JP2006280376A - 細胞への遺伝子導入用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、O,O′−N−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンハライド、リン脂質及びコレステロールを含有する遺伝子、細胞内に導入されにくい大きさの分子量の生理活性ペプチド類又は蛋白質類の細胞への導入用組成物に関する。
【選択図】なし
Description
また、本発明は、さらに遺伝子、細胞内に導入されにくい大きさの分子量の生理活性ペプチド類又は蛋白質類を含有する組成物を提供するものである。
X1はハロゲン原子を示し;
nは1〜10の整数を示す〕
一般式(1)中、nは1〜10の整数を示すが、1又は10であることが特に好ましい。nが1である場合、Aは
この時の水系溶媒の組成も特に限定はされないが、水のほか、グルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液;グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液;生理食塩液;リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液;細胞培養用の培地などが挙げられる。この水系溶媒に分散したまま脂質膜構造体を安定に長期間保存させるためには、凝集などの物理的安定性からは水系溶媒中の電解質をなるべくなくすこと、脂質の化学的安定性からは、水系溶媒のpHを弱酸性から中性付近(pH3.0〜8.0)に設定したり、窒素バブリングにより溶存酸素を無くしたりすることが重要である。さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には糖水溶液を、凍結保存をする場合には糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能となる。
また、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体をさらに乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥が挙げられる。この時の水系溶媒としては、上記したように糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液や乳糖水溶液を用いるとよい。ここで、水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥させるメリットとしては、脂質膜構造体の長期保存が可能となることの他、この乾燥物に遺伝子水溶液を添加すると効率良く脂質混合物が水和されるために遺伝子自身も効率よくリポソーム等の脂質膜構造体に保持されることが挙げられる。
なお、脂質膜構造体と遺伝子との混合物が水系溶媒に分散した形態の製造方法にはいくつかの種類があり、それぞれに特徴があって、できあがりの脂質膜構造体と遺伝子との混合物の存在様式が異なるので注意を要する。
上記の脂質膜構造体と遺伝子との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられるが、この時の水系溶媒としては、脂質膜構造体単独の場合と同様に、糖水溶液や多価アルコール水溶液を用いるとよい。
1−1.空のリポソーム分散液の製造
所定量の第4級アンモニウム塩、リン脂質、コレステロールをいったんクロロホルムに溶解させ、次にこれをエバポレーターにより減圧乾固させて脂質混合物とした。この脂質混合物に、等張のショ糖又は乳糖水溶液を所定量加え、加温しながらホモミキサーによる乳化を行ってリポソーム粗分散液を得た。次に、リポソームの粒子径をそろえるために、孔径0.22μmのメンブランフィルターを用いて、高圧下でイクストルージョン(押し出し濾過)を行い、これを空のリポソーム分散液とした。
1−2.凍結乾燥空リポソームの製造
1−1.で製造した空のリポソーム分散液をバイアルに所定量分注し、凍結乾燥を行って凍結乾燥空リポソームとした。
実施例2 遺伝子を含有するリポソーム分散液の製造
2−1.遺伝子を含有するリポソーム分散液(タイプ1)の製造
1−1.で製造した空のリポソーム分散液(全脂質濃度として2μmol/mL)を、第4級アンモニウム塩として100nmol/mLとなるように、無血清培地(D−MEM)で希釈した。次に、このリポソーム分散液100μL(第4級アンモニウム塩として10nmol含有)とDNA(PGV−C〔ルシフェラーゼ遺伝子〕又はpCAG−lacZ〔βガラクトシダーゼ遺伝子〕)を1μg含む無血清培地(D−MEM)100μLとを混和し、15分間放置した。さらに0.8mLのFBS12.5%添加D−MEM(最終FBS濃度は10%)を加えて1Lとし試料とした。
1−2.で製造した凍結乾燥空リポソーム(全脂質濃度として2μmol/mL相当)に注射用蒸留水を加えて復水させ元に戻した(全脂質濃度として2μmol/mL)後、さらに、第4級アンモニウム塩として100nmol/mLとなるように、無血清培地(D−MEM)で希釈した。次に、このリポソーム分散液100μL(第4級アンモニウム塩として10nmol含有)とDNA(PGV−C又はpCAG−lacZ)を1μg含む無血清培地(D−MEM)100μLとを混和し、15分間放置した。さらに0.8mLのFBS12.5%添加D−MEM(最終FBS濃度は10%)を加えて1mLとし試料とした。
1−2.で製造した凍結乾燥空リポソーム(全脂質濃度として2μmol/mL相当)にDNA(PGV−C又はpCAG−lacZ)含有注射用蒸留水(第4級アンモニウム塩10nmol当りDNA量として1μg)を加えて復水させ、15分間放置した。さらに最終DNA濃度が1μg/mLとなるように、このリポソーム分散液をFBS10%添加D−MEMで希釈して試料とした。
1−1.で製造した空のリポソーム分散液(全脂質濃度として2μmol/mL)を、第4級アンモニウム塩として400nmol/mLとなるように、無血清培地(D−MEM)で希釈した。次に、このリポソーム分散液500μL(第4級アンモニウム塩として200nmol含有)とDNA(pCAG−lacZ)を20μg含む無血清培地(D−MEM)500μLとを混和し、5分間放置し、これを試料とした。
1−2.で製造した凍結乾燥空リポソーム(全脂質濃度として2μmol/mL相当)に注射用蒸留水を加えて復水させ元に戻した(全脂質濃度として2μmol/mL)後、さらに、第4級アンモニウム塩として400nmol/mLとなるように、無血清培地(D−MEM)で希釈した。次に、このリポソーム分散液500μL(第4級アンモニウム塩として200nmol含有)とDNA(pCAG−lacZ)を20μg含む無血清培地(D−MEM)500μLとを混和し、5分間放置し、これを試料とした。
1−2.で製造した凍結乾燥空リポソーム(全脂質濃度として2μmol/mL相当)にDNA(pCAG−lacZ)含有注射用蒸留水(第4級アンモニウム塩10nmol当りDNA量として1μg)を加えて復水させ、15分間放置した。さらに最終DNA濃度が20μg/mLとなるように、このリポソーム分散液を無血清培地(D−MEM)で希釈して試料とした。
2−5.で製造した遺伝子を含有するリポソーム分散液(タイプ5)のDNAをpCAG−lacZからpCAG−TK[チミジンキナーゼ遺伝子]に変更した以外は全て同じように製造した。
各種腫瘍細胞を6穴プレートに1×105〜8×105個播種し、FBS10%添加培地で24時間培養後、無血清培地で1回洗浄した。次に実施例2で製造した遺伝子(PGV−C)を含有するリポソーム分散液(2−1.2−2.並びに2−3.:最終DNA濃度として1μg/10nmol第4級アンモニウム塩/mL)を各ウェルに1mL加え、37℃で5時間反応させた。5時間後、ウェルを無血清培地で1回洗浄し、FBS10%添加培地を加えて2日間培養した後、ルシフェラーゼ・アッセイを行った。
b)SA:ステアリルアミン(代表的カチオン脂質)
c)DOPE:ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
d)DLPC:ジラウロイルホスファチジルコリン
e)DC−6−12:O,O′−N−ジドデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンクロリド
DC−6−14:O,O′−N−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンクロリド
DC−6−16:O,O′−N−ジヘキサデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンクロリド
DC−6−18:1:O,O′−N−ジオクタデセノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンクロリド
f)Cho1:コレステロール
1)N−〔α−トリメチルアンモニオアセチル〕−ジドデシル−D−グルタメ ート/DOPE/DLPC=2/4/4(モル比)
2)ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド/DOPE=2.9/7.1(重量比)
3)2,3−ジオレイルオキシ−N−〔2−(スペルミンカルボキサミド)エチル〕−N,N−ジメチル−1−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート/DOPE=3/1(重量比)
4)N−〔1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル〕−n,n,n−トリメチルアンモニウムクロリド/DOPE=5/5(重量比)
5)1,2−ジミリスチルオキシプロピル−3−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド/コレステロール=1/1(モル比)
6)3−β−〔N−(N′,N′−ジメチルアミノエタン)カルバモイル〕コレステロール/DOPE=6/4(モル比)
7)市販品は、lipid film(リピドフィルム)であり、ここに成分中のカチオン脂質10nmol当たりDNAとして1μgとなるように、遺伝子を含む水溶液(水性溶媒)を添加したのち、ボルテックスミキサーによる攪拌を行って、遺伝子含有リポソーム水分散液を得る。
8)市販品及び文献の方法は、空のリポソーム(あるいは脂質膜構造体)の水分散液であり、ここに成分中のカチオン脂質10nmol当たりDNAとして1μgとなるように、遺伝子を含む水溶液(水性溶媒)を外部から添加して、遺伝子とリポソームとのコンプレックス分散液を得る。
g)TC−1−12:O,O′,O″−トリドデカノイル−N−(ω−トリメチルアンモニオデカノイル)−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンブロミド
h)LysoPC:リゾホスファチジルコリン
i)Lyso−LPC:リゾラウロイルホスファチジルコリン
j)Lyso−MPC:リゾミリストイルホスファチジルコリン
各種腫瘍細胞を6穴プレートに1×105〜8×105個播種し、FBS10%添加培地で24時間培養後、無血清培地で1回洗浄した。次に、実施例2で製造した遺伝子(pCAG−lacZ)を含有するリポソーム分散液(2−1.2−2.並びに2−3.:DNA濃度として1μg/10nmol第4級アンモニウム塩/mL)を各ウェルに1mL加え、37℃で5時間反応させた。5時間後、ウェルを無血清培地で1回洗浄し、FBS10%添加培地を加えて2日間培養し、X−gal染色を行った。
DC−6−14:O,O′−N−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンクロリド
DC−6−16:O,O′−N−ジヘキサデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンクロリド
TC−1−12:O,O′,O″−トリドデカノイル−N−(ω−トリメチルアンモニオデカノイル)−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンブロミド
b)DOPE:ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
c)Cho1:コレステロール
d)DLPC:ジラウロイルホスファチジルコリン
1)N−〔α−トリメチルアンモニオアセチル〕−ジドデシル−D−グルタメート/DOPE/DLPC=2/4/4(モル比)
2)2,3−ジオレイルオキシ−N−〔2−(スペルミンカルボキサミド)エチル〕−N,N−ジメチル−1−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート/DOPE=3/1(重量比)
3)1,2−ジミリスチルオキシプロピル−3−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド/コレステロール=1/1(モル比)
4)市販品は、lipid film(リピドフィルム)であり、ここに成分中のカチオン脂質10nmol当たりDNAとして1μgとなるように、遺伝子を含む水溶液(水性溶媒)を添加したのち、ボルテックスミキサーによる攪拌を行って、遺伝子含有リポソーム水分散液を得る。
5)市販品及び文献の方法は、空のリポソーム(あるいは脂質膜構造体)の水分散液であり、ここに成分中のカチオン脂質10nmol当たりDNAとして、1μgとなるように、遺伝子を含む水溶液(水性溶媒)を外部から添加して、遺伝子とリポソームとのコンプレックス分散液を得る。
各種腫瘍細胞をヌードマウス腹腔内に5×106個(mEIIL、ES−2)〜6×107個(HRA)接種し、1日(HRA)、10日前後(ES−2)あるいは3週間前後(mEIIL)経過した後、上に示した遺伝子(pCAG−lacZ)を含有するリポソーム分散液(2−4.2−5.並びに2−6.:最終DNA濃度として20μg/200nmol第4級アンモニウム塩/mL)を1mLマウス腹腔内に投与した。mEIIL、HRA腫瘍細胞の場合には1日後、ES−2腫瘍細胞の場合には2日後にそれぞれ腫瘍細胞を回収し、3×105〜5×105個を6穴プレートに播種し、FBS10%添加培地で24時間培養して細胞が付着したところでX−gal染色を行った。X−gal染色は試験例2と同様に行った。結果を表6に示す。
DC−6−14:O,O′−N−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンクロリド
b)DOPE:ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
c)Cho1:コレステロール
1)N−〔α−トリメチルアンモニオアセチル〕−ジドデシル−D−グルタメート/DOPE/DLPC=2/4/4(モル比)
2)ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド/DOPE=2.9/7.1(重量比)
3)2,3−ジオレイルオキシ−N−〔2−(スペルミンカルボキサミド)エチル〕−N,N−ジメチル−1−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート/DOPE=3/1(重量比)
4)N−〔1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル〕−n,n,n−トリメチルアンモニウムクロリド/DOPE=5/5(重量比)
5)1,2−ジミリスチルオキシプロピル−3−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド/コレステロール=1/1(モル比)
6)市販品は、lipid film(リピドフィルム)であり、ここに成分中のカチオン脂質10nmol当たりDNAとして1μgとなるように、遺伝子を含む水溶液(水性溶媒)を添加したのち、ボルテックスミキサーによる攪拌を行って、遺伝子含有リポソーム水分散液を得る。
7)市販品及び文献の方法は、空のリポソーム(あるいは脂質膜構造体)の水分散液であり、ここに成分中のカチオン脂質10nmol当たりDNAとして、1μgとなるように、遺伝子を含む水溶液(水性溶媒)を外部から添加して、遺伝子とリポソームとのコンプレックス分散液を得る。
各種腫瘍細胞をヌードマウス腹腔内に3×105 個(HRA)、1×106 個(mES−2)あるいは5×106 個接種し(Day0)、HRA、ES−2の場合には7日目(Day7)から、mEIILの場合には10日目(Day10)から、1日おきに7回、上に示した遺伝子(pCAG−TK)を含有するリポソーム分散液(2−7.:最終DNA濃度として20μg/200nmol第4級アンモニウム塩/mL)を1mLマウス腹腔内に投与した。またHRA、ES−2の場合には9日目(Day9)から毎日13日間(Day21まで)、mEIILの場合には12日目(Day12)から毎日13日間(Day24まで)、それぞれガンアシクロビルを1日2回、35mg/kgマウス腹腔内に投与した。対照としてはpCAG−TK遺伝子の代わりにpCAG−lacZ遺伝子を投与した群をおいたが、有意差の検定はCox−Mantel法により行った。結果を表7に示す。
DC−6−14:O,O′−N−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンクロリド
b)DOPE:ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
c)Cho1:コレステロール
表7から明らかなように、本発明の遺伝子導入用組成物は良好な延命効果を示した。
Claims (7)
- O,O′−N−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンハライド、リン脂質及びコレステロールを含有する遺伝子、細胞内に導入されにくい大きさの分子量の生理活性ペプチド類又は蛋白質類の細胞への導入用組成物。
- リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲン及びホスファチジン酸から選ばれる1種又は2種以上である請求項1記載の組成物。
- リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンから選ばれる1種又は2種以上である請求項1記載の組成物。
- O,O′−N−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンハライドとリン脂質との混合物:コレステロールのモル比が、3:7〜9:1である請求項1〜3のいずれか1項記載の組成物。
- リポソームを形成しているものである請求項1〜4のいずれか1項記載の組成物。
- さらに遺伝子、細胞内に導入されにくい大きさの分子量の生理活性ペプチド類又は蛋白質類を含有するものである請求項1〜5のいずれか1項記載の組成物。
- O,O′−N−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンハライドが、O,O′−N−ジテトラデカノイル−N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)−ジエタノールアミンクロリドである請求項1〜6のいずれか1項記載の組成物。
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WO2012053484A1 (ja) * | 2010-10-19 | 2012-04-26 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 水溶性脂質を内水相に添加する二段階乳化法による単胞リポソームの製造方法およびその製造方法により得られる単胞リポソーム |
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WO2012053484A1 (ja) * | 2010-10-19 | 2012-04-26 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 水溶性脂質を内水相に添加する二段階乳化法による単胞リポソームの製造方法およびその製造方法により得られる単胞リポソーム |
JP5838970B2 (ja) * | 2010-10-19 | 2016-01-06 | コニカミノルタ株式会社 | 水溶性脂質を内水相に添加する二段階乳化法による単胞リポソームの製造方法およびその製造方法により得られる単胞リポソーム |
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