されているペプチドを含み得る。保存的置換の例としては、或る非極性（疎水性）残基から別の非極性（疎水性）残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニン）への置換が挙げられる。同様に、本発明は、或る極性（親水性）残基の置換（例えばアルギニンとリシンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、及びグリシンとセリンとの間）を考慮する。さらに、或る塩基性残基から別の塩基性残基（例えばリシン、アルギニン又はヒスチジン）への置換、又は或る酸性残基から別の酸性残基（例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸）への置換も考慮される。

リン脂質膜及びリポソームの形成
本発明は、皮膚膜若しくは粘膜を通して、又は血液脳関門若しくは他の細胞膜を通して特定の薬学的因子又は画像化因子を送達するためのサポシン媒介性の膜融合に影響を与える、アニオン性リン脂質膜を利用する。これらのアニオン性リン脂質膜は一般的に、リポソームを調製するのに用いられる。リポソームは、同心円状の脂質二重層から成る微小小胞であり、本明細書で用いられるように球状の二重層で配置された両親媒性脂質から成る小さい小胞を表す。構造的にリポソームは、数百Å〜わずか１ｍｍの寸法で、長いチューブから球体までとサイズ及び形状に幅がある。全体的な形状にかかわらず、二重層は一般的に、閉じた同心円状のラメラとして組織化され、水性層がそれぞれのラメラと隣接したラメラとを隔てている。通常、小胞のサイズは、直径約２０ｎｍ〜約３００００ｎｍの範囲である。

通常、ラメラ間の液膜は、約３ｎｍ〜１０ｎｍである。様々なリポソーム形態を調製する多種多様な方法が、定期刊行物及び特許文献で記載されている。リポソーム作製の具体的な総説及び情報に関して、Pagano及びWeinsteinによる総説に対して言及が為される（Ann. Rev. Biophysic. Bioeng., 7, 435-68（1978）及びAnn. Rev. Biophysic. Bioeng., 9, 467-508（1980）を参照されたい）。

一実施形態において、アニオン性リン脂質膜は小胞である。別の実施形態では、小胞はリポソームである。リポソームは、ナノコンテナ形態であり、ナノコンテナ（例えばナノ粒子又はリポソーム）が薬物の封入に一般的に用いられる。好ましくは、リポソームの平均直径は約２００ｎｍである。別の実施形態では、リポソームの平均直径は５０ｎｍ〜３５０ｎｍである。別の実施形態では、リポソームの平均直径は１５０ｎｍ〜２５０ｎｍである。

標的組織（例えば増殖細胞塊、新生物組織、炎症性組織、炎症組織、及び感染組織）へのリポソームの特異的送達は、治療的因子を当該標的組織に送達するのに適したリポソームサイズを選択することによって達成することができる。例えば、平均直径１８０ｎｍのリポソームは固形腫瘍で集積され得ず、平均直径１４０ｎｍのリポソームは同じ固形腫瘍の周辺部で集積され、平均直径１１０ｎｍのリポソームは、この固形腫瘍の周辺部及び中心部分で集積される。

小胞組成物を伴う実施形態に関連して、小胞のサイズは、特定の意図される最終用途（例えば診断用途及び／又は治療用途を含む）のために調整することができる。好ましくは小胞サイズは、直径約３０ナノメータ（ｎｍ）〜約３００マイクロメータ（μｍ）の範囲、及びこの範囲内のあらゆる組合せ（all combinations and subcombinations）であり得る。より好ましくは小胞の直径は、約１００ｎｍ〜約１０μｍであり、平均直径は約２００ｎｍ〜約７μｍであることがさらにより好ましい。特定の使用（例えば、血管系の磁気共鳴画像化法を含む血管内使用）に関連して、小胞の直径は、大きくても約３０μｍであり得ることが好ましく、より小さい小胞（例えば直径が大きくても１２μｍの小胞）が好ましい。或る特定の好ましい実施形態では、小胞の直径は約７μｍ以下であってもよく、平均直径が約５μｍ以下の小胞がより好ましく、平均直径が約３μｍ以下の小胞がさらにより好ましい。

必要に応じて、様々な手法（例えば振盪、微小乳化、ボルテックス、押出、濾過、超音波処理、ホモジナイゼーション、凍結サイクルと解凍サイクルとの反復、規定サイズの孔を通す加圧下での押出及び同様の方法を含む）によって、リポソームのサイズを調整することができる。

上記の脂質、タンパク質性化合物及び／又はポリマー化合物に加えて、又はその代わりに、本明細書で記載される組成物は、１つ又は複数の安定化材料を含み得る。例えば、このような安定化材料の例は生体適合性ポリマーである。安定化材料を用いて、望ましくは小胞の形成を助ける、及び／又は気体若しくは気体前駆体の実質的な封入を確実にすることができる。さらに相対的に不溶性で非拡散性の気体（例えばペルフルオロプロパン又は六フッ化硫黄）に関して、１つ又は複数の安定化材料を気体及び気体前駆体を充填した小胞の形成に用いると、改善された小胞組成物を得ることができる。これらの化合物は、そのサイズ、形状及び／又は他の特質に関する小胞の安定性及び完全性を改善するのを助け得る。

本明細書で用いられるように「安定な」又は「安定した」という用語は、小胞が、有用な期間、分解（例えば小胞構造の欠損、又は封入された気体若しくは気体前駆体の損失を含む）に実質的に耐性であり得ることを意味する。典型的には、本発明で用いられる小胞は望ましい保存寿命を有し、大抵、通常の周囲条件下で少なくとも約２週間〜３週間、その元々の構造の体積の少なくとも約９０％を維持する。好ましい形態の小胞は、望ましくは少なくとも約１ヶ月間、より好ましくは少なくとも約２ヶ月間、さらにより好ましくは少なくとも約６ヶ月間、さらにより好ましくは約１８ヶ月間、及びさらにより好ましくは最大約３年間、安定である。また、本明細書で記載される小胞（気体及び気体前駆体が充填された小胞を含む）は、通常の周囲条件下で実験された温度及び圧力を超える又はそれより低い温度及び圧力のような悪条件下でさえ安定であり得る。

本明細書で記載される小胞の安定性は、小胞を作製する材料（例えば上記の脂質、ポリマー及び／又はタンパク質を含む）に少なくとも一部起因し、付加的な安定化材料を用いる必要はないが、任意でそうしたほうが好ましい場合が多い。このような付加的な安定化材料及びこれらの特性は以下でさらに十分に記載される。

好ましくは、小胞を構築する材料は、生体適合性の脂質、タンパク質又はポリマー材料であり、これらの中で生体適合性脂質が好ましい。さらに、投与の直前に小胞の調製能を含む、作製の容易さのために、これらの小胞はその場で好都合に作製され得る。

気体及び気体前駆体を充填した小胞を調製するのに、安定化材料として有用な生体適合性ポリマーは天然起源であっても、半合成（修飾天然）起源であっても、合成起源であってもよい。本明細書で用いられるようなポリマーという用語は、２つ以上の反復モノマー単位、及び好ましくは１０個以上の反復モノマー単位から成る化合物を示す。本明細書で用いられるような半合成ポリマー（又は修飾天然ポリマー）という語句は、幾つかの様式で化学的に修飾されている天然ポリマーを示す。本発明で用いるのに好適な天然ポリマーの例としては天然多糖が挙げられる。このような多糖としては、例えばアラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（例えばイヌリン）、レバン、フコイダン、カラギナン、ガラトカロロース（galatocarolose）、ペクチン酸、ペクチン（アミロースを含む）、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、デキストリン、デキストロース、ポリデキストロース、プスツラン（pustulan）、キチン、アガロース、ケラタン、コンドロイチン（chondroitan）、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、デンプン並びに様々な他の天然ホモポリマー又はヘテロポリマー（例えば１つ又は複数の以下のアルドース、ケトース、酸又はアミンを含有するもの）：エリトロース、トレオース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、ルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、エリチルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、マルトース、セロビオース、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、及びノイラミン酸及びその天然誘導体が挙げられる。したがって、好適なポリマーとしては、例えばアルブミン等のタンパク質が挙げられる。半合成ポリマーの例としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、及びメトキシセルロースが挙げられる。本発明で用いるのに好適な合成ポリマーの例としては、ポリエチレン（例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン、及びポリエチレンテレフタレート）、ポリプロピレン（例えば、ポリプロピレングリコール）、ポリウレタン（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ塩化ビニル及びポリビニルピロリドン）、ナイロンを含むポリアミド、ポリスチレン、ポリ乳酸、フッ素化炭化水素、フッ素化炭素（例えばポリテトラフルオロエチレン）、及びポリメチルメタクリレート並びにそれらの誘導体が挙げられる。米国特許第５，２０５，２９０号（この開示は、全体が参照により本明細書に援用される）で記載及び言及されたもののような当該技術分野で既知の情報と本開示が結び付いて、本開示が効力を発揮すると（armed with）、安定化化合物としてポリマーを用いる小胞を調製する方法は当業者に容易に明らかになる。

概して、本発明で用いられるリポソームは、それらの全体サイズ及びラメラ構造の性質に基づき、３つのカテゴリーに分けることができる（１９７７年１２月のNew York Academy Sciences Meeting、「リポソーム及び生物医学におけるその使用（Liposomes and Their Use in Biology and Medicine）」を参照されたい）。この４つの分類としては、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ’ｓ）、小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ’ｓ）、大きい単ラメラ小胞（ＬＵＶ’ｓ）及び巨大な単ラメラ小胞（ＧＵＶ’ｓ）が挙げられる。定義として、ＳＵＶ及びＬＵＶは二重層を１つだけ有するのに対し、ＭＬＶは多くの同心円状の二重層を含有する。多分散性が低い球状の単ラメラ小胞（ＵＬＶ）は、荷電したリン脂質混合物で自然発生的に形成することができる。通常、このような多分散性が低いＵＬＶの形成は、急激な温度上昇プロセス又は突然の希釈を必要とする。場合によっては、自然発生的な多分散性が低いＵＬＶを調べると、経時的に希釈時では安定性が高く、このことは薬物送達又は遺伝子治療に対する封入担体になる潜在性が大きいことを示す。Nieh他著「多分散性が低いリン脂質単ラメラ楕円小胞及びサポシンＣのへリックスドメインとのこれらの相互作用（Low-Polydispersity Phospholipid Unilamellar Ellipsoidal Vesicles and Their Interaction with Helical Domains of Saposin C）」（写本）を参照されたい。

リポソームは、そのサイズ、組成、及び荷電によって多種多様な特徴を示す。例えば、不飽和脂質をわずかな割合有するリポソームは、やや浸透性が高い傾向があるが、コレステロール又は他のステロールを組み込むリポソームは、より硬質であり浸透性が低い傾向がある。リポソームは、親水性基によって、正、負又は中性に荷電していてもよい。例えば、コリンベースの脂質は全体的に中性電荷を与え、リン酸塩及び硫酸塩ベースの脂質は負電荷を与え、グリセロールベースの脂質は一般的に負に荷電し、ステロールは一般的に、溶液中では中性であるが、荷電基を有する。本発明で用いられる脂質はアニオン性脂質及び中性脂質の両方である。

リポソーム組成物の調製に関して多種多様の方法が利用可能である。したがって、当業者に明らかである多様な従来のリポソーム調製技法のいずれか１つを用いて、リポソームが調製され得る。これらの技法としては、例えば溶媒透析、フレンチプレス、押出（凍結解凍あり又はなし）、逆相蒸発、単純な凍結解凍、超音波処理、キレート透析、ホモジナイゼーション、溶媒注入、微小乳化、自然形成、溶媒蒸発、溶媒透析、フレンチプレッシャーセル技法、及び制御浄化剤透析等が挙げられ、それぞれ様々な様式での小胞の調製を伴う。例えば、Madden他著「脂質の物理化学（Chemistry and Physics of Lipids）」, 1990 53, 37-46（この開示はその全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。好適な凍結解凍技法が、例えば１９８９年１１月８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０号（この開示はその全体が参照により本明細書に援用される）で記載される。リポソームの調製に関しては、凍結解凍技法を伴う方法が好ましい。リポソームの調製は、溶液（例えば生理食塩水溶液、リン酸緩衝水溶液、又は滅菌水）中で行われ得る。リポソームは、振盪又はボルテックスを含む様々なプロセスによっても調製され得る。例えば、機械的な振盪装置（例えばＷｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ（Crescent Dental、イリノイ州ライオンズ）、Ｍｉｘｏｍａｔ（Degussa AG製、ドイツ国フランクフルト）、Ｃａｐｍｉｘ（Espe Fabrik Pharmazeutischer Praeparate GMBH & Co.製、ドイツ国オーベラウ（Oberay）ゼーフェルト）、Ｓｉｌａｍａｔ Ｐｌｕｓ（Vivadent製、リヒテンシュタイン（Lechtenstein））、又はＶｉｂｒｏｓ（Quayle Dental製、イングランドサセックス））の使用によってこれが達成され得る。従来の微小乳化機器（例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Microfluidics、マサチューセッツ州ウォバーン））も用いられ得る。

噴霧乾燥を用いて、小胞を調製してもよい。この手法を用いて、脂質を水性環境で予混合した後、噴霧乾燥して、気体充填小胞を得ることができる。小胞は、所望の気体のヘッドスペースで保存され得る。

小胞組成物の調製に用いるのに適合し得る多くのリポソーム調製技法は、例えば米国特許第４，７２８，５７８号、英国特許出願第ＧＢ２１９３０９５号（Ａ）、米国特許第４，７２８，５７５号、米国特許第４，７３７，３２３号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１号、Mayer他, Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 858, pp. 161-168（1986）、Hope他, Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 812, pp. 55-65（1985）、米国特許第４，５３３，２５４号、Mayhew他, Methods in Enzymology, Vol. 149, pp. 64-77 （1987）、Mayhew他, Biochimica et Biophysica Acta, Vol 755, pp. 169-74（1984）、Cheng他, Investigative Radiology, Vol. 22, pp.47-55（1987）、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０５０４０号、米国特許第４，１６２，２８２号、米国特許第４，３１０，５０５号、米国特許第４，９２１，７０６号、及び「リポソーム技術（Liposome Technology）」 Gregoriadis, G.編, Vol. I, pp. 29-31, 51-67 and 79-108（CRC Press Inc., Boca Raton, Fla. 1984）（これらの開示はそれぞれ、それらの全体が参照により本明細書に援用される）で記述される。

代替的に、１つ又は複数の抗殺菌剤及び／又は保存剤は、組成物（例えば安息香酸ナトリウム、第４級アンモニウム塩、アジ化ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、クロロブタノール、デヒドロ酢酸、エチレンジアミン、モノチオグリセロール、安息香酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ソルビン酸カリウム、重亜硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、及び無機水銀塩）の製剤に含まれ得る。安定化小胞が侵襲性の環境下で（例えば血管内で又は腹腔内で）画像化するのに用いられる場合、他の従来手段（例えば放射線）によっても達成され得る、このような殺菌が必要になる。殺菌の適切な手段は、本開示に基づき当業者に明らかになる。

脂質及び／又は小胞組成物の調製と同様に、脂質製剤の調製に多種多様な技法が利用可能である。例えば、脂質及び／又は小胞製剤は、脂質化合物と、タンパク質と、生体活性剤との混合物から調製され得る。この場合、生体活性剤も含む脂質組成物が上記のように調製される。このようにして例えば、ミセルは生体活性剤の存在下で調製することができる。

当業者が理解するように、脂質及び／又は小胞組成物、及び／又は脂質及び／又は小胞製剤のいずれかは、保存のために凍結乾燥してもよく、激しくかき混ぜながら例えば水性媒体（例えば滅菌水、リン酸緩衝溶液、又は生理食塩水溶液）で再構築してもよい。凍結乾燥の結果として脂質及び／又は小胞が凝集又は融合するのを防ぐのに、このような融合又は凝集が起こるのを防ぐ添加剤を含むことが有用であり得る。有用であり得る添加剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、トレハロース、ポリビニルピロリドン及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）（例えばＰＥＧ４００）が挙げられる。これら及び他の添加剤は、U.S. Pharmacopeia, USP XXII, NF XVII, The United States Pharmacopeia, The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention Inc., 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, Md. 20852（この開示はその全体が参照により本明細書に援用される）のような文献に記載される。凍結乾燥調製物は一般的に保存寿命が長いという利点がある。

概して、本発明の脂質混合物はアニオン性長鎖脂質から成る。一実施形態では、サポシンＣ含有リポソームを合成するのに用いた脂質混合物は、１）アニオン性長鎖脂質、２）中性長鎖脂質、及び３）短鎖脂質から成る。短鎖脂質は中性又はアニオン性のいずれであってもよい。別の実施形態では、脂質混合物は、アニオン性長鎖脂質及び中性又はアニオン性短鎖脂質のみから成る。以下の表は、本発明の目的を達成するように、サポシンＣを含有するリポソームを合成するのに用いられ得るリン脂質の組合せの例を示す。サポシンＣ又はサポシンＣのポリペプチドは、本明細書に記載の方法を用いて、以下の脂質の組合せに添加され得る。以下の表１は、本発明を実施するのに用いられ得るリン脂質の組合せを示す。実施例は包括的ではなく、本発明の可能性のある実施形態を示すように意図される。

リポソーム複合体におけるサポシンＣタンパク質の存在が、リポソーム膜を不安定化及び再構築するものとして観察され、このタンパク質を用いるリポソーム送達システムの保存寿命の制限がもたらされる。Mu-Ping Nieh他著「多分散性が低いリン脂質単ラメラ楕円小胞及びサポシンＣのへリックスドメインとのこれらの相互作用（Low-Polydispersity Phospholipid Unilamellar Ellipsoidal Vesicles and Their Interaction with Helical Domains of Saposin C）」（2005）を参照されたい。本発明はこの課題に対処している。本発明の一実施形態は、少なくとも一種類の短鎖脂質の使用を含む。短鎖脂質の添加によって、膜の安定化、リポソームの保存寿命の増大、リポソームベースの治療法の有用性及び利用可能性の増大がもたらされる。

サポシンＣリポソームを合成するのに用いられる脂質混合物の一例は、負に荷電した脂質ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）を含むものであり、少量の中性長鎖脂質ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）及び中性短鎖脂質ジヘキサノイルホスファチジルコリン（phosphatidycholine）（ＤＨＰＣ）が添加される。例えば、Nieh他著、「多分散性が低いリン脂質単ラメラ楕円小胞及びサポシンＣのへリックスドメインとのこれらの相互作用（Low-Polydispersity Phospholipid Unilamellar Ellipsoidal Vesicles and Their Interaction with Helical Domains of Saposin C）」（写本）を参照されたい。電荷及び長さで対応させた当該技術分野で既知の任意の脂質が用いられ得る。少量のサポシンＣでドープされた脂質のこの組成物を含有するサンプルは不安定化しないが、大きい凝集体は、より高濃度のサポシンＣを用いたシステムで溶液から析出させることができ、このことは膜の不安定化を示している。ＤＯＰＳ／ＤＰＰＣ／ＤＨＰＣサンプルは、２４ヶ月間にわたって安定であり、このことは中性長鎖脂質及び短鎖脂質の添加が凝集体の安定性を高めることを示している。しかし、本明細書に記載されるように本発明に従って、長鎖脂質と短鎖脂質との任意の組合せを用いてもよい。

本発明の負の長鎖脂質は、炭素長が約１４〜約２４、又は約１８〜約２０の炭素鎖を有する任意の長鎖リン脂質であり得る。脂質の包括的なリストは、www.avantilipids.comで利用可能である。当業者は、どの脂質を本発明で用いることができるかを理解する。長鎖脂質と短鎖脂質との任意の組合せが用いられ得るが、組合せによっては、より安定なリポソームが得られる。例えば、本発明を限定する意図はないが、以下で、リポソームが形成される組成物の選択を導くことができ、炭素長が約２０〜約２４の長鎖脂質を用いる場合、炭素長が約６〜約８の短鎖脂質がリポソームの安定性を改善するのに用いられ得る。炭素長が約１４〜約１８の長鎖脂質を用いる場合、炭素長が約６〜約７の短鎖脂質が、リポソームの安定性を改善するのに用いられ得る。脂質のこれらの組合せによってより安定なリポソームが得られるが、他の組合せを首尾よく用いてもよく、否定を意図しない。表２は、より安定なリポソームを生成するのに用いられ得るリン脂質の組合せの例を示す。しかし、これらの例は、リン脂質の他の組合せが本発明で用いることができないことを意図しない。

さらに、脂質鎖上の飽和炭化水素の有無がリポソームの安定性に影響を与える。例えば、炭素鎖長が約１８以上の脂質を用いる場合、リン脂質は飽和又は不飽和（好ましくは不飽和）であり得る。約１４個〜約１６個の炭素を有するもののようなより短い長鎖脂質に関して、脂質は不飽和であり得るが、飽和脂質の使用によって、本発明の性能が改善される。

適切な脂質の比の例は以下の通りである。組成物中の選択された中性リン脂質と、選択された陰性リン脂質とのモル比は、約１：１０（約１０％の中性リン脂質）、又は約１：５（約２０％の中性リン脂質）、又は約１：１（５０％の中性リン脂質）である。組成物中の選択された長鎖リン脂質と、選択された短鎖脂質とのモル比は、約４：１（約２０％の短鎖脂質）であり、約１０：１（１０％の短鎖脂質）〜約３：１（約３３％の短鎖脂質）である可能性がある。一実施形態での長鎖脂質と短鎖脂質との比の一例は、（［中性長鎖脂質］＋［酸性長鎖脂質］）／［中性短鎖脂質］＝約４である。別の例としては、一実施形態では、混合物中のＤＯＰＳとＤＰＰＣとのモル比は、約１０〜８：１、又は約７〜６：１、又は約５〜３：１、又は約１〜２：１であり、（［ＤＰＰＣ］＋［ＤＯＰＳ］）／ＤＨＰＣ＝約４である。本発明で用いるのに適切な脂質は、当該技術分野で既知の又はwww.avantilipids.comで与えられるような任意の脂質から選択され得る。

多くの薬物が治療可能性を有するために、それらが身体の適切な場所に送達される必要があり、薬物は、必要な組織へのアクセス能を有していなければいけない。リポソームは、持続性薬物放出及び特定の細胞型又は身体の一部分への送達のための基盤を形成することができる。リソソームの治療的使用としては、遊離形態で通常毒性がある薬物の送達も挙げられる。リポソーム形態で毒性薬物を塞ぎ、この薬物に感受性がある組織から離して、選択領域に対して標的化することができる。リポソームは、長時間にわたって薬物を放出し、投与頻度を減らすために治療的に用いることもできる。さらに、リポソームは、通常、静脈内送達に不適切な疎水性又は両親媒性の薬物の水性分散液を形成する方法も提供することができる。

本発明のリポソームは、二重膜内の水性部分に、又は二重層間に捕捉された、或いは二重層内の疎水性分子を捕捉することによって、１つ又は複数の薬学的因子及び／又は画像化因子を含み得る。幾つかの技法を利用して、感受性がある組織から離して、選択宿主組織に対して封入薬物を標的化するのにリポソームを用いることができる。これらの技法は、リポソームのサイズ、これらの正味表面電荷、及びこれらの投与経路を操作することを含む。

本発明のリポソームは、受動送達経路によっても送達され得る。リポソームの受動送達は、様々な投与経路（例えば静脈内、皮下、筋肉内及び局所）の使用を伴う。それぞれの経路は、リポソームの局在性で違いが生じる。

本発明のリポソームは、血液脳関門を通る治療的因子又は画像化因子の送達にも理想的である。本発明は、治療的因子を含有するリポソームを用いて、これらの作用因子をＣＮＳに送達することができる方法であって、作用因子は、上記で言及された脂質と、サポシンＣ、プロサポシン又はサポシンの変異型とから成るリポソーム内に含有される、治療的因子を含有するリポソームを用いて、これらの作用因子をＣＮＳに送達することができる方法に関する。治療的因子を含有するリポソームは、当該技術分野で一般的に許容される方法を用いて、ＩＶ注射、ＩＭ注射、経鼻送達、又は任意の他の経血管薬物送達方法で投与することができる。

理論による限定の意図はなく、サポシン媒介性膜融合がどのように起こるかに関する１つの可能性がある機構は、タンパク質構造変化を介するものである。プロサポシン由来のタンパク質の中で、サポシンＡ及びサポシンＣは高度なアミノ酸同一性／類似性を示す。コンピュータを用いると、両方のタンパク質は、両親媒性のへリックス束モチーフに折り畳まれることが予測される。概して、サポシンフォールドは、単一の球状ドメインに折り畳まれた５つの両親媒性α−へリックスを有する共通の超二次構造であり、両方のタンパク質に共通である。一実施形態では、折り畳みはアミノ末端で中心に位置するヘリックスに沿っており、これに対してヘリックス２及びへリックス３は一方の側から、ヘリックス４及びヘリックス５はもう一方の側からパックされる。このフォールドは、界面に膜相互作用を与え得る。

アニオン性リン脂質膜とのサポシン媒介性膜融合の機構は、２工程プロセスであると考えられる。第１の工程では、サポシンの正に荷電したアミノ酸（塩基性型）、リシン（Ｌｙｓ）及びアルギニン（Ａｒｇ）と、負に荷電したリン脂質膜との間の静電気的相互作用によって、これら２つの種間で結び付く（図１を参照されたい）。第２の工程では、２つの隣接したサポシンタンパク質のへリックス間の分子内疎水性相互作用は、２つの膜を膜の融合が行われるように十分密接させる（図２を参照されたい）。

したがって、本発明に従って、サポシンＣの正に荷電した塩基性アミノ酸残基と、アニオン性膜との静電気的相互作用によって、サポシンＣと膜との最初の結び付きが生じるので、サポシン（特にサポシンＣ）と脂質との結び付きには一般的に、約５．５以下のｐＨ範囲が必要である。したがって、多くの静電気的相互作用を達成するために、塩基性アミノ酸がプロトン化形態で存在するのが非常に望ましい。

代替的に、関連の融合タンパク質及びタンパク質のサポシンファミリー由来のペプチドは、このｐＨ範囲上限を有していなくてもよく、したがって他の膜融合タンパク質及びペプチドのｐＨ範囲は、生理学的ｐＨ（ｐＨ約７）からそれより低いｐＨの範囲であり得る。

生体活性剤
本発明に従って、生体活性剤（例えば、薬学的因子）は、皮膚膜及び粘膜内の及び／又は下の、又は血管脳関門若しくは他の細胞膜を通る、サポシン媒介性輸送のために、アニオン性リン脂質膜又はリポソーム内に含有される。活性剤は、脂質、特にセラミド、ステロイド、脂肪酸、トリアシルグリセロール、遺伝子及びタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡを含む（が、これらに限定されない）大きな生体分子であり得る。活性剤は、小さな有機分子から成っていてもよい。本明細書で用いられるように、「薬学的因子」は、サポシンＣリポソームによって送達する場合に美容的利点又は治療的利点を与える任意の材料又は材料の組合せを意味する。

本発明のシステムによって送達され得る生体活性剤又は薬物の例としては、鎮痛剤、麻酔剤、抗真菌剤、抗生物質、抗炎症剤、駆虫剤、解毒剤、制吐剤、抗ヒスタミン剤、降圧剤、抗マラリア剤、抗菌剤、抗精神病剤、解熱剤、防腐剤、抗関節炎剤、抗結核剤、鎮咳剤、抗ウイルス剤、心臓作用薬、下剤、化学療法剤、コルチコイド（ステロイド）、抗鬱剤、抑制剤、診断補助薬、利尿剤、酵素、去痰剤、ホルモン、睡眠剤、ミネラル、栄養補給剤、副交感神経興奮剤、カリウム補給剤、鎮静剤（sedatives）、スルホンアミド、興奮剤、交感神経興奮剤、精神安定剤、尿路感染症治療薬（urinary antiinfectives）、血管収縮剤、血管拡張剤、ビタミン、及びキサンチン誘導体等が挙げられ得るが、これらに限定されない。

診断薬
薬学的因子の好ましい例としては、ジギタリス薬（例えばジゴキシン、ジギトキシン、ジゴキシゲニン、及びジギトキシゲニン）が挙げられる。これらの薬物は全て主に、強心剤として用いられる。

ステロイド化合物
ステロイド化合物は別の好ましい群の薬学的因子を形成する。ステロイド系の薬学的因子の例は、主な雄ステロイドのテストステロン（１７β−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３−オン）である。この主な治療的使用は、睾丸の内分泌機能の欠損の治療である。エストラジオール（エストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオール）も好ましいステロイド系の薬学的因子である。エストラジオール及びそのエステル誘導体は、更年期症状及び内因性エストロゲン産生不足を引き起こす他の病態の治療に適応される。プロゲステロンも好ましいステロイド系の薬学的因子である。プロゲステロンは主に、発情期を抑制又は同調するのに、並びに習慣流産を制御し、生理不順を診断及び治療するのに用いられる。付加的な好ましいステロイド系の薬学的因子としては、３−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０−オン、３−β−ヒドロキシ−プレグン−５−エン−２０−オン及び関連化合物が挙げられる。

非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）
ＮＳＡＩＤの例としては、ピロキシカム（４−ヒドロキシ−２−メチル−Ｎ−２−ピリジニル−２Ｈ−１，２−ベンゾチアジン−３−カルボキサミド１，１−ジオキシド）、ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、メペリジン、プロポキシフェン、ナルブフィン、ペンタゾシン、ブプレノルフィン、アスピリン、インドメタシン、ジフルニサル、アセトアミノフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、メクロフェナメート、ゾメピラク、ペニシラミン、フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、アザチアプリン、シクロホスファミド、レバミゾール、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、及びメチルプレドニソロン、及びインドメタシン（１−（４−クロロベンゾイル）−５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−酢酸）が挙げられる。

アミノ酸ベースの薬物
タンパク質及びペプチドベースの薬物、並びに他のアミノ酸ベースの薬物は、本発明による薬学的因子として用いてもよい。タンパク質及びペプチド薬物に対する従来の送達戦略に関連した課題は広く理解されている。これらの薬物の経口投与は、胃腸管中での分解及び非吸収のために一般的には実用的ではない。したがって、未だに非経口経路が主な送達経路である。

アミノ酸ベースの薬物（例えばセファロスポリン）の分子量は典型的に、約５０００未満、好ましくは約２５００未満、より好ましくは１０００未満である。タンパク質及びペプチド薬物の分子量は典型的に、少なくとも約１００ダルトン、より典型的には約２００ダルトン〜４００００ダルトンの範囲である。このサイズ範囲のペプチド及びタンパク質の例としては、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチン、ブラジキニン、ゴセレリン、ソマトトロピン、ブセレリン、血小板由来増殖因子、トリプトレリン、ゴナドレリン、アスパラギナーゼ、ナファレリン、硫酸ブレオマイシン、ロイプロリド、キモパパイン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、コレシストキニン、絨毛性ゴナドトロピン、インスリン、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、カルシトニン、エリスロポイエチン、グルカゴン、ヒアルロニダーゼ、インターフェロン（例えば、インターフェロンα）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１）、チロトロピン放出ホルモン、メノトロピン、下垂体ホルモン（例えば、ウロフォリトロピン（卵胞ｈＧＨ、ｈＭＧ、ｈＣＧ、ＦＳＨ等）、メラニン細胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、オキシトシン、バソプレシン、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、アンギオテンシンｉｉアンタゴニスト、ブラジキニン増強因子Ｂ、ブラジキニンアンタゴニスト、ブラジキニン増強因子Ｃ、エンケファリン、インスリン様増殖因子、プロスタグランジンアンタゴニスト、腫瘍壊死因子、上皮増殖因子（ｅｇｆ）、アミリン、リポトロピン、及び甲状腺刺激ホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましいペプチド薬学的因子の例は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である（Harper他編、「生理化学の総説（Review of Physiological Chemistry）」16th Ed., Lange Medical Publications, Los Altos, Calif.（1977） p. 468を参照されたい）。また、Ｎ末端からの約３４個のアミノ酸残基から成る断片が単離され、ＰＴＨの総生物学的活性を示すことが見出された（Potts他, Parathyroid Hormone and Thyrocalcitonin (Calcitonin), R. V. Talmage他編 Excerpta Medica, New York（1968）を参照されたい）。ポリペプチドの配列は哺乳動物種間でわずかに異なる。本発明によれば、ＰＴＨは、ヒトの副甲状腺ホルモン並びに他の変異型、及び３４個のアミノ酸の断片を含む意味がある。ＰＴＨは、カルシウム及びリン酸代謝のホメオスタティック制御における調節因子として働く（例えば、Parsons他著「副甲状腺ホルモンの生理化学（Physiology and Chemistry of Parathyroid Hormone）」, Clinics in Endocrinology and Metabolism, I. MacIntyre, Ed. Saunders, Philadelphia（1972） pp.33-78を参照されたい）。ＰＴＨに対する主な治療的使用は、骨粗鬆症の治療である。ＰＴＨは、血液カルシウム調節因子としても用いられている。

一実施形態において、カルシトニンも好ましいペプチド薬学的因子である。カルシトニンは３２個のアミノ酸残基を含有するポリペプチドである（Harper他編、「生理化学の総説（Review of Physiological Chemistry）」, 16th Ed., Lange Medical Publications, Los Altos, Calif.（1977）, p. 469を参照されたい）。本発明によれば、カルシトニンは全てのカルシトニン（ヒト、哺乳動物、及び魚類のものを含む）、並びに他の変異型を含むように意図される。カルシトニンはカルシウム調節ホルモンであり、骨粗鬆症、高カルシウム血症及びページェット病の治療で用いられている。

付加的な好ましいタンパク質薬物はサイトカインＩＬ−１０である。ＩＬ−１０は、ＴＨ２ヘルパーサブセット、Ｂ細胞サブセット及びＬＰ活性化単球によって産生される。ＩＬ−１０は、皮膚免疫応答に関連する幾つかの免疫機能、及びしたがって薬物の経皮送達に関連することもある刺激及び炎症の進行を阻害する。より具体的には、ＩＦＮ−αの放出（皮膚免疫応答をもたらす細胞活性化のカスケードを開始する）はＩＬ−１０によって阻害される。ＩＬ−１０は、マクロファージによる多くの炎症促進性サイトカインの合成、及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現を下方調節することによる抗原特異的Ｔ細胞の増殖も抑制する。

核酸ベースの薬物
一般的に核酸ベースの薬物は、一部その安定性及び送達に関する課題のために、治療的因子としての成功が制限されている。ヌクレオチドベースの薬学的因子は、ヌクレアーゼによる分解に感受性があるホスホジエステル結合を含有することが多い。このような分解は、その認識特異性のために配列の完全性によって変わる薬学的因子としてのオリゴヌクレオチド又は核酸の使用に対する重大な障害となる。したがって典型的に、天然オリゴヌクレオチド及び核酸を化学修飾し、ｉｎ ｖｉｖｏで、又は適切な条件を選択するのに注意を払わなければ、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏでこれらを分解するヌクレアーゼに対して耐性にさせなければいけない場合が多い。しかし、これは、必ずしも本発明の薬物送達システムを用いる必要はない。

本発明のヌクレオチドベースの薬物としては、アプタマー、アンチセンス化合物、及び三重へリックス薬物が挙げられる。ヌクレオチドベースの薬物の分子量は典型的に、約３５０塩基超であり、最大約１００塩基の範囲であり得る。ヌクレオチドベースの薬物の例としては、ジヌクレオチド及びトリヌクレオチド（例えばインフルエンザウイルスに対して潜在的な治療活性を有するジヌクレオチド類似体であるＧＳ３７５（Gilead Sciences, Inc.、カリフォルニア州フォスターシティ））が挙げられる。

一実施形態において、ヌクレオチドベースの薬物は、１つ又は複数の治療遺伝子を含む。リポソーム内に封入される治療遺伝子は、治療的因子及び診断剤を発現するのに用いられる任意の一般的な治療遺伝子であり得る。治療遺伝子の例としては、神経変性疾患、脳梗塞、又は脳損傷の治療のための脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；パーキンソン病のためのチロシンヒドロキシラーゼ及び／又は芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ；β−グルクロニダーゼ；ヘキソサミニダーゼＡ；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ又は脳腫瘍の治療のための上皮（epidemal）増殖因子受容体に対するアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子；Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ及び他のリソソーム貯蔵障害のためのリソソーム貯蔵障害補充（replacement）酵素；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の脳成分の治療のためのアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子が挙げられる。治療遺伝子のほかに、プラスミドＤＮＡは、治療配列の前後いずれかにＤＮＡ配列を含有してもよく、プラスミドのこれらの追加部分は、脳中の特定の細胞におけるプラスミドの組織特異的な転写を促進することができ、治療遺伝子のｍＲＮＡの翻訳及び／又は安定化の増強を促進することができ、脳細胞におけるトランス遺伝子のエピソーム複製を可能にすることができる。概して、治療遺伝子は少なくとも１００個のヌクレオチドを含有するか、又は分子量が３００００ダルトン超である。治療遺伝子がプラスミド、又はリポソーム若しくはナノコンテナの内部区画内への封入に好適な他の担体内に含有されるのが好ましい。

任意の既知の薬物封入プロセスに従って、治療遺伝子はリポソーム内に封入され得る。例えば、封入は、超音波処理、凍結／解凍、エバポレーション、及び膜フィルタを通す押出によるものである。

リポソーム内に封入された治療遺伝子の数は、治療される疾患によって１から多数まで様々であり得る。限定要因は、リポソーム内に封入される治療遺伝子の直径であり得る。ポリカチオン性タンパク質（例えばヒストン、プロタミン又はポリリシン）を用いることで、数千個のヌクレオチドを含有するプラスミドＤＮＡのサイズを直径が１０ｎｍ〜３０ｎｍの構造に圧縮することが可能である。直径が１００ｎｍのリポソームの体積は、直径が１０ｎｍ及び３０ｎｍのＤＮＡ圧縮スフェアの体積のそれぞれ１０００倍及び３５倍である。したがって、リポソーム内に同じ遺伝子の多くのコピー、又は複数の遺伝子の複数のコピーを封入することが可能である。

生体活性剤としては、（１）アンチセンス化合物及び（２）他の生体活性オリゴマー等のオリゴマーが挙げられる。本明細書で用いられるように、「アンチセンス化合物」という用語は、特に一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ、ＲＮＡ様）、又はアンチセンス配向オリゴヌクレオチド、アンチセンスＰＮＡ、リボザイム及びＥＧＳ（下記）を含む二本鎖構築物若しくは自己ハイブリダイズ構築物を包含する。アンチセンス化合物は、多様な方法でその効果を発揮することができる。このような方法の１つは、内因性ヌクレアーゼ（例えば真核生物におけるＲＮアーゼＨ、又は原核生物におけるＲＮアーゼＰ、又は標的核酸へのＲＮＡｉ経路におけるｄｓＲＮＡアーゼ）のアンチセンス媒介性の方向付けである（Chiang他, J. Biol. Chem., 1991, 266, 18162；Forster他, Science, 1990, 249, 783）。ＲＮアーゼＰを補充する配列は外部ガイド配列（以下、略語「ＥＧＳ」）として知られている（Guerrier-Takada他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 8468）。

別の種類の生体活性オリゴマーは、遺伝子発現を調整することができるＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子である。場合によっては、二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと記載され得る。本発明の実施形態を説明するために、ｓｉＲＮＡはアンチセンス鎖とセンス鎖との組合せであり、それぞれが安定性及び標的特異性等の所望の特性を示すのに十分な特定の長さ（例えば約８〜３０、約１２〜２７、約１７〜２５、又は約１９〜２３ヌクレオチド長）を有する。このようなオリゴヌクレオチドの相補対は平滑末端化することができるか、又は５’末端若しくは３’末端のいずれか若しくは両方で付加的なヌクレオチドを含み得る。さらに、これらはその３’末端又は５’末端上で他の分子又は分子構造（例えば５’末端上のリン酸基）を含み得る。本発明の化合物の好ましい基としては、アンチセンス鎖化合物の５’末端上のリン酸基が挙げられる。他の好ましい化合物としては、センス鎖化合物の５’末端上のリン酸基も挙げられる。さらにより好ましい化合物は、３’末端上の２塩基突出部（overhang）等の付加的なヌクレオチドを含み得る。

「他の生体活性オリゴマー」という用語は、特にアプタマー及び分子デコイを包含する。本明細書で用いられるように、この用語は、（１）予防、緩和又は治療効果を、それを必要とする動物に与える、及び（２）非アンチセンス機構によって、すなわち核酸とハイブリダイズすること以外の或る手段によって作用する任意のオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ又はＰＮＡを含む）を表すように意図される。

一実施形態において、生体活性剤はアプタマー又は分子デコイである。アプタマーは、ワトソン−クリック塩基対合以外の機構によって特定のリガンドと結合する一本鎖オリゴヌクレオチドである。アプタマーは典型的に、例えばタンパク質に対して標的化され、核酸と結合するようには設計されない（Ellington他, Nature, 1990, 346, 818）。

分子デコイは、因子（例えばタンパク質）が結合する核酸上の部位を模倣する短い二本鎖核酸（核酸自体が「折り畳む」ように設計された一本鎖核酸を含む）である。すなわちこの因子の分子が過剰なデコイと結合し、デコイに対応する細胞部位と結合する因子の濃度が低下して、治療、緩和又は予防効果が得られるので、このようなデコイは競合的にこの因子を阻害することが予測される。デコイ分子を同定及び構築する方法は、例えばEdwards他への米国特許第５，７１６，７８０号に記載される。

別の種類の生体活性オリゴマーは、内因性核酸を遺伝子変換させることができるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子である（Cole-Strauss他, Science, 1996, 273, 1386）。任意の上記の生体活性オリゴマーは、本発明のリポソームで作製され、予防目的又は治療目的に用いられ得る。

本発明の幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの第１の領域としてアンチセンス部分及びオリゴヌクレオチドの第２の領域としてセンス部分の両方を有する単一オリゴヌクレオチドが選択される。ヌクレオチドリンカー（配列中で共に連結する一連の１つ又は複数のヌクレオチド）又は非ヌクレオチドリンカー領域によって、又はヌクレオチドと非ヌクレオチド構造との両方の組合せによって、第１の領域及び第２の領域が共に連結される。これらの構造のそれぞれでは、それ自体が折り畳まれる場合、オリゴヌクレオチドは少なくとも第１の領域のアンチセンス部分と、第２の領域のセンス部分との間で相補的である。したがって、オリゴヌクレオチドは、その中でパリンドローム構造を有し、５’から３’方向の第１の領域のアンチセンス部分が、３’から５’方向の第２の領域のセンス部分と相補的である。

さらなる実施形態において、本発明はオリゴヌクレオチド／タンパク質組成物を含む。この組成物は、オリゴヌクレオチド成分及びタンパク質成分の両方を有する。オリゴヌクレオチド成分は、アンチセンス又はセンスのいずれかのオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含むが、アンチセンスのオリゴヌクレオチド（標的核酸に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチド）が好ましい。この組成物のタンパク質成分は、ＲＮＡ誘導性のサイレンシング複合体、いわゆるＲＩＳＣ複合体の一部分を形成するタンパク質を少なくとも１つ含む。オリゴヌクレオチド成分は、アンチセンス鎖及びセンス鎖の両方のオリゴヌクレオチドも含み得る。

ＲＩＳＣは、オリゴヌクレオチド成分と、アルゴノートタンパク質ファミリーのタンパク質とを含有するリボヌクレオタンパク質複合体である。本発明者等は理論によって拘束されることを望んではいないが、アルゴノートタンパク質は、幾つかがＰＡＺ及びＰｉｗｉドメインを含有することを示し、これまでに転写後サイレンシングに関するプロセスに関与しているタンパク質群である。アルゴノートファミリーのタンパク質としては、ｅ１Ｆ２Ｃ１及びｅ１Ｆ２Ｃ２が挙げられるが、種に依存し、必ずしもこれらに限定されない。ｅ１Ｆ２Ｃ２はヒトＧＥＲｐ９５としても知られる。本発明者等は理論によって拘束されることを望んではいないが、少なくともアンチセンスのオリゴヌクレオチド鎖がタンパク質成分と結合し、ＲＩＳＣ複合体を形成する。さらに、複合体はセンス鎖のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよい。

本発明のオリゴマー化合物は、一本鎖、二本鎖、環状又はヘアピン形態のオリゴマー化合物の形で用いてもよく、内部又は末端のバルジ又はループ等の構造要素を含有してもよい。システムに導入されると、本発明のオリゴマー化合物は、１つ又は複数の酵素又はタンパク質の作用を誘発し、標的核酸を修飾させ得る。

このようなタンパク質の非限定的な例の１つはＲＩＳＣ複合体である。したがって、ＲＮＡ標的を切断させるのにＲＩＳＣ複合体を用いることによって、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介性の阻害効率が大いに高まる。同様の役割は、他のリボヌクレアーゼ（例えばＲＮアーゼＩＩＩ及びリボヌクレアーゼＬ酵素ファミリーのもの）で想定されている。

別の実施形態において、本発明のオリゴマー化合物としては、ＲＩＳＣ複合体で結合する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの二本鎖アンチセンス／センス対、又はアンチセンス部分及びセンス部分の両方を含む一本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの化合物又は組成物のそれぞれを用いて、遺伝子機能の潜在的で且つ特異的な調節を誘導する。このような遺伝子機能の特異的な調節が、二本鎖構造（例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子）の導入によって多くの種で示され、遺伝子又はその関連の遺伝子産物の機能の潜在的で且つ特異的なアンチセンス媒介性の低減を誘導することが示されている。この現象は植物及び動物の両方で起こり、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシングと進化的な関連があると思われる。

アプタマー（又は核酸抗体）は、特異的な分子標的と結合する一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ分子、又は一本鎖ＲＮＡ分子である。一般的にアプタマーは、血中に循環する標的プールと結合することによって、分子標的（例えばタンパク質）の作用を阻害することで機能する。アプタマーの例としては、Gileadの抗トロンビン阻害剤ＧＳ５２２及びその誘導体が挙げられる（Gilead Science, Foster City, Calif.；Macaya他（1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3745-9；Bock他（1992） Nature（London） 355:564-566；及びWang他（1993）Biochem. 32:1899-904も参照されたい）。同様に、当該技術分野で既知のｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ分子）を本発明で用い得る。図８及び図９を参照されたい。

遺伝子の不適切な発現に起因する疾患に関して、このような遺伝子の発現の特異的な阻止又は低減が理想的な治療を表す。原則として、特定の遺伝子産物の産生は、ｍＲＮＡにおけるアクセス可能な配列、又はプレｍＲＮＡプロセシングに必須の転写産物内の配列、又はこの遺伝子自体の中の配列に相補的な一本鎖のデオキシヌクレオチド又はリボデオキシヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、阻害、低減又は遮断され得る。遺伝制御に関するこのパラダイムはアンチセンス又はアンチジーン阻害と称されることが多い。

アンチセンス化合物は、結合するように設計され、特定のタンパク質を生成するのに関与するｍＲＮＡの産生を無効にするか、又は阻止するオリゴヌクレオチドである。アンチセンス化合物は、疾患を引き起こすか、又は疾患に関わる１つ又は複数のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの形成を阻害することによって、治療機能を与えることができる。或る特定の遺伝子メッセンジャーＲＮＡ又はウイルス配列に相補的なアンチセンス化合物は、ウイルス及びレトロウイルスの感染性因子に関する疾患の拡大を防ぐと報告されている（例えば、Matsukura他（1987） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7706、及び本明細書で言及される参考文献を参照されたい）。他の参考文献では、オリゴヌクレオチドが、三重へリックス形成によって二本鎖ＤＮＡと結合し、転写及び／又はＤＮＡ合成を阻害することができると報告されている。

アンチセンス化合物としては、アンチセンスＲＮＡ若しくはＤＮＡ、一本鎖若しくは二本鎖のオリゴヌクレオチド、又はこれらの類似体が挙げられ、個々のｍＲＮＡ種と特異的にハイブリダイズし、ｍＲＮＡ種の転写及び／又はＲＮＡプロセシング、及び／又はコード化ポリペプチドの翻訳を防ぐことによって、それぞれのコード化ポリペプチドの量を減少させることができる（Ching他 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10006-10010（1989）；Broder他 Ann. Int. Med. 113:604-618（1990）；Loreau他 FEBS Letters 274:53-56（1990）を参照されたい）。

三重へリックス化合物（三本鎖薬物とも称される）は、二本鎖ＤＮＡ配列と結合するオリゴヌクレオチドであり、ウイルス遺伝子（例えばＨＩＶウイルス、単純ヘルペスウイルス）及び癌遺伝子等の病原遺伝子、の転写を選択的に阻害する、すなわち細胞核でタンパク質産生を停止させるように意図される。これらの薬物は、細胞ゲノムで二本鎖ＤＮＡと直接結合し、三重へリックスを形成して、それによって細胞が標的タンパク質を作製するのを防ぐ（例えば米国特許第５，１７６，９９６号（Hogan他、１９９３年１月５日出願）を参照されたい）。

オリゴヌクレオチド（例えばアンチセンス化合物及び三重へリックス薬物）の部位特異性は、ホスホジエステル結合の修飾から、又はオリゴヌクレオチド末端の化学修飾から有意な影響を受けない。結果として、これらのオリゴヌクレオチドを化学修飾することができ、全体的な結合安定性を高め、化学的分解に関する安定性を増大させ、オリゴヌクレオチドを細胞に運ぶ速度を増大させ、分子に対する化学反応性を与えることができる。アンチセンス治療に有用な様々なオリゴヌクレオチドを構築する一般的なアプローチは、vander Krol他（1988）Biotechniques 6:958-976及びStein他（1988）Cancer Res. 48:2659-2668によって概説されている。

したがって、アプタマー、アンチセンス化合物及び三重へリックス薬物は、オリゴヌクレオチドの機能特性として、関連の標的配列との特異的なハイブリダイゼーション、又はそれとの連結が維持されていれば、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、又は転位も含み得る。例えば、幾つかの実施形態は、その天然リン酸ジエステルカウンターパート（counterparts）よりもヌクレアーゼによる分解に耐性があり、それによってｉｎ ｖｉｖｏで持続性がより高く、効能がより強いことが予測されるホスホロチオエート類似体を利用する（Campbell他（1990） J. Biochem. Biophys. Methods 20:259-267を参照されたい）。オリゴヌクレオチドのアミド亜リン酸誘導体は、相補的なポリヌクレオチドと結合し、共有結合したリガンド種を適合させるさらなる能力を有することも知られており、本発明の方法を許容することができる（Froehler他（1988） Nucleic Acids Res. 16（11）: 4831）。

さらに、例えば糖又は塩基が化学的に修飾されるヌクレオチド類似体を本発明に用いることができる。プリン及びピリミジンの類似体形態は当該技術分野で一般的に既知であり、その多くは化学療法剤として用いられる。

また末端修飾によって、細胞型特異性、薬物動態、核浸透性及びオリゴヌクレオチド薬学的因子の細胞取り込みの絶対速度を変えるのに有用な手法が与えられる。例えば、５’末端及び３’末端での置換は、ヌクレオチドベースの薬学的因子と他の種とを共有結合的に架橋させる反応基、及び細胞取り込みを改善する嵩高い（bulky）基を含む（「オリゴデオキシヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセンス阻害剤（Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression）」（1989）Cohen編, CRC Press；「癌及びＡＩＤＳに対するアンチセンス核酸療法の展望（Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapeutics for Cancer and AIDS）」（1991）, Wickstrom編, Wiley-Liss；「遺伝子調節：アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生物学（Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA）」,（1992） Erickson及びIzant編, Raven Press；並びに「アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ（Antisense RNA and DNA）」,（1992）, Murray編, Wiley-Lissを参照されたい）。アンチセンス化合物に関連する一般的方法に関しては、「アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ（Antisense RNA and DNA）」,（1988）, D. A. Melton編, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.を参照されたい）。

外因性ヌクレオチド配列を発現するのに、ポリヌクレオチドを細胞に送達して、内因性ヌクレオチド配列の発現を阻害、除去、増大若しくは変更させるか、又は自然状態では細胞と関連しない特定の生理学的特徴に影響を与えることができる。ポリヌクレオチドは、その細胞中での存在又は発現が細胞遺伝子又はＲＮＡの発現又は機能を変える配列であり得る。送達されたポリヌクレオチドは、内因性遺伝物質から離れて細胞質又は核内に留まることができる。代替的にＤＮＡは、内因性遺伝物質と組み換えを行う（の一部となる）ことができる。組み換えは、相同又は非相同の組み換えのいずれかによってＤＮＡを染色体ＤＮＡに挿入させることができる。

ポリヌクレオチドベースの遺伝子発現阻害剤は、細胞中での存在若しくは発現が、配列特異的に遺伝子を分解させるか、又は遺伝子の機能、転写若しくは翻訳を阻害させる配列を含有する任意のポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドベースの発現阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、干渉ＲＮＡ又はＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスポリヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸をコードするＤＮＡ発現カセットを含む群から選択され得る。ｓｉＲＮＡは、典型的には１５塩基対〜５０塩基対及び好ましくは１９塩基対〜２５塩基対を含有し、細胞内で発現された標的遺伝子若しくはＲＮＡと同一であるか又はほぼ同一であるヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む。ｓｉＲＮＡは、２つのアニーリング（annealed）ポリヌクレオチド又はヘアピン構造を形成する単一ポリヌクレオチドから成り得る。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、そのｍＲＮＡ標的の破壊又は翻訳抑制に関係する約２２ヌクレオチド長の小さい非コードポリヌクレオチドである。アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子又はｍＲＮＡと相補的な（complimentary）配列を含む。アンチセンスポリヌクレオチドとしては、モルホリノ、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、及びＲＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドベースの発現阻害剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで重合し、組み換え型はキメラ配列又はこれらの群の誘導体を含有し得る。ポリヌクレオチドベースの発現阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、又は標的ＲＮＡ及び／又は遺伝子が阻害されるような任意の好適な組合せを含有し得る。

ポリヌクレオチドは、全ての若しくは一部のタンパク質又はＲＮＡを発現するようにコードされた発現カセットを含有し得る。発現カセットは、配列を発現することができる天然又は組み換えによって生成されたポリヌクレオチドを表す。カセットは、対象の配列の発現に影響を与える任意の他の配列と共に、対象の遺伝子のコード領域を含有する。典型的に発現カセットには、プロモータ（転写を開始させる）及び転写配列が含まれる。任意で、発現カセットには、転写エンハンサー、非コード配列、スプライシングシグナル、転写停止シグナル、及びポリアデニル化シグナルが含まれ得るが、これらに限定されない。典型的にＲＮＡ発現カセットには、翻訳開始コドン（翻訳を開始させる）、及び１つ又は複数のタンパク質をコードする配列が含まれる。任意で、発現カセットとしては、翻訳停止シグナル、ポリアデノシン配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び非コード配列が含まれ得るが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、標的細胞では特定の機能を果たさないが、ポリヌクレオチドの生成に用いられる配列を含有し得る。このような配列には、宿主生物におけるポリヌクレオチドの複製又は選択に必要な配列が含まれるが、これに限定されない。

本発明の或る特定の実施形態において、上記のようにサポシン融合膜又はリポソームを用いて、従来のｓｉＮＡよりも大きい核酸分子（ｓｉＮＡの大きい核酸前駆体を含む）の送達を容易にする。例えば、本明細書に記載の方法及び組成物は、「前駆体」である大きい核酸の所望のｓｉＮＡへの送達を高めるのに用いられてもよく、前駆体アミノ酸は、標的細胞への送達前、送達中又は送達後に切断又はそうでなければ処理され、標的細胞内の遺伝子発現を調整するために活性ｓｉＮＡを形成し得る。例えば、ｓｉＮＡ前駆体ポリヌクレオチドは、２つ以上のループ構造と、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を含むステムとを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドとして選択されることができ、アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその一部分においてヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドはｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで処理され、ＲＮＡｉを媒介可能な活性ｓｉＮＡ分子を生成することができる。

哺乳動物細胞において、３０塩基対より長いｄｓＲＮＡは、通常インターフェロンによって誘導され、ｄｓＲＮＡ依存性キナーゼＰＫＲ及び２’−５’−オリゴアデニレートシンセターゼを活性化することができる。活性化ＰＫＲが、翻訳因子である真核生物開始因子２α（ｅＩＦ２α）のリン酸化によって通常の翻訳を阻害する一方で、２’−５’−オリゴアデニレートシンセターゼがＲＮアーゼＬの活性化による非特異的なｍＲＮＡ分解を引き起こす。本発明のｓｉＮＡでは、通常３０塩基対未満、及び最も一般的には約１７塩基対〜１９塩基対、１９塩基対〜２１塩基対、又は２１塩基対〜２３塩基対のその小さいサイズのために（特に非前駆体形態で言及される）、インターフェロン応答の活性化が避けられる。

長いｄｓＲＮＡの非特異的な効果に対して、ｓｉＲＮＡは哺乳動物系における選択的遺伝子サイレンシングを媒介することができる。また、短いループとステムに１９塩基対〜２７塩基対とを有するヘアピンＲＮＡは、二本鎖ステムにおける配列と相同な遺伝子発現を選択的にサイレンシングする。哺乳動物細胞は、短いヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換して、選択的遺伝子サイレンシングを媒介することができる。

ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中で行われる。研究によって、２１個のヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖が２つのヌクレオチドの３’突出部を含有する場合に最も活性であることが示されている。さらに、２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドによる一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖の完全な置換がＲＮＡｉの活性を破壊する一方で、デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）による３’末端のｓｉＲＮＡ突出部のヌクレオチドの置換は耐容性があることが報告されている。

研究によって、デオキシリボヌクレオチドによる、２つのヌクレオチドの３’突出部を有する２１−ｍｅｒのｓｉＲＮＡ二本鎖の３’突出部片の置き換えにはＲＮＡｉ活性に対して悪影響がないことが示されている。デオキシリボヌクレオチドによる完全な置換はＲＮＡｉ活性を喪失させる一方で、デオキシリボヌクレオチドによる、ｓｉＲＮＡのそれぞれの末端上での最大４ヌクレオチドの置き換えが十分に耐用性があるとして報告されている。

代替的に、ｓｉＮＡは、標的細胞内で単一又は複数のｓｉＮＡをコードし、その発現に関するポリヌクレオチドベクターによって発現され、単一又は複数の転写産物として送達することができる。これらの実施形態では、標的内細胞内で発現されるｓｉＲＮＡの最終転写産物の二本鎖部分の長さは、例えば１５ｂｐ〜４９ｂｐ、１５ｂｐ〜３５ｂｐ、又は約２１ｂｐ〜３０ｂｐである。例示的な実施形態の中で、２つの鎖が対になったｓｉＮＡの二本鎖部分は、完全に対になったヌクレオチド片に限定されず、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補的ではない）、バルジ（一方の鎖上で対応する相補的なヌクレオチドが欠けている）、及び突出部等による、非対部分を含有してもよい。非対部分は、ｓｉＮＡ形成を妨げない程度に含有することができる。より詳細な実施形態では、「バルジ」は１個〜２個の非対ヌクレオチドを含んでいてもよく、２つの鎖が対になったｓｉＮＡの二本鎖領域は、約１個〜７個、又は約１個〜５個のバルジを含有していてもよい。さらに、ｓｉＮＡの二本鎖領域に含有された「ミスマッチ」部分は、約１個〜７個又は約１個〜５個の数で存在し得る。ミスマッチのほとんどの場合、ヌクレオチドの一方がグアニンであり、もう一方はウラシルである。このようなミスマッチは、例えば、センスＲＮＡをコードする対応ＤＮＡにおけるＣからＴへの突然変異、ＧからＡへの突然変異、又はそれらの混合に起因し得るが、他の原因も考慮される。さらに本発明では、２つの鎖が対になったｓｉＮＡの二本鎖領域は、おおよそ特定の数の範囲でバルジ及びミスマッチ部分の両方を含有し得る。

本発明のｓｉＮＡの末端構造は、ｓｉＮＡが標的遺伝子の発現をサイレンシングする活性を維持していれば、平滑末端又は付着（突出）末端のいずれかであり得る。付着（突出）末端構造は、他で報告されたような３’突出部だけに限定されない。それどころか、ＲＮＡｉ等による遺伝子サイレンシング効果を誘導することができれば、５’突出構造を含んでいてもよい。さらに、突出ヌクレオチドの数は、報告された限界である２又は３ヌクレオチドに限定されず、突出部がｓｉＮＡの遺伝子サイレンシング活性を損なわなければ任意の数であり得る。例えば、突出部は、約１〜８ヌクレオチド、より頻繁には約２〜４ヌクレオチドを含み得る。付着末端構造を有するｓｉＮＡの全長は、対になった二本鎖部分の長さと、両端で突出した一本鎖を含む対の長さとの合計として表される。例えば、両端で４ヌクレオチド突出部を有する１９ｂｐの二本鎖ＲＮＡの場合、全長は２３ｂｐと表される。さらに、突出配列は標的遺伝子との低い特異性を有し得るので、必ずしも標的遺伝子配列に相補的（アンチセンス）又は同一（センス）である必要はない。さらに、ｓｉＮＡが標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング効果を維持することができれば、例えば一方の末端の突出部分で低分子量構造（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ若しくはウイルスＲＮＡ等の天然ＲＮＡ分子、又は人工ＲＮＡ分子）を含有してもよい。

さらに、ｓｉＮＡの末端構造は、二本鎖核酸の一方の末端がリンカー核酸（例えばリンカーＲＮＡ）と連結されるステム−ループ構造を有し得る。二本鎖領域（ステム−ループ部分）の長さは、例えば１５ｂｐ〜４９ｂｐ、頻繁には１５ｂｐ〜３５ｂｐ、及びより一般的に約２１ｂｐ〜３０ｂｐ長であり得る。代替的に、標的細胞で発現されるｓｉＮＡの最終転写産物である二本鎖領域の長さは、例えば約１５ｂｐ〜４９ｂｐ、１５ｂｐ〜３５ｂｐ、又は約２１ｂｐ〜３０ｂｐ長であり得る。リンカー片が用いられる場合、リンカーがステム部分の対合を妨げなければ、リンカーの長さには特に制限はない。例えば、ステム部分の安定な対合、及びこの部分をコードするＤＮＡ間の組み換えの抑制のために、リンカー部分は、クローバ−リーフｔＲＮＡ構造を有し得る。リンカーがステム部分の対合を妨げる長さを有するとしても、例えば前駆体ＲＮＡから成熟ＲＮＡへのプロセシング中にイントロンを切除することによって、ステム部分が対合されるように、イントロンを含むようにリンカー部分を構築することが可能である。ステム−ループｓｉＲＮＡの場合、ループ構造を有しないＲＮＡのいずれかの末端（頭部又は尾部）は低分子量ＲＮＡを有する。上記のように、これらの低分子量ＲＮＡは、天然ＲＮＡ分子（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ又はウイルスＲＮＡ）、又は人工ＲＮＡ分子を含み得る。

ｓｉＮＡは、標的核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部分と相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドも含み得て（例えば、このようなｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列のｓｉＮＡ分子内に存在する必要はない）、一本鎖ポリヌクレオチドは末端リン酸基（例えば５’リン酸塩（例えばMartinez他, Cell., 110: 563-574（2002）及びSchwarz他, Molecular Cell, 10: 537-568（2002）を参照されたい）、又は５’，３’二リン酸塩）をさらに含むことができる。

本明細書で用いられるように、ｓｉＮＡ分子という用語は、天然ＲＮＡ又はＤＮＡを含有する分子に限定されず、化学修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチドも包含する。或る特定の実施形態では、本発明の低分子干渉核酸分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠いている。或る特定の実施形態では、低分子干渉核酸には、ＲＮＡｉを媒介するための２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドが存在する必要はなく、また本発明の低分子干渉核酸分子は任意で、リボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を全く含まない。しかし、ＲＮＡｉを支持するのにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドが存在する必要のないこのようなｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１つ又は複数のヌクレオチドを含有する、付着リンカー（複数可）、又は他の付着若しくは連結基、部若しくは鎖を有することができる。任意でｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド部分（positions）の約５、１０、２０、３０、４０、又は５０％でリボヌクレオチドを含むことができる。

本明細書で用いられるように、ｓｉＮＡという用語は、配列特異的なＲＮＡｉを媒介することができる核酸分子を説明するのに用いられる他の用語（例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、及び翻訳後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）等）と同等の意味である。

他の実施形態において、本明細書中で用いられるｓｉＮＡ分子は、別々のセンス及びアンチセンス配列又は領域を含むことができ、センス領域及びアンチセンス領域はヌクレオチド若しくは非ヌクレオチドのリンカー分子で共有結合するか、又は代替的にイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、及び／又はスタッキング相互作用によって非共有結合する。

「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的な配列を有するＲＮＡ鎖であり、標的遺伝子のｍＲＮＡとの結合によってＲＮＡｉを誘導すると考えられる。「センスＲＮＡ」はアンチセンスＲＮＡと相補的な配列を有し、相補的なアンチセンスＲＮＡとアニーリングして、ｓｉＲＮＡを形成する。従来、これらのアンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡは、ＲＮＡ合成器で合成されてきた。本明細書で用いられるように、「ＲＮＡｉ構築物」という用語は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡを形成するようにｉｎ ｖｉｖｏで切断することができる他のＲＮＡ種を含む指定を通じて用いられる総称である。本明細書のＲＮＡｉ構築物には、細胞中でｄｓＲＮＡ又はヘアピンＲＮＡを形成する転写産物、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを産生することができる転写産物を生じる可能性がある発現ベクター（ＲＮＡｉ発現ベクターとも称される）も含まれる。任意で、ｓｉＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖のｓｉＲＮＡを含む。

ｓｉハイブリッド分子は、ｓｉＲＮＡと同様の機能を有する二本鎖核酸である。二本鎖ＲＮＡ分子の代わりに、ｓｉハイブリッドは、ＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖とから成る。好ましくは、ＲＮＡ鎖は、標的ｍＲＮＡと結合する鎖のようなアンチセンス鎖である。ＤＮＡ 鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションによって作製されたｓｉハイブリッドは、ハイブリダイズされた相補部分、及び好ましくは少なくとも１つの３’突出末端を有する。

本発明で用いられるｓｉＮＡは、一方の鎖がセンス鎖であり、もう一方の鎖がアンチセンス鎖である２つの別々のオリゴヌクレオチドから集合化することができ、アンチセンス鎖及びセンス鎖は自己相補的である（すなわち、それぞれの鎖は、アンチセンス鎖及びセンス鎖が二本鎖又は二本鎖構造（例えば二本鎖領域は約１９塩基対である）を形成するように、もう一方の鎖におけるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む）。アンチセンス鎖は、標的核酸分子におけるヌクレオチド配列又はその一部と相補的なヌクレオチド配列を含んでもよく、センス鎖は、標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列を含んでもよい。代替的に、ｓｉＮＡは単一オリゴヌクレオチドから集合化することができ、ｓｉＮＡの自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域は、核酸ベース又は非核酸ベースのリンカー（複数可）によって連結される。

さらなる実施形態内で、本発明の方法及び組成物による細胞内送達のためのｓｉＮＡは、二本鎖、不斉二本鎖、ヘアピン又は不斉ヘアピン二次構造で、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を有するポリヌクレオチドであることができ、アンチセンス領域は、別々の標的核酸分子におけるヌクレオチド配列又はその一部分と相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部分に対応するヌクレオチド配列を含む。

ｓｉＮＡで行うことができる化学修飾の非限定的な例としては、ホスホロチオエートのヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「普遍的に塩基性の（universal base）」ヌクレオチド、「非環式」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び末端グリセリル及び／又は反転デオキシ脱塩基残基の組み込みが挙げられるが、これらに限定されない。様々なｓｉＮＡ構築物において用いた場合、これらの化学修飾は、細胞中のＲＮＡｉ活性を維持するが、同時にこれらの化合物の血清安定性が劇的に増大することが示される。

非限定的な例において、化学修飾したヌクレオチドの核酸分子への導入は、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性及び外因的に送達される天然ＲＮＡ分子に固有のバイオアベイラビリティの潜在的な限界を克服する強力なツールを提供する。例えば、化学修飾した核酸分子の半減期が血清中で長くなる傾向があるので、化学修飾した核酸分子の使用によって、所定の治療効果に対する特定の核酸分子の用量を低くすることが可能になる。さらに、或る特定の化学修飾は、特定の細胞又は組織を標的化すること、及び／又は核酸分子の細胞取り込みを改善することによって、核酸分子のバイオアベイラビリティを改善させることができる。したがって、たとえ化学修飾した核酸分子の活性が、天然核酸分子に比べて（例えば全ＲＮＡの核酸分子と比べて）低下するとしても、修飾核酸分子の活性全体が、安定性の改善及び／又は分子の送達のために天然分子のものより大きくなり得る。天然非修飾ｓｉＮＡとは異なり、化学修飾したｓｉＮＡは、ヒトにおいてインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限にすることもできる。

本明細書に記載されるｓｉＮＡ分子、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、当該アンチセンス領域の３’末端でホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含むことができる。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれかでは、アンチセンス領域は、当該アンチセンス領域の５’末端で約１個〜約５個のホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含むことができる。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれかでは、本発明のｓｉＮＡ分子の３’末端のヌクレオチド突出部は、核酸の糖、塩基又は骨格で化学修飾されるリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書で記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれかでは、３’末端のヌクレオチド突出部は、１つ又は複数の普遍的に塩基性のリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の実施形態のいずれかでは、３’末端のヌクレオチド突出部は、１つ又は複数の非環式ヌクレオチドを含むことができる。

例えば、非限定的な例では、本発明は、一方のｓｉＮＡ鎖で約１、２、３、４、５、６、７、又は８個以上のホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を有する化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。さらに別の実施形態では、本発明は、両方のｓｉＮＡ鎖で約１、２、３、４、５、６、７、又は８個以上のホスホロチオエートのヌクレオチド間結合をそれぞれ有する化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオエートのヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖（例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖）で存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方で１つ又は複数のホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端で約１個〜約５個以上（例えば約１、２、３、４、又は５個以上）の連続ホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含むことができる。別の非限定的な例では、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖で１つ又は複数（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上）のピリミジンホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含むことができる。さらに別の非限定的な例では、本発明の例示的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖で、１つ又は複数（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上）のプリンホスホロチオエートのヌクレオチド間結合を含むことができる。

ｓｉＮＡ分子は環状核酸分子から成ることができ、ｓｉＮＡは、約１８〜約２３（例えば１８、１９、２０、２１、２２、又は２３）塩基対を有する約３８〜約７０（例えば約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０）ヌクレオチド長であり、環状オリゴヌクレオチドは、約１９塩基対及び２つのループを有するダンベル形構造を形成する。

環状ｓｉＮＡ分子は２つのループモチーフを含有し、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方のループ部分は生分解性である。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＮＡ分子のループ部分の分解によって、３’末端突出部（例えば約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド突出部）を有する二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成することができるように、本発明の環状ｓｉＮＡ分子が設計される。

ｓｉＮＡ分子（好ましくはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖であるが、任意でセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方でも）で存在する修飾ヌクレオチドは、天然リボヌクレオチドと同様の特性又は特徴を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、ノーザン構造（例えば、ノーザン擬回転サイクル、例えばSaenger著「核酸構造の原理（Principles of Nucleic Acid Structure）」 Springer-Verlag編, 1984を参照されたい）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。また、本発明のｓｉＮＡ分子（好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖であるが、任意でセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方でも）で存在する化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ分解に耐性であるが、同時にＲＮＡｉの媒介能を維持する。ノーザン構造を有するヌクレオチドの非限定的な例としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。

二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、センス鎖の３’末端、５’末端又は３’末端及び５’末端の両方で反転デオキシ塩基部等の末端キャップ部を有し得る。

さらにｓｉＮＡは、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、又はｓｉＮＡのセンス領域と、ｓｉＮＡのアンチセンス領域とを連結させる混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーをさらに含み得る。一実施形態では、ヌクレオチドリンカーは、２ヌクレオチド長より大きい（例えば約３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長の）リンカーであり得る。別の実施形態では、ヌクレオチドリンカーは核酸アプタマーであり得る。本明細書で用いられるように「アプタマー」又は「核酸アプタマー」とは、標的分子と特異的に結合する核酸分子を意味し、この核酸分子は、その自然環境下で標的分子によって認識される配列を含む配列を有する。代替的に、アプタマーは、標的分子と結合する核酸分子であってもよく、この標的分子は自然状態で核酸と結合しない。標的分子は任意の対象の分子であり得る。例えば、アプタマーを用いて、タンパク質のリガンド結合ドメインと結合することによって、天然リガンドとタンパク質とが相互作用するのを防ぐ。これは非限定的な例であり、当業者は、当該技術分野で一般的に知られている技法を用いて、他の実施形態を容易に作製することができることを理解する［例えばGold他, Annu. Rev. Biochem., 64: 763（1995）；Brody及びGold, J. Biotechnol., 74: 5（2000）；Sun, Curr. Opin. Mol. Ther., 2:100（2000）；Kusser, J. Biotechnol., 74: 27（2000）；Hermann及びPatel, Science 287: 820（2000）；並びにJayasena, Clinical Chemistry, 45: 1628.（1999）を参照されたい］。

非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は他のポリマー化合物（例えば２個〜１００個のエチレングリコール単位を有するようなポリエチレングリコール）を含み得る。具体例としては、Seela及びKaiser, Nucleic Acids Res., 18:6353（1990）及びNucleic Acids Res., 15:3113（1987）；Cload及びSchepartz, J. Am. Chem. Soc., 113:6324（1991）；Richardson及びSchepartz, J. Am. Chem. Soc., 113:5109（1991）；Ma他, Nucleic Acids Res., 21:2585（1993）及びBiochemistry 32:1751（1993）；Durand他, Nucleic Acids Res., 18:6353（1990）；McCurdy他, Nucleosides & Nucleotides, 10:287（1991）；Jschke他, Tetrahedron Lett., 34:301（1993）；Ono他, Biochemistry, 30:9914（1991）；Arnold他、国際公開特許第ＷＯ８９／０２４３９号；Usman他、国際公開特許第ＷＯ９５／０６７３１号；Dudycz他、国際公開特許第ＷＯ９５／１１９１０号、並びにFerentz及びVerdine, J. Am. Chem. Soc., 113:4000（1991）で記載されるものが挙げられる。さらに「非ヌクレオチド」は、１つ又は複数のヌクレオチド単位で核酸鎖に組み込むこと（糖及び／又はリン酸のいずれかの置換を含む）ができる任意の基又は化合物を意味し、残存塩基がその酵素活性を示すことができる。この基又は化合物は、例えば糖のＣ１位で一般的に認識されるヌクレオチド塩基（例えばアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミジン）を含有しないという点で脱塩基性であり得る。

化学修飾することができる、本発明のｓｉＮＡ分子の合成は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖の合成；（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに好適な条件下で共に２つの相補鎖をアニーリングすることを含む。別の実施形態では、ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成によるものである。さらに別の実施形態では、ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成によるものである。

オリゴヌクレオチド（例えば、或る特定の修飾オリゴヌクレオチド又はリボヌクレオチドを失ったオリゴヌクレオチド部分）は、例えばCaruthers他, 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19、Thompson他、国際公開特許第ＷＯ９９／５４４５９号、Wincott他, 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684、Wincott他, 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59、Brennan他, 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45、並びにBrennan、米国特許第６，００１，３１１号で記載されるような当該技術分野で既知のプロトコルを用いて合成される。本発明の或る特定のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡの合成は、例えばUsman他, 1987, J. Am. Chem. Soc, 109, 7845；Scaringe他, 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433；及びWincott他, 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684、Wincott他, 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59で記載されるような一般的な手法に従う。

複素環式薬物
複素環式薬物、特に少なくとも１つの窒素複素環を含有するものは、本明細書で記載される方法における薬学的因子として用いることができる。例えば、ヨヒンビンは、α−２−アドレナリン受容体を遮断するインドールアルカロイドである。ヨヒンビンの末梢効果は、アドレナリン活性を低減させるのと同時に、コリン活性を増大させることである。この組合せによって、或る特定の種類の雄の勃起性インポテンツの治療及び診断分類にヨヒンビンが使用されている。

複素環式薬物の他の例としては、モルヒネ、メトトレキサート（以前はアメトプテリン、Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）−メチル］メチルアミノ］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸）、ロラゼパム（７−クロロ−５−（ｏ−クロロ−フェニル）−１，３−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン）、６−メルカプトプリン（１，７−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−チオン一水和物）、５−フルオロウラシル、ニコチン、ニコチン酸及びナイアシンが挙げられるが、これらに限定されない。

薬学的因子の作製及び送達
本発明の組成物は一般的に、融合サポシンタンパク質又はポリペプチドを含み、所望の効果のために安全で且つ効果的な量で薬学的因子又は画像化因子（全て適切なｐＨで薬学的に許容可能な担体に含有される）を含有する、少なくとも１つの中性長鎖脂質を有する又は有しない少なくとも１つのアニオン性長鎖脂質と、少なくとも１つの中性若しくはアニオン性短鎖脂質とのいずれかから成るアニオン性リポソームに関する。活性剤の安全で且つ効果的な量は、患者において所望の美容効果又は治療効果を引き起こす量として定義される。本発明に熟練した経験のある実践者は適切な用量比に関する知識を有する。

当然、任意の所定の症例で投与される適切な用量は既知の要因（例えば特定の薬学的因子の薬力学的特徴、並びにその投与形態及び投与経路；レシピエントの年齢、全身状態、代謝、体重及び化合物に対する応答に影響する他の要因；併用療法の種類、治療頻度、並びに望まれる効果）によって変わる。

一実施形態では、本発明は、安全で且つ効果的な量で所望の薬学的因子を含み、薬学的因子はｐＨ約５．５以下の緩衝水溶液中でアニオン性リポソームに組み込まれる。好ましい融合タンパク質又はポリペプチドは、濃度が約２０ｎＭ〜約１００ｎＭ（ナノモル）、好ましくは約４０ｎＭ〜約５０ｎＭのサポシンＣであり、それからリポソーム−薬学的因子混合物へと導入される。リポソームの濃度は、融合タンパク質又はポリペプチドの濃度よりも過剰であり、モル比でサポシンＣの濃度よりも約１倍〜１０倍過剰、又は約３倍〜７倍過剰（すなわちサポシンＣ：リポソームのモル比が少なくとも１：１０）である。本実施形態では、少なくとも１つの画像化特性を有する少なくとも１つの画像化因子がリポソーム組成物に添加され得る。代替的に本実施形態では、薬学的因子を画像化因子に置き換えてもよい。

一実施形態において、リポソームは、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）等の負に荷電した長鎖脂質を少なくとも１種類含有する。リポソームは、好適な量のアニオン性長鎖脂質を含有する脂質の任意の混合物から作製され得る。特定の一実施形態では、リポソームは、アニオン性長鎖脂質（例えばＤＯＰＳ又はジミリストイルホスファチジルグリセロール（phosphatidylglcerol）（ＤＭＰＧ））と、中性長鎖脂質（例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）又はジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ））と、中性短鎖脂質（例えばＤＨＰＣ）とを含有する混合物から作製される。脂質混合物由来の得られるリポソームの総電荷は負である。短鎖リン脂質も負に荷電し得る。

それから、このような組成物を皮膚に局所塗布するか、又は本明細書に記載の方法によって他の組織、すなわち脳及びＣＮＳに投与することができる。活性剤がリポソーム内に含有される、このようなリポソーム−融合タンパク質複合体を調製する他の例は、米国特許第６，０９９，８５７号（Gross, ２０００年8月８日）、及び米国特許第５，７６６，６２６号（Gross, １９９８年６月１６日）（参照により本明細書に援用される）で与えられる。

経皮送達
本明細書に記載の薬学的因子−化学修飾剤複合体は経皮投与することができる。経皮投与は典型的に、患者の体循環への薬物の経皮通過のために薬学的因子を送達することを伴う。皮膚部位は、薬物を経皮投与するための解剖学的領域を含み、前腕、腹部、胸部、背部、臀部、及び乳様突起域等が挙げられる。

経皮送達は、長時間、患者の皮膚に複合体源を曝露することによって達成される。経皮パッチは、身体への薬学的因子の制御送達を与えるという追加利点を有する（「経皮薬物送達：開発問題及び研究イニシアチブ（Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives）」、Hadgraft及びGuy（編）, Marcel Dekker, Inc.,（1989）；「制御薬物送達：基礎及び応用（Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications）」、Robinson及びLee（編）, Marcel Dekker Inc.,（1987）；並びに「薬物の経皮送達（Transdermal Delivery of Drugs）」, Vols. 1-3, Kydonieus及びBerner（編）, CRC Press,（1987））。このような投与形態は、適切な媒体（例えばエラストマーマトリクス材料）中への薬学的因子、サポシンＣ及びアニオン性リポソームの溶解、分散、又はそうでなければ組み込みによって作製することができる。吸収促進剤を用いて、皮膚を通る化合物の流量を増大させることもできる。速度制御膜を設けること、又はポリマーマトリクス又はゲル中に化合物を分散することのいずれかによって、このような流速を制御することができる。

受動経皮薬物送達
様々な種類の経皮パッチが本明細書に記載の方法で用いられることが見出される。例えば、単一の接着パッチは、基材及びアクリル酸系接着剤から調製することができる。薬学的因子−化学修飾剤複合体及び任意の促進剤が接着剤を流し込んだ溶液に配合され、完全に混合された。溶液を基材上に直接流し込み、流延溶媒をオーブンでエバポレートし、接着フィルムをもたらす（leaving）。剥離（release）ライナーを接着し、このシステムを完了させることができる。

代替的に、ポリウレタンマトリクスパッチを用いて、薬学的因子−化学修飾剤複合体を送達することができる。このパッチの層は、基材、ポリウレタン薬物／促進剤マトリクス、膜、接着剤、及び剥離ライナーを含む。ポリウレタンマトリクスは、室温で硬化するポリウレタンプレポリマーを用いて調製される。プレポリマーへの水、アルコール及び複合体の添加によって、基材のみに直接流し込むことができる粘着性フィルムエラストマーを形成する。

本発明のさらなる実施形態は、ヒドロゲルマトリクスパッチを用いる。典型的に、ヒドロゲルマトリクスは、アルコール、水、薬物、及び幾つかの親水性ポリマーを含む。このヒドロゲルマトリクスは、基材と接着層との間の経皮パッチに組み込むことができる。

受動送達システムに関して、典型的に、リザーバと皮膚との間に位置する膜によって、モノリシックデバイスからの拡散によって、又は送達システムにおいて速度制御バリアとして働く皮膚自体によって、放出速度が制御される（米国特許第４，８１６，２５８号；同第４，９２７，４０８号；同第４，９０４，４７５号；同第４，５８８，５８０号；同第４，７８８，０６２号を参照されたい）。薬物送達速度は一部、膜の性質に依存する。例えば、身体内の膜を通る薬物送達速度は一般的に、皮膚バリアを通るよりも早い。複合体がデバイスから膜に送達される速度は、リザーバと皮膚との間に位置する律速膜の使用によって最も好都合に制御される。皮膚が複合体を十分に浸透させることができる（すなわち、皮膚を通る吸収が、膜を通る通過速度よりも大きい）と仮定すると、膜は患者が受ける用量速度を制御するように働く。

好適な浸透膜材料は、所望の浸透度、複合体の性質、及びデバイスの構築に関する力学的考察に基づいて選択され得る。浸透膜材料の例としては、多種多様な天然及び合成ポリマー（例えばポリジメチルシロキサン（シリコーンゴム）、エチレンビニルアセテートコポリマー（ＥＶＡ）、ポリウレタン、ポリウレタン−ポリエーテルコポリマー、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セルロース系材料、例えば三酢酸セルロース及び硝酸／酢酸セルロース、並びにヒドロゲル、例えば２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ））が挙げられる。

所望のデバイス特徴によって、治療薬の他の従来成分等の他の要素（items）がデバイスに含まれ得る。例えば、本発明による組成物は、１つ又は複数の防腐剤又は静菌剤（例えばヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、及び塩化ベンザルコニウム等）も含み得る。これらの薬学的組成物は、抗菌剤（特に抗生物質）、麻酔剤、鎮痛剤及び鎮痒剤等の他の活性成分も含有することができる。

局所治療
本発明の別の態様は、薬学的組成物の局所送達を提供する。この治療レジメンは、薬学的因子の全身投与、又は局所療法（すなわち病理組織又は疾患組織に直接）のいずれかに好適である。

典型的に、局所製剤は、罹患皮膚に薬学的因子−化学修飾剤複合体を直接送達するために、非毒性の薬学的に許容可能な局所担体と共に、典型的に約０．００１％〜１０％、好ましくは約０．０１％〜約１０％、より好ましくは約０．１％〜約５％、及び最も好ましいは約１％〜約５％の範囲の濃度で複合体を含む調製物を含む（「皮膚製剤：経皮吸収（Dermatological Formulations: Percutaneous Absorption）」, Barry（編）, Marcel Dekker Inc.,（1983）を参照されたい）。従来の薬学的因子の標準用量に関しては、例えば米医薬品便覧（１９９２年版）及び米国医師会（1992）のDrug Evaluations Subscriptionsを参照されたい。

局所調製物は、薬学的因子−化学修飾剤複合体と、局所乾燥製剤、液状製剤、クリーム状製剤及びエアロゾル製剤で一般的に用いられる従来の薬学的希釈剤及び担体とを組合せることによって調製することができる。例えば、軟膏及びクリームは、好適な増粘剤、及び／又はゲル化剤を添加しながら、水性基剤又は油性基剤で作製され得る。このような基剤は、水及び／又は脂質パラフィン等のオイル、又はラッカセイ油若しくはヒマシ油等の植物油を含み得る。基剤の性質に従って用いられ得る増粘剤としては、軟パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、水添ラノリン、及び蜜蝋等が挙げられる。ローションは、水性基剤又は油性基剤で作製することができ、また概して、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤及び香料等の１つ又は複数を含む。粉末は任意の好適な粉末基剤（例えばタルク、ラクトース、及びデンプン等）を用いて形成され得る。ドロップは、１つ又は複数の分散剤、懸濁剤、及び可溶化剤等も含む水性基剤又は非水性基剤で作製され得る。

本発明の複合体の局所投与用の剤形としては、粉末、噴霧剤（sprays）、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が挙げられる。活性化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容可能な担体と、及び必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝剤、又は推進剤と混合され得る。

軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、賦形剤（例えば動物性油及び植物油、オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、タルク及び酸化亜鉛）又はこれらの混合物も含有し得る。粉末及び噴霧剤は、賦形剤（例えばラクトース、タルク、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末）、又はこれらの物質の混合物も含有することができる。噴霧剤はさらに、従来の推進剤（例えばクロロフルオロ炭化水素）、及び揮発性非置換炭化水素（例えばブタン及びプロパン）を含有することができる。

経粘膜送達
本明細書におけるほとんどの記述は経皮送達に関する技法に集中しているが、本発明の方法は、粘膜（例えば胃腸膜、舌下膜、口腔膜、鼻膜、肺膜、膣膜、角膜及び眼球膜）を通る薬学的因子の輸送及び送達の増強にも適用可能である（Mackay他（1991） Adv. Drug Del. Rev, 7:313-338を参照されたい）。特に、皮膚膜と粘膜との間には多くの類似性が存在する。例えば、口腔膜は非角化である。しかし、口腔膜は皮膚に類似しており、これは両方とも、表面の扁平上皮細胞に至る基底膜において多角性細胞から成る口腔膜で層を成しているためである。

経粘膜（すなわち、舌下、口腔及び膣）薬物送達は、体循環への活性物質の効果的な侵入及び肝臓及び腸壁フローラによる即座の代謝の低減を提供する。経粘膜薬物の剤形（例えば、錠剤、坐薬、軟膏、ゲル、ペッサリー、メンブレン及び粉末）は典型的に、粘膜と接触し迅速に分解及び／又は溶解して、即時に体内に吸収される。

口腔投与
口腔膜又は舌下膜への送達に関しては典型的に、経口製剤（例えばロゼンジ、錠剤、又はカプセル）が用いられる。これらの製剤の製造方法は当該技術分野で既知であり、製造前錠剤への薬学的因子−化学修飾剤複合体の添加；不活性充填剤と、結合剤と、薬学的因子−化学修飾剤複合体又は複合体を含有する物質のいずれかとの冷間圧縮（米国特許第４，８０６，３５６号（参照により援用される）で記載される）；及び封入が挙げられるが、これらに限定されない。

別の経口製剤は、例えば米国特許第４，９４０，５８７号（参照により援用される）で記載されるような経口粘膜に接着剤（例えばセルロース誘導体、ヒドロキシプロピルセルロース）で塗布することができるものである。頬粘膜に塗布する場合、この口腔接着性製剤によって、頬粘膜を通して口に薬学的因子−化学修飾剤複合体を制御放出することができる。

鼻／肺投与
鼻膜及び／又は肺膜への送達に関しては典型的に、エアロゾル製剤が用いられる。「エアロゾル」という用語は、細気管支又は鼻腔に吸引することができる、任意の気体媒介性（gas-borne）懸濁相の薬学的因子−化学修飾剤複合体を含む。特にエアロゾルは、定量吸入器若しくはネブライザ、又は噴霧器で作製され得るような本発明の化合物の気体媒介性懸濁液滴を含む。エアロゾルは、空気又は他の担体気体中で懸濁された薬学的因子−化学修飾剤複合体の乾燥粉末組成物も含み、吸入器からの吸入によって送達され得る。

血液脳関門を通る送達
本発明を用いて、血液脳関門を通して薬学的因子又は画像化因子を輸送することもできる。サポシンＣ（又はその変異体若しくはそのペプチド）を含有するリポソーム、及びＤＯＰＳ等の負に荷電した長鎖脂質は、当該技術分野で記載されたような方法を用いて、ＣＮＳ（特に脳）への送達のために筋肉内投与、静脈内投与、眼球内投与又は経鼻投与することができる。例えば、鼻腔を通る投与によって、嗅覚器官のＣＳＦへ、それから脳室内注入（ＩＣＶ）と同様に末梢血液中へと侵入する。全て上記のように、当業者は、他の中性長鎖脂質及び／又は短鎖脂質（中性又は陰性）が、最終組成物の安定性又は有用性を改善するために上記されたリポソーム組成物に含まれ得ることを理解されたい。

ＣＮＳへの輸送の成功例として、本発明者は、サポシンＣを、ＤＯＰＳリポソームとの複合体によって容易に、培養マウスの皮質ニューロン及び海馬ニューロンに輸送することができることを実証している。サポシンＣは、長鎖アニオン性リン脂質を含有するサポシンＣリポソームを用いて、エンドソーム区画及びリソソーム区画に輸送することができる。この方法は、神経疾患（例えばＭＶＢの集積が疾患の病変及び進行に起因するものを含む）の治療に用いることができる。例えば、ＭＶＢ形成がニューロン及び脳組織で見出されるＰＳＡＰ−／−マウスでは、尾注射によるＤＯＰＳ−サポシンＣリポソームの投与によって、これらの構造の集積が低減された。図５及び図７を参照されたい。

別の実施形態において、多くの血液脳標的剤がリポソーム表面に結合する。好適な標的剤としては、これらのペプチド全てがＢＣＭ上にも存在するＢＢＢ内に内因性ＲＭＴシステムを有し、これらの内因性ペプチドを「輸送可能なペプチド」として用いることができるので、インスリン、トランスフェリン、インスリン様増殖因子、又はレプチンが挙げられる。代替的に、リポソーム表面は、１つのペプチドが内因性ＢＢＢ受容体を標的とし、もう１つのペプチドが内因性ＢＣＭペプチドを標的とする、２つの異なる「輸送可能なペプチド」と結合することができる。後者は、脳内の特定細胞（例えばニューロン、膠細胞、周皮細胞、平滑筋細胞又は小膠細胞）に特異的であり得る。標的ペプチドは、受容体の内因性ペプチドリガンド、内因性リガンドの類似体、又は内因性リガンドの同じ受容体と結合するペプチド擬似ＭＡｂであり得る。ＢＢＢ「輸送可能なペプチド」としてのトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）特異的なペプチド擬似モノクローナル抗体の使用が、米国特許第５，１５４，９２４号、同第５，１８２，１０７号、同第５，５２７，５２７号、同第５，６７２，６８３号、同第５，８３３，９８８号及び同第５，９７７，３０７号で詳細に記載される。ＢＢＢ「輸送可能なペプチド」としてのヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）へのＭＡｂの使用が記載されている。

リポソーム表面に血液関門標的剤を結合させるのに用いられる連結剤は、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は他の有機ポリマー等の既知のポリマー連結剤のいずれかであり得る。一実施形態では、ＰＥＧは連結剤である。一実施形態では、連結剤の分子量は、１０００Ｄａ〜５００００Ｄａである。一実施形態では連結剤は、一方の末端で脂質、及びもう一方の末端でマレイミド基を含有する二官能性で２０００ＤａのＰＥＧである。ＰＥＧの脂質末端は、受容体特異的なモノクローナル抗体又は他の血液脳関門標的ビヒクルと結合するマレイミド基を有するリポソーム表面と結合する。一実施形態では、５個〜１０００個の標的ビヒクルはそれぞれのリポソームと結合する。一実施形態では、約２５個〜４０個の標的ビヒクルと結合したリポソームが与えられる。

本発明は、好ましいナノコンテナとしてリポソームを用いて記載されているが、他のナノコンテナを用いてもよいことが当業者によって認識される。例えば、リポソームはナノ粒子、又はＤＮＡを封入し、核酸をヌクレアーゼから保護することができる、直径２００ｎｍ未満の任意の他の分子ナノコンテナで置き換えることができるが、製剤は依然として血液中又は血液から標的細胞の細胞内区画への輸送中に存在する。また、ＰＥＧ鎖は、スフィンゴミエリン（sphingomylein）等の複数の他のポリマー物質に置き換えることができ、リポソーム又はナノコンテナの表面に結合し、「輸送可能なペプチド」の結合のため、及び血液由来製剤の除去を遅らせ、血漿薬物動態を最適化するために足場を提供するという二重の目的を達成する。さらに、本発明は特異的な標的受容体を有するいずれかの群の細胞又は組織への遺伝子の送達を考慮する。

融合サポシンタンパク質及びポリペプチドによるゴーシェ病の治療
さらに、サポシンＣは、ｉｎ ｖｉｖｏでのグルコシルセラミドのセラミドへの加水分解に必須である。表皮グルコセレブロシダーゼの欠乏によって、グルコシルセラミドとセラミドとの比が変わり、この比の変化がゴーシェ病の特徴である皮膚バリアの異常に関わる。サポシンＣは、角質層において生理学的濃度のグルコシルセラミド及びセラミドを維持することによる表皮透過バリアの形成に必須であると考えられる。この様式によれば、グルコセレブロシダーゼを刺激する際のサポシンＣの役割は、膜に対する脱安定化作用によって媒介される。このように、表皮グルコセレブロシダーゼが欠乏した患者では、薬学的に許容可能な担体に含有された混合物であるサポシンＣ−リポソーム複合体（リポソームは酸βグルコシダーゼを含有する）の局所適用を利用して、皮膚バリアの形成及び機能の調節の助けとなるように、グルコシルセラミドのセラミドへの加水分解を容易にするために、細胞膜と融合することができる。例えば、これらの組成物は、クリーム、ローション、溶液又はゲルとして作製することができる。例えば、担体としては、薬学的に許容可能な皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、溶媒、防腐剤、着色剤及び香料が挙げられ得る。

画像化因子の投与用の送達システムとしてのサポシンＣリソソーム
本発明の別の実施形態において、サポシンＣ含有リポソームを用いて、１つ又は複数の異なる画像化特性を有する少なくとも１つの画像化因子を同時に送達することができる。これらの画像化因子は、核磁気画像化特性、蛍光特性、又はＣＴ／ＰＥＴ検出特性を利用し得る。サポシンＣ含有リポソームの単一集団を用いて、薬学的因子を有する又は有しない複数の画像化因子が所望の組織に送達され得るように、１つ又は複数の画像化因子は、サポシンＣ含有リポソームに同時に統合又は封入され得る。

本発明のさらなる実施形態において、本発明のリポソームベースの造影剤（contrast medium）は、従来の造影剤（contrast agents）等の付加的な造影剤をさらに含んでもよく、ＭＲＩに対する造影剤の有効性を増大させるように働き得る。多くのこのような造影剤は当業者に既知であり、常磁性及び超常磁性の造影剤が挙げられる。

本発明で用いるのに好適な常磁性造影剤の例としては、安定なフリーラジカル（例えば安定なニトロキシド）、並びに遷移元素、ランタニド元素及びアクチニド元素を含む化合物が挙げられ、必要に応じて塩形態であってもよく、又は錯化剤（その脂溶性誘導体を含む）、若しくはタンパク質性巨大分子と共有結合若しくは非共有結合してもよい。

好ましい遷移元素、ランタニド元素及びアクチニド元素としては、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｅｒ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）及びＤｙ（ＩＩＩ）が挙げられる。より好ましくは、これらの元素としては、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）及びＤｙ（ＩＩＩ）、特にＭｎ（ＩＩ）及びＧｄ（ＩＩＩ）が挙げられる。

必要に応じてこれらの元素は、マンガン塩（例えば塩化マンガン、炭酸マンガン、酢酸マンガン、並びにグルコン酸マンガン及びヒドロキシルアパタイトマンガン等のマンガンの有機塩）及び鉄塩（例えば硫化鉄及び塩化第二鉄等の第二鉄塩）等の塩形態であってもよい。

必要に応じて、これらの元素は、例えば錯化剤（その脂溶性誘導体を含む）、又はタンパク質性巨大分子と共有結合又は非共有結合してもよい。例えば好ましい錯化剤としては、ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレン−ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＤＯ３Ａ）、３，６，９−トリアザ−１２−オキサ−３，６，９−トリカルボキシメチレン−１０−カルボキシ−１３−フェニル−トリデカン酸（Ｂ−１９０３６）、ヒドロキシベンジルエチレン−ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ピリドキシル−５−ホスフェート）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ’−二酢酸塩（ＤＰＤＰ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、クリプタンド（kryptands）（すなわち、大環状錯体）、及びデスフェロキサミンが挙げられる。より好ましくは、錯化剤はＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯ３Ａ及びクリプタンド、最も好ましくはＤＴＰＡである。好ましくはその脂溶性錯体としては、錯化剤ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ等のアルキル化誘導体（例えばＥＤＴＡ−ＤＤＰ、すなわちＮ，Ｎ’−ビス−（カルボキシ−デシルアミドメチル−Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸塩；ＥＤＴＡ−ＯＤＰ、すなわちＮ，Ｎ’−ビス−（カルボキシ−オクタデシルアミド−メチル−Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸塩；ＥＤＴＡ−ＬＤＰ Ｎ，Ｎ’−ビス−（カルボキシ−ラウリルアミドメチル−Ｎ−２，３−ジヒドロキシプロピル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸塩等、例えば１９９２年５月２２日に出願された米国特許第８８７，２９０号（その開示は全体が参照により本明細書に援用される）で記載されたもの）が挙げられる。好ましいタンパク質性巨大分子としては、アルブミン、コラーゲン、ポリアルギニン、ポリリシン、ポリヒスチジン、γ−グロブリン及びβ−グロブリンが挙げられる。より好ましくは、タンパク質性巨大分子は、アルブミン、ポリアルギニン、ポリリシン、及びポリヒスチジンを含む。

したがって、好適な錯体としては、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＴＰＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＯＴＡ、Ｍｎ（ＩＩ）−ＤＯ３Ａ、Ｍｎ（ＩＩ）−クリプタンド、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡ、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＯＴＡ、Ｇｄ（ＩＩＩ）−ＤＯ３Ａ、Ｇｄ（ＩＩＩ）−クリプタンド、Ｃｒ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡ、Ｃｕ（ＩＩ）−ＥＤＴＡ、又は鉄−デスフェリオキサミン、特にＭｎ（ＩＩ）−ＤＴＰＡ又はＧｄ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡが挙げられる。

ニトロキシドは、ニトロキシド分子において１つの不対電子によってＴ１及びＴ２の両方の緩和速度を増大させる常磁性造影剤である。ＭＲＩ磁性剤としての所定の化合物の常磁性効率は、常磁性（paragmagnetic）核又は分子における不対電子の数、特に不対電子の数の二乗に少なくとも一部関連する。例えば、ガドリニウムは７つの不対電子を有し、ニトロキシド分子は１つの不対電子だけを有する。したがって、ガドリニウムは一般的に、ニトロキシドよりも非常に強いＭＲＩ造影剤である。しかし、造影剤の有効性を評価するのに重要な別のパラメータである有効相関時間によって、ニトロキシドに対する潜在的な緩和能の増大が与えられる。有効相関時間がプロトンラーモア周波数に非常に近い場合、緩和速度は劇的に増大し得る。例えば常磁性造影剤を大きい構造体に結合させることによるタンブリング速度が遅い場合、タンブリング速度が遅くなることによって、エネルギーをより効率的に移動させ、水プロトンの緩和を早める。しかしガドリニウムでは、電子スピン緩和時間が早く、遅い回転相関時間が緩和能を増大することができる範囲が制限される。しかし、ニトロキシドに関しては、電子スピン相関時間がより良好であり、これらの分子の回転相関時間を遅くすることによって、緩和能の劇的な増加が達成され得る。本発明のリポソームは、回転相関時間を遅くし、それによって緩和能を改善するという目的を達成するのに理想的である。特定の動作理論に拘束されることを望んでいないが、ニトロキシドが、例えばそのアルキル誘導体を作製することによってリポソーム周辺を覆うように設計され得るので、得られる相関時間を最適化することができると考えられる。さらに、得られた本発明の造影剤は、緩和能を最大限にする幾何学形状である磁性球と見なされ得る。

必要に応じて、ニトロキシド２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル及び２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、フリーラジカル（ＴＭＰＯ）等のニトロキシドは、アルキル化又はそうでなければ改質（derivitized）され得る。

本発明に用いるのに好適な超常磁性造影剤の例としては、磁区を経験する金属酸化物及び金属硫化物、強磁性化合物又はフェリ磁性化合物（例えば純鉄）、磁性酸化鉄（例えばマグネタイト）、γ−Ｆｅ_２Ｏ_３、マンガンフェライト、コバルトフェライト及びニッケルフェライトが挙げられる。

造影剤（例えば上記の常磁性造影剤及び超常磁性造影剤）は、ミクロスフェア内又はミクロスフェアを含む造影剤中の成分として用いられ得る。これらは、ミクロスフェアの内部空間内で封入しても、ミクロスフェア内に溶液として投与しても、又はミクロスフェア壁を形成する安定化合物に組み込んでもよい。

例えば、必要に応じて、常磁性造影剤又は超常磁性造影剤は、アルキル化誘導体、又は安定化合物（特にミクロスフェアの脂質壁）に組み込まれた他の誘導体として送達され得る。特に、ニトロキシド２，２，５，５−テトラメチル−１−ピロリジニルオキシ、フリーラジカル及び２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシ、フリーラジカルは、多くの異なる連結（例えばアセチルオキシ基）によってメチル基で占められていない環の位置で長鎖脂肪酸を有する付加化合物を形成することができる。このような付加化合物は、安定化合物（特に脂質性のもの）に非常に組み込まれやすく、本発明のミクロスフェア壁を形成する。

造影剤中の常磁性造影剤及び／又は超常磁性造影剤の任意の１つ又は複数の混合物が同様に用いられ得る。

必要に応じて、上記の常磁性造影剤及び超常磁性造影剤は、別々に同時投与してもよい。

本発明で用いられるリポソームは、超常磁性造影剤の有効な担体（例えば酸化鉄）として働くだけでなく、造影剤の作用の感受性を増大させることもできるようである。超常磁性造影剤としては、金属酸化物（特に酸化鉄であるが、酸化マンガンを含む）が挙げられるが、これは酸化鉄が、磁区を経験する様々な量のマンガン、コバルト及びニッケルを含有するためである。これらの造影剤はナノ粒子又はマイクロ粒子であり、高い体積磁化率（bulk susceptibility）及び横緩和速度を有する。例えば直径が１００ｎｍの大きい粒子は、Ｒ１緩和能よりもＲ２緩和能が非常に高いが、例えば直径が１０ｎｍ〜１５ｎｍの小さい粒子はＲ２緩和能が幾らか低く、はるかにＲ１の値とＲ２の値とのバランスがとれている。直径が３ｎｍ〜５ｎｍの最も小さい粒子（例えば単結晶酸化鉄粒子）はさらにＲ２緩和能が低く、もっともＲ１緩和速度とＲ２緩和速度とのバランスがとれている。フェリチンは、非常に高い緩和速度の超常磁性鉄の中心を封入するように作製することもできる。本発明で用いられる安定化リポソームは、これらの従来の酸化鉄ベースのＭＲＩ造影剤の有効性及び安全性を増大することができることが発見されている。

リポソームへの造影剤の組み込みは、これに含有される薬学的因子の取り込み及び送達の測定に有利である。さらに、このような造影剤が、組織構造、又は癌の場合、転移又は腫瘍増殖の程度の画像化も可能にする。本発明の一実施形態では、サポシンＣ含有リポソームは、生体膜を通して薬学的因子及び画像化因子の両方を輸送することができる。別の実施形態では、複数の画像化因子をリポソーム膜に組み込むことができ、又は複数の画像化特性を有する画像化因子（例えば上記及び実施例で記載されるＰＴＩＲ剤）を用いることができる。いずれかの方法によって、臨床医又は研究者がリポソーム組成物の単一投与で複数の検出方法を利用することが可能になる。

画像化因子は、磁気共鳴画像化装置、蛍光装置又はＰＴ／ＣＡＴ装置を利用し得る。身体での磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）造影強化剤又は放射性同位体の使用は、様々な方法によって実施される。例えば、Li他、米国特許第６，５６９，４５１号（参照により援用される）は、重合化リポソーム粒子を用いて、造影剤（例えば磁気共鳴画像化を利用するもの）を送達し得る方法を教示する。

本発明の一実施形態において、ＭＲ造影剤（例えば極小超常磁性酸化鉄（Ultrasmall SuperParamagnetic Iron Oxide）（ＵＳＰＩＯ）ナノ粒子）は、リポソームの水性内部に封入することができる。ＭＲＩスキャン法はガドリニウム又はマンガネーゼのキレートを用い得る。しかし、ＭＲ検出のための非食細胞の標識には、リポソームが十分な量の造影剤を封入及び送達することが必要である。腫瘍特異的なリポソームを用いて組織に造影剤を送達し、検出をより早く、ＭＲＩを用いた視覚化をより良好にすることができる。標的薬物の送達及び取り込みは、薬物及び造影剤に対する二重担体として本発明のリポソームを用いることによって、造影強化されたＭＲマイクロ画像化を利用して予測することもできる。例えば、ＭＲＩを用いて検出される分子画像化因子であるＣＯＭＢＩＤＥＸ（Advanced Magnetics, MA、サイズ０ｎｍ）は、ジオレイルホスファチジルセリン（dioleylphosphatidyserine）（ＤＯＰＳ）で作製されたリポソームに封入することができる。それから、これらのリポソームをヒト神経芽腫細胞に効率的に送達することができる。このことは、本発明の実施例３に詳しく記載される。

必要に応じて、２つ以上の異なる鉄を組合せて用いてもよい。当業者が認識するように、本開示が効力を発揮すれば、脂溶性化合物と常磁性鉄との様々な組合せを用いて、得られる造影剤の緩和挙動を変えることができる。本発明の対象の常磁性鉄と脂溶性化合物との複合体は、磁気共鳴画像化に極めて効果的な造影強化剤であることが見出されている。

本発明の脂溶性化合物は、単独で用いても、又は互いに組合せて用いても、磁気共鳴画像化用の造影剤として、１つ又は複数の常磁性鉄と組合せて用いてもよい。常磁性鉄の例としては、本開示を鑑みて当業者にとって容易に明らかであるように、遷移イオン、ランタニドイオン（希土類）及びアクチニドイオンが挙げられる。好ましい常磁性イオンとしては、Ｃｒ３、Ｃｏ２、Ｍｎ２、Ｎｉ２、Ｆｅ３、Ｆｅ２、Ｌａ３、Ｃｕ２、Ｇｄ３、Ｃｅ３、Ｔｂ３、Ｐｒ３、Ｄｙ３、Ｎｄ３、Ｈｏ３、Ｐｍ３、Ｅｒ３、Ｓｍ３、Ｔｍ３、Ｅｕ３、Ｙｂ３及びＬｕ３から成る群から選択されるものが挙げられる。より好ましくは、常磁性イオンは、Ｍｎ２、Ｆｅ３及びＧｄ３、最も好ましくはＭｎ２から成る群から選択される。

複数の造影剤が、磁気共鳴画像化において組織の造影を高めるのに利用可能である。幾つかの最も一般的に用いられる造影剤は、ガドリニウムのキレート（例えばＧｄ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、及びＧｄ−ＤＯＴＡ）である。現在最も利用可能な造影剤製剤は分子サイズが小さい。一実施形態では、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム及びマグネタイトから成る群から選択される。

さらに、蛍光画像化因子は、本発明のリポソーム内に組み込まれ得ることによって、付加的な検出手段を提供する。例えば、ＮＢＤ、ローダミン、上記のＰＴＩＲ標識、又は他の既知の蛍光剤が用いられ得る。任意の市販の蛍光標識又は蛍光標識色素（脂溶性であるか又は脂溶性部を含有する）（例えば上記のもの）が本発明で用いられ得る。Hui, L他は、ＰＴＩＲ造影剤を用いてＬＤＬ粒子を標識することができ、参照により本明細書中に援用される方法を説明している。Hui, L他著「低密度のリポタンパク質受容体のＭＲ及び蛍光画像化（MR and Fluroescent Imaging of Low Density Lipoproteing Receptors）」, Acad Radiol 2004; 11:1251-1259。脂質組成物中の蛍光剤の全濃度は、約１％〜約５％又は約２％〜約４％である。蛍光剤の中で、ＰＴＩＲ２７１及び３１６等のより長い波長（赤色蛍光）を発するマーカーによって、ｉｎ ｖｉｖｏでより小さいバックグラウンドが得られる。青色波長及び緑色波長はより大きいバックグラウンドシグナルを有する。ＰＴＩＲ２７１は、本発明者によって、最小のバックグランド及び明らかに検出可能なシグナルでサポシンＣ含有リポソームに組み込まれることが実証されている。図７は、ＰＴＩＲ２７１及び３１６を含有するＤＯＰＳリポソームの取り込みを示す。

脂質、ヨウ素含有化合物（好適にはヨードフェニル誘導体又はポリヨードフェニル誘導体）がヨウ素含有造影剤として用いられる。好適な材料としては、イオプロミド、イオキシタラメート、イオキサグラート、イオパミドール、イオヘキソール、イオトラロン、メトリザミド又はウルトラビストが挙げられる。同時に造影剤は、凍結乾燥品（lyophilisates）の混合用の溶媒として働く。ガドリニウム含有造影剤又はマグネタイト含有造影剤のいずれかが、磁気共鳴断層撮影法（ＭＲＴ）に用いられる。好適には、３０ｍｇ〜９０ｍｇの凍結乾燥粒子を要求される量の細胞増殖抑制薬と混合し、その後３ｍｌ〜６ｍｌの造影剤中に溶解する。

新規の調製物及びその使用によって、間接的な方法の助けを借りずにＸ線透視を利用して、フローコード化（flow-coded）測定配列と組合せてガドリニウム含有造影剤又はマグネタイト含有造影剤を用いて、十分な塞栓が直接投影されること、塞栓血管を有する腫瘍を静止画像として画像化することが可能であるが、塞栓は、磁気共鳴断層撮影法の助けを借りても投影することができる。腫瘍組織における細胞増殖抑制薬の達成可能濃度は、他の投与形態に比べて大幅に増大する（最大２０倍）。適用は単純化されるが、同時に安全性が増大する（不良な逆灌流（retrograde faulty perfusion）が避けられる）。

最終的に、コンピュータ断層撮影法（ＣＴスキャン）又はポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）を利用する画像化因子を用いることができる。最も一般的に用いられる放射性核種画像化因子としては、放射活性ヨウ素及びインジウムが挙げられる。ＣＴスキャンによる画像化は、鉄キレート等の重金属を利用し得る。さらに、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）には、酸素、窒素、鉄、炭素又はガリウムのポジトロン放出体を用いることが可能であり得る。画像化手順に有用な放射性核種の例としては、^４３Ｋ、^５２Ｆｅ、^５７Ｃｏ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７７Ｂｒ、^８１Ｒｂ、^８１Ｋｒ、^８７Ｓｒ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１２３Ｉ、^１２５I、^１２７Ｃｓ、^１２９Ｃｓ、^１３１Ｉ、^１３２Ｉ、^１９７Ｈｇ、^２０３Ｐｂ及び^２０６Ｂｉが挙げられる。ＣＴ／ＰＥＴで検出可能なこれらの画像化因子は、当業者に既知の方法を用いて、サポシンＣリポソームに組み込むことができる。

当業者は、既知の技法を用いてサポシンＣポリペプチドと放射性核種とを結合し得る。例えば、Magerstadt, M.（1991）著「抗体複合体及び悪性疾患（Antibody Conjugates And Malignant Disease）」, CRC Press, Boca Raton, Fla.,；並びにBarchel, S. W.及びRhodes, B. H.（1983）著「放射性画像化及び放射線治療（Radioimaging and Radiotherapy）」, Elsevier, New York, N.Y.（それぞれが参照により本明細書に援用される）は、様々な治療的放射性核種及び診断的放射性核種と、抗体のアミノ酸との結合を教示している。このような反応を適用し、放射性核種と、サポシンＣペプチド又は適切なリンカーを有するサポシンＣペプチドとを結合し得る。

標識
本発明の組成物は任意に、１つ又は複数の標識（例えば蛍光標識又は発光標識等の光学的に検出可能な標識、及び／又は磁性標識等の非光学的に検出可能な標識）を含む。多くの蛍光標識は当該技術分野で既知であり、量子ドット、疎水性フルオロフォア（例えばクマリン、ローダミン及びフルオレセイン）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）並びにそれらの変異型（例えばシアン蛍光タンパク質及び黄色蛍光タンパク質）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Haughland（2002）著「蛍光プローブ及び研究成果のハンドブック（Handbook of Fluorescent Probes and Research Products）」（第９版又は最新のウェブ版、両方ともMolecular Probes, Incから利用可能である）を参照されたい。同様に、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの蛍光消失（quenching）、非ＦＲＥＴベースの蛍光消失、又は波長シフト回収（harvester）分子を利用した多様なドナー／アクセプタ及びフルオロフォア／クエンチャの組合せが既知である。組合せの例としては、シアン蛍光タンパク質及び黄色蛍光タンパク質、テルビウムキレート及びＴＲＩＴＣ（テトラローダミンイソチオシアネート）、ランタニド（例えば、ユーロピウム又はテルビウム）キレート及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はＣｙ５、ユーロピウムクリプテート及びアロフィコシアニン、フルオレセイン及びテトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ及びフルオレセイン、ＥＤＡＮＳ及びＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン及びＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン及びフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ及びＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、並びにフルオレセイン及びＱＳＹ７色素が挙げられる。ＤＡＢＣＹＬ等の非蛍光アクセプタとＱＳＹ７及びＱＳＹ３３色素とは、直接（すなわち非感作）アクセプタ励起に起因するバックグランド蛍光を取り除くという特定の利点がある。例えば、ＦＲＥＴ色素の記載に関しては、Mathies他への米国特許第５，６６８，６４８号、同第５，７０７，８０４号、同第５，７２８，５２８号、同第５，８５３，９９２号、及び同第５，８６９，２５５号を参照されたい。

生体分子の標識としての量子ドットの使用に関しては、例えば、Dubertret他（2002）Science 298:1759；Nature Biotechnology（2003） 21:41-46；及びNature Biotechnology（2003） 21:47-51を参照されたい。本発明の文脈では、このような量子ドットを用いて、任意の対象の核酸（例えば干渉ＲＮＡ）を標識することができる。

他の光学的に検出可能な標識も本発明で用いることができる。例えば、金ビーズを標識として用いることができ、共鳴光散乱によって白色光源を用いて検出することができる。例えばhttp://www.geniconsciences.comを参照されたい。好適な非光学的に検出可能な標識も当該技術分野で既知である。例えば、磁性標識を本発明で用いることができる（例えば標識及びＮＭＲ検出としての３ｎｍの超常磁性コロイド状酸化鉄、例えばNature Biotechnology（2002） 20:816-820を参照されたい）。

合成中、又は当該技術分野で確立された技法による合成後の反応によって、標識を核酸に導入することができる。例えば、核酸の酵素的合成又は化学合成中に、例えば事前に選択された又はランダムなヌクレオチド位置で、蛍光標識ヌクレオチドをＲＮＡ又はＤＮＡに組み込むことができる。代替的に、合成後の反応によって、ランダムな又は事前に選択された位置で、蛍光標識をＲＮＡ又はＤＮＡに付加することができる（例えば、オリゴヌクレオチドは、事前に選択された位置で末端アミン又は遊離チオールで化学合成することができ、フルオロフォアは、アミン又はチオールによる反応によってオリゴヌクレオチドと連結することができる）。核酸の蛍光標識のための試薬が市販されており、例えば核酸を蛍光標識するための様々なキットがMolecular Probes, Inc.（www.probes.com）から利用可能であり、二本鎖ＲＮＡをランダムに標識するためのキットはAmbion, Inc.（www.ambion.com、サイレンサー（商標）ｓｉＲＮＡ標識キット）から利用可能である。類似の技法によって、クエンチャを導入することができる。

自動合成中、及び合成後反応によるオリゴへの標識の付着が記載されている。例えばTyagi及びKramer（1996）著「分子指標：ハイブリダイゼーションの際に蛍光を発するプローブ（Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization）」Nature Biotechnology 14:303-308；Tyagi他への米国特許第６，０３７，１３０号（２０００年３月１４日）、表題「波長シフトプローブ及びプライマー、並びにアッセイ及びキットにおけるそれらの使用（Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits）」；並びにTyagi他への米国特許第５，９２５，５１７号（１９９９年７月２０日）、表題「検出可能に標識された二重構造のオリゴヌクレオチドプローブ、アッセイ及びキット（Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits）」を参照されたい。官能性オリゴの合成に対するさらなる詳細は、Nelson他（1989）著「新規のＣＰＧ支持体を用いて合成した二官能性オリゴヌクレオチドプローブは、一塩基対突然変異を検出することができる（Bifunctional Oligonucleotide Probes Synthesized Using A Novel CPG Support Are Able To Detect Single Base Pair Mutations）」Nucleic Acids Research 17:7187-7194で見出すことができる。

例えば、クエンチャ（例えば、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニル部（ＤＡＢＳＹＬ））を導入するのに制御孔ガラス円柱を用いることによって、標識及び／又はクエンチャをオリゴヌクレオチドに導入することができる。例えば、自動合成中にオリゴヌクレオチドの３’末端でクエンチャを付加することができる。付着部位が第１級アミノ基である場合、４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）のスクシンイミジルエステルを用いることができ、付着部位がスルフヒドリル基である場合、４−ジメチルアミノフェニルアゾ−フェニル−４’−マレイミド（ＤＡＢＭＩ）を用いることができる。同様に、ヌクレオシドをフルオレセインに置き換えるフルオレセインホスホルアミダイトを用いて、又はスペーサによってチミジン環でフルオレセイン部を導入するフルオレセインｄＴホスホルアミダイトを用いることによって、フルオレセインをオリゴに導入することができる。フルオレセイン部を末端位置と連結させるために、ヨードアセトアミドフルオレセインをスルフヒドリル基と連結することができる。５’−テトラクロロ−フルオレセインホスホルアミダイトを用いて自動合成中にテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）を導入することができる。他の反応性フルオロフォア誘導体及びそのそれぞれの付着部位は、アミノ基と連結した５−カルボキシローダミン−６Ｇ（ＲＨＤ）のスクシンイミジルエステル；スルフヒドリル基と連結したテトラメチルローダミンのヨードアセトアミド；アミノ基と連結したテトラメチルローダミンのイソチオシアネート；又はスルフヒドリル基と連結したテキサスレッドのスルホニルクロリドを含む。必要に応じて、例えば高速液体クロマトグラフィ又は他の方法によって標識オリゴヌクレオチドを精製することができる。

同様に、当該技術分野で既知の原則的に任意の方法によって、標識からのシグナル（例えば、蛍光標識による吸収及び／又は蛍光標識からの蛍光放出）を検出することができる。例えば、多色検出、ＦＲＥＴ（例えばランタニドキレートドナーと、蛍光色素アクセプタとの間の時間分解（すなわちＴＲ−）ＦＲＥＴを含み、例えばJournal of Biomolecular Screening（2002） 7:3-10を参照されたい）の検出等が当該技術分野で既知である。要するに、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は、十分に近接する場合、発光スペクトルと励起スペクトルとが重複した２つのフルオロフォアが共鳴双極子誘導性の双極子相互作用によってエネルギー移動を受ける非放射性エネルギー移動現象である。この現象は、核酸及びタンパク質等の分析物の結合を研究するのに一般的に用いられる。ＦＲＥＴは、１つのフルオロフォアの発光が、近接の（観察可能な発光の変化が起こるのに十分近い）もう１つのフルオロフォアの励起と結び付く距離依存的な励起状態相互作用である。幾つかの励起フルオロフォアは相互作用してエキシマを形成し、これはMolecular Probesから利用可能な発光スペクトルの変化を示す励起状態のダイマー（例えばピレンｓｎ−２アシル鎖を有するリン脂質類似体）であり、例えばHaughland（2003）著「蛍光プローブ及び研究成果のハンドブック（Handbook of Fluorescent Probes and Research Products）」（第９版）を参照されたい。ＦＲＥＴの簡潔な記述は、このハンドブック及びこのハンドブックで言及された参考文献で見出すことができる。

別の例として、蛍光偏光を利用することができる。要するに、このような蛍光結合アッセイの実施の際に、比較的迅速な回転相関時間を有する、典型的には小さい蛍光的に標識した分子（例えばリガンド、抗原等）を用いて、極めて遅い回転相関時間を有する、極めて大きい分子（例えば受容体タンパク質、抗体等）と結合する。小さい標識分子と、大きい分子との結合が（すなわち遊離した非結合標識分子よりも標識された複合体のほうが）、標識した種の回転相関時間を有意に増大させる（回転量を減少させる）。このことは、検出可能な偏光レベルに対応する効果を有する。特に、標識された複合体は、非結合標識分子よりも極めて高い蛍光偏光を示す。

当業者が認識するように、脂質化合物及び脂質化合物を含有する調製物（脂質及び造影剤調製物を含む）のいずれかは、保存のために凍結乾燥してもよく、激しく撹拌しながら、例えば水性媒体（例えば滅菌水又はリン酸緩衝生理食塩水）中で再構築してもよい。凍結乾燥の結果として脂質が凝集又は融合するのを防ぐのに、このような融合又は凝集を防ぐ添加剤を製剤中に含むことが有用であり得る。有用であり得る添加剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、トレハロース、ポリビニルピロリドン及びポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ４００）が挙げられる。これらの及び他の添加剤はU.S. Pharmacopeia, USP XXII, NF XVII, The United States Pharmacopeia, The National Formulary, United States Pharmacopeial Convention Inc., 12601 Twinbrook Parkway, Rockville, Md. 20852（これらの開示はその全体が参照により本明細書に援用される）のような文献で記載される。凍結乾燥調製物は一般的に、保存寿命が長いという利点がある。

必要に応じて、本発明の造影剤は懸濁剤をさらに含んでいてもよい。好ましい懸濁剤としては、ポリエチレングリコール、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、エチルアルコール、グリセリン、レシチン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン及びアルブミンが挙げられる。当業者が認識するように、様々な糖及び他のポリマー（例えばポリエチレン、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール及びポリオキシエチレン）も用いられ得る。常磁性アシル化ＭＲ造影剤（例えばＭｎ−ＤＤＰ−ＥＤＴＡ）の量は、常磁性ＭＲ造影剤乳剤を作製するのに用いられる全成分の約１重量％〜７５重量％と異なり得る。

本発明は、一般的に患者を画像化するのに、及び／又は特に患者において疾患組織の存在を診断するのに有用である。本発明の画像化プロセスは、患者に本発明の造影剤を投与し、それから患者の内部領域及び／又はこの領域の任意の疾患組織の可視画像を得るのに磁気共鳴画像化法を用いて患者をスキャンすることによって行い得る。患者の領域とは、患者全体、又は患者の特定領域若しくは特定部分を意味する。

任意の様々な種類の磁気共鳴画像化装置を本発明の実施に用いることができ、特定の種類又は型の装置は本発明の方法に必須ではない。用いられる磁気共鳴画像化技法は従来のものであり、例えばKean, D. M.及びM. A. Smith著「磁気共鳴画像化法：原理及び用途（Magnetic Resonance Imaging: Principles and Applications）」（Williams及びWilkins, Baltimore 1986）（この開示はその全体が参照により本明細書に援用される）で記載される。考慮される磁気共鳴画像化法としては、核磁気共鳴画像化法（ＮＭＲ）、ＮＭＲ分光法、及び電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。 好ましい画像化診断法はＮＭＲである。

当業者が認識するように、患者への造影剤の投与は、様々な投与形態を用いて様々な様式（例えば血管内、経口、直腸等）で行われ得る。好ましくは、血管内に投与される。投与するのに有用な用量及び特定の投与形式は、年齢、体重及び特定の動物、並びにスキャンされる領域、並びに用いられる特定の本発明の造影剤によって変わる。典型的に、低レベルで投与が始まり、所望の造影剤の強化が達成されるまで増加する。一般的な指針によって、患者の体重１ｋｇ当たりそれぞれ、通常本発明の脂溶性化合物を約０．１ｍｇ〜約１ｇ、及び常磁性鉄を約１μＭ〜約５０μＭ投与するが、より多量及びより少量を用いることができる。同様に、一般的な指針によって、脂質又は懸濁剤が製剤中に用いられる場合、一般的にそれぞれ製剤全体の約０．５重量％〜約５０重量％を用い得るが、より多量及びより少量を用いることもできる。

本発明の方法を行う際、造影剤は、単独で用いても、又は他の診断的因子、治療的因子若しくは他の作用因子と組合せて用いてもよい。このような他の作用因子としては、香味材料又は着色材料等の賦形剤が挙げられる。

一実施形態において、この方法は細胞塊の増殖の疑いがあるヒトに特に有用である。本明細書で記載されるように、この方法は他の画像化技法及び装置でも用いることができる。画像化は類似の組成物を利用して薬物の事前投与を開始し、最良のリポソームのサイズを求めるか、又は注射後にリポソーム担持薬物を体内に分布させることができる。典型的に、この組成物は、ヒトの血管に注射される。画像化は、当該組成物の注射の少なくとも１０時間後又はそれより早く画像化することを含む。静脈内シリンジ注射、カテーテル、点滴及び腹腔内シリンジ注射から成る群から選択されるデバイスを用いて、この組成物を投与することができる。既知の方法を用いて、脂質用量範囲を確定することができ、体重１ｋｇ当たり０．１０ｍＭ〜０．５０ｍＭの脂質用量を含むことができる。

標的組織（例えば増殖細胞塊、新生物組織、炎症性組織、炎症組織、及び感染組織）へのリポソームの特異的送達は、治療的因子を当該標的組織に送達するのに適切なリポソームのサイズを選択することによって達成することができる。例えば、平均直径が１８０ｎｍのリポソームは固形腫瘍で集積され得ず、好ましくは平均直径が１４０ｎｍのリポソームが同じ固形腫瘍の周辺で集積され、好ましくは平均直径が１１０ｎｍのリポソームがこの固形腫瘍の周辺部及び中心部で集積される。

本発明の別の実施形態において、画像化因子を保有する異なるサイズのリポソーム調製物を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでの毛細管透過性及び孔サイズを調べることができる。この情報を用いて、幾つかの実験（例えば２つ〜３つ）における特定の種類の疾患の治療に対して、治療的因子を保有するリポソームの最適な粒子サイズを求めることができる。腫瘍が生物学的には異種であり、同じ腫瘍型であっても、異なる患者間で異なる挙動をし得るので、この情報はリポソームのサイズを調整するのに、及び癌又は炎症性組織等の特定の種類の疾患の治療に最も好都合な調製に非常に有用であり得る。別の実施形態では、標的組織へのリポソームの送達の特異性は、抗体（例えば治療的因子）又は他の組織マーカーを有するリポソームを標識することによってさらに高められ得る。別の実施形態では、抗体標識を用いて、治療的因子の細胞内送達を達成又は増強することができる。

一実施形態において、本発明は、
ａ）
ｉ）十分量の画像化因子と、
ｉｉ）二重層、融合タンパク質若しくはポリペプチド、及び内部容積を含むリポソームであって、当該リポソームは当該リポソームを組織に送達させるのに十分な量であり、且つ画像化因子を保有する、リポソームと、
を含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与すること、並びに
ｂ）哺乳動物の組織を画像化すること、
を含む画像化する方法を提供する。

別の実施形態では、画像化方法で用いられる組成物は、治療量の治療的因子をさらに含み、上記リポソームは当該治療的因子を保有する。

本発明は、哺乳動物における送達に基づく、薬物送達、薬物送達のモニタリング、腫瘍壊死、腫瘍退縮、腫瘍増殖のモニタリング及び薬物投与の方法も提供する。薬物送達方法は、
ａ）
ｉ）常磁性イオンを有する常磁性キレートであって、当該常磁性キレートはＮＭＲ画像化を高めるのに十分な量である、常磁性キレートと、
ｉｉ）二重層、融合タンパク質若しくはポリペプチド、及び内部容積を含むリポソームであって、当該リポソームは当該リポソームを組織に送達させるのに十分な量であり、且つ当該常磁性キレートを保有する、リポソームと、
を含む組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与すること、並びに
ｂ）上記哺乳動物の組織をＭＮＲ画像化すること、
を含むことができる。

別の実施形態において、画像化方法で用いられる組成物は、治療量の治療的因子をさらに含み、上記リポソームは当該治療的因子を保有する。

好ましくは、画像化は定量的であり、上記組織に送達される上記リポソームの量を予測することができ、選択的に送達される薬物の量を算出することができる。これらの方法は組織塊をモニタリングする方法と組み合わせて、薬物送達方法及び薬物の治療的有効性を評価することができる。例えば、組織容量をモニタリングするため、組織増殖を示すため、又は組織塊の低減をモニタリングするために組織の量を求めることができる。このような方法は、特定の患者における特定の病理組織に最適な送達レジュメを求めるのに用いてもよい。

診断用途（例えば超音波及びＣＴ）の場合、エネルギー（例えば超音波エネルギー）を患者の少なくとも一部分に適用し、標的組織を画像化する。それによって、疾患組織の有無を確認することができるように、患者の内部領域の可視画像が得られる。

診断目的及び治療目的の両方で超音波を用いることができる。診断用超音波では、超音波又は超音波の連発パルスが振動子（transducer）によって与えられ得る。一般的に超音波は連続的ではなくパルス化されるが、必要に応じて連続であってもよい。このように、診断用超音波は一般的にパルスエコーの適用を伴い、その後リスニング（listening）期間で超音波振動子が反射シグナルを受ける。高調波、超高調波（ultraharmonics）又は低調波が用いられ得る。二次高調波モードを有益に用いることができ、２ｘ（ここで、ｘは寄生（incidental）周波数である）の周波数を受ける。これは、所望の部位（例えば血栓）に対して標的化され得る本発明の標的造影剤を用いて、バックグラウンド材料からのシグナルを低減し、振動子からのシグナルを増大する働きがあり得る。この方法を用いて、他の高調波シグナル（例えば、３ｘ又は５ｘ等の奇数高調波シグナル）を同様に受ける。低調波シグナル（例えばｘ／２及びｘ／３）は、画像が形成されるように受け取り、処理されてもよい。

パルス方法に加えて、連続超音波（例えばパワードップラー）が適用され得る。これは、剛直な小胞（例えばポリメチルメタクリレートから作製される小胞）が用いられる場合に特に有用であり得る。この場合、パワードップラーのエネルギーが相対的に高くなると、小胞が共鳴することによって、それらの破壊を促進し得る。このことによって、低調波又は超高調波範囲で、又は場合によっては適用される超音波と同じ周波数であり得るアコースティックエミッション（acoustic emissions）を発生させることができる。このプロセスで放出されたアコースティックシグネクチャ（acoustic signatures）のスペクトルが存在し、このようにして用いられ得る振動子はアコースティックエミッションを受け、例えば血栓の存在を検出し得ることが予測される。さらに、小胞破壊のプロセスを用いて、例えば血栓表面に運動エネルギーを伝達させ、血栓の溶解を促進し得る。したがって、診断的超音波と治療的超音波とを組合せる間に治療的血栓溶解が達成され得る。スペクトルドップラーも用いられ得る。概して、診断的超音波由来のエネルギーレベルは、小胞の破壊を促進するのには、並びに生体活性剤の放出及び細胞取り込みを容易にするには不十分である。上述のように、診断的超音波は、１つ又は複数の音波パルスの適用を伴い得る。パルス間の休止時間によって、反射音波シグナルを受信し、解析することができる。診断的超音波で用いられるパルス数の制限は、研究する組織に送達される有効エネルギーを制限する。

超音波のエネルギーが高くなると、例えば超音波治療器によって発生される超音波は、一般的に小胞種を破壊させることができる。概して、超音波治療器は、超音波で処理される組織領域に依存して、約１０％〜約１００％のデューティサイクルを用いる。一般的に筋肉量がより大きいことを特徴とする身体領域（例えば背中及び大腿部）、及び高度に血管新生された組織（例えば心臓組織）では、より大きいデューティサイクル（例えば最大約１００％）を必要とし得る。

治療的超音波において、連続超音波を用いて、より高いエネルギーレベルを送達する。小胞の破壊には、連続超音波が好ましいが、音波エネルギーをパルス化してもよい。パルス化音波エネルギーが用いられる場合、一般的に音波は一度に約８パルス〜約２０パルス以上のエコートレイン長でパルス化される。好ましくは、エコートレイン長は一度に約２０パルスである。さらに、用いられる音波の周波数は、約０．０２５メガヘルツ（ＭＨｚ）〜約１００メガヘルツと様々であり得る。概して、好ましくは治療的超音波の周波数は、約０．７５ＭＨｚ〜約３ＭＨｚの範囲であり、約１ＭＨｚ〜約２ＭＨｚがより好ましい。さらに、エネルギーレベルは、１平方センチメートル（ｃｍ^２）当たり約０．５ワット（Ｗ）〜約５．０Ｗ／ｃｍ^２と様々であることができ、約０．５Ｗ／ｃｍ^２〜約２．５Ｗ／ｃｍ^２のエネルギーレベルが好ましい。異常高温を伴う治療的超音波のエネルギーレベルは一般的に、約５Ｗ／ｃｍ^２〜約５０Ｗ／ｃｍ^２である。非常に小さい小胞（例えば直径が約０．５μｍ未満の小胞）では一般的に、より高い周波数の音波が好ましい。これは、小胞が小さければ、より高い周波数の音波でより効果的に音波エネルギーを吸収することができるためである。非常に高い周波数（例えば約１０ＭＨｚ超）が用いられる場合、音波エネルギーは一般的に制限された深さまでしか液体及び組織を浸透させられない。したがって、音波エネルギーの外部適用は、皮膚及び他の表面組織に好適であり得る。しかし、一般的に超音波エネルギーが選択的に収束帯内に向かうように、深部構造が超音波エネルギーを収束させることが必要である。代替的に、隙間プローブ、血管内超音波カテーテル、又は経尿道カテーテルによって、超音波エネルギーが適用され得る。このようなプローブ又はカテーテルは、例えば食道癌の診断及び／又は治療のために食道で用いられ得る。上述の治療用途に加えて、本発明の組成物は、食道癌に関して、又はアテローム性動脈硬化症の治療のために冠状動脈で、及び例えば米国特許第５，１４９，３１９号（この開示はその全体が参照により本明細書に援用される）で記載される治療用途で用いることができる。

周波数の２つの超音波を用いる超音波治療器が利用され得る。第１の周波数がｘであり、第２の周波数が２ｘであり得る。好ましい形態では、第１の周波数と第２の周波数との収束帯が単一の収束帯に集まるように、この機器が設計される。それから、この機器の収束帯は、標的組織内の標的組成物（例えば標的小胞組成物）に指向され得る。この超音波機器は、超音波エネルギーの周波数ｘ及び２ｘの同時適用による二次高調波治療を提供し得る。小胞を伴う超音波の場合、この二次高調波治療によって、単一の周波数を伴う超音波エネルギーに比べて改善された小胞破壊が提供され得ることが予測される。好ましい周波数範囲は小胞の基本高調波周波数内に残り得ることも予測される。低エネルギーをこの機器に用いてもよい。上述の二次高調波治療に関して用いられ得る超音波機器が、例えばKawabata, K.他, Ultrasonics Sonochemistry, Vol. 3, pp. 1-5（1996）（この開示はその全体が参照により本明細書に援用される）で記載される。

超音波画像化を伴う方法に関して、特に小胞を伴う実施形態において、診断的な超音波画像化が、例えば小胞と組合せた生体活性剤のキャビテーションの改善又は標的放出等の目的のために小胞を破壊するように、治療的超音波の適用と同時に行われ得る。この方法は、（ｉ）大量の小胞を患者に投与する工程、（ｉｉ）小胞を破壊させる周波数及びエネルギーで、治療的超音波で患者領域の小胞に音波付加（insonating：インソネート）する工程、並びに（ｉｉｉ）治療的超音波の周波数の高調波で音波付加した小胞から超音波放出を受けると同時に、受け取った超音波放出から当該領域の画像を作製する工程を含む。同時の画像化によって、オペレータはリアルタイムで小胞の破壊をモニタリングすることができる。

当業者が認識するように、本開示の教示が効力を発揮すれば、広範に変化する量の小胞が、本明細書に記載の方法の実施に用いられ得る。本明細書で用いられるように、「小胞の量」という用語は、このような量を全て包含するように意図される。

診断的画像化は、患者の内部身体領域を可視化することを意味する。診断的画像化としては、例えば超音波（ＵＳ）、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）；造影剤に放射性物質が含まれる場合の核医学；及び特に蛍光造影剤による光学的画像化が挙げられる。診断的画像化は、本発明の方法による小胞の破壊を促進することも含む。例えば、超音波を用いて、小胞を可視化し、或る特定の組織における小胞の局在化を実証し得る。さらに、小胞が目的とする標的（組織及び／又は受容体移動先（destination）を含む）に達すると超音波を用いて、小胞の破壊を促進することによって生体活性剤及び／又は診断剤を放出し得る。

本発明によれば、一般的には患者を画像化する方法、及び／又は具体的には患者における疾患組織の存在を診断する方法が提供される。本発明の画像化プロセスは、本発明の造影剤を患者に投与すること、及びその後患者の内部領域及び／又はこの領域の任意の疾患組織の可視画像を得るために、例えば超音波、コンピュータ断層撮影及び／又は磁気共鳴画像化を用いて患者をスキャンすることによって行われ得る。患者領域とは、患者全体、又は患者の特定域若しくは特定部分を意味する。

造影剤を用いる際、これらは水溶液中で懸濁し、滅菌技法を用いて造影剤を作製することが好ましい。より小さいリポソーム（例えばサイズが２００ｎｍ以下）及びミセル又は乳化脂質、並びに常磁性イオンと脂溶性化合物との単一懸濁物を用いる利点は、投与（例えば静脈注射）の直前に、又は造影剤の作製における最終工程として０．２２μｍのラインフィルタで造影剤を濾過し、任意の潜在的なピロゲンを除去し得ることである。

これらの造影剤を安定な製剤に配合するために、他の添加剤を用いてもよい。例えば、静脈注射用の造影剤を作製する際、非経口添加剤が製剤中に含まれ得る。このような添加剤としては、等張造影剤を作製するための浸透圧調整添加剤（例えばデキストロース及び塩化ナトリウム）が挙げられる（to include）。これらの浸透圧調整添加剤は一般的に、最小量（例えば全製剤の約０．１重量％〜約０．５重量％）で与えられる。さらに、抗菌性添加剤は、細菌の増殖を防ぐように最終調製物中に含まれ得る。このような抗菌性添加剤（一般的に許容可能な量）としては、塩化ベンザルコニウム（典型的に全製剤の０．０１重量％）、ベンジルアルコール（典型的に１重量％〜２重量％）、クロロブタノール（典型的に０．２５重量％〜０．５重量％）、メタクレゾール（典型的に０．１重量％〜０．３重量％）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル（典型的に０．０１５重量％）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル（典型的に０．１重量％〜０．２重量％）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル（典型的に０．２重量％）、フェノール（０．２５重量％〜０．５重量％）及びチメロサール（典型的に０．０１重量％）が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、抗酸化物質が調製物中に含まれてもよく、造影剤が不飽和脂質を含有する場合に特に有用である。このような抗酸化物質（これらの一般的に有用な量）としては、アスコルビン酸（典型的に０．０１重量％〜０．５重量％）、システイン（典型的に０．１重量％〜０．５重量％）、モノチオグリセロール（典型的に０．１重量％〜１．０重量％）、重亜硫酸ナトリウム（典型的に０．１重量％〜１．０重量％）、メタ重亜硫酸ナトリウム（典型的に０．１重量％〜１．０重量％）、及びトコフェロール（典型的に０．０５重量％〜０．５重量％）が挙げられる。当業者が認識するように、本発明の造影剤は、血管内送達、任意の体腔への送達、又は他の送達標的に特に好適な様々な手段で作製され得る。

追加剤
また、上記の生体適合性脂質及びポリマーに加えて、合成物（compositions of matter）を用いてミクロスフェアを調製することは、このように調製されたミクロスフェアが本明細書に記載の安定性及び他の基準を満たしていれば、本発明の一部であることが予測される。

プロピレングリコールが添加され、脂質粒子の分散又は溶解を促進することによって混濁を除去し得る。プロピレングリコールは、ミクロスフェア膜又は皮膚上の表面張力を増大させることによってミクロスフェアの形成及び安定性を改善する増粘剤としても機能し得る。プロピレングリコールはさらに、ミクロスフェアの膜又は皮膚を覆う追加層として機能することによって、さらなる安定化を提供することが可能である。このようなさらなる基礎的又は補助的な安定化合物の例として、例えば米国特許第４，６８４，４７９号及び同第５，２１５，６８０号で用いられ得る従来の界面活性剤が存在する。

さらなる補助的な安定化合物及び基礎的な安定化合物としては、ピーナッツオイル、菜種油、オリーブオイル、サフラワーオイル、コーンオイル、又は本明細書で記載される要求及び指示に従って安定化合物として用いるのに好適で、接種可能であることが一般的に知られている任意の他のオイル等の作用因子が挙げられる。

さらに、混合ミセル系を作製するのに用いられる化合物は、基本的な又は補助的な安定化合物として用いるのに好適であることができ、臭化ラウリルトリメチルアンモニウム（ドデシル−）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ヘキサデシル−）、臭化ミリスチルトリメチルアンモニウム（テトラデシル−）、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム（アルキル＝Ｃ_１２、Ｃ_１４、Ｃ_１６）、臭化／塩化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、臭化／塩化ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、臭化／塩化ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、臭化／塩化セチル−ジメチルエチルアンモニウム、又は臭化／塩化セチルピリジニウムが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明で用いられるリポソームは、本明細書に記載の様々な付加的な又は補助的な安定化剤の中から選択することによって、サイズ、溶解度及び熱安定性に従って制御され得ることが分かっている。これらの安定化剤は、脂質コーティングとのこれらの物理的相互作用だけでなく、リポソーム表面の粘度及び表面張力を変えるこれらの能力によってもミクロスフェアのこれらのパラメータに影響を与えることができる。したがって、本発明で用いられるリポソームは、例えば多種多様の（ａ）〜（ｅ）（（ａ）粘度調整剤（炭水化物、並びにそのリン酸化誘導体及びスルホン酸化誘導体と、好ましくは分子量が４００〜１０００００の範囲であるポリエーテルと、好ましくは分子量が２００〜５００００の範囲であるジヒドロキシアルカン及びトリヒドロキシアルカン、並びにこれらのポリマーとを含むが、これらに限定されない）；（ｂ）乳化剤及び／又は可溶化剤は、所望の修飾及びさらなる安定化を達成するのに脂質と共に用いてもよく、このような作用因子としては、アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン、モノステアリン酸グリセリル、ラノリンアルコール、レシチン、モノグリセリド及びジグリセリド、モノエタノールアミン、オレイン酸、オレイルアルコール、ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８、ポロキサマー１８４、及びポロキサマー１８１）、ステアリン酸ポリオキシエチレン５０、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、二酢酸プロピレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、ステアリン酸、トロラミン、及び乳化蝋が挙げられるが、これらに限定されず；（ｃ）脂質に用いられ得る懸濁剤及び／又は粘度増大剤（アカシア、アガー、アルギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、マグマ、カルボマー９３４Ｐ、カルボキシメチルセルロース、カルシウム及びナトリウム及びナトリウム１２、カラギナン、セルロース、デキストラン、ゼラチン、グアーガム、ローカストビーンガム、ビーガム（veegum）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、キサンタンガム、α−ｄ−グルコノラクトン、グリセロール並びにマンニトールを含むが、これらに限定されない）；（ｄ）合成懸濁剤も用いることができ（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリプロピレングリコール、及びポリソルベート）；（ｅ）浸透圧上昇剤を含んでいてもよく、このような作用因子としては、ソルビトール、プロピレングリコール及びグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない）の１つ又は複数の添加によって好都合に修飾及びさらに安定化され得る。

水性環境を作り出すのに用いることができる希釈剤としては、安定化ミクロスフェアの作製及び維持、又はＭＲＩ造影剤としてのこれらの使用を妨げない水等（脱イオン化しているか、又は任意の数の溶解塩を含有する）、並びに生理食塩水及び生理学的な食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、最も好ましい実施形態に関して記載されているが、付加的な実施形態が、特許請求される本発明の範囲及び精神内にある。本発明の好ましいデバイスは、本発明を図示するだけであり、添付の特許請求の範囲で規定されるように本発明の範囲を限定する意図はない。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのサポシンＣ及びリポソームの調製及び送達
材料 − 以下の材料は、商業的供給源からのものである：マウスラミニン、Ｐ／Ｓ、ウシ胎仔血清、及びＤＭＥＭ（Gibco BRL, Gaithersborg, MD）；Ｂ２７を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Life Technologies）；制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）；ｐＥＴ２１ａ（＋）ＤＮＡベクター、大腸菌宿主株［ＢＬ２１（ＤＥ３）］、及びＨｉｓ・Ｂｉｎｄ樹脂（Novagen, Medison, WI）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８と結合した抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（QIAGEN, Valencia, CA）；フルオレセイン結合ヤギ抗ウサギ抗体及びローダミン結合ヒツジ抗マウス抗体（ICN/CAPPEL, Aurora, OH）；アンチフェード（antifade）試薬（Ventana Medical Systems, Tucson, AZ）；Ｃ_４逆相ＨＰＬＣカラム（Alltech Association Inc.、イリノイ州ディアフィールド）；クロロホルムストック溶液としてＤＯＰＳ及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）（ＮＢＤ−ＤＯＰＳ）（Avanti Polar Lipids、アラバマ州アラバスター）；ポリエチレンイミン及びパパイン（Sigma、ミズーリ州セントルイス）。アニオン性脂質はナトリウム塩である。全ての他の化学物質は試薬等級又はそれより上級のものである。

線維芽細胞培養物 − ヒト及びマウスの初代線維芽細胞は全ての実験で用いられ、本研究所における標準的な手法によって確立される^１５。マウスのプロサポシン欠乏線維芽細胞はＰＳＡＰ−／−マウス由来である。全ての細胞は、次に使用するために、単層で３７℃のＤＭＥＭ／ＦＢＳ（１０％）培地で培養する。

初代皮質ニューロン培養物 − 皮質ニューロンは、Whitmarsh他^４４によって記載されたように、Ｂ２７を補充した血清無含有Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Neuroblasal）培地中で培養する。Ｅ１６マウス胚を採取し、頭部を切断して、パパイン（１ｍｇ／ｍｌ）を有する氷冷Ｃａ／Ｍｇ無含有ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中にこれらを入れる。脳を解剖し、２つの大脳半球の間に背側正中線に沿わせるが、切断面はわずかに外してメスを入れる。これによって、無菌大脳皮質が得られる。海馬が位置している皮質の内側に触れないようにゆっくりと髄膜を剥離する。鋭利な外科用ハサミで皮質を切断し、氷冷ＨＢＳＳ中でこれらを回収する。室温で１５分〜２０分間、パパインＮＢＳＳ溶液中に皮質組織を再び入れ、組織を柔らかくさせる。室温でさらに５分間、これらをパパイン阻害剤溶液に移し、最後に氷冷ＨＢＳＳ ２ｍｌに戻す。１２ウェルプレート中のフィッシャーブランド（Fisherbran）１２−５４６（１８ＣＩＲ−２）カバーガラスを、ＰＥＩ含有ラミニンで一晩コーティングする。単離した皮質組織をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地を有するプレートにおけるＰＥＩコーティングカバーガラス上で培養する。培地に薬物を添加することによって、カイニン酸処理を行う。

サポシンＣ及びリポソームの調製
本発明者等の研究所で、大腸菌細胞におけるＩＰＴＧ誘導性ｐＥＴシステムを用いて、組み換えサポシンＣを通常通り作製する^１１。全ての発現タンパク質は、Ｈｉｓタグを含有しており、ニッケルカラム上で、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの線形（０％〜１００％）勾配を用いて、Ｃ４逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィによって精製する。主要なタンパク質ピークを回収し、凍結乾燥する。Qi他^１１によって以前に記載されたように、タンパク質濃度を求める。

クロロホルム中のＤＯＰＳ脂質（１６．２μｇ）をＮ_２下で乾燥し、真空化して、脂質薄膜を形成する。サポシンＣ（７９μｇ）を脂質薄膜に添加し、０．１Ｍのクエン酸／０．２Ｍのリン酸塩（ｐＨ４．７）５０μｌ中に懸濁する。さらに、培地又はＰＢＳを添加する。浴音波処理によって、大きい単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を調製する^１４。Ｎ４＋サブミクロン粒子サイズ分析器（Coulter、フロリダ州マイアミ）による光子相関分光法によって、リポソームサイズを求める。Ｎ４＋サブミクロン粒子サイズ分析器を用いて、ＬＵＶ集合のサイズを評価し、平均直径２５０±１００ｎｍで分散する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのサポシンＣ−ＤＯＰＳプロテオリポソームの送達
カバーガラス（Ｌａｂ−Ｔｅｋ ＩＩ, Nalge Nunc International）を備える８ウェルチャンバスライドで４８時間、ＤＭＥＭ培地中で細胞（１０^５個）を培養する。培地中のサポシンＣ−ＤＯＰＳ複合体を細胞培養物に添加する。３７℃で４８時間インキュベート後、ＰＢＳで２回、細胞を洗浄し、免疫蛍光アッセイのために２％パラホルムアルデヒドで固定する。ｉｎ ｖｉｖｏ研究では、ＰＢＳ中のプロテオリポソームをマウスの尾静脈に注射する。免疫蛍光アッセイのために、タンパク質−脂質複合体の投与の４８時間後にマウスの脳組織を回収する。

組織病理及び免疫蛍光
マウスの脳組織を固定し、処理する前に１０％ホルマリンで急速凍結する。パラフィン切片をヘマトキシリン及びエオシン（H&E）で染色し、光学顕微鏡で分析する。

若干変更して記載されるように、免疫蛍光染色を行う^１５。カバースリップを備えるペトリ皿中の培養細胞（１×１０^５個）をＰＢＳで洗浄し、室温で１０分間、２％パラホルムアルデヒドで固定する。ＰＢＳ中で０．１％トリトンＸ−１００による処理後、３７℃でそれぞれ一次抗血清（２時間）及び蛍光結合二次抗体（１時間）で、サンプルをインキュベートする。一次抗体及び二次抗体の希釈度はそれぞれ、１：３０及び１：６０である。一次抗Ｈｉｓ抗体の添加の前に、５％マウス血清を含有する（contains）阻害溶液で、４％パラホルムアルデヒド中のマウスの脳組織切片をインキュベートする。ローダミン結合抗マウス抗体を検出用二次抗体として用いる。蛍光消失を防ぐために、アンチフェードを切片上に添加する。共焦点顕微鏡法（ＬＳＭ５１０、Zeiss）又は蛍光顕微鏡法（Zeiss Axioskop）によって、蛍光シグナルを検出する。

酸性長鎖脂質、中性長鎖脂質及び中性短鎖脂質を用いるリポソームの合成
材料及び方法
ＤＯＰＳ、ＤＰＰＣ及びＤＨＰＣの全てのリン脂質を粉末状でAvanti polar lipidsから購入し、さらに精製せずに用いる。動的光散乱（ＤＬＳ）測定に関して、混合物中のＤＯＰＳとＤＰＰＣとのモル比は約１０：約１の範囲であり、全てのサンプルで（［ＤＰＰＣ］＋［ＤＯＰＳ］）／ＤＨＰＣ＝約４である。ボルテックスと温度サイクル（５０℃〜４℃）との組合せを利用して、脂質混合物を全脂質濃度１０重量％で濾過した超純粋Ｈ_２Ｏ（Millipore EASYpure UV）で溶解する。それから、濾過したＨ_２Ｏで５、２、１、０．５及び０．１重量％に均質化した１０重量％溶液を段階的に希釈する。

ＤＬＳ前に、ストック脂質サンプルを５倍、５０倍及び２００倍に希釈し、Ｎ４^＋粒子サイズ分析器（particle sizer）（Coulter、フロリダ州マイアミ）を用いて分析する。この系を希釈することはサイズ測定に影響しないと判断する。ＳＡＮＳ実験の場合、Ｈ_２Ｏの代わりにＤ_２Ｏ（９９．９％、Chalk River Laboratories、オンタリオ州チョークリバー）を用いて、全脂質濃度が０．５重量％のサンプルを得ることを除いて同じサンプル調製プロトコルを［ＤＯＰＳ］／［ＤＰＰＣ］＝１０のサンプルに適用する。それから、等量の０．１Ｎの酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）及び０．１Ｎの酢酸（ＨＡｃ）から成る酸性緩衝液を用いて、０．５重量％の溶液を０．１重量％及び０．０５重量％の混合物にさらに希釈する。得られた溶液のｐＨ値は、Ｄ_２Ｏ中で４．７８±０．０２であり、緩衝液のｐＨはＤ_２Ｏによる１２倍希釈でも安定である。

ＳＡＮＳ実験の場合、全脂質濃度が０．５重量％になるまで、濾過したＨ_２Ｏの代わりにＤ_２Ｏ（９９．９％、Chalk River Lab.）を用いることを除いて同じサンプル調製手法を［ＤＯＰＳ］／［ＤＰＰＣ］＝１０のサンプルに適用する。それから、等量の０．１Ｎの酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）と０．１Ｎの酢酸（ＨＡｃ）溶液との混合物から成る酸性緩衝液で、０．５重量％の溶液を０．１重量％及び０．０５重量％に希釈して、Ｄ_２Ｏ中で４．７８±０．０２のｐＨ値を得る。緩衝液のｐＨ値はＤ_２Ｏによる１２倍希釈でも安定である。

ＩＰＴＧ誘導性ｐＥＴシステムを用いることによって大腸菌細胞でＳａｐＣが過剰発現する（２６）。Ｈｉｓタグを有する発現タンパク質をニッケルカラムから溶離する。透析後、以下のようなＨＰＬＣクロマトグラフィによって、タンパク質をさらに精製する：１０分間、Ｃ４逆相カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化し、それから６０分間、アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡの線形（０％〜１００％）勾配においてタンパク質を溶離する。主要なタンパク質ピークを回収し、凍結乾燥する。Qi他, 1994によって以前に記載されたように、タンパク質濃度を求める。

Ｈ１（ＹＣＥＶＣＥＦＬＶＫＥＶＴＫＬＩＤ）及びＨ２（ＥＫＥＩＬＤＡＦＤＫＭＣＳＫＬＰＫ）ペプチドは、SynPep Corp.（米国カリフォルニア州）によって合成され、１．５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤ_２Ｏ中に溶解する。それから、［ＤＯＰＳ］／［ＤＰＰＣ］＝１０及び（［ＤＰＰＣ］＋［ＤＯＰＳ］）／ＤＨＰＣ＝４の０．１重量％の脂質溶液に、それぞれ約１２：１の容量比で２つのペプチド溶液（１．５ｍｇ／ｍＬ）及び約１２：１の容量比でＳａｐＣ溶液を添加し、膜不安定化を誘導するのに必要なＳａｐＣ濃度より大きい６２．５μＭの最終ペプチド（又はＳａｐＣ）濃度が得られる（Wang他, 2003）。

国立標準技術研究所（ＮＩＳＴ）中性子研究センター（ＮＣＮＲ、Gaithersburg、米国 メリーランド州）にある３０ｍ ＳＡＮＳ機器、ＮＧ７の１つでＳＡＮＳ実験を行う。８．０９Åの波長（λ）、及び１５．３ｍの長いサンプル検出器間距離（ＳＤＤ）と組合せた中性子焦点レンズを利用すると、より小さい散乱ベクトル値が得られる：ｑ＝４π／λ・ｓｉｎ（θ／２）（式中、θは散乱角である）。５ｍ及び１ｍの他の２つのＳＤＤも利用して、０．００２Å^−１〜０．３５Å^−１のｑ範囲全体がカバーする。それから、未処理の２Ｄデータを、検出器感度、バックグラウンド、空のセルの散乱、及びサンプルの透過で補正し、その後ビーム中心の周りを環状に平均化して、１Ｄデータを得る。直接ビーム光束に従って、１Ｄデータを絶対尺度にする。最後の１０個〜２０個のデータ点の強度を平均して、次元を低下させたデータから差し引いて、インコヒーレントプラトーを求める。

記載のように（１４、１５）Ｎ４＋サブミクロン粒子サイズ分析器（Coulter、フロリダ州マイアミ）による光子相関分光法によって、リポソームのサイズを測定する。Ｎ４＋サブミクロン粒子サイズ分析器を用いて、ＬＵＶの集合のサイズを評価し、平均直径２０ｎｍ〜８００ｎｍで多分散させる。リポソームサイズ推定に関するデータを９０度で得て、公正な自己相関関数によるサイズ分布処理（ＳＤＰ）解析を用いて処理する。ＳＤＰ測定によって、主要な小胞画分でサイズが与えられる。ＡＮＯＶＡ解析によって統計的有意性を予測する。誤差バーは標準偏差を示す。

Hitachi製のＴＥＭ（Ｈ−７６００、日本国日立市）で透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像を撮影する。それぞれのサンプルの液滴を支持ｆｏｒｍｖａｒフィルム（２００メッシュ、厚さ範囲３０ｎｍ〜７５ｎｍ、Electron Microscopy Sciences、ペンシルバニア州）で覆ったニッケル格子上に置く。ＴＥＭ解析の２時間前に室温で、ニッケル格子を濾紙上に置く。８０ｋＶの加速電圧でＴＥＭを操作する。画像化バックグラウンドを高倍率で最適化する一方で、対象の領域を低倍率（５０倍〜１０００倍）で示す。最大５００００倍の倍率を用いて、単一小胞に焦点を合わせる。「鮮明な」画像が得られるまでコントラスト及び光度を手動で調整し、画像化バックグラウンドを高倍率で最適化する。適切な画像収集ソフトウェアを備える二本撮り（dual）ＡＭＴ ＣＣＤデジタルカメラ（２Ｋ×２Ｋ、１６ビット）を用いて、ＴＥＭ顕微鏡写真を撮影する。

短鎖脂質を用いる実施形態に関して、低多分散性ＵＬＶを形成する速度に関する一般的に許容されているモデルを以下の通りに記載する。

最初に、縁を覆う短鎖脂質、及びディスクの平坦な二重層表面では長鎖脂質によって、盤状ミセル前駆体の形成が始まり、縁での湾曲エネルギーを最小にする。希釈又は温度上昇のいずれかによって、縁にある短鎖脂質が二重層又は溶液へと喪失し、線張力が増大し、その結果としてディスク間で癒着が起こり、より大きいディスクを形成する。線張力の増大によって、近接の盤状ミセルの癒着が圧縮されるので、縁の輪郭長が減少し、二重層が開口を有する円殻へと折り畳まれ、その縁が短鎖脂質で覆われる。最終的に、縁の周りの短鎖脂質を消失させて、開口を閉じることができ、これによって小胞形態が得られる。

ＤＯＰＳリポソームを用いてＵＳＰＩＯで標識した腫瘍細胞のＭＲ検出
ＵＳＰＩＯ等のＭＲ検出用標識を含有するリポソームを調製するために、以下の方法を用いる。ＤＯＰＳを含む水溶液中でのデキストランで覆われたＵＳＰＩＯ粒子の超音波処理では、リポソーム内で十分な封入が得られない。リポソーム内のＵＳＰＩＯ含有量を増大させるために、Bogdanov他著「アミノリン脂質との一時的な結合によるリポソームにおけるデキストランで覆われたコロイドの封入（Trapping of dextran-coated colloids in liposomes by transient binding to aminophospholipid: preparation of ferrosomes）」 Biochim Biophys Acta, 1994. 1193(1): p. 212-8によって記載されたような化学カップリング法が若干変更して用いられる。要するに、ＵＳＰＩＯ粒子上を覆うデキストランを酸化して、アルデヒド基を発生させる。アルデヒドは、ＤＯＰＳのアミンによって高ｐＨでシッフ共有結合を形成する。Ｎ４＋粒子サイズ分析器（Beckman Coulter、カリフォルニア州）の分析によって確認されたように、得られるリポソームの平均サイズは１５０ｎｍである。リポソーム溶液が低ｐＨ溶液に対して透析され、リポソームの外層と結合したＵＳＰＩＯを分離させる。Ｃｏｎ−Ａセファロース４Ｂカラム（Amersham Biosciences Corp.、ニュージャージ州）を用いたアフィニティクロマトグラフィによって、封入していないＵＳＰＩＯを除去する。従来の電子顕微鏡法によって、ＵＳＰＩＯ−ＤＯＰＳリポソーム構造を確認する。既知の量の遊離ＵＳＰＩＯ及びＤＯＰＳリポソーム混合物を用いて作製した標準Ｒ２緩和能曲線を用いて、ＤＯＰＳリポソームにおける鉄濃度を予測する。１ｍＭのＤＯＰＳ濃度を用いると、Ｆｅ最大含有量が３２μｇ／ｍｌに達する。１つの群当たり約１００００個の細胞を用いて、４つの神経芽種細胞のサンプルを調製する。それぞれの培養培地中の１００μＭ及び３００μＭのＵＳＰＩＯ−ＤＯＰＳリポソーム調製物を用いて、第１のサンプル及び第２のサンプルをインキュベートする。第３のサンプルは、ＵＳＰＩＯ又はリポソームを有しない細胞を含有していた。インキュベートの３６時間後、細胞を４回洗浄し、４ｍｌ容のガラスバイアル中で０．５％アガロース溶液と、培養培地との混合物（１：１）でトリプシン化し、固定する。

Ｔ２強調（weighting）に最適化したグラジエントエコー法を利用して、７Ｔ Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｅｃスキャナを用いて、細胞の高解像度のＭＲ画像化を行う。ＴＲ／ＴＥ／０が２００ｍｓ／３５ｍｓ／１０度の３Ｄ ＦＬＡＳＨ画像列、及び３２０×３２０×６４のマトリクスを３．２ｃｍ×３．２ｃｍ×０．６４ｃｍのＦＯＶに用いて、等方性の１００μｍの解像度が得られる。

ＭＲ画像によって、サンプル１及びサンプル２における細胞によるＵＳＰＩＯ粒子の取り込みが示され、サンプル２によって、より高濃度のＵＳＰＩＯ−ＤＯＰＳリポソームに対応する取り込みの増大が示される。超音波処理によって調製されたリポソーム−ＵＳＰＩＯ溶液によって、細胞を含有するサンプルで非常に少数の細胞を検出する。ＩＤＬで記載された処理後アルゴリズムを用いて、それぞれのバイアルで検出された細胞の数の予測が得られる。バイアル２で検出された細胞の数は、バイアル１に比べて約１．４倍である。ゲルと、低強度領域を示す細胞との間の平均コントラスト−ノイズ比（ＣＮＲ）は２０．１５であり、ＳＤは１１である。

ＳａｐＣ−ＤＯＰＳプロテオリポソームの調製
ＳａｐＣのプロトン付加を用いて、ＳａｐＣとＤＯＰＳ膜との結合を促進する。最初に、一定量の酸性緩衝液（ｐＨ５、２０μｌ）で溶解してから、ＰＢＳ又は中性緩衝液（ｐＨ７）で最終容量１ｍｌに希釈することによって、ＳａｐＣにプロトン付加する。代替的に、ブロンステッド酸（例えばＴＦＥ、クロロホルム、メタノール（methonal）等）を用いて、ＤＯＰＳ脂質でＳａｐＣを溶解することができる。これらのブロンステッド酸は、良好なＨ結合ドナーであり、タンパク質に対するプロトン付加効果があることが報告されている（１）。これらの溶媒をエバポレートし、Ｎ２ガス又は真空系下で乾燥させることができる。好適な緩衝液（plecable）（例えばＰＢＳ）を添加し、ＳａｐＣ−ＤＯＰＳプロテオリポソームを形成する。この手法は、酸性ｐＨでＳａｐＣによって誘導されたＤＯＰＳリポソーム融合を避けることである。このアプローチによって調製されたプロテオリポソームは、平均サイズが２００ｎｍの単分散形態である。

ＳａｐＣ−ＤＯＰＳプロテオリポソームの温度制御漏出
リポソームに封入した内容物が漏出する温度に感受性があるように、様々な脂質組成物でＳａｐＣ−ＤＯＰＳプロテオリポソームを設計する。

リポソーム／サポシンＣの特徴付け
サポシンと、リポソーム膜との一時的な空間的相互作用を明らかにするために、本発明者は、内因性（Ｔｒｐ）及び／又は外因性（ＮＢＤ、ピレン等）の蛍光測定法の開発に努力している。これらのアプローチには、最大発光スペクトルシフト、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光ストップフロー解析、蛍光ビーズ−サポシン−リポソーム複合体のフロー分析、及び蛍光顕微鏡法が含まれる。さらに、円偏光二色性（ＣＤ）を利用して、脂質無含有サポシンから脂質結合サポシンへの相対的な二次構造変化を評価する。最初の結果の解析が仮説の提示に発展した。

サポシン−リン脂質相互作用及び膜誘導の発現、精製、機能解析、突然変異生成、並びに蛍光分析に関する研究を以下に要約する。

Ｉ．天然サポシン及び組み換えサポシンの精製及び特徴付け
ａ）原核細胞系由来のサポシンの発現
天然サポシンを単離し、特徴付けているが、提示された研究のために、大量の通常のサポシン、突然変異したサポシン及びＴｒｐ標識したサポシンのアクセス可能な供給源を提供する組み換え発現系を確立することが重要である。以下に基づいて、原核生物系を開発する：１）サポシンは、少なくとも１つの占有的なＮ−グリコシル化部位を有するが、サポシンＢ及びサポシンＣに関して、機能するのにはこれらの部位の占有は必要ではない。２）真核生物系におけるタンパク質の発現が労働集約型で且つ資源集約型であり、緩やかである。これに比べて、原核生物系は迅速であり、高収率の野生型タンパク質及び組み換えタンパク質が与えられる。また、３）野生型であるサポシンＡが天然Ｔｒｐ（３７Ｗ）を含有する唯一のサポシンであるので、内因性蛍光プローブとしてＴｒｐ残基でタンパク質を標識することができる。

ｂ）大腸菌において活性なサポシンの産生
ｐＥＴ２１ａシリーズのベクターを用いて、機能的なサポシンをＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰発現した。３７℃又は３０℃でのＩＰＴＧ誘導の後に、大量のＨｉｓタグを含有するサポシンが破壊細胞の可溶性画分で見出された。これらを電気泳動的に均質になるまでニッケル充填カラム上で好都合に精製した。代替的に、タンパク質コード領域の後に停止コドンを導入することによってＨｉｓタグを有しないサポシンを生成し、それからＴ７−ｔａｑモノクローナル抗体を有する免疫親和性カラムを用いて精製した。精製された組み換えサポシンＣは、酸β−グリコシダーゼの優れた活性化及び他の生物学的な特性を示す。円偏光二色性スペクトル、光散乱、及びＥＳ−ＭＳ解析を用いて、精製したサポシンの物理的特性（例えば凝集状態及び分子量）を評価した。必要となる対照実験のために、Ｈｉｓタグを有しないＴｒｐ−サポシンも生成した。リポソーム再構築システム及び神経突起生成アッセイにおいて、脱脂された同種の酸β−グリコシダーゼを用いて、組み換えサポシンＣの機能的完全性を求める。スルファチド結合アッセイを用いて、組み換えサポシンＢの機能を求める。組み換えサポシンＢ及びサポシンＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ機能は、天然サポシン又は脱グリコシル化サポシンに類似している。

ＩＩ．リン脂質によって誘導されたサポシンの機能的な構造
サポシンＣ−リン脂質相互作用の特異性を求めるために、ＣＤ、蛍光発光シフト、及び蛍光消失法を用いて、リポソームシステムを開発する。個々のＴｒｐ（Ｗ）を含有するように産生された突然変異サポシンＣは、サポシンＣ（０Ｗ）、（Ｓ３７Ｗ）、及び（８１Ｗ）と呼ばれる。これらのＴｒｐ標識サポシンＣは以下の通りである：サポシンＣ（０Ｗ）は、成熟サポシンＣの最初のＮＨ_２末端のアミノ酸の前にＴｒｐを有し、サポシンＣ（Ｓ３７Ｗ）は、３７番目の残基で（すなわち、中央で）Ｔｒｐを有し、サポシンＣ（８１Ｗ）は、最後のＣＯＯＨ末端のアミノ酸の後ろにＴｒｐを有する。これらの置換には、サポシンＣの活性化特性又はＣＤスペクトルに影響を与えなかった。

ａ）ＣＤスペクトル
ＣＤ分光法を用いて、組み換えサポシンの相対的な二次構造の変化が膜結合によって誘導される。酸性の不飽和ホスファチジルセリン（ＰＳ）／サポシンＣ複合体、及び中性のホスファチジルコリン（ＰＣ）／サポシンＢ複合体から得られたサポシンの相対的な二次構造の変化は類似しており、β鎖が減少し、αへリックス含有量が増大する（表４）。

ｂ）蛍光発光スペクトル
トリプトファン環境が極性を変化させる場合、タンパク質の発光スペクトルがシフトする。脳ホスファチジルセリン（ＰＢＳ）リポソームの添加の際に得られたサポシンＡ（０Ｗ）、Ａ（３７Ｗ）、Ａ（８１Ｗ）、Ｃ（０Ｗ）、及びＣ（８１Ｗ）の蛍光スペクトルは、青色シフトを示していた（表５）。

青色シフトは、複合体形成中のサポシンと脂質との相互作用を示唆してる。しかし、サポシンＣ（Ｓ３７Ｗ）はＰＢＳの存在下ではシフトを示さない。このことは、サポシンＣのＮＨ_２−（０Ｗ）末端及びＣＯＯＨ−（８１Ｗ）末端は膜に侵入するが、配列の中央は侵入しないことを示唆している。サポシンＡでは、反転は膜における配列の中央（３７Ｗ）に当たる。このことは、サポシンＡ−膜の連結は、サポシンＣのものと全く異なることを意味する。これらの結果はＣＤ解析と一致している。最大発光波長変化は、中性ＥＰＣの存在下におけるサポシンＡ又はサポシンＣでも、飽和脂肪酸鎖を含有するＰＳでも見られない。

１．サポシンとリン脂質膜との一時的な空間的相互作用
サポシンとリポソーム膜との一時的な空間的相互作用を研究するために、サポシンの内因性蛍光プローブとしてＴｒｐを用いて、蛍光ストップフローアプローチ及び蛍光消失アプローチを利用する。これらの実験によって、サポシンと脂質二重層との間の局所的相互作用、及びこれらの結合速度が同定される。

一時的な相互作用
酸性ｐＨで合成ホスファチジルセリン［ＰＳ（１８：１、１）］小胞とのサポシンＣ（０Ｗ）の結合の際に、蛍光強度が有意に増大した。この結合は、脂質濃度依存的な変化を誘導し、少なくとも１つの不飽和脂肪酸鎖が必要である。この相互作用の速度を評価するために、ストップフロー実験を行い、サポシンＣ／リポソーム複合体形成中の蛍光の変化をモニタリングする。サポシンＣ（０Ｗ）をＰＳ（１８：１、１）又はＢＰＳ小胞を混合すると、Ｔｒｐの蛍光は増大するが、機械性能に限界があるため、この変化の経時的変化は検出不可能である。明らかに、サポシンＣと、不飽和ＰＳ含有膜との相互作用は少なくとも１０ｍｓ以内で起こる。

ＣＤデータ及び発光スペクトルデータから、サポシンＣは負に荷電した不飽和リン脂質と結合する。このことは、サポシンＣにおいて正に荷電した残基と、負に荷電した膜表面との間に静電気的な相互作用が存在することを示唆している。この最初の相互作用に続いて、疎水性相互作用によって膜内にタンパク質が包埋される。サポシンＣ（０Ｗ）とＰＳ（１８：０、０）との混合物では、発光シフト又はＴｒｐ蛍光強度の変化は見られない。

空間的相互作用
ＢＰＳリポソームへのサポシンの挿入深度を求めるために、モルパーセントを増大しながら（０％〜５０％）、スピン標識ホスファチジルコリン（ＳＬＰＣ）をＢＰＳリポソームに組み込む。疎水性蛍光消失剤であるＳＬＰＣは、アシル鎖の異なる炭素（ｎ）に位置するドキシル基を含有する：ＳＬＰＣ５（ｎ＝５）、ＳＬＰＣ１０（ｎ＝１０）、及びＳＬＰＣ１６（ｎ＝１６）。Ｔｒｐ−サポシンの添加後、タンパク質−リポソーム混合物（タンパク質：脂質＝１：２０）を室温で３０分間インキュベートし、それから蛍光強度の変化を記録する。表２で青色シフトを示すＴｒｐ−サポシンに関して、ＢＰＳ／ＳＬＰＣ５リポソームで有意な消光効果（３０％〜６０％）が見られる。消光効率は、ＳＬＰＣ上のドキシル基のアシル鎖における位置に依存する。ドキシル基が膜中で深くにあれば、消光効率が低くなる。ＢＰＳ／ＳＬＰＣ１０では、サポシンＣ（０Ｗ）のトリプトファン蛍光は３０％消失する。

２．サポシンＣ誘導性膜融合
サポシンＣは、リポソーム酵素活性及び神経突起生成活性を有する多官能性分子である。サポシンＣの詳細な機能／組織構造を図３に示す。

５１〜６７番目のアミノ酸残基がその最適な酵素活性化機能に必要ではあるが、十分という訳ではない。脂質結合の際のサポシンＣのジスルフィド構造及び立体配座変化もこの活性に必要である。この研究には、３つのアプローチが用いられる：（１）蛍光プローブ含有小胞と、サポシンＣによって誘導される非蛍光小胞との融合によって生じる自己消光の低減のストップフローモニタリング；（２）Ｎ４＋サブミクロン粒子サイズ分析器（Coulter Co.）を用いて求められるようなサイズ分布である小胞にサポシンＣを添加する際の脂質小胞のサイズ変化のモニタリング；（３）リポソーム融合中のＴｒｐ−サポシンＣ変化の内因性蛍光のモニタリング。これらの結果は、サポシンＣにおけるアミノ末端及びカルボキシル末端のαへリックスドメインにある融合活性領域、及びサポシンＣ誘導性リポソーム融合の速度を規定する（以下を参照されたい）。

サポシンＣ誘導性リポソーム融合
蛍光プローブは、膜融合（例えば蛍光発光（dequenching）及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＥＴ））を求めるのに広く使われており、定量分析及び速度分析に用いることができる。発光アプローチを用いて、サポシンＣの融合活性を研究する。オクタデシルローダミンＢ（Ｒ１８）が蛍光プローブとして選択され、ＢＰＳ又はＰＳ（１８：１、１）による同時超音波処理によって、リポソーム小胞の内部水性区画に封入される。Ｒ１８は高濃度で自己消光を示す。

Ｒ１８の蛍光増大（発光）が、Ｒ１８濃度の減少の際に起こる。非標識小胞及び標識小胞の融合後、Ｒ１８濃度が希釈され、蛍光強度が増大する。蛍光プローブなしで、Ｒ１８標識小胞（脂質：Ｒ１８＝９６：４（ｍｏｌ：ｍｏｌ））を同じ脂質小胞と混合する。これらの小胞をサポシンＣ又はＣａ^２＋イオンと迅速に混合するのに、ストップフローアッセイを行う。速度分析のために時間トレース（Time-trace）曲線を作製する。サポシンＣによる不飽和ＰＳ（１８：１、１）膜融合の誘導は、Ｃａ^２＋によるものと同じ速度を示している。反応温度がリン脂質の相転移温度（Ｔ_ｃ）より大きい場合、融合が広範囲にわたって起こる。合成ＰＳ（１８：１）のＴ_ｃは約−１１℃である一方で、ＰＳ（１８：０）のＴ_ｃは非常に高い（６８℃）。したがって、２４℃でのＰＳ（１８：１、１）の脂質二重層の相は、ＢＰＳ（１８：０及び１８：１）のものとは異なっている。この結果は、サポシンＣ誘導性膜融合の速度が、脂質二重層の物理的状態によって求められることを示している。

３．サイズ変化の測定
融合小胞のサイズが非融合のものよりも大きいため、小胞融合分析には、電子顕微鏡法（ＥＭ）を用いる。Ｎ４＋サブミクロン粒子サイズを用いて、３ｎｍ〜３μｍの範囲の粒子サイズを予測する。これは、ほとんどのリポソームがこの範囲に適合するためである。カップ音波処理器による音波処理条件は、サイズが約２００ｎｍの単分散ＢＰＳ−リポソームを与える。サポシンＣの添加の際に、これらの小胞は最大２μｍ〜３μｍのより大きいサイズに変化する。上記の発光実験によって示されるように、サイズ増大は小胞融合に関連する。サポシンＣは、ｐＨ４．７で１０分間にわたって小胞サイズが大きくなるが、ｐＨ７．４では大きくならない（図４を参照されたい）。

これらのデータは、サポシンＣのｐＨ感受性の融合活性を示唆している。サポシンＣは、約５０ｎＭ濃度でのサイズ変化を促進する。この融合特性に関与する領域を規定するために、サポシンＣにおいてＮＨ_２末端を５０％だけ、又はＣＯＯＨ末端を５０％含有するペプチドを試験する。両方のペプチドは融合活性を示す。これらのデータは、両方のサポシンＣ末端上に位置する直鎖配列（複数可）媒介性の融合を示唆している。

４．融合機構
タンパク質の構造変化は、タンパク質媒介性膜融合に関与すると考えられる。サポシンＣ依存性膜融合を用いて、この融合機構を評価する。最初に、サポシンＣ−ＰＳ（１８：１、１）リポソーム複合体が形成される。このサポシンＣ固定膜で、タンパク質構造が変化する。この複合体はｐＨ３〜１０で安定であり、低濃度のＳＤＳ溶液中に存在する。これは、ＰＳ小胞からのサポシンＣの解離速度が非常に緩やかであることを示していた。

サポシンＣ（０Ｗ）におけるＴｒｐが脂質二重膜の内側に包埋されるので、このシグナル変化は、Ｔｒｐの周囲環境が変化していることを示している。約２０ｍｓ〜３０ｍｓ後、Ｔｒｐ蛍光シグナルは開始レベルまで低減する。このことは、複合体中のサポシンＣが付加的なＰＳ−小胞と相互作用したことを示している。この直後に、シグナルは、融合プロセスの終わりにシグナル伝達して、開始レベルまで落ちる。これらのデータは、脂質膜と結合した場合でも、サポシンＣは融合活性を維持することを示している。したがって、脂質結合の際のサポシンＣの構造変化は、その融合活性には必要ではない。この結果は、直鎖配列（複数可）が膜融合を誘導するのに十分であるという結論と一致する。

ＸＩ．サポシンＣ遺伝子の最適化及び合成
サポシンＣのＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの二次構造、及び後でサブクローニングに用いられる制限部位の脱離を考慮して、大腸菌における発現に対してコドンを最適化する。制限部位ＮｄｅＩ及びＳａｌＩをそれぞれその遺伝子の５’末端及び３’末端に付加し、二重終止コドンをサポシンＣコード配列の末端に付加し、確実に発現タンパク質を適切に末端化させる。遺伝子合成は、DNA2.0が請け負っており、シーケンシングによって最適化された遺伝子を確認し、クローニングベクター「ｐＪ２」におけるＶＴＩに供給する。このベクター構築物はｐＪ２−ＳａｐＣｇと称され、制限部位ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで分けられた最適化サポシンＣ遺伝子カセットはＳａｐＣｇと称される。

ｐＥＴ２４ａへのクローニング
ＳａｐＣｇのｐＥＴ２４ａへのクローニングは以下のように行う。制限部位ＮｄｅＩ及びＳａｌＩを用いて、ｐＪ２−ＳａｐＣｇからＳａｐＣｇを切断し、またこれらと同じ部位で切断されている発現ベクターｐＥＴ２４ａ（Novagen）にライゲートする。このライゲートした構築物を大腸菌クローニング株ＴＯＰ１０（Invitrogen）に形質転換する。カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）によって選択を行う。コロニーＰＣＲを行い、どの形質転換コロニーが、ＳａｐＣｇが挿入されたベクターを保有していたかを求める。さらなる研究のために、陽性と試験されたコロニーから１つのコロニーを選択する。プラスミドミニプレップキット（Qiagen）によって、このクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、制限及び配列分析によって、ＳａｐＣｇ挿入ＤＮＡの存在を確認する。このプラスミド構築物はｐＥＴ２４ａ−ＳａｐＣｇと呼ばれる。

振盪フラスコ誘導
発現構築物ｐＥＴ２４ａ−ＳａｐＣｇをコンピテント大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）に形質転換する。３つのコロニー（クローン）を選択し、最初の試験でサポシンＣの発現を試験する。ＢＬ２１（ＤＥ３）クローンに関して、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を有するＬＢ培地を用いて、１２５ｍｌ容の振盪フラスコでこの小規模な発現を行う。細胞のＯＤ６００が約０．６に達する場合、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによって、誘導が達成される。誘導の直前、又は誘導の４時間後、サンプルを採取する。正しいサイズのタンパク質の発現は、３つのＢＬ２１（ＤＥ３）クローン全てと類似している。３つのクローン全てに対して、研究用の（Working）グリセロール種（seed stocks）を調製する。さらなる開発のために、１つのクローンをランダムに選択する。

発酵条件
発酵に用いられるクローンは、大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）で形質転換したｐＥＴ２４ａ−ＳａｐＣｇ（上記）である。発酵は、８Ｌ容のＮＢＳＣ ＢｉｏＦｌｏｗ３０００発酵槽を用いて行い、ＤＯ−Ｓｔａｔ供給方式によるフェドバッチ発酵から成る。最初の培養容量は５Ｌである。バッチ培地及び供給培地の組成は表１及び表２に示す。誘導前の発酵温度は３０℃である。３７℃への温度変化を伴って、後期の対数期で１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによって、誘導が達成される。全発酵は２２時間続き、１０時間誘導される。

封入体調製
上記の発酵由来のペーストを用いて、封入体調製を行う。ペースト約２０ｇを全量２００ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）で再懸濁する。再懸濁及び完全な均質化の後、微小流動化を用いて開細胞を破壊する。４℃、１６０００×ｇで６０分間、遠心分離によって、細胞溶解物の不溶性部分を沈澱させる。全量８００ｍｌの溶解緩衝液＋１％トリトンＸ−１００中で、ペレットを均質化し、室温で４５分間混合する。４℃、１６０００×ｇで６０分間、遠心分離を行う。１％トリトンＸ−１００を有する溶解緩衝液を用いて２回以上、及びトリトンＸ−１００を有しない溶解緩衝液を用いて１回、洗浄を行う。それから、全量６００ｍｌの６Ｍの尿素（ｐＨ８．５）（２０ｍＭのトリスで緩衝化する）でペレットを再懸濁し、室温で３時間撹拌する。４℃、１６０００×ｇで６０分間、遠心分離を行い、サンプルを透明にする。サポシンＣ特異的な抗体を用いて、サポシンＣの存在を確認した後、得られた上清を用いて、さらに精製する。

ＳａｐＣクロマトグラフィ及びリホールディング
エンドトキシン無含有条件下で、以下のクロマトグラフィ工程、リフォールディング工程及び濃縮工程を全て行う。Ｑセファロース高速流樹脂（GE Amersham）を用いたイオン交換クロマトグラフィによって、封入体由来のサポシンＣの精製を行う。平衡緩衝液（緩衝液Ａ）は、６Ｍの尿素／０．０２Ｍのトリス（ｐＨ８．５）である。溶離緩衝液（緩衝液Ｂ）は、６Ｍの尿素／１ＭのＮａＣｌ／０．０２Ｍのトリス（ｐＨ８．５）である。最初に１０カラム容量に対して５％緩衝液Ｂ／９５％緩衝液Ａ、それから１０カラム容量に対して１０％緩衝液Ｂ／９０％緩衝液Ａの段階勾配、その後１０カラム容量で１０％〜１００％緩衝液Ｂの線形勾配で溶離を行う。全ての画分を回収及び維持する。サポシンＣの存在に関する画分の分析をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行い、大部分のサポシンＣを含有する画分をリフォールディングのために選択する。

ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（０．０５Ｍのクエン酸／０．１Ｍのリン酸塩（ｐＨ４．７））への透析によって、リフォールディングを行う。それから、サポシンＣタンパク質を約０．２ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの外観検査によって、この調製物の純度が約９０％であることが求められる。

サポシンＣ誘導性の融合のためのクリップオンモデルを表す図である。リポソーム結合サポシンＣは、疎水性相互作用によって次々と繋がり、リポソーム融合を誘導する。 サポシンＣと、リポソーム小胞との連結を示す図である。サポシンフォールドの立体配座変化が脂質結合サポシンＣで見出される。サポシンＣの膜トポロジー相互作用によって、アミノ末端及びカルボキシル末端の両親媒性へリックスが脂質二重膜に包埋され、サポシンＣの中間領域が水性相に曝露されることが示された。サポシンＣの中間領域は水性相に曝露される。 神経突起生成性の酸β−グルコシダーゼ活性化と、サポシンＣの脂質結合特性との機能的構築の模式図である。予測された順番及びジスルフィド結合を示すボックスを除いて、この図には既知の物理的構造を示す意図はない。２２〜３２番目の残基は、神経栄養効果に対して重要な意味を有する。４２〜６１番目の残基に広がる領域は、サポシンＣの酸β−グルコシダーゼの活性化効果に必須であり、３つのジスルフィド結合全ての存在も、この機能に重要である。さらに、サポシンＣの完全な活性化には、高次構造が必要である。脂質／脂質膜相互作用の領域は、ＮＨ_２末端領域及びＣＯＯＨ末端領域の両方に位置する。 ｐＨ４．７又はｐＨ７．４でのＣａ^２＋（Ａ）又はサポシンＣ（Ｂ）によって誘導されたＢＰＳ（脳ホスファチジルセリン）リポソームのサイズ変化を示す図である。公正な自己相関関数、分散（dust）＝０．０％、基線誤差＜１％（室温）。 ＮＢＤ−ＤＯＰＳ及びサポシンＣのマウス脳の小脳への輸送を示す図である。ＮＢＤ−ＤＯＰＳ−サポシンＣプロテオリポソーム（Ａ、Ｃ、Ｄ）及びＰＢＳ（Ｂ、Ｅ、Ｆ）が、ＦＢＶ／Ｎ成体マウスの尾静脈を通して投与された。凍結小脳切片が注射の４８時間後に調製された。（Ａ）及び（Ｂ）でＤＯＰＳを検出するためのＮＢＤ緑色蛍光が、顕微鏡（Zeiss Axioskop、１００×）を用いて視覚化された。プルキンエ細胞においてサポシンＣ（Ｄ及びＦ）を検出するためのＮＢＤ緑色蛍光（Ｃ及びＥ）及び抗Ｈｉｓ抗体（ローダミン結合二次抗体、赤色蛍光）が、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Zeiss）で撮像された。バー：２０μｍ（Ｃ〜Ｆ）。用語：ｐ＝プルキンエ細胞、ｇ＝顆粒細胞。 ＰＢＳ中のＰＴＩＲ−２７１（２０μＭ）／サポシンＣ−ＤＯＰＳプロテオリポソーム（図７Ａ）、及びＰＢＳ中のＰＴＩＲ−３１６（２０μＭ）／ＳａｐＣ−ＤＯＰＳプロテオピポソーム（図７Ｂ）に対する蛍光スペクトルを示す図である。 ＰＴＩＲ−２７１及びＰＴＩＲ−３１６を含有するサポシンＣ−ＤＯＰＳのヒト神経芽腫細胞（ＣＨＬＡ−２０）への取り込みを示す図である。図８Ａ及び図８Ｂは、ＳａｐＣ−ＤＯＰＳリポソームによって送達されるＰＴＩＲ−２７１の取り込みを示す。図８Ｃ及び図８Ｄは、ＳａｐＣ−ＤＯＰＳリポソームによって送達されるＰＴＩＲ−３１６の取り込みを示す。対照リポソーム（ＰＴＩＲ−２７１又はＰＴＩＲ−３１６を有しないＳａｐＣ−ＤＯＰＳリポソームで処理）は、図８Ｅ及び図８Ｆで示される。赤色の画像は、色素の取り込みを示す。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ−ＡｐｏＴｏｍｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（６３×及び４０×のオイルレンズ）：λ_EＸ／λ_ＥＭ、ビームスプリッター：６６０、細胞形態に対してＢ／Ｗの位相差を用いて視覚化する。Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを画像化に用いた。 ＳａｐＣ−ＤＯＰＳリポソームを用いた、ＧＦＰ２２ ｓｉＲＮＡのＥＧＦＰ ４Ｔ１細胞への送達を示す図である。ＧＦＰ２２ ｓｉＲＮＡは、緑色蛍光タンパク質の遺伝子発現を特異的に阻害する２２ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡである（NJ Caplen他, PNAS, 2001, 98:9742-9747）。インキュベート時間は７２時間であった。２０×、８００ミリ秒の曝露、フォトショップ：入力レベル２７、１．１９、１６４、出力レベル２５５。サイズ３×２．２９インチ。図９Ａ及び図９Ｃは、リポソームを含有するＧＦＰ２２ ｓｉＲＮＡを示し、図９Ｂ及び図９Ｄは、ＧＦＰの発現に影響しない非サイレンシングｓｉＲＮＡ（２２ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ断片から成る）を用いた陰性対照を示す。ＲＮＡは全て、QIAGENから購入した。 ＧＦＰ２２ ｓｉＲＮＡの、（ａ）ローダミン−ＧＦＰ２２ ｓｉＲＮＡ、（ｂ）位相差、及び（ｃ）併合を示す神経芽細胞腫（ＣＨＬＡ−２０）癌細胞への送達の顕微鏡写真である。

Claims (12)

1. 血液脳関門の膜を通して磁気共鳴検出用標識を送達するためのリポソームであって、
   ａ）アニオン性長鎖脂質と中性長鎖脂質との混合物であるリン脂質と、
   ｂ）安全で且つ効果的な量の前記磁気共鳴検出用標識と、
   ｃ）プロサポシン由来の融合タンパク質又はポリペプチドと、
   ｄ）薬学的に許容可能な担体と、
   を含む組成物に前記リポソームが含められており、前記組成物における前記リポソームの濃度が前記膜を通して安全で且つ効果的な量の前記磁気共鳴検出用標識を送達するのに十分な量であり、前記リン脂質が全体的に負に荷電した前記リポソームを形成し、前記磁気共鳴検出用標識が前記リポソーム内に封入されている、リポソーム。
2. 血液脳関門の膜を通して磁気共鳴検出用標識を送達するためのリポソームであって、
   ａ）アニオン性長鎖脂質と、中性長鎖脂質と、中性短鎖脂質との混合物であるリン脂質と、
   ｂ）安全で且つ効果的な量の前記磁気共鳴検出用標識と、
   ｃ）プロサポシン由来の融合タンパク質又はポリペプチドと、
   ｄ）薬学的に許容可能な担体と、
   を含む組成物に前記リポソームが含められており、前記組成物における前記リポソームの濃度が前記膜を通して安全で且つ効果的な量の前記磁気共鳴検出用標識を送達するのに十分な量であり、前記リン脂質が全体的に負に荷電した前記リポソームを形成し、前記磁気共鳴検出用標識が前記リポソーム内に封入されている、リポソーム。
3. 前記リポソームがカチオン性リン脂質を含有する、請求項２に記載のリポソーム。
4. アニオン性長鎖脂質、中性長鎖脂質及び短鎖脂質の量が、（［中性長鎖脂質］＋［アニオン性長鎖脂質］）／（短鎖脂質）＝４である式によって支配される、請求項２に記載のリポソーム。
5. 前記リポソームが、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びヘキサノイルホスファチジルコリンから成り、アニオン性長鎖脂質、中性長鎖脂質及び中性短鎖脂質の量が、（［中性長鎖脂質］＋［アニオン性長鎖脂質］）／（中性短鎖脂質）＝４である式によって支配される、請求項２に記載のリポソーム。
6. 前記組成物のｐＨが５．５〜２である、請求項１又は２に記載のリポソーム。
7. 前記融合タンパク質又はポリペプチドがサポシンＣである、請求項１又は２に記載のリポソーム。
8. 前記リポソームの濃度が、プロサポシン由来の前記融合タンパク質又はポリペプチドの濃度に対してモル比で少なくとも１倍〜１０倍過剰である、請求項１又は２に記載のリポソーム。
9. ジオレオイルホスファチジルセリンと、ジパルミトイルホスファチジルコリンとのモル比が１０：１である、請求項５に記載のリポソーム。
10. ＳＡＮＳ実験における散乱ベクトル値であるｑ値が１〜１０である、請求項１又は２に記載のリポソーム。
11. 前記磁気共鳴検出用標識が２つ以上の画像化特性を有する、請求項１又は２に記載のリポソーム。
12. 前記磁気共鳴検出用標識が磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって検出することができるフルオロフォア及びＧｄ（ＩＩＩ）部の両方を含有するＰＴＩＲ色素である、請求項１１に記載のリポソーム。