JPH0678798A - ｐ５３による配列特異的ＤＮＡ結合 - Google Patents

ｐ５３による配列特異的ＤＮＡ結合

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JPH0678798A
JPH0678798A JP4155394A JP15539492A JPH0678798A JP H0678798 A JPH0678798 A JP H0678798A JP 4155394 A JP4155394 A JP 4155394A JP 15539492 A JP15539492 A JP 15539492A JP H0678798 A JPH0678798 A JP H0678798A
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バート・ヴォーゲルスタイン
Kenneth W Kinzler
ケネス・ダブリュー・キンズラー
Michael I Sherman
マイケル・アイ・シャーマン
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Pharmagenics Inc
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Abstract

(57)【要約】 【構成】ヒトゲノムの特異的配列は、野性型ｐ５３蛋白
質が強力に結合するが該蛋白質のミュータント型には結
合しない部位である。 【効果】これらの配列は野性型ｐ５３の量が減少した細
胞を検出するための診断に用いられる。これらの配列は
また、癌細胞中のＤＮＡに対して野性型ｐ５３の消失を
正す薬剤のスクリーニングに使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本出願は、米国特許出願０７／７
１５，１８２号， １９９１年６月１４日提出、の続き
の部分を含む。
【０００２】本研究は、ＮＩＨ（国立衛生研）助成金Ｃ
Ａ０６９７３，ＣＡ０９２４３，ＣＡ３５４９４，ＣＡ
０９０７１及びＣＡ４３４６０のもとで、米国政府によ
る援助を一部分受けた。米国政府は、本発明にある程度
の権利を保持している。
【０００３】本発明は、癌の発見及び軽減のための診断
及び治療方法に関するものである。特に、癌抑制物質ｐ
５３が特異的に結合するＤＮＡ配列の同定に関するもの
である。
【０００４】
【従来の技術】リン酸化核タンパクｐ５３の遺伝子は、
ヒトの癌において現在までに同定された、最も一般的に
変異している遺伝子である（Vogelstein, B., Nature,
348:681 (1990))。結腸、肺、胸部、卵巣、膀胱、及び
他のいくつかの組織の腫瘍において、ミスセンス変異が
発見されている（S.J. Baker, et al., Science, 244:2
17 (1989); J.M. Nigro, et al., Nature, 342:705 (19
89); T.Takahashi, et al., Science, 246:491 (1989);
Romano, et al., Oncogene, 4:1483 (1989), Menon, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5435 (1990); Iggo, e
t al., Lancet ii, 675 (1990); T.Takahashi, et al.,
J. Clin.Invest. 86:363(1990); Mulligan, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 87:5863 (1990); Bartek, et al.,
Oncogene,5:893(1990); Stratton et al., Oncogene,
5:1297 (1990))。現在の癌研究が行っている重要な挑戦
の一つは、ｐ５３遺伝子産物の生化学的性質及び、どの
ようにｐ５３遺伝子の変異がそれらの性質に影響を与え
ているのかということを解明することである。
【０００５】例えばin vitro形質転換したマウス細胞
（Eliyahu, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:87
63 (1989); Finlay, et al., Cell, 57:1083 (198
9)）、あるいはヒト癌細胞（Baker, et al., Science,
249:912 (1990); Mercer, et al.,Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 87:6166 (1990); Diller et al., Mol. Cell
Biol. 10:5772 (1990)）の増殖を抑制する能力を持つな
どｐ５３の生物学的特徴がいくつか明確にされてきてい
るが、この抑制の生化学的根拠は、大部分が未解明のま
まである。このような性質を理解するための一歩とし
て、我々は、ｐ５３がヒトゲノム中に存在する特異的Ｄ
ＮＡ配列に結合するか否かを決定しようと試みてきた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】細胞内の野生型ｐ５３
タンパクの存在を検出する方法を提供することが本発明
の目的である。
【０００７】細胞に対して野生型ｐ５３タンパクの生理
学的影響を与える方法を提供することが、本発明のまた
一つの目的である。
【０００８】ｐ５３−特異的ＤＮＡ結合部位を含む二重
鎖ＤＮＡ断片を提供することが、本発明のまた一つの目
的である。
【０００９】ｐ５３−特異的ＤＮＡ結合部位と特異的に
複合可能な、一本鎖オリゴヌクレオチドあるいはヌクレ
オチド類似体を含むオリゴヌクレオチドを提供すること
が、本発明のまた一つの目的である。
【００１０】ｐ５３−特異的ＤＮＡ結合配列に特異的に
結合する混合物を同定する方法を提供することが、本発
明のさらにもう一つの目的である。
【００１１】変異型ｐ５３タンパクが特異的ＤＮＡ結合
配列への結合能を回復させる混合物を同定する方法を提
供することが、本発明のさらにもう一つの目的である。
【００１２】本発明のこれらやその他の目的は、下記の
態様のうちの一つあるいは複数のものによって提供され
る。一つの態様において、細胞における野生型ｐ５３タ
ンパクの存在を検出するために、ｐ５３−特異的結合Ｄ
ＮＡをヒト組織から得た細胞破砕液と接触させて細胞破
砕液中に存在する野生型ｐ５３にＤＮＡ断片を結合させ
ること、及びｐ５３特異的結合ＤＮＡ断片の野生型ｐ５
３への結合の検出というステップからなる方法が提供さ
れる。
【００１３】本発明のもう一つの態様において、細胞に
野生型ｐ５３タンパクの生理学的影響を与えるために、
ｐ５３−特異的結合部位と特異的に複合することが可能
な混合物を細胞に与えるというステップからなる方法が
開示される。
【００１４】また一つの態様において、ｐ５３−特異的
ＤＮＡ結合部位からなる二重鎖ＤＮＡ断片が提供される
（この態様では、断片は５’−ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ−
３’という配列のモノマーの２回以上の反復からなり、
断片は、不溶性のポリマー支持体に共有結合で付着して
いる。）。
【００１５】本発明のもう一つの態様において、ｐ５３
−特異的ＤＮＡ結合部位（該結合部位は５’−ＲＲＲＣ
ＷＷＧＹＹＹ−３’という配列のモノマー２つ以上から
なる）と特異的に複合可能な、天然のヌクレオチド及び
／あるいはヌクレオチド類似体を含む一本鎖オリゴヌク
レオチドが提供される。
【００１６】本発明のまた一つの態様において、ｐ５３
−特異的ＤＮＡ結合配列と特異的に結合する混合物を同
定するために、固相支持体に固定したｐ５３−特異的結
合ＤＮＡ断片を検定化合物と接触させて検定化合物をＤ
ＮＡ断片に結合させること、及びＤＮＡ断片に結合した
検定混合物の量を決定するというステップからなる方法
が提供される。
【００１７】本発明のもう一つの態様においても、ｐ５
３−特異的ＤＮＡ結合配列と特異的に結合する化合物を
同定するために、固相支持体に固定したｐ５３−特異的
結合ＤＮＡ断片を検定化合物及び野生型ｐ５３タンパク
の双方と接触させて野生型ｐ５３タンパクをＤＮＡ断片
に結合させること、ＤＮＡ断片に結合した野生型ｐ５３
タンパクの量の決定、ｐ５３−特異的ＤＮＡ結合配列へ
の検定化合物の結合を示唆する、検定化合物による野生
型ｐ５３タンパクの結合阻害というステップからなる方
法が提供される。
【００１８】さらにもう一つの態様において、患者の癌
細胞で発見された変異遺伝子にコードされているｐ５３
タンパクの、ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹという配列のモノマ
ー２つ以上からなるＤＮＡ分子に対する結合量の測定、
検定物質存在下における該ＤＮＡ分子に対する該ｐ５３
タンパクの結合量の測定、及び該検定物質存在下におけ
るｐ５３タンパク結合量の該検定物質非存在下における
ｐ５３タンパク結合量に対する比較からなる、結合量を
上昇させる検定混合物が癌治療用の候補となっている癌
治療用薬剤の前審査法が提供される。
【００１９】本発明のもう一つの態様において、癌治療
用薬剤を前審査するために、検定物質にトランスフェク
トした細胞（このトランスフェクトした細胞は、患者の
癌細胞で発見された変異遺伝子にコードされているｐ５
３タンパク、及びアッセイ可能な産物をコードするレポ
ーター遺伝子と、ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹというモノマー
を２つ以上持つｐ５３共通結合部位に一致する配列から
なり、該配列が該レポーター遺伝子の上流かつ近傍に位
置するレポーター遺伝子構築を含む）を接触させること
及び該レポーター遺伝子の発現量が検定物質によって変
化するか否かを決定することからなる、該レポーター遺
伝子の発現量を変化させる検定物質を癌治療用の候補と
する方法が提供される。
【００２０】さらにもう一つの態様において、ＲＮＡポ
リメラーゼとリボヌクレオチドを転写構築物に添加する
こと（ここで示す転写構築物は、アッセイ可能な産物を
コードするレポーター遺伝子と、ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ
というモノマーを２つ以上持つｐ５３共通結合部位に一
致する配列からなる、該配列が該レポーター遺伝子の上
流かつ近傍に位置するレポーター遺伝子構築であり、添
加過程は検定物質の存在及び非存在下において行われ
る。）、及び該レポーター遺伝子の転写量が該検定物質
の存在によって変化するか否かを決定することからな
る、該レポーター遺伝子の転写量を変化させる検定物質
を癌治療用の候補としている癌治療用薬剤の前審査法が
提供される。
【００２１】さらにまた一つの態様において、アッセイ
可能な産物をコードするレポーター遺伝子と、ＲＲＲＣ
ＷＷＧＹＹＹというモノマーを２つ以上持つｐ５３共通
結合部位に一致し該レポーター遺伝子の上流かつ近傍に
位置する配列からなるＤＮＡ構築物が提供される（この
態様では、該ＤＮＡ構築物は、組換えプラスミド、ウィ
ルスベクターあるいは単離したＤＮＡ分子によって構成
されているグループより選択している。）。
【００２２】本発明のもう一つの態様において、ヒトパ
ピローマウィルス（ＨＰＶ）の腫瘍誘発株あるいは過形
成誘発株を診断するために、ＨＰＶに感染している疑い
のある患者の細胞あるいは細胞抽出液をｐ５３−特異的
ＤＮＡ断片と接触させること、及び該細胞及び細胞抽出
液中の該ＤＮＡ断片に結合する野生型ｐ５３の量を検出
することからなる、結合するｐ５３が存在しないことが
ｐ５３を不活化するＨＰＶ株に感染していることを示す
方法を提供される。
【００２３】本発明のこれら及びその他の態様は、ヒト
の癌で同定されている最も一般的に変異している遺伝子
の機能の欠失を検出し、治療するための新たな手段を含
む技術を提供する。
【００２４】
【課題を解決するための手段】野生型ｐ５３タンパクが
ヒト染色体ＤＮＡの特定断片に結合するということは、
本発明の発見である。断片はいずれも０から１３ｂｐで
分断された二重鎖モチーフ５’−ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ
−３’というモノマーを２つ以上含んでいる。これらの
配列のうちいくつかは、ある動物ウィルスや動物細胞の
複製開始点の近傍で見いだされている。Jelinek et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, vol. 77, pp. 1398-1
402(1980)参照。ヒトの腫瘍で一般的に発見される４種
の変異型ｐ５３タンパクは、これらの配列に対する結合
能を持たない。従って、ｐ５３の機能は、そのヒトゲノ
ム中の特定のＤＮＡ配列に結合する能力によって成り立
つ可能性がある。
【００２５】野生型ｐ５３タンパクは特異的にあるＤＮ
Ａ配列に結合する。既に単離されていたＤＮＡ断片（本
明細書中では断片Ａ及び断片Ｂと呼ぶ）について、結合
に必要に見受けられる残基がどこに含まれるかが同定さ
れていた。これらの残基は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の
塩基１０３−１３４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の塩基
１０４−１９８を含むＤＮＡ部分内に位置している。
【００２６】断片Ａはリボソーム遺伝子クラスターの推
定複製開始点の近傍の配列を含み、一方断片Ｂは、Ｈｅ
ｌａ細胞において近傍の配列を染色体外の環として複製
可能にするような配列を含んでいる（Sylvester, et a
l., Gene 84, 193, 1989)。これらの断片両方のＤＮＡ
結合領域に存在しているＴＧＣＣＴリピートは、他の複
製開始点と思われるところでも観察されていた。従っ
て、ｐ５３は、結合することによってＤＮＡ合成の開始
を制御に関与している可能性がある。
【００２７】ｐ５３は、同様の配列モチーフを持つヒト
ゲノム中の他の配列にも特異的に結合するであろうこと
が予測されていた。免疫沈降法を”全ゲノムＰＣＲ”
（Kinzler, et al., Nucleic Acids Research, 17:3645
-3653(1989)）と組み合わせる方法を利用し、１９種の
ｐ５３に結合するヒトＤＮＡ断片を同定した。断片はい
ずれも０から１３ｂｐで分断された二重鎖モチーフ５’
−ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ−３’のダイマーと一致する配
列を含んでいる。ＤＮａｓｅＩプロテクション及びメチ
ル化アッセイによる判定によると、これらのダイマーが
直接結合を媒介している。共通ダイマーは、任意の方向
を向いている４つの５’−ＲＲＲＣＷ−３’ユニットを
持ち、驚くべき対称性を有している。１０ｂｐの共通配
列を含む合成モノマーは結合には不十分であり、一方２
つ以上のモノマーの組み合わせは、ｗｔｐ５３には強く
結合するが、変異型ｐ５３にはほとんど結合しない。つ
まり、２つ以上のモノマーが結合に必要な様である。モ
ノマー間の距離は０から４０塩基まで可能だが、単離さ
れている天然の結合部位では全て１５塩基未満の間隔で
ある。共通ダイマー内の４つの”半部位”による対称性
から、ｐ５３はＤＮＡに四量体として相互作用すること
が示唆されている。図１０に示した１８個の独立なクロ
ーンを用いて、ｐ５３によって制御され、その増殖抑制
効果を媒介する可能性のある近傍の遺伝子を同定するこ
とが可能である。
【００２８】共通配列と一致する配列は完全なダイマー
の配列である必要はない。図１０に示されているよう
に、ｐ５３結合配列が、定められた配列と異なる塩基を
持つ場合も有り得る。ダイマー内に挿入された余分の塩
基が存在することもある。ダイマーから塩基が抜けてい
る場合もある。典型的には、ｐ５３結合配列は、位置に
してわずかに５塩基ほど共通配列から変化しているので
あろう。
【００２９】野生型ｐ５３が特異的結合部位近傍の遺伝
子の発現を活性化できるということは、この発明のさら
なる発見である。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏトランス活性
化レベルがｉｎ ｖｉｔｒｏのＤＮＡ結合力に比例して
いる。癌遺伝子ｐ５３遺伝子（すなわち、ヒトの患者の
癌細胞で発見された遺伝子）にコードされている変異型
ｐ５３は、トランス活性能を完全に欠いている。変異型
ｐ５３タンパクは優性−不活効果を及ぼすことに加え
て、野生型ｐ５３のトランス活性化能を劇的に減少させ
る。
【００３０】ｐ５３特異的ＤＮＡ結合断片の配列情報に
基づいて、多くの診断及び治療法が考案されている。こ
のような方法の一つに従い、特異的ＤＮＡ結合能による
野生型ｐ５３が存在・非存在について、細胞破砕液をテ
ストした。様々な癌及び癌の段階において、腫瘍組織で
はｐ５３対立遺伝子の片方もしくは両方が変異型である
ことが知られているので、野生型ｐ５３タンパクが存在
するかどうかを調べることによって、腫瘍と患者という
観点から見ると、診断的及び予知的情報の提供が可能で
ある。テストする細胞は、通常癌の疑いのある組織から
単離される。望ましくは、組織は注意深く調製及び単離
し、新生物組織以外の組織が、新生物組織に混じって、
解析が混乱するようなことのないようにする。新生物組
織を、新生物以外の組織から分離する方法は、当分野で
は既知であり、フローサイトメトリーの利用と同様に、
パラフィンによる切開あるいは凍結切片作成を含む。細
胞破砕液は、腫瘍組織から、当分野で知られているいず
れの方法かに従って調製可能である。そこで、細胞破砕
液を、野生型ｐ５３タンパクと結合することが知られて
いるＤＮＡ断片と、このようなＤＮＡ／タンパクの相互
作用が起こりやすい条件下でインキュベートする。別の
方法として、細胞破砕液について記述したのと同様にし
て、組織学的試料をＤＮＡとインキュベーションするこ
とによって解析することができる。
【００３１】ｐ５３はＤＮＡに非特異的にも結合するこ
とがわかっている。当分野で知られている方法によっ
て、特異的な結合を非特異的な結合から識別することが
できる。例えば、特異的結合による相互作用は、非特異
的結合による相互作用より強力である。従って、特異的
な結合反応が優先的に検出されるように、インキュベー
ション混合液をタンパク／ＤＮＡ相互作用を不安定化す
るような試薬あるいは条件のどれかにさらすこともでき
る。別の方法としては、以下でさらに特定して紹介する
ように、非特異的な競合物（例えばｄＩ−ｄＣ）をイン
キュベーション混合液に添加することが可能である。特
異的結合部位を含むＤＮＡが標識され、競合物が標識さ
れていない場合、特異的結合反応は標識されたＤＮＡを
測定する際に、主に検出される反応であると予測され
る。
【００３２】本発明の一つの態様に従って、ｐ５３に結
合するＤＮＡを、結合しないＤＮＡから、ｐ５３特異的
抗体による免疫沈降法により分離した。２種の異なるモ
ノクローナルｐ５３抗体を使用する場合、それぞれ単独
に用いた場合より完全な免疫沈降を生じることができ
る。免疫沈降物中のＤＮＡ量は、当分野で知られている
いずれの方法によっても定量可能である。本発明の様相
に従い、ＤＮＡ断片を検出可能な物質（例えば、放射性
物質、比色物質あるいは蛍光物質のような）で標識す
る。このようなＤＮＡ標識技術は、当分野ではよく知ら
れている。本発明のもう一つの態様に従って、本発明の
特異的ＤＮＡ配列に結合したｐ５３をゲルシフトアッセ
イ（Tan, Cell, 62:367, 1990)、ヌクレアーゼプロテク
ションアッセイ（実施例９参照、以下）、あるいはメチ
ラーゼ阻害アッセイ（実施例９参照、以下）によって検
出することができる。
【００３３】本発明のもう一つの態様に従い、ｐ５３を
特異的結合ＤＮＡ断片とインキュベーションした後、Ｄ
ＮＡ断片と結合しない細胞破砕液の構成成分を全て除去
した。これは、他の方法では、不溶性の重合性支持体
（例えばアガロース、セルロースやその類似体）に付着
させたＤＮＡ断片を用いて行うことができる。結合後、
ｐ５３をＤＮＡ／固相支持体に結合させたまま、結合し
ていない構成成分を洗い流すことができる。ｐ５３は当
分野で知られているいずれの方法によっても定量するこ
とができる。それはＥＬＩＳＡ、ＲＩＡあるいはウェス
タンブロッティングといった、免疫学的アッセイを使用
して決定することができる。
【００３４】本発明の診断的アッセイは、ｐ５３変異を
含むことが知られている癌のみならず、ヒトパピローマ
ウィルス（ＨＰＶ）のようなヒトのウィルスにも応用可
能である。ＨＰＶタンパクＥ６は野生型ｐ５３には強く
結合するが、変異型ｐ５３には結合しない。Werness et
al., Science, 248, 76-69(1990)参照。この強力な結
合が、ｐ５３の特異的ＤＮＡ結合配列との相互作用を阻
害していると予想されている。潜在的に腫瘍を誘発する
あるいは高度に癌を誘発するＨＰＶあるいは他のウィル
スの株に感染している疑いのある細胞、あるいは細胞抽
出液を調べることによって、感染した細胞を同定するこ
とができる。なぜなら、感染細胞のＥ６タンパクは野生
型ｐ５３の結合能を抑制していると予測され、ｐ５３を
特異的ＤＮＡ結合配列に結合できないようにするからで
ある。このようなアッセイは、細胞抽出液あるいは組織
学的標本に対して行うことができる。
【００３５】本発明に従って、野生型ｐ５３の機能を、
変異型ｐ５３対立遺伝子を持つ細胞に供給する方法も提
供される。野生型ｐ５３遺伝子あるいは遺伝子の一部
を、細胞に、遺伝子が染色体の外に保持されるようにベ
クターに入れて導入することができる。このような状態
では、遺伝子は、細胞によって染色体の外の位置から発
現されると予測される。細胞内に存在する変異型ｐ５３
遺伝子が発現される場合、野生型ｐ５３遺伝子あるいは
遺伝子の一部が変異型遺伝子より高いレベルで発現され
なければならない。これは、変異型タンパクが野生型タ
ンパクとオリゴマーを形成すると考えられているためで
ある（Eliyahu et al., Oncogene, vol. 3, p. 313, 19
88.）。変異型ｐ５３対立遺伝子を持つ細胞に遺伝子の
一部を導入し発現する場合、遺伝子の一部は、細胞の非
新生物性増殖に必要なｐ５３タンパクの一部をコードし
なければならない。より望ましいのは、変異細胞に、野
生型ｐ５３遺伝子あるいはその一部が細胞に存在してい
る内在性野生型ｐ５３遺伝子と組替わるようにこれらを
導入されるような状況である。このような組み替えは、
ｐ５３遺伝子変異を矯正するであろう２重の組み替えを
必要とすると予測される。組み替えおよび染色体外での
維持の両方のための遺伝子導入用ベクターが当分野では
知られており、適切なベクターであればいずれでも使用
可能である。
【００３６】ｐ５３活性をもつポリペプチドあるいは他
の分子は、変異型ｐ５３対立遺伝子をもつ細胞に供給可
能である。活性のある分子を細胞内に、例えばマイクロ
インジェクションあるいはリポソームによって導入する
ことができる。別の方法として、このような活性分子の
いくつかは、細胞によって積極的にあるいは拡散によっ
て取り入れられることが可能である。このような活性分
子の供給は新生物（腫瘍）の活動を抑える効果を果たす
と予測される。
【００３７】本発明に従うと、ｐ５３活性のある化合物
とは、ｐ５３特異的ＤＮＡ結合配列と特異的に複合体を
形成するものである。野生型ｐ５３はこのような化合物
のひとつであるが、ｐ５３特異的結合部位への結合能を
保持しているｐ５３の一部もまた利用可能である。オリ
ゴヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むオリゴ
ヌクレオチドもまた、ｐ５３特異的ＤＮＡ結合部位と複
合できるそのような化合物に入ると考えられている。出
願者は、特定の理論のいずれにもしばられることは望ん
でいないが、オリゴヌクレオチドは二重鎖ＤＮＡと結合
して三重鎖を形成すると信じられていれる。このような
三重鎖は、ＤＮＡメチラーゼのような酵素の働きからＤ
ＮＡ結合部位を守るのと同様に、ある特定の遺伝子の転
写を阻害することが示されている。もとはこのようなオ
リゴヌクレオチドはピリミジン（シトシンおよびチミ
ン）のみあるいは、主にピリミジンを必要とすると考え
られていたが、プリンも三重鎖を形成するオリゴヌクレ
オチドに取り入れられることができている。使用可能な
特定のオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
の塩基１４０−１６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基
１２８−１５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の塩基１１４
−１２３、あるいはこれらのうちの少なくとも１０ヌク
レオチドを持つ一部を含む。
【００３８】ヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオ
チドあるいはその他の修飾を受けているオリゴヌクレオ
チドもまた、二重鎖ＤＮＡとも複合体の形成に有用であ
る。例えば、３’末端のある修飾は、オリゴヌクレオチ
ドのヌクレアーゼによる分解を受け難くするために施す
ことができる。３’−あるいは５’−末端に付加するこ
とができる物質は、置換あるいは非置換アミノ基、ポリ
エチレングリコール、ポリリシン、アクリジン、ドデカ
ノール、及びコレステロールを含む。利用可能なオリゴ
ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むオリゴヌ
クレオチドは、メチルホスホネート、アミノメチルホス
ホネート、ホスホロチオネート、ホスホロジチオネー
ト、置換あるいは非置換ホスホラミド、オリゴリボヌク
レオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、アルファ
−オリゴヌクレオチド及びこれらの混合物を含む。細胞
あるいは核によるオリゴヌクレオチドの取り込みを上昇
する、あるいはヌクレアーゼ感受性を減少するのにオリ
ゴヌクレオチドのその他の修飾が望ましいことがある。
このような修飾はすべて、本発明の計画の範囲内にあ
る。
【００３９】スウィッチバックリンカーもまた、オリゴ
ヌクレオチドとその類縁体の中に取り入れることができ
る。このようなリンカーは、Riordan and Martin(Natur
e, 350, 452,1991)によって紹介された。それらは分子
模型によって、二重鎖ＤＮＡ分子の異なる鎖と相互作用
するように、オリゴヌクレオチドの一部に適当な間隔を
供給するように設計されている。このようなリンカーを
持つオリゴヌクレオチドの例として以下のようなものが
挙げられる：ＴＴＧＣＣＴＴＧＣＣＴ−スウィッチバッ
クリンカー−ＣＣＴ−スウィッチバックリンカー−ＣＴ
ＴＧＣＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に相当する二重鎖
配列の塩基１０５−１２５に対応する）あるいはその一
部。
【００４０】ヌクレオチド類似体を含む、一本鎖、線状
あるいは環状オリゴヌクレオチドで、上記のｐ５３特異
的結合部位の全体あるいは一部と特異的に複合すること
ができるものもまた、本発明の一部として計画している
（環状オリゴヌクレオチドに関してはKool, J. Am. Che
m. Soc., vol. 113:625-626, 1991,参照）。ヌクレオチ
ド類似体を含むこのようなオリゴヌクレオチドは、ヒト
のゲノム全体に対して必要な特異性を持つためには、少
なくとも約長さ１０ヌクレオチドから構成されていなけ
ればならない。ｐ５３結合部位の一部と同様にその近傍
の配列とも複合する、オリゴヌクレオチドあるいはヌク
レオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドもまた、本発
明の一部として計画している。オリゴヌクレオチドある
いはヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドはｐ
５３結合領域に好んで結合すると予測される。しかしな
がら、また、本発明のオリゴヌクレオチドあるいは類縁
体に適した標的となるような、ヒトゲノム中のほかの結
合領域が発見される可能性がある。これら他の結合部位
はｐ５３の重要な標的であってもおかしくないので、こ
れらの部位を複合化することで癌腫瘍細胞の特徴である
制御を逸脱した増殖が阻害される可能性がある。
【００４１】ｐ５３特異的ＤＮＡ結合配列からなり、不
溶性の重合支持体に付着させてある二重鎖ＤＮＡ断片も
また本発明によって考案されている。支持体は、アガロ
ース、セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン及
びその類縁体が使用可能である。このような支持断片
は、ｐ５３−特異的ＤＮＡ結合部位に結合する化合物を
同定するスクリーニングに使用可能である。同様に、こ
のような支持断片は、腫瘍の疑いのある組織から調製し
た細胞破砕液に対して検査を行う目的で使用可能であ
る。これらは、以下に記述するような、化学療法薬剤と
なり得る薬剤をスクリーニングするためのアッセイにも
使用可能である。
【００４２】本発明のｐ５３特異的ＤＮＡ結合配列を利
用する方法であればいかなる方法でも行えるが、特に２
つの方法がｐ５３特異的ＤＮＡ結合部位に結合するさら
なる化合物のスクリーニングついて開示されている。一
つの方法に従って、上述のように、検定化合物を支持Ｄ
ＮＡ断片とインキュベートした。支持ＤＮＡ断片に結合
した検定化合物の量を決定する。この決定は、便利な方
法のいずれのよっても行うことができる。例えば、支持
断片とインキュベーションした後に取り除くことのでき
たＤＮＡの量を、はじめにのせた量と比較することがで
きる。別の方法としては、検定化合物を標識して、支持
断片に結合した量を直接アッセイすることができる。こ
のスクリーニング法をより特異的にするために、ｐ５３
ＤＮＡ結合配列を含まない可溶性ＤＮＡ断片をインキュ
ベーション混合液に添加することができる。可溶性断片
はｐ５３野生型タンパクに特異的に結合する能力を持た
ないはずである。
【００４３】ｐ５３の特異的ＤＮＡ結合能を刺激する化
合物のもう一つのスクリーニング法に従い、上述のよう
に、検定化合物を支持ＤＮＡ断片とインキュベートし
た。しかしながら、この方法では、野生型ｐ５３タンパ
クもインキュベーション混合液に添加した。ＤＮＡ断片
に結合するｐ５３タンパク量は、上述の方法で測定し
た。検定化合物が存在するために生じるｐ５３結合の減
少はいかなるものも、おそらく支持断片の特異的ＤＮＡ
結合部位に対するｐ５３と検定化合物の競争阻害による
ものである。上述のアッセイを利用して、結合部位断片
に検定化合物が直接結合していることを確かめることが
可能である。
【００４４】ｐ５３遺伝子あるいは遺伝子産物が存在す
るか否かもまた、血清、大便、あるいは尿やたんのよう
なその他の体液、といった体試料で検出することができ
る。上述した、組織内に遺伝子産物が存在するか否かに
対する検出と同じ技術を、ほかの体試料に応用すること
が可能である。これらの体試料をスクリーニングするこ
とによって、簡便で迅速な診断を多くのタイプの癌につ
いて行うことができる。さらに、ｐ５３遺伝子あるいは
遺伝子産物がこれらの体試料内に存在するか否かを検定
することにより、化学療法あるいは放射線療法の進歩を
容易に確かめることができる。
【００４５】本発明の新生物性組織の診断および治療の
ための方法は広範囲の腫瘍に応用可能である。これらに
は、肺、胸部、脳、結腸直腸、膀胱、間充織、前立腺、
肝臓及び胃の腫瘍が含まれる。さらに、白血病や骨肉腫
にもこの方法は利用可能である。つまり、ｐ５３遺伝子
は広範囲の腫瘍の進行において役割を持っているようで
ある。本発明の診断及び治療の方法は、腫瘍の進行にｐ
５３が役割を果たしていればどのような腫瘍に対しても
応用可能である。本発明の診断方法は、臨床医にとって
適切な処置法を決定することができるため非常に有用で
ある。例えば、ｐ５３対立遺伝子が両方とも欠失してい
ることが示されている腫瘍は、ｐ５３対立遺伝子が片方
のみ欠失していることが示されている腫瘍と比較してよ
り厳しい治療法を要求する。
【００４６】ｐ５３特異的ＤＮＡ結合能を持つ化合物
は、野生型ｐ５３タンパク、野生型ｐ５３の一部に対応
するポリペプチド、オリゴヌクレオチドとヌクレオチド
類似体を含むオリゴヌクレオチド、を他の有機分子と同
様に含むが、これらは、医薬的及び治療的組成物とし
て、ひと及び動物にもまた投与可能である。効力のある
量を投与すれば、腫瘍細胞の腫瘍の進行が遅延する、あ
るいは完全に腫瘍細胞の増殖が停止する効果が出るであ
ろう。通常、人間あるいは他の動物１個体当たり、量は
１０ｎｇから１０μｇの範囲であるだろう。治療用化合
物は、どのような常法的な医薬用希釈剤（例えば、生理
食塩水あるいはその他の生理学的に適合可能な水性緩衝
剤）中にも調製可能である。一般的には、静脈あるいは
筋肉注射によって投与されるであろう。しかし、当分野
で知られている他の投与方法は、本発明の化合物の投与
に用いることができる。
【００４７】図面の簡単な説明 図１Ａ 免疫沈降法を利用したｐ５３が結合する断片のスクリー
ニング。パネル１はhFosAva2クローン、パネル２は７７
２ ＣBE、パネル３はラムダ５Ｒ、パネル４はランダム
にクローン化されたヒトゲノム配列が挿入されているク
ローン集団を含む。７７２ ＣBE及びラムダ ５Ｒは、
比較的強くｐ５３を結合するHinfI断片（それぞれ、２
５９及び１９０ｂｐ）を含む（矢印）。”Ｃ”−対照レ
ーン、結合反応に使用した標識ＤＮＡの２％を含む。”
Ｂ”−免疫沈降物から回収した結合したＤＮＡ。図１
Ｂ：ｐ５３及び特異的抗体依存性テスト。野生型ｐ５３
ｃＤＮＡが挿入されている（＋）あるいは挿入されてい
ない（−）ワクシニアウィルスに感染させて細胞破砕液
を調製した。免疫沈降は、抗−ｐ５３モノクローナル抗
体（＋）あるいは正常マウスIgG（−）を用いて行っ
た。
【００４８】図２ 野生型及び変異型ｐ５３の断片Ａを沈澱させる相対能
力。”Ｃ”−対照レーン、結合反応に使用した標識ＤＮ
Ａの２％を含む。”Ｂ”−免疫沈降物から回収した結合
したＤＮＡ。図２Ａ：バキュロウィルス発現システムか
らアフィニティ精製した野生型及び変異２７３his ｐ
５３の量を増加させて標識したＣBE断片を沈澱するのに
使用した。図２Ｂ：野生型（ｗｔ）、変異型（１７５
his）ｐ５３、あるいはｐ５３タンパクなし（−）を生
産するワクシニア ウィルス システム（Ｖａｃ）から
調製した破砕液を用いて標識したＣBE断片を免疫沈降し
た。ウエスタンブロットによる解析によると同等量のｐ
５３が野生型及び変異型ｐ５３破砕液に含まれてい
た。”Ｂａｃ”レーンでは、ワクシニア感染破砕液のか
わりにバキュロウィルス−感染 昆虫細胞で生産された
アフィニティ精製したｐ５３が使用された。
【００４９】図３Ａ ７７２ ＣBEの１０ｄサブクローンにおける断片Ａ及び
近傍のベクター配列。この配列は、公表されている７７
２ ＣBE配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍ２５７１８）とＣＴ
Ｔ繰り返し（ｂｐ １７３−２２９）の回数及びｂｐ１
１６がＣのかわりにＡになっている点において異なる。
図３Ｂ：ラムダ５Ｒの８ａサブクローンにおける断片Ｂ
及び近傍のベクター配列。ファイル上の関連配列（Ｇｅ
ｎｂａｎｋ Ｘ０５９１３）は研究したラムダ ５Ｒサ
ブクローンと幾分異なる。
【００５０】図４ 断片Ａ及びＢのサブ断片のワクシニアウィルス感染細胞
破砕液より得たｐ５３に対する結合。図４Ａ：断片Ａの
サブ断片（サブクローン１０ｄ）を免疫沈降法により、
ワクシニアウィルス感染細胞破砕液より得た野生型ｐ５
３に対する結合能についてアッセイを行った。反応に加
えたＤＮＡの少なくとも２％が結合した場合、陽性
（＋）結果と評定した。２％以下だが意味のある結合の
場合には”＋／−”と記録した。二重線（＝）は、断片
Ａの配列を示す。一重線（−）は、断片Ａにはもともと
存在していなかったベクターのポリリンカー配列を示す
（図１）。断片５mut１はｂｐ１２０においてＧからＴ
に変換されている。断片５mut２はｂｐ１２０から１２
２においてＧからＴに変換されている。図４Ｂ：図４Ａ
に図示されている断片Ａ（パネル１−４）及び断片Ｂ
（パネル５）サブ断片をバンドの左を標識する。パネル
４の”Ｖ”バンドはサブ断片６をクローン化した２．９
ｋｂのベクターに対応する。サブ断片８（パネル５）は
断片Ｂのｂｐ１０４−２３８（図３Ｂ参照）を含んでい
る。対照レーン（Ｃ）は、結合アッセイ（Ｂ）に使用し
た標識ＤＮＡの２％を含んでいる。
【００５１】図５ 断片Ａにおけるメチル化及び点変異のＤＮＡ結合に与え
る影響。図５Ａ。メチル化阻害アッセイ。”Ｂ”−免疫
沈降物から回収した結合したＤＮＡ。”Ｃ”−結合反応
を受けていない同等量の対照ＤＮＡ断片。結合及び対照
ＤＮＡ試料をメチル化グアニンにおいて切断し、等量ず
つ６％変性ゲルで電気泳動して分離した。点は、メチル
化を受ける部位（白抜きは一部、黒は強い阻害）を表し
ている。アッセイごとによってバンドの強さが幾分変化
したので、複数回生じる変化を印す。図５Ｂ。断片Ａ
の”変異型”サブ断片（５ｍｕｔ１及び５ｍｕｔ２）の
精製バキュロウィルス生産ｐ５３に対する結合。断片５
mut１はｂｐ１２０においてＧの代わりにＴを含み、断
片５mut２はｂｐ１２０、１２１及び１２２においてＧ
の代わりにＴを含む。
【００５２】図６ 図６Ａはトランスフェクトされたクローン系統のＲＮas
eプロテクション アッセイを示す。標識したアンチセ
ンスｐ５３プローブを全細胞ＲＮＡにハイブリダイズ
し、ＲＮaseＡで消化した。内在性ＲＮＡは標識プロー
ブにある全ての配列を含んでいた。発現ベクターから生
じる外来ｐ５３ＲＮＡは、プローブの約２／３の長さし
か伸長しなかった。
【００５３】図６Ｂはトランスフェクトされたクローン
系統のサザンブロット解析を示す。外来性ｐ５３遺伝子
は１．８ｋｂＢａｍＨＩ断片上に存在した。内在性ｐ５
３遺伝子は７．８ｋｂＢａｍＨＩ断片を生じた。他の大
きさのバンドは、恐らく組換えによって生じたものであ
る。
【００５４】図７ 図７Ａはプールしたクローンの発現を示す。解析は図６
Ａに記載したとおりである。
【００５５】図７ＢはＳＷ４８０プールのクローンのサ
ザンブロット解析を示す。
【００５６】図８ ｐ５３に結合するヒトゲノム配列の単離 図８Ａ。ｐ５３に結合するヒトゲノムＤＮＡ断片の単離
及び解析の為の実験概略。
【００５７】図８Ｂ。クローン化した断片の免疫沈降
（ＩＰ）アッセイ。増幅及び選択した（ＡＳ）ＤＮＡの
クローンをｐ５３結合断片が存在するかどうかＩＰによ
ってテストした。各クローンについて、結合したＤＮＡ
を、結合アッセイに使用した全末端標識ＤＮＡの２％を
含む対照レーン（Ｃ）のそばのＢレーンに示す。ここに
示した実験で、６個の独立なゲノム断片を表す８個の結
合断片が同定された。２，３，５，９，１０及び１１と
名付けたレーンのクローンから得た挿入断片は、ｐ５３
結合断片を含んでいたが、一方他のレーンは何も含んで
いなかった。レーン２とレーン５のクローンはそれぞれ
２個の結合断片を含んでいた。
【００５８】図９ ＤＮａｓｅＩプロテクション（ＤＰ）及びメチル化阻害
（ＭＩ）によるｐ５３結合部位のマッピング。各フット
プリントにおいて、１番目と４番目のレーンは、全標識
ＤＮＡの対照試料を含み、一方、中央の２レーンは同等
量のｐ５３結合ＤＮＡを含む。鎖１上のｐ５３−結合領
域に対応するＤＮＡ配列は図１０に示されている。
【００５９】図１０ ｐ５３に対する共通結合部位の決定。フットプリンティ
ング法によって決定された、１８のクローン化されたヒ
トゲノムＤＮＡ断片のｐ５３結合部位は、２つの１０ｂ
ｐ共通モノマーを分ける中央対称軸を揃えて図示されて
いる。大文字で表されている塩基は、共通配列と一致し
ているゲノム配列を示し、一方、小文字は、共通配列と
異なることを示す。共通配列の周囲にあるあるいは２つ
の１０ｂｐモノマーを分離する配列も小文字で表されて
いる。ｐ５３が結合する能力について調べた１０個の合
成オリゴヌクレオチドは、底部に示されている。オリゴ
ヌクレオチドＮｏ．６から１０はプラスミドベクターに
クローニングした後にテストした。小文字はベクター由
来の配列を表している。共通結合部位の２つのモノマー
内を合わせた塩基使用率（％）は中央に示されている。
【００６０】図１１ 合成オリゴヌクレオチドの野生型（ｗｔ）及び変異型ｐ
５３タンパクに対する結合。
【００６１】図１１Ａ。１０ｂｐの共通モノマー一つで
は結合に不十分であったが、１０ｂｐ共通配列の様々な
方向のダイマー、あるいはそれ以上の重合体は、ｐ５３
に強く結合した。各試料について、対照レーン（Ｃ）は
結合反応に用いた全ＤＮＡの２％を含んでおり、２．９
ｋｂベクターＤＮＡ断片、及び挿入部を含まない４０か
ら８０ｂｐの断片（レーン９；ＸｈｏＩとＰｓｔＩで消
化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋）、１０ｂ
ｐ共通モノマー配列５’−ＡＧＧＣＡＴＧＴＣＴ−３’
（レーン５）あるいは示されているように編成されたこ
の配列の重合体（レーン１から４、６から８）の２つの
断片からなっている。ＩＰから結合されたＤＮＡは、Ｂ
レーンに示されている。
【００６２】図１１Ｂ。共通ダイマーに対する野生型及
び変異型ｐ５３の結合能の比較。ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻
訳されたｐ５３タンパクを共通ダイマーに対する結合能
についてＩＰによりテストした。結合に使用した全ＤＮ
Ａの２％をレーン１に示した。レーン７は、バキュロウ
ィルスで生産したヒト野生型ｐ５３タンパクに対する結
合を示している。レーン２から６はｉｎ ｖｉｔｒｏで
翻訳された野生型及び変異型ｐ５３タンパクの結合を示
している。変異型ｐ５３タンパクは、１４３番目のコド
ン（valからala）、１７５番目のコドン（argからhi
s）、２４８番目のコドン（argからtrp）、及び２７３
番目のコドン（argからhis）において変異している。
【００６３】図１２ トランスフェクションに用いたレポーター及び発現構
築。
【００６４】図１２Ａ。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II
ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内のレポータ
ー構築。ＰＧn 、ｐ５３結合配列ＰＧのｎコピーの”コ
ンカテマー”（連結体）。ＭＧn 、ｐ５３を結合しない
変異配列のコンカテマー。ＣＡＴ、クロラムフェニコー
ル アセチルトランスフェラーゼ コード配列。Ｌａｃ
Ｚ、Ｂ−ガラクトシダーゼ コード配列。Ｐｙ、ポリオ
ーマウィルス由来初期遺伝子プロモーター。ＣＹＣ、酵
母チトクロームｃ遺伝子プロモーター。
【００６５】図１２Ｂ。発現ベクター。ＣＭＶ、親ベク
ターｐＣＭＶneoBam由来のサイトメガロウィルスプロモ
ーター。Ｇａｌ、酵母由来ガラクトース誘導プロモータ
ー。
【００６６】図１３ ＤＮＡ結合とトランス活性化の関係が示されている。
【００６７】図１３Ａ。免疫沈降アッセイを用いた、ｐ
５３結合配列の様々な長さのコンカテマー（ＰＧn シリ
ーズ）の相対的ＤＮＡ結合能。クローンを制限酵素で切
断してコンカテマーを切り出し、末端を標識し、バキュ
ロウィルスで生産した精製野生型ヒトｐ５３とインキュ
ベートし、抗ｐ５３及びプロテインＡセファロースと共
に免疫沈降し、結合した断片を回収し、変性ポリアクリ
ルアミドゲルで分離した。Ｃ、対照レーン、結合反応に
用いた標識ＤＮＡの２％を含んでいる。Ｂ、結合反応か
ら回収した結合ＤＮＡ。
【００６８】図１３Ｂ。クロラムフェニコール アセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイによって比較
した各種のＰＧn コンカテマーを含むレポーターのトラ
ンス活性化効率。１．７μｇの発現ベクターｐ５３−ｗ
ｔをＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクトした。レポー
ターは、ＰＧ2−ＣＡＴとＰＧ13−ＣＡＴを除いて（こ
れらは、逆向き（．．．ＡＧＧＣＡ．．．Ｐｙ．．．Ｃ
ＡＴ．．．）を持つ）、ＰＧn 配列を一方向に持
つ（．．．ＴＧＣＣＴ．．．Ｐｙ．．．ＣＡ
Ｔ．．．）。結果は、任意に１００に設定されているレ
ーン７におけるＣＡＴ活性と比較して表されている。
【００６９】図１４ 野生型と変異型ｐ５３の、コンカテマー化した結合配列
（ＰＧ16）に対する結合能の比較とＭＧ15に対する結合
能の欠失が示されている。各型のｐ５３（本質的にKer
n, et al., Oncogene, 6:131-136(1991)記載に従って作
成されたウサギ網状赤血球を用いて調製され、免疫ブロ
ットによってｐ５３量を等量にしてある。データは示さ
ない。）を使用して末端標識したＤＮＡを免疫沈降し
た。Ｃ、対照レーン、結合反応に用いた標識ＤＮＡの２
％を含んでいる。Ｂ、免疫沈降物から回収した結合ＤＮ
Ａ。
【００７０】図１５ プロモーターに対する結合配列の位置の変化の影響を示
している。
【００７１】図１５Ａ。ポリオーマウィルスプロモータ
ーから様々な距離に置かれたＰＧ13を持つレポーター効
率。様々な長さの非結合配列（ＭＧn シリーズ）を使用
して決められた長さの挿入スペーサーを与えた（図８Ａ
参照）。ＣＡＴアッセイを示している。
【００７２】図１５Ｂ。ＣＡＴの下流にＰＧ１６を持つ
（ＣＡＴ−ＰＧ16）レポーターのトランス活性化効率。
１．７μｇの各発現及びレポーター構築物をトランスフ
ェクトした。ＭＧ１５−ＣＡＴをネガティブ対照とし
た。ＣＡＴアッセイを示している。
【００７３】図１６ 野生型及び変異型ｐ５３の相対的転写活性化能を示して
いる。
【００７４】図１６Ａ。代表的ＣＡＴアッセイ（表１の
実験２）。
【００７５】図１６Ｂ。トランスフェクトした細胞にお
けるｐ５３の発現のウェスタンブロット解析。変異型ク
ローンの場合にも、少なくとも野生型ｐ５３と同等量の
発現が得られていることを示している。１４３alaの場
合は、ｐ５３の発現レベル（レーン３）が他の構築物と
比較して、理由は不明であるが、若干低かった。２．５
５μｇのベクターをトランスフェクションに使用した場
合は、しかしながら、ｐ５３−１４３ベクターによる生
産レベル（レーン７）は少なくともｐ５３−ｗｔベクタ
ーと同程度であったが、トランス活性化は観察されなか
った（表１）。
【００７６】図１７ 一緒に発現させた１７５his変異型ｐ５３が、野生型ｐ
５３によるトランス活性化に与える影響を示している。
１．７μｇのＰＧ13−ＣＡＴレポーターを安定量のｐ５
３発現構築物と共に用いた。トランスフェクトしたプラ
スミドの釣り合いは、ｐＣＭＶneoBam（発現用）及びｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（レポーター用）で
合わせて、５．１μｇである。ＣＡＴアッセイを示して
いる。
【００７７】図１８ 様々な変異型ｐ５３タンパクの優性−不活性効果を示し
ている。０．８５μｇのｐ５３−ｗｔを、変異型ｐ５３
構築物を加えない、あるいは０．８５μｇまたは２．５
５μｇ添加する、あるいはさらに２．５５μｇｐ５３−
ｗｔを添加するといった、全てのトランスフェクション
において使用した。どの場合にも１．７μｇＰＧ13−Ｃ
ＡＴレポーターを用いた。示されている複合的な結果
は、異なる日に行われた少なくとも２回以上のトランス
フェクションに相当している。
【００７８】図１９ ｐ５３変異の影響に対する生化学的モデルを図示してい
る。細胞内のｐ５３は、オリゴマーとして存在する。オ
リゴマーのｐ５３はＤＮＡ上の認識配列（斜線の太線）
に結合し、近傍の遺伝子（黒い箱）の転写を活性化す
る。ｐ５３をダイマーで描いたのは、図示する目的のた
めだけである。四量体やそのほかの形でも同様に存在す
る可能性がある。変異型タンパクとヘテロ（異型）オリ
ゴマー化（複合体化）することによって、そこに含まれ
ている野生型ｐ５３分子のトランス活性化機能が不活化
されるため、ミスセンスｐ５３変異の優性−不活化効果
が生じる。残りの野生型ホモ（同型）オリゴマーによっ
て与えられている残されている活性は、残っている野生
型対立遺伝子の欠失（ヒトの新生物（腫瘍、癌）の進行
途中で頻繁に起こるできごとである）によって失われ
る。
【００７９】本発明の発見の結果として、ガンの治療に
使用することができる化学試薬を分離する方法を考案す
ることができる。特に、本試薬は変異ｐ５３分子の構造
に影響し、特異的な結合部位に結合し（あるいは）それ
をトランス活性化する能力を回復させることができるこ
とに対して、スクリーニングすることができる。そのよ
うなスクリーニング法に対する必要な構成物は本発明に
より提供され、ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹなる配列モノマー
を１つ以上と、腫瘍に見いだされる変異ｐ５３タンパク
質1/をふくんでいる。
【００８０】そのような前スクリーニング法の１つが結
合アッセイであり、本コンセンサス結合部位（またはそ
れに一致する配列）を含むＤＮＡ分子に対するｐ５３変
異タンパク質の結合量を計測する。結合量はまた、検定
物質中に存在するｐ５３変異タンパク質に対しても計測
される。その検定物質がｐ５３結合量を増加させれば、
その検定物質は抗腫瘍治療に利用される１つの候補とな
る。ヒトに使用される前にさらに検定が要されるであろ
う。結合量の測定手法は、本分野で知られているものの
いづれでもよい。例、タン（Ｔａｎ）ら，Ｃｅｌｌ，６
２：３６７−３７７（１９９０）を参照。ある特殊な方
法では免疫沈降を使用している。簡単に述べると、精製
したｐ５３またはｐ５３を発現している細胞からのライ
セートを、タンパク質がＤＮＡに結合しうる条件下で放
射性標識したＤＮＡと抗ｐ５３抗体とともにインキュベ
ートする。プロテインＡ−セファロースとｐｏｌｙ−ｄ
ＩｄＣ−ｐｏｌｙ−ｄＩｄＣを加えさらにインキュベー
トする。ペレットを形成させ洗い、タンパク質をプロテ
アーゼで消化することにより取り除き、ＤＮＡをフェノ
ール抽出により得た。抽出したＤＮＡを次に、電気泳動
により解析し、定量した。ＤＮＡの定量は例えば、オー
トラジオグラフィにより行うことができる。免疫沈降し
たＤＮＡの量は、ｐ５３タンパク質のそのＤＮＡへの結
合量に比例する。
【００８１】１／ ｐ５３のすべての変異が特異的なＤ
ＮＡ結合能を壊すわけではない。例えば、ｐ５３のリン
酸化部位における変異が既に作られ検定されているが、
それらは結合活性を保持している。腫瘍ではそのような
変異は見いだされていない。腫瘍で見られるｐ５３の変
異は、ここではガン原性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）と呼ん
でいる。
【００８２】別の方法に従えば、腫瘍からの変異ｐ５３
タンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏで転写をトランスに活性
化することができるかどうかを、検定物質のあるなしに
関わらず評価することができる。検定物質がｐ５３によ
り活性化される転写の量を増加させるならば、その検定
物質は抗腫瘍治療の使用に対して１つの候補となる。転
写の活性化は、クロラムフェニコール アセチルトラン
スフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼなどの、簡便にア
ッセイできる酵素活性をコードしているレポーター遺伝
子と上流のｐ５３コンセンサス結合部位（またはそれに
一致する配列）から成る転写コンストラクトを使って計
測した。その結合部位は、転写開始点からの距離は重大
ではないが、必ず上流になければならない。本結合部位
は、レポーター遺伝子に隣接しているが、０から１ｋｂ
上流にあってもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写アッセ
イ系は本分野ではよく知られたものである。例、ルー
（Ｌｕｅ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，６６１−６６４
（１９８９）を参照。
【００８３】また別の方法によれば、転写の活性化は、
そのすぐ近くの上流にｐ５３のコンセンサスな結合部位
（またはそれに一致する配列）をもった、酵素や抗原な
どのアッセイ可能な産物をコードする遺伝子を含むレポ
ーター遺伝子コンストラクトでトランスフェクトした変
異ｐ５３タンパク質を含む細胞において計測することが
できる。トランスフェクトした細胞を検定物質で処理す
る。変異ｐ５３によって起こるトランスな活性化の量が
その検定物質により高められるならば、恐らく変異タン
パク質との相互作用によりその物質は抗腫瘍治療の１つ
の候補になる。特別なトランス活性化アッセイ（一過性
発現アッセイ）が下記の実施例１２に記載されている。
特別なレポーターコンストラクトを図１２Ａに示す。本
発明の範囲内で他のものを使用することもできる。ま
た、トランスフェクトした細胞が野生型ｐ５３を含んで
いるならば、消失した活性化は、本検定物質が結合部位
に対してｐ５３と競合することを示していると考えられ
る。本発明の別の具象では、変異ｐ５３タンパク質に対
して本コンセンサス結合部位またはそれに一致する配列
に結合する能力を快復するオリゴヌクレオチドを単離す
ることができる。ｐ５３特異的な結合ＤＮＡ断片を不動
化した固相支持体に、変異ｐ５３タンパク質とランダム
なオリゴヌクレオチドを加えた。固相支持体に結合した
オリゴヌクレオチドを回収し解析した。固相支持体への
結合が変異ｐ５３の存在に依存するものは、変異タンパ
ク質に結合しそのコンフォメーションを回復することに
より本支持体に結合しているものと考えられる。
【００８４】一過性発現コンストラクトはプラスミドや
ウイルスベクター上に簡便に作製されるので、増やすこ
とが可能である。これらはまたｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮ
Ａポリメラーゼ、リボヌクレオチド、および他の共因子
の存在下での転写アッセイにも使用することができる。
【００８５】
【実施例】実施例１ 本実施例はｐ５３特異的な結合部位を同定するために使
用するスクリーニング法を示すものである。
【００８６】塩基配列特異的な可能性の高い結合部位を
同定しようと、多数のクローン化したＤＮＡ配列を免疫
沈降法を用いてスクリーニングした。ＤＮＡ結合性に対
する免疫沈降アッセイはＲ．Ｄ．Ｇ．マッケイ（Ｍａｃ
Ｋａｙ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４５，７４１（１
９８１）から改変した。結合反応は、ワクシニア感染さ
せた細胞ライセートから精製したバキュロウイルスｐ５
３調製物を５μｌと、結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ７．２，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１０％グリ
セロール，１％ ＮＰ−４０，５ｍＭ ＥＤＴＡ）を９
５μｌ，６−２０×１０4ｄｐｍ 32Ｐ標識したＤＮ
Ａ，４μｌ（０．４μｇ）のｐＡｂ４２１，４μｌ
（０．４μｇ）のｐＡｂ１８０１ 抗ｐ５３精製済モノ
クローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
を４℃、３０分で行われた。１．５ｍｇプロテインＡ−
セファロース（Ｓｉｇｍａ），１２．５μｇポリｄＩｄ
Ｃ−ポリｄＩｄＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）／２５μｌ結
合バッファー溶液を加え、反応液を４℃で３０分間エン
ド−オーバー−エンドで回転させた。ペレットを結合バ
ッファーで２回洗い、タンパク質をＳＤＳ−プロテイナ
ーゼＫで分解し、次いでフェノールとクロロホルムで抽
出した。そのＤＮＡをエタノール沈殿し、電気泳動サン
プルバッファーに溶かした。その断片をトリス−ホウ酸
非変性ポリアクリルアミド（７，１０または１２％）
ゲル上で分離した。そのゲルを固定し、乾燥させてオー
トラジオグラフィにかけた。
【００８７】４０Ｋプロモーターからｐ５３を発現する
組み換えワクシニアウイルスを、Ｊ．リヨンズ（Ｌｙｏ
ｎｓ）ら，Ｉｎｆｅｃ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ．５８，４
０８９（１９９０）に記載されたようにして単離、精製
した。
【００８８】ワクシニア感染させた細胞ライセートを以
下のようにして調製した：指示された細胞（約２．５×
１０7）を感染させ（ＭＯＩ ２）、２４時間後に回収
し、２ｍｌのリシスバッファー（５ｍＭ ＥＤＴＡ，
０．５％ ＮＰ−４０，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ，１０μ
ｇ／ｍｌ ＴＰＣＫ，１μｇ／ｍｌ アプロチニン，１
０μｇ／ｍｌ トリプシンインヒビター，１１μｇ／ｍ
ｌ ロイペプチンを含むＰＢＳ）中で溶解させた。細胞
の残骸を１６，０００×ｇで落とし、その上清をＵＶ照
射（０．５ジュール）した。上清はアリコットで−８０
℃で凍らせた（最低６ケ月は安定であることが見出ださ
れた）。
【００８９】バキュロウイルスにより産生されたｐ５３
をＰ．Ｎ．フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）ら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，９
２７５（１９９０）に記載されたようにして精製した。
精製した調製物内に付随するコファクターの存在は排除
できないが、本調製物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動では銀染色で５３ｋＤの位置に移動する単一の
ポリペプチドしか見られなかった。
【００９０】２つのクラスのクローンを検定した。第１
のクラスは、ヒトゲノムからランダムに得られた３００
から１０００塩基対のインサートを含む４００クローン
から成る。第２のクラスは、正常な増殖制御に重要と考
えられる配列を含むことを理由に選択されたコスミドお
よびプラスミドクローンから成る。ランダムヒトゲノム
クローンはヒトＤＮＡをＭｂｏＩで部分消化することに
よって調製された。部分消化後、３００−１０００ｂｐ
の断片を精製しＥｃｏＲＩリンカーに連結した後、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃ
ｏＲＩ部位にクローン化した。正常な増殖に重要と思わ
れることから選択されたクローンは、以下のものを含ん
でいた。Ｔ．キュラン（Ｃｕｒｒａｎ）より得たＳＰ６
５ｈＦｏｓＡｖａ２（ｆｏｓ遺伝子の制御配列を含んで
いる）；７７２ＣBE（Ｊ．Ｅ．Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，
Ｒ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ｄ．Ｓｃｈｍｅｎｃｋｅ
ｌ，Ｇｅｎｅ，８４，１９３（１９８９））はＪ．シル
ベスター（Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ）から；ラムダ（Ｌａｍ
ｂｄａ）５Ｒの４．４ｋｂ Ｂｇｌ サブクローンは
Ｃ．シュミット（Ｓｃｈｍｉｄ）から；ｃ−ｍｙｃクロ
ーンはＪ．ＢｉｓｈｏｐからのＨＳＲ−１（Ｋ．Ａｌｉ
ｔａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８０，１７０７（１９８３））であった。ｐ５
３の完全なゲノム領域を含むコスミドはＹ．ナカムラ
（Ｎａｋａｍｕｒａ）から；ハムスター細胞からのＤＨ
ＦＲアンプリコン全体を含むコスミド（Ｂ．Ａｎａｃｈ
ｋａｖａ＆Ｊ．Ｌ．Ｈａｍｌｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．９，５３２（１９８９））はＪ．ハムリンか
らのものであった。
【００９１】各クローンを適当な制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、32Ｐで末端標識し、組み換えワクシニアウ
イルスを感染させｐ５３タンパク質を発現する細胞のラ
イセートからのｐ５３タンパク質とともにインキュベー
トした。それから、ｐ５３に結合した標識したＤＮＡ断
片をｐ５３に対するモノクローナル抗体で免疫沈降する
ことにより回収した。１４００以上の制限断片から、２
つのみが用いた実験条件下で再現性よくｐ５３と結合し
た：クローン７７２ＣBEの２５９塩基対ＨｉｎｆＩ断片
（フラグメントＡ）（パネル２，図１Ａ）とクローン
ラムダ５Ｒの１９０塩基対ＨｉｎｆＩ断片（フラグメン
トＢ）（パネル３，図１Ａ）；これらのフラグメント
は、同じアッセイ混合物中に存在する他のより大きいま
たはより小さいサイズの標識したフラグメントより遥か
に高い程度で結合した。
【００９２】実施例２ 本実施例はフラグメントＡの免疫沈降がｐ５３タンパク
質と抗ｐ５３抗体の両方に依存することを示すものであ
る。
【００９３】本免疫沈降アッセイは実施例１に記載する
ようにしてフラグメントＡに対して行われた。細胞ライ
セートは野生型ｐ５３ＤＮＡのインサートを含む、ある
いは含まないワクシニアウイルスでの感染により作られ
た。使用した抗体は抗ｐ５３抗体か正常なマウスＩｇＧ
であった。
【００９４】野生型ワクシニアウイルスで感染させた細
胞からのライセート（ｐ５３を欠く）はフラグメントＡ
を特異的に免疫沈降することができなかった（図１
Ｂ）。同様に、フラグメントＡの沈殿の検出は抗ｐ５３
抗体の存在に依存していた（図１Ｂ）。結合性は、ワク
シニアウイルスで感染させ野生型ｐ５３を発現するヒト
ＨｅＬａ細胞またはサルＢＳＣ４０細胞から調製したラ
イセートにおいて明白であった（図１Ｂ）。
【００９５】免疫沈降アッセイにおいて、アフィニティ
精製したバキュロウイルス製の野生型ｐ５３タンパク質
をワクシニア感染させた細胞ライセートの代わりに使用
したところフラグメントＡと強く結合することが見出だ
された（図２Ａ）。このことは、フラグメントＡに対す
る結合がｐ５３ポリペプチドに固有の性質でありワクシ
ニア感染させた細胞ライセートに存在する他の因子に依
存するものではないことを示唆するものである。
【００９６】実施例３ 本実施例は、ヒトの腫瘍に見出だされる変異ｐ５３タン
パク質がフラグメントＡに結合できないことを示すもの
である。
【００９７】バキュロウイルス発現系からアフィニティ
精製した野生型および変異２７３hi s ｐ５３タンパク
質を、量を増加させながら、ＣBEからの標識したフラグ
メントの免疫沈降に使用した。（図２Ａを参照）野生型
ｐ５３タンパク質に結合するフラグメントＡの割合はア
ッセイ混合物に加えたｐ５３の量に連繋して増加した。
（図２Ａ）反対に、用いた最高のｐ５３タンパク質濃度
でもフラグメントＡは変異型ｐ５３（２７３his）タン
パク質に特異的には結合しなかった。２７３hi s変異は
ヒトの腫瘍で同定された最もよく見られるｐ５３変異で
ある。ヒトの腫瘍でよく見出だされる別のｐ５３変異
（１７５his）もまたフラグメントＡに結合しなかった
（図１Ｂ）。
【００９８】実施例４ 本実施例はフラグメントＡ内の野生型ｐ５３タンパク質
に特に結合し得る配列を決定するものである。
【００９９】フラグメントＡをサブクローニングし、そ
のサブクローンからの２５９ｂｐのインサート（１０
ｄ，ＳＥＱ ＩＤ：１および図３Ａ）が予想通りにｐ５
３に結合した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と制限
エンドヌクレアーゼ消化に基づくストラテジーを本クロ
ーンのサブフラグメントの作製に使用した。
【０１００】各ＰＣＲの一方のプライマーを５μｌ反応
液中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５´端に
標識をいれ、キナーゼは７０℃、５分で失活させた。Ｐ
ＣＲは５０μｌ反応液中に適当なプライマーを各々３５
０ｎｇと約５０ｎｇのプラスミドのテンプレートを含
み、ベーカー（Ｂａｋｅｒ）ＳＪら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．，５０：７７１７（１９９０）に明細されたＰＣ
Ｒ条件を２５サイクル使用した。その産物をフェノール
とクロロホルムで抽出しエタノール沈殿し、結合前に３
ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．２ｍＭ ＥＤＴＡに溶かした。サ
ブフラグメント１はフラグメントＡのサブクローン１０
ｄの塩基対１−４２５までを含んでいた（図３Ａ）；サ
ブフラグメント１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅはフラグ
メント１からそれぞれＢａｍＨＩ，ＭｂｏＩ，Ｈｉｎｄ
III，ＨｉｎｄIII，ＢａｍＨＩでサブフラグメント１を
消化することにより作製した。サブフラグメント２は塩
基対２８３から４２５までを含んでいた。サブフラグメ
ント３ａはサブフラグメント３（塩基対１０６から２９
４）をＨａｅIIIで消化することにより作製した。サブ
フラグメント４はサブフラグメント４（塩基対１から１
４１）からＨｉｎｄIII消化により作られた。サブフラ
グメント５ａ，５ｂはサブフラグメント５（塩基対８７
から１４１）のＨａｅIII消化の産物であった。”変
異”サブフラグメント５ｍｕｔ１，５ｍｕｔ２はプライ
マーＰ３ｍｕｔ１（５´−ＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡ
ＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＴ−３´）とＰ３ｍｕｔ２
（５´−ＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＴ
ＡＡＡＧＴ−３´）を使って作られた（本プライマーで
下線を引いた位置以外はサブフラグメント５と同じであ
った）。サブフラグメント６は塩基対１０６から１３８
までを含んでおり、本インサートはＨｉｎｄIII，Ｂａ
ｍＨＩを用いた制限により切り出してフラグメント６ａ
を、ＨｉｎｄIII，ＥｃｏＲＩを用いた制限により切り
出してフラグメント６ｂを作製した。塩基対１０６から
２９４を含むサブフラグメント３（図４Ｂ，パネル２）
は塩基対１から１４１を含むサブフラグメント４（図４
Ｂ，パネル３）と同様にｐ５３によく結合した。更に別
のサブフラグメントについても同様にアッセイしたとこ
ろ（図４Ａ，４Ｂ）、決定的な配列は塩基対１０６から
１４１に位置づけられた。このセグメントはＴＧＣＣＴ
なる配列を３つ繰り返して含んでいた（図３Ａ）。サブ
フラグメント３のＨａｅIIIによる消化（塩基対１２５
−１２６の間を切断しＴＧＣＣＴリピートの２つを排除
する）はこの結合性を大きく減少させた（図４Ｂ，サブ
フラグメント３Ａ，パネル２）。このことは決定的な配
列がこの制限部位あるいはその近くにあり、ＴＧＣＣＴ
リピート１つでは結合に十分でなかったことを示唆して
いる。さらにサブフラグメントを検定したところ（＃
５，塩基対８７から１４１，図４Ａ，５Ｂ；＃６，塩基
対１０６から１３８，図４Ａ，４Ｂ，パネル４）、３つ
のＴＧＣＣＴリピートを含む３３ｂｐインサートが結合
能を提供することが確立された。
【０１０１】実施例５ 本実施例は、あるＧ残基がフラグメントＡのｐ５３への
結合に決定的であることを示すものである。
【０１０２】我々はメチル化干渉アッセイを使用して単
一ヌクレオチドレベルでの結合に対する必要性を研究し
た。一端を標識したＰＣＲ産物を、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で標識
したプライマーを使って作製した。各ＰＣＲ反応の産物
をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、５０
０ｍＭ酢酸アンモニウム中で破砕したゲルのスライスか
ら溶出し、フェノールとクロロホルムで抽出しエタノー
ル沈殿した。２×１０6 ｄｐｍのＤＮＡを、（Ｔ．マニ
アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｅ．Ｆ．フリッツ（Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ），Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第１版，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
１９８３，ｐ．４７７）記載のようにしてジメチルスル
フォン酸を使ってグアニン残基のところをメチル化し、
エタノール沈殿し、３ｍＭ Ｔｒｉｓ，０．２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ １０μｌに溶かした。０．５μｌをＤＮＡコン
トロールとして取っておいた。４．５μｌをバキュロウ
イルス製のｐ５３またはワクシニア感染させた細胞ライ
セートを含む結合反応液に加えた。沈殿したＤＮＡをＳ
ＤＳ／プロテイナーゼＫ消化により精製し、フェノール
−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿した。コントロ
ールＤＮＡと結合したＤＮＡの沈殿物をメチル化された
部位でピペリジンを使って切断した。等量の標識したＤ
ＮＡを変性ポリアクリルアミド（１４．５％）シークエ
ンスゲル上で分離し、それを固定し乾燥させオートラジ
オグラフィにかけた。有効な結合を示すサブフラグメン
ト５（図４Ａ，５Ｂ）をｉｎ ｖｉｔｒｏでメチル化し
ｐ５３に結合させた後、免疫沈降した。次にその結合し
たＤＮＡをメチル化された残基のところでピペリジンで
切断し、シークエンスゲルでの電気泳動により分離し
た。一方の鎖についてアッセイしたところ（図５Ａ，
右）、塩基対１２０のＧにおけるメチル化が有意に結合
に干渉することが示された。その反対側の鎖では（図５
Ａ，左）、塩基対１１７，１２１，１２２のＧにおける
メチル化により最も効果的な干渉が生じた。部分的な干
渉が近くのＧ部位（塩基対１１０−１１２，１１４，１
１５）でのメチル化によっても生じた。以上のことか
ら、メチル化干渉アッセイにより、中央のＴＧＣＣＴリ
ピート（塩基対１２１が中心）の１つと隣の塩基対が結
合に決定的であることが指摘された。
【０１０３】メチル化干渉により同定されたＧ残基に対
する特異性とは独立な証拠を得るために、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ突然変異誘発を使用した。塩基対１２０，１２１，
１２２のＧをＴ残基で置換した以外はサブフラグメント
５と同一のＤＮＡ断片を作製した。この”変異”サブフ
ラグメント（＃５ｍｕｔ２）はｐ５３に弱く結合した
（図５Ｂ）。１つの塩基対以外はサブフラグメント５と
同一なフラグメント（塩基対１２０のＧをＴに置換）を
検定した。このフラグメント（＃５ｍｕｔ１）もはっき
りとは結合しなかった（図５Ｂ）。
【０１０４】実施例６ 本実施例はｐ５３結合に重要なフラグメントＢの領域を
定義するものである。
【０１０５】フラグメントＢをサブクローニングした
（配列は図３Ｂ参照、ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２）。興味深
いことに本フラグメントは２つのＴＧＣＣＴモチーフリ
ピート（塩基対１３５，１５２に中心がある）を持って
いた。フラグメントＡに使用したのと同様なストラテジ
ーを使用して、これらの２つのリピート両方を含む９５
塩基対のサブフラグメント（塩基対１０４から１９８）
が結合に十分であることを示した（図４Ｂ，パネル
５）。
【０１０６】実施例７ 本実施例は、ヒト結腸直腸ガンの細胞における野生型ｐ
５３遺伝子の発現によりその増殖が劇的に阻害され、ヒ
ト結腸直腸ガンからクローン化した変異ｐ５３遺伝子が
そのような阻害を行えないことを示すものである。
【０１０７】結腸ガンの７５％を代表する結腸直腸ガン
細胞系列ＳＷ４８０，ＳＷ８３７は、各々１コピーの染
色体１７ｐ（ｐ５３を含む）を失っており、またもう一
方のｐ５３のアリルが突然変異を起こしている（ベーカ
ー（Ｂａｋｅｒ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，２１７
（１９８９）；ニグロ（Ｎｉｇｒｏ）ら，Ｎａｔｕｒｅ
３４２，７０５（１９８９））。ＳＷ８３７系列はコ
ドン２４８においてアルギニンからトリプトファンへの
変異を含んでいる（ニグロ，上）。ＳＷ４８０系列はコ
ドン２７３のアルギニンからヒスチジン、コドン３０９
のプロリンからセリンの２つの点突然変異を含んでいる
（ニグロ，上）。コドン２４８，２７３における置換は
ヒトの腫瘍に見られる典型的なもので、４つの変異の”
ホットスポット”の２つを成している（ニグロ，上）。
【０１０８】トランスフェクション研究のために、我々
は２つの独立した転写単位を含むよう設計されたベクタ
ーｐＣＭＶ−Ｎｅｏ−Ｂａｍを構築した。発現ベクター
ｐＣＭＶ−Ｎｅｏ−Ｂａｍはヒト ベータグロビン配列
とウシパピローマウイルス配列をＢａｍＨＩとＮｏｔＩ
で切り出すことによりＢＣＭＧＮｅｏ−ｍＩＬ２（カラ
スヤマ（Ｋａｒａｓｕｙａｍａ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６９，１３（１９８９））から誘導したものであ
る。次にユニークなＸｈｏＩ部位に存在するインターロ
イキン２（ＩＬ−２）配列を取り除き、リンカーをつけ
てＸｈｏＩ部位をＢａｍＨＩ部位に変換した。本ベクタ
ーはＣＭＶプロモーター／エンハンサー配列（ＢａｍＨ
Ｉ部位のインサートの発現を行わせる）とウサギ ベー
タグロビン遺伝子由来のスプライシングおよびポリアデ
ニル化部位（細胞内で転写されたインサートの正しいプ
ロセッシングを行わせる）を含んでいた。ｐＢＲ３２２
複製オリジンとβ−ラクタマーゼ遺伝子は大腸菌内での
本プラスミドの増殖を容易にした。本プラスミドは独立
したＨＳＶチミジンキナーゼの制御下にあるネオマイシ
ン耐性遺伝子の発現によりジェネティシン耐性を付与さ
れた。第１の転写単位は発現されるｃＤＮＡ配列のイン
サートが入る部位の上流にあるサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーと、適切なプロ
セッシングを受けるためのスプライスおよびポリアデニ
ル化部位を含んでいた。第２の転写単位はトランスフェ
クトされた細胞をジェネティシンで選択するためのネオ
マイシン耐性遺伝子の上流にあるヘルペスシンプレック
スウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼのプロモーター
／エンハンサーを含んでいた。
【０１０９】野生型ｐ５３ｃＤＮＡをｐＣＭＶ−Ｎｅｏ
−Ｂａｍに挿入しｐＣ５３−ＳＮ３を作った。同様に、
ヒト結腸直腸ガンＣＸ３からの変異ｃＤＮＡを発現する
ｐＣ５３−ＳＣＸ３も構築した。ｐ５３−ＳＮ３とｐ５
３−ＳＣＸ３との唯一の相違は１ヌクレオチド（Ｃから
Ｔ）であり、ｐ５３−ＳＣＸ３ではｐ５３のコドン１４
３にバリンの代わりにアラニンが置換されている。２つ
のコンストラクトは以下のようにして作られた：翻訳開
始点に対してヌクレオチド−１３０から１６７１までの
１．８ｋｂ ＸｂａＩ断片を野生型またはＣＸ３ｃＤＮ
Ａクローンから分離した。その断片をＤＮＡポリメラー
ゼのクレノウ断片で平滑末端にし、ＢａｍＨＩリンカー
に連結して発現ベクターｐＣＭＶ−Ｎｅｏ−Ｂａｍのユ
ニークなＢａｍＨＩ部位にクローン化した。
【０１１０】そのクンストラクトをＳＷ８３７とＳＷ４
８０細胞（アメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄより入
手）にトランスフェクトし、３週間後ジェネティシン耐
性のコロニーを計数した。両タイプの受容細胞でｐＣ５
３−ＳＮ３でトランスフェクトした細胞はｐＣ５３−Ｓ
ＣＸ３でトランスフェクトしたものに比べ５から１０倍
もコロニーが少なかった（表１）。
【０１１１】
【表１】表１ 野生型および変異ｐ５３発現ベクターで
トランスフェクトした後のコロニー形成。各実験につ
き、１つまたは２つの７５cm2 フラスコをトランスフェ
クトし、ジェネティシン選択した３または４週間後の総
コロニーを計数した（０．８ｍｇ／ｍｌ）。（Ｅｘｐ．
＝実験） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 形成されたジェネティシン耐性コロニー数 細胞系列 Ｅｘｐ． −−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ｐＣ５３−ＳＣＸ３ ｐＣ５３−ＳＮ３ （変異） （野生型） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ＳＷ８３７ １ ７５４ ６６ ２ ８１７ ６２ ＳＷ４８０ １ ４４９ ７９ ２ ３６４ ２６ ＲＫＯ １ １８５８ １９０ ２ １８２５ １６６ ＶＡＣＯ ２３５ １ １８ １６ ２ ２６ ２８ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ＳＷ８３７，ＳＷ４８０細胞の両方において発現ベクタ
ーｐＣＭＶ−Ｎｅｏ−Ｂａｍ（ｐ５３ｃＤＮＡインサー
トを含まない）により生じたコロニー数はｐＣ５３−Ｓ
ＣＸ３コンストラクトにより誘導されたものと同様であ
った。
【０１１２】これらの結果は野生型ｐ５３遺伝子がＳＷ
８３７，ＳＷ４８０両方の細胞系列のクローン増殖を阻
害することを示唆している；しかしながら、野生型コン
ストラクトのトランスフェクション後に有意な数のコロ
ニーが形成された。もし野生型ｐ５３の発現が本当に細
胞増殖に抑制的ならば、１つのコロニーも形成されない
かまたは形成されたコロニーでのｐ５３の発現は変異ｐ
５３ｃＤＮＡコンストラクトで産生されたものに比べて
減少していることが予想された。このことを評価するた
めに、我々は独立なＳＷ４８０，ＳＷ８３７コロニーを
線状に引き伸し、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）プロ
テクションアッセイを行い外来性配列から発現されたｐ
５３のｍＲＮＡ量を決定した。ｐＣ５３−ＳＣＸ３コン
ストラクトでのトランスフェクションからの３１系列の
うち１２個（３８％）が外来性変異ｐ５３ｍＲＮＡを発
現していた。この割合は２つの独立した転写単位を含む
ベクターでトランスフェクトしたヒトの細胞で予想され
た結果と一致していた。以前の研究から、げっ歯類の細
胞と違い霊長類の細胞は少量の外来ＤＮＡ（約６ｋｂ）
しかインテグレートできないので一方の転写単位の発現
で選択されたクローンの１０から３０％のみが第２の転
写単位をそのままの形で含んでいる（Ｆ．コラベール−
ガラピン（Ｃｏｌｌａｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ）ら，
Ｇｅｎｅ，５０，２７９（１９８６）；ホエイジメーカ
ー（Ｈｏｅｉｊｍａｋｅｒｓ）ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．
Ｒｅｓ．，１６９，１１１（１９８７）；マイン（Ｍａ
ｙｎｅ）ら，Ｇｅｎｅ ６６，６５（１９８８），ディ
ーン（Ｄｅａｎ）ら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１
８３，４７３（１９８９）。対照的に、ｐＣ５３−ＳＮ
３ベクターでトランスフェクトしたＳＷ４８０，ＳＷ８
３７細胞から確立した２１のクローン系列のいづれにも
外来性ｐ５３野生型ｍＲＮＡの発現は見られなかった
（図６Ａ）。以上のＲＮアーゼ プロテクションアッセ
イの結果はクローン内の外来性ｐ５３ＤＮＡ配列の分析
により支持された。ｐＣ５３−ＳＣＸ３トランスフェク
ション由来のｐ５３を発現するクローンはすべて外来性
ｐ５３遺伝子をインタクトに含んでいた（図６Ｂ）。対
照的に、ｐＣ５３−ＳＮ３トランスフェクション由来の
クローンすべてにおいて外来性ｐ５３遺伝子は欠失して
いたり再編成したりしていた（図６Ｂ）。
【０１１３】個々のクローンからの結果は、プールした
クローンの解析（多数のクローンを同時に評価できる）
により支持された。２または３回の独立したトランスフ
ェクション実験からの４０またはそれ以上のクローンを
プールし、トランスフェクションして約３週間後に解析
した。ＲＮアーゼ プロテクション研究は、野生型配列
の実質的な発現が検出できないことを示した（図７
Ａ）。サザン（ＤＮＡ）ブロッティングからの結果は、
変異ｐ５３ｃＤＮＡ発現ベクター由来のコロニーにおけ
るインタクトなｐ５３配列に対し、野生型トランスフェ
クタントからプールしたコロニーからは再編成していな
い外来性野生型ｐ５３配列を検出できないという点で、
ＲＮアーゼ プロテクション研究と一致した（図７
Ｂ）。
【０１１４】以上の実験から作られた結論は、ｐ５３タ
ンパク質がトランスフェクトされた細胞系列で生産され
ているという仮定に依存している。外来性変異ｐ５３配
列を含むクローンは内在性ｐ５３遺伝子により生産され
るものに比べて１．５から３．５倍の濃度のｐ５３ｍＲ
ＮＡを生産していた（図６Ａ，７Ａ）。イムノブロット
分析は、トランスフェクトしていない細胞に比べトラン
スフェクトした細胞ではｐ５３タンパク質発現の付随す
るような小さな増加（１．５−３倍）があることを示し
た。しかしながら、これらの細胞は有意な量の内在性ｐ
５３タンパク質（内在性ｐ５３ｍＲＮＡと異なり、ベク
ターにより生産されたものと区別できない）を生産して
いるので、こうした増加を定量するのは困難であった。
トランスフェクトしたヒトの細胞が我々のコンストラク
トからのｐ５３タンパク質を発現することを確かめるた
めに、我々は更に別の結腸直腸ガン細胞系列（ＲＫＯ）
を研究した。ＲＫＯ細胞はＭ．ブラッテン（Ｂｒａｔｔ
ａｉｎ）の好意により入手した。ＲＫＯ細胞はｐ５３を
コードすると考えられる配列、即ちエクソン５−９には
変異を含んでいないが正常な結腸直腸粘膜や研究された
他の細胞系列に比べｐ５３ｍＲＮＡの発現濃度が低く生
産されるタンパク質は検出限界以下であった。
【０１１５】トランスフェクトしたＲＫＯ細胞における
コロニー形成アッセイの結果は、ＳＷ４８０およびＳＷ
８３７細胞におけるものと同様であった。野生型ｐ５３
遺伝子トランスフェクタントによるコロニー形成は変異
ｐ５３コンストラクトに比べ１０倍も効率が低かった
（表１）。トランスフェクトしたＲＫＯ細胞におけるｐ
５３タンパク質の免疫化学的な検出は以下のようにして
行われた：約５×１０4の細胞をポリリシンコートした
スライド上に細胞遠心し、ホルマリン中で１０分間固定
し０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で５分間浸透
化した。ＡＢＣイムノペルオキシダーゼシステム（Ｖｅ
ｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と組み合わせた
ヒトｐ５３タンパク質に対するマウスモノクローナル抗
体をｐ５３の細胞免疫化学的検出（バンクス（Ｂａｎｋ
ｓ）ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５９，５２９
（１９８６））に使用した。スライドあたり１０から２
０の無作為に選択した顕微鏡視野を解析した。これらの
観察は以前に示された野生型ｐ５３タンパク質に対する
変異型の優れた安定性（Ｃ．Ａ．フィンレイ（Ｆｉｎｌ
ａｙ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，５３１
（１９８８））と一致している。しかしながら、４８と
９６時間後における一過的なｍＲＮＡの発現もＳＣＸ３
トランスフェクタントに比べてＳＮ３トランスフェクタ
ントでは有意に低かった。これは野生型ｐ５３を発現す
るＲＫＯ細胞が変異ｐ５３産物を生産するものに比べて
選択的に不利であるという考えを指示している。
【０１１６】ｐ５３を発現する細胞がその増殖ポテンシ
ャルを阻害されていることについて別の証拠を得るため
に、トランスフェクトされたＲＫＯ細胞のＤＮＡ合成へ
のｐ５３遺伝子発現の影響を［3Ｈ］チミジンで２時間
標識して調べた。細胞を逐次的に固定しｐ５３タンパク
質の存在に対して免疫細胞化学的に染色しオートラジオ
グラフした。検出可能なｐ５３タンパク質を発現してい
ない細胞に比べ、外来性変異ｐ５３タンパク質を生産し
ている細胞ではＤＮＡ合成を行っている細胞の数は僅か
しか少なくなかった。しかし、野生型タンパク質の発現
はチミジンの取り込みを劇的に阻害した（表２）。
【０１１７】
【表２】 表２ トランスフェクトしたＲＫＯ細胞の免疫細胞化学および［3Ｈ］チミジ ンの取り込み −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 時間におけるｐ５３を ［3Ｈ］チミジンを取り込 発現している細胞の百分率 んでいる細胞の百分率 プラスミド −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ６ ２４ ４８ ９６ ｐ５３＋ ｐ５３− 時間後 pC53-SCX3 １．０ １１ ４．３ ２．０ ２４ ３１ pC53-SN3 １．９ ５．２ ０．３ ０．２ １．７ ３３ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− これらの結果はすべて、野生型ｐ５３がガン細胞の増殖
にｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制的な効果をもたらすことを示
唆した。この抑制効果が細胞型特異的であるかどうかを
評価するため、結腸の良性腫瘍由来の結腸直腸の上皮細
胞（ＶＡＣＯ２３５アデノーマ細胞系列）をトランスフ
ェクトした。ＶＡＣＯ ２３５細胞はＪ．Ｋ．Ｖ．ウィ
ルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，
４７，２７０４（１９８７）により記載されている。以
前の研究から大部分のアデノーマは２コピーの染色体１
７ｐを含み正常な結腸粘膜と同様な濃度の野生型ｐ５３
ｍＲＮＡを発現していることが示されている。類似し
て、ＶＡＣＯ ２３５細胞系列のｐ５３アリルの塩基配
列（エクソン５−９）を決定したところ野生型であるこ
とがわかり、ｐ５３ｍＲＮＡの発現は正常な結腸粘膜と
同様であることが見出だされた。ＳＷ４８０，ＳＷ８３
７，ＲＫＯ細胞で見られた結果と比べると、ｐＣ５３−
ＳＮ３，ｐＣ５３−ＳＣＸ３コンストラクトはＶＡＣＯ
２３５系列のトランスフェクション後、ほぼ同数のジ
ェネティシン耐性コロニーを生じた（表１）。しかし、
我々は変異ｐ５３遺伝子に対する野生型による特異な増
殖阻害の最も決定的な検定は、プールしたトランスフェ
クタントにおける外来性ｐ５３の発現の解析を要すると
考えた。このような解析を通じて多くのコロニーを同時
に試験し、外来性変異および野生型ｐ５３遺伝子の発現
を直接比較した。トランスフェクトした遺伝子の相対的
な発現における大きな相違が、検定した３つのガン細胞
系列すべてに見られた。しかし、ＶＡＣＯ ２３５トラ
ンスフェクタントはｐＣ５３−ＳＮ３（野生型），ｐＣ
５３−ＳＣＸ３（変異型）ｐ５３コンストラクトからほ
ぼ等量の外来性ｐ５３ｍＲＮＡを発現していた（図７
Ａ）。
【０１１８】以上をまとめると我々の結果は、結腸直腸
ガン細胞系列の野生型ｐ５３遺伝子の発現が増殖と両立
しえないことを示唆している。野生型ｐ５３の抑制効果
は２つの意味で特異的であった。第１に、ｐ５３遺伝子
コンストラクトの単一の点突然変異は、３つの独立した
アッセイ（コロニー形成、トランスフェクトされたクロ
ーンでの外来性ｐ５３の発現、チミジンの取り込み）に
よって計測されたように、その抑制性を排除した。ＣＸ
３はただ１つの保存的な変異（ある単一コドンで疎水性
アミノ酸（バリン）を別のもの（アラニン）に置換す
る）しか含まないことから、遺伝子特異性に対するコン
トロールを提供した。第２に、野生型ｐ５３コンストラ
クトの増殖抑制効果は細胞型特異的であった。ＶＡＣＯ
２３５アデノーマ細胞系列に野生型ベクターを導入し
ても、変異ベクターと比較して計測可能な抑制効果は見
られなかった。導入されたベクターの特異な効果を説明
し得る幾つかの相違が、細胞系列間に存在する。その相
違にたいする基礎を無視してもＶＡＣＯ ２３５細胞系
列の結果は、野生型ｐ５３コンストラクトが受容細胞に
対し非特異的な毒性効果を持つ可能性を最小にするもの
である。即ち本効果は細胞型特異的であった。
【０１１９】表１および図７Ａのトランスフェクション
と発現の結果は、腫瘍進行の前悪性ステージの細胞（Ｖ
ＡＣＯ ２３５）が悪性の細胞（ＳＷ４８０，ＳＷ８３
７，ＲＫＯ）に比べて野生型ｐ５３の抑制効果に対する
感受性が低いと考えられることを示唆している。この仮
説は、野生型ｐ５３の抑制性が正常なラット胚の繊維芽
細胞の増殖に対する方がガン遺伝子をトランスフェクト
した誘導体に対するよりも弱いことを示唆した以前の結
果と一致するものである。フィンレイら，Ｃｅｌｌ ５
７，１０８３（１９８９）；エリヤフ（Ｅｌｉｙａｈ
ｕ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８６，８７６３（１９８９）。この感受性は単に相
対的なものであってもよい：高濃度での野生型遺伝子の
発現がリン酸化などの正常な調節過程を克服することに
より、非新生物細胞を含めたいかなる細胞の増殖も阻害
してもよい。サマド（Ｓａｍａｄ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３、８９７（１９
８６）；ミーク（Ｍｅｅｋ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．８，４６１（１９８８）。野生型ｐ５３の発現
をさらなる腫瘍の増殖や拡大に対する重要な律速因子と
すると、結腸直腸腫瘍の進行の間に生じる遺伝子変更が
細胞のｐ５３阻害に対する感受性の増加をもたらしても
よい。この時点（これ以前ではない）で、ｐ５３遺伝子
における変異はｉｎ ｖｉｖｏで細胞に選択的な増殖有
利性を付与するであろう。このことは、結腸直腸の腫瘍
形成のより進行したステージでのみ、ｐ５３遺伝子の変
異やアリル喪失が頻繁に起こることを説明するものであ
ろう。
【０１２０】実施例８ 本実施例はｉｎ ｖｉｔｒｏでｗｔ ｐ５３蛋白質へ結
合することができるヒトゲノムフラグメントの同定を証
明する。
【０１２１】この過程は図８Ａに説明されているが、ｐ
５３結合部位の単離および分析のために用いた実験戦略
を概説する。全ヒトゲノムＤＮＡフラグメントは、引き
続くＰＣＲ増幅およびクローニングを可能にするため
に、特別に設計した「キャッチ」リンカー（Ｋｉｎｚｌ
ｅｒら（１９８９），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，
１７：３６４５−３６５３，およびＫｉｎｚｌｅｒら
（１９９０），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：
６３４−６４２）に連結させた。連結したゲノムＤＮＡ
を次にｗｔ ｐ５３とインキュベートし、そして抗−ｐ
５３抗体により沈降させた。結合したＤＮＡを次にキャ
ッチリンカーと相補的なプライマーを用いてＰＣＲで増
幅させ、そしてその工程を繰り返した。免疫沈降とＰＣ
Ｒの連続を４回行った後、増幅されそして選択された
（ＡＳ）ＤＮＡをクローン化した。クローンをアトラン
ダムに拾いあげ、先ず免疫沈降（ＩＰ）により、そして
次にメチレーション阻害（ＭＩ）およびＤＮＡｓｅ Ｉ
保護（ＤＰ）により、ｐ５３結合をテストした。
【０１２２】図８Ａのアウトラインの後、本発明者らは
５３０クローンの挿入片に関して、ｐ５３への結合を調
べた。クローンの制限フラグメントを末端標識し、精製
したヒトｗｔ ｐ５３蛋白質（バキュロウイルス感染細
胞で製造した）とともにインキュベートした。
【０１２３】全ゲノムのＰＣＲは、前記のように実施し
たが、但し、ただ一つのオリゴヌクレオチド（５' −Ｇ
ＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＴＣＴＣ−３' ）を増
幅に用いた（Ｋｉｎｚｌｅｒら（１９８９），Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１７：３６４５−３６５３，
およびＫｉｎｚｌｅｒら（１９９０），Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：６３４−６４２）。２００ngの
「キャッチ」−連結ヒトゲノムＤＮＡを、バキュロウイ
ルス−生産ヒトｗｔ ｐ５３を前記のように精製したも
の１００ngとインキュベートし（Ｆｒｉｅｄｍａｎら
（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８７：９２７５−９２７９）、そして後述のよ
うに免疫沈降させた。ＩＰおよびＰＣＲを４ラウンド行
った後、ＡＳＤＮＡをＥｃｏＲI で開裂し、そしてベク
ターとしてラムダ Ｚａｐ IIまたはｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ II ＳＫ+ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のいずれ
かにクローニングした。個々のクローンを無作為に拾い
あげ、ｐ５３の結合に関して調べた。パネルＢにおい
て、クローン化プラスミドＤＮＡサンプルは、ＥｃｏＲ
I で開裂され、そしてクレノウによる埋め込み（フィル
イン）で末端標識した。ＩＰ（ＭｃＫａｙら（１９８
１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.,１４５：４７１−４７
９）のためには、１０ngのＤＮＡを１００ngのバキュロ
ウイルス生産ヒトｗｔｐ５３および１００ngのポリｄＩ
−ｄＣとともに、４℃で３０分間、１００μl の「ＤＮ
Ａ−結合バッファー（１００mM ＮａＣｌ、２０mM ト
リス，ｐＨ７．０，１０％グリセロール，１％ ＮＰ４
０および５mM ＤＴＴを含有する）」中でインキュベー
トした。ｐ５３に結合したＤＮＡフラグメントは、各４
００ngの抗−ｐ５３抗体ｐＡｂ４２１およびｐＡｂ１８
０１（両方ともＯｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅから
入手した）を含む液８μl を添加して、ｐ５３に結合し
たＤＮＡフラグメントを抗体と複合体形成させ、４℃で
３０分間インキュベートした。ＤＮＡ結合バッファー
は、１．５mgのプロテインＡ（１．５mgプロテインＡセ
ファロースおよび１０μg のポリｄＩ−ｄＣを含有する
ＤＮＡ結合バッファー２６μl を添加により沈澱させ、
４℃で３０分間混合したもの）を含んでいた。上清を除
去した後、免疫沈降物を１mlのＤＮＡ結合バッファーで
２回洗浄した。結合したＤＮＡをＳＤＳおよびプロテイ
ナーゼＫで４８℃３０分間処理して精製し、フェノール
およびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、
１０％非変性条件のポリアクリルアミドゲルで電気泳動
して、オートラジオグラフを施した。
【０１２４】２３個のクローンがｐ５３に結合したフラ
グメントを含有していた。ＩＰ実験の例は図８Ｂに示
す。クローンＳ６１（レーン１１Ｂ，Ｃ）は、ｐ５３に
結合した２０２ｂｐの単一ゲノムフラグメントを含んで
いた。クローンＮ２は５個のフラグメントを含有し、そ
のうち一つのみ（３５７ｂｐ）がｐ５３に結合した（レ
ーン１０Ｂ，Ｃ）。ｐ５３結合フラグメントの他の例も
得られ、これらの各々は更に分析するためサブクローニ
ングされた。これと対照的に、ＩＰアッセイを用いて調
べたとき、同様のサイズの選択されないヒトＤＮＡ挿入
片がｐ５３結合したものは１０００以上のクローンの内
一つも存在しなかった。したがって、この全ゲノムＰＣ
Ｒ法によりｐ５３結合配列が有意に豊富化された。
【０１２５】実施例９ 本実施例は、ｐ５３が結合ＤＮＡフラグメントと接触す
る場所を証明する。
【０１２６】ｐ５３が結合する領域の確認は、サブクロ
ーニングされたＤＮＡフラグメントをプローブとして用
いたＤＰアッセイまたはＭＩアッセイによってなされ
た。ＭＩにおいては、フラグメントをＧ残基でメチル化
してｐ５３に結合された（図９）。ｐ５３結合に必須の
Ｇ残基のメチル化は、結果としてＩＰの阻止を生じる。
例えば、クローン１１Ｂ３からの２４８ｂｐ挿入片のヌ
クレオチド２１７，２２，２２７から２２９，および２
３３をメチル化すると、このフラグメントのｐ５３への
結合は完全に阻止された（図９，フットプリント２）。
反対の鎖の分析では、阻止はヌクレオチド２１９，２２
３，２２４，２３０，２３５および２３６に相当するＧ
残基で観察された（図９，フットプリント１）。ＤＰに
おいては、標識ＤＮＡフラグメントを最初にＩＰ処理
し、次に種々の量のＤＮａｓｅ Ｉとインキュベートし
た。クローンＮ２２について、ｐ５３結合は残基１８７
から２１１でのＤＮａｓｅ Ｉ開裂に対する保護をもた
らした（図９，フットプリント９）。ＭＩはＤＮａｓｅ
Ｉ保護された領域内でのみＧ残基での阻止を示した
（図９，フットプリント１０）。ＤＰおよびＭＩマッピ
ングの他の例も図９に示す。ｐ５３結合ＤＮＡフラグメ
ントをサブクローニングして、一方の末端を標識し、ゲ
ルで精製しそしてＤＰまたはＭＩマッピングした。ＭＩ
においては、１０ngのＤＮＡを、２００μl の５０mM
Ｎａカコジレート、１mM ＥＤＴＡ，pH８．０および５
μl の１０％ジメチルサルフェート／９０％メタノール
と共に、５分間２０℃でインキュベートし、Ｇ残基をメ
チル化した。１．５mM酢酸ナトリウム、１Ｍ β−メル
カプトエタノールおよび６０μg のグリコーゲンを含有
する液５０μl を添加した。混合物をエタノールで沈澱
させ、洗浄し、そして５μl の３mMトリス，０．２mM
ＥＤＴＡ，pH７．５に再度懸濁し、図１の説明で記載し
たようにして野性型ｐ５３と結合させた。ＩＰおよびＤ
ＮＡ精製の後、サンプルを１００μl の１Ｍピペリジン
と９０℃で３０分間インキュベートした。次にサンプル
を真空乾燥し、６％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル
で電気泳動分離した。コントロールＤＮＡサンプルをｐ
５３を添加する以外は、全てのインキュベートにおいて
同様に行った。これらのコントロールサンプルには、上
清（ｐ５３の不存在下で標識ＤＮＡを含む）を除去する
ことなしに、プロテインＡペレットをＳＤＳおよびプロ
テイナーゼＫで処理した。
【０１２７】ＤＰアッセイのためには、末端標識ＤＮＡ
フラグメントを、図８の説明で記載した用にして免疫沈
降させた。プロテインＡセファロースペレットは、２５
℃で２分間、５mM ＭｇＣｌ2 中の２００ngのと共にイ
ンキュベートした。ＤＮＡを前記のようにして精製した
後、サンプルを配列決定用ゲルで電気泳動分離し、そし
てＭＩのために既に記載したようにして負荷した。ＭＩ
は、ｐ５３に結合した全ての１８ゲノムＤＮＡフラグメ
ントについて行った。ＤＰアッセイは１３フラグメント
について行い、保護領域はＭＩアッセイにより示された
領域と均一に一致した。
【０１２８】実施例１０ 本実施例はｐ５３結合ＤＮＡ領域の配列の分析である。
【０１２９】次に２３クローンの配列を比較した。挿入
片の配列平均は３０７ｂｐであった（１３９−４７０の
範囲）。２３クローンのうち１０クローンは独特のもの
ではなく、少なくとも１００連続ヌクレオチドが他の一
つのクローンと同一であった。したがって、この２３ク
ローンは１８の独立のゲノムＤＮＡフラグメントを代表
していた。本発明者らは、コンピューター手法によって
これら１８フラグメント間の類似性を求める試みを行っ
たが、有意な関係は見つからなかった。しかしながら、
ｐ５３結合に関与する領域（ＭＩおよびＤＰで評価し
た）を並べると、これらクローンの顕著且つ統一的特徴
が明らかになった（図１０）。各々の結合部位は１０ｂ
ｐの成分：５’−ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ−３’の２コピ
ーを、０ないし１３ｂｐ隔てて含んでいた。一つのクロ
ーン（Ｓ５９２）は、二つの分離したフットプリント領
域を含み、両領域は１０ｂｐ成分のダイマーを有してい
た（図１０）。全てのクローンにおいて、ＤＰおよびＭ
Ｉを示す領域は必ずこのダイマー内に存在し、そしてこ
の１０ｂｐ成分内のＧ残基はｐ５３への結合に強く干渉
した（図９に例示）。この１０ｂｐのコンセンサスモノ
マーは、内部対称性を有し、５’−ＲＲＲＣＷ−３’型
の半成分二つを反対向きに有していた。この対称性はダ
イマーでも認められ、４つの半成分が交互に反対を向
き、疑似パリンドーマ構造を形成し、ある場合には間に
ループが介在していた。このコンセンサスダイマーは、
プラスミドＣＢＥ１０ｄ内でマッピングされたｐ５３結
合配列内にも認められた（図１０）。ｐ５３結合配列全
てに認められた顕著な対称性にもかかわらず、どのゲノ
ム部位もパリンドーマ性ではなかった。
【０１３０】実施例１１ この実施例ではコンセンサス成分のダイマーがｐ５３へ
の結合に要求されることおよび腫瘍中に見いだされるミ
ュータントｐ５３蛋白質はコンセンサス配列に結合しな
いことを証明する。
【０１３１】１０ｂｐコンセンサスモノマーがｐ５３に
結合可能かどうかを調べるため、コンセンサス配列を含
む合成オリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＧＣＡＴＧＴＣ
Ｔ−３’）を研究した。オリゴヌクレオチドの２本鎖を
直接またはプラスミドベクターにクローニングした後に
試験した。モノマーは単独でも（図示していない）また
はプラスミド配列４３ヌクレオチドに隣接していても、
ｐ５３に結合しなかった（図１１Ａ、レーン５）。これ
に対して、ダイマー（２コピーのモノマーを、頭部と頭
部、尾部と尾部、または頭部と尾部の向きに並べて構成
したもの）は、それぞれ強くｐ５３蛋白質に結合した
（図１１Ａ，レーン１から４，６）。このモノマーの高
次オリゴマーはＩＰアッセイにおいてダイマーほど良好
には結合しなかった（図１１Ａ，レーン６から８）。コ
ンセンサス配列に適合しているがしかし完全パリンドー
マ性の別のモノマーも、ダイマーとして結合したがモノ
マーでは結合しなかった（図１０，合成オリゴヌクレオ
チド３，４）。コンセンサス成分の二つの変異体につい
ても結合を調べた。最初のものでは、モノマーの４位お
よび６位の二つの重要なＧ：Ｃ塩基対をＡ：Ｔ塩基対に
置換した（図１０，合成オリゴヌクレオチド１，２）。
この配列は完全対称性であるのに、モノマーとしてもダ
イマーとしてもｐ５３に結合しなかった。さらに本発明
者らは、半成分５’−ＰｕＰｕＰｕＣ（Ａ／Ｔ）−３’
の直接反復物も調べたが、これらはｐ５３に結合しなか
った（図１０，合成オリゴヌクレオチド５）。したがっ
て、１０ｂｐコンセンサスモノマー中の半成分の鏡像対
称性は、その活性に不可欠であった。
【０１３２】最後に、本発明者らはヒトの癌においてし
ばしば変化している４つの「ホットスポット（ｈｏｔ−
ｓｐｏｔｓ）」（Ｎｉｇｒｏら（１９８９），Ｎａｔｕ
ｒｅ，３４２：７０５−７０８，およびＨｏｌｓｔｅｉ
ｎら（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：４９−５
３）の各々を有するｐ５３ミュータントを、コンセンサ
スダイマーに結合する能力に関して調べた。ｐ５３ミュ
ータントはいずれも、ｗｔ蛋白質が強く結合する条件下
で、この配列に検知できる程度の結合を示さなかった
（図１１Ｂ）。これらの実験はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
で翻訳されたｐ５３は、バキュロウイルス感染昆虫細胞
から精製されたｐ５３と同様に、ＤＮＡを特異的に結合
する能力を有することも示した。
【０１３３】要約すると、ｐ５３を結合することのでき
るヒトゲノムＤＮＡ配列のセットが単離され、ｐ５３に
対するコンセンサス結合配列を調べるために用いられ
た。コンセンサスダイマー中の４つの半成分の対称性
は、ｐ５３がテトラマー性蛋白質としてＤＮＡと相互作
用することを示唆している。この事実は、ｐ５３が集ま
ってホモテトラマーを形成することを示唆した報告と一
致する（Ｋｒａｉｓら（１９８８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，
６２：４７３７−４７４４およびＷｅｉｎｂｅｒｇ（１
９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１１３８−１１４
６）。
【０１３４】実施例１２ この実施例では、正常なｐ５３はヒト細胞内で発現を活
性化しうることを証明する。
【０１３５】本発明者らは先ず、レポータープラスミド
（ＰＧn −ＣＡＴ系列）を作成した、これらは、ポリオ
ーマウイルスの初期プロモーターの一部およびｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでｐ５３に結合できるＤＮＡ配列の顆粒に位置
するＣＡＴ遺伝子を有する（図８）。ＣＡＴレポーター
には、相補オリゴヌクレオチドをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ II ＳＫ＋（ストラタジーン）のＥｃｏＲＶ部位に
連結してＰＧn およびＭＧn 系列を形成して、ＣBEのｐ
５３結合領域のコンカテマーを形成した。ｐＰｙＯＩＣ
ＡＴ（村上ら（１９９０），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５：
５）のＢｇｌII−ＢａｍＨI フラグメント（これはポリ
オーマウイルスの初期プロモーターおよびＣＡＴ遺伝子
コード領域を有している）をＰＧn 系列およびＭＧn 系
列のクローンのＢａｍＨI 部位に連結して、ＰＧn −Ｃ
ＡＴ系列およびＭＧn −ＣＡＴ系列を形成し、そして挿
入片の向きを制限酵素分析で調べた。ＰＧ9 −ＭＧn −
ＣＡＴ系列およびＰＧ13−ＭＧn −ＣＡＴ系列の形成
は、ＰＧ9 −ＣＡＴおよびＰＧ13−ＣＡＴのＨｉｎｄII
I −ＳａｌI フラグメントを切りだし、平滑末端とな
し、ＸｂａI リンカーを付加し、そしてＭＧn −ＣＡＴ
系列のプラスミド（ｎ＝１，５，１０および１５であ
る）のＸｂａI 部位へ連結することにより行った。酵母
β−ガラクトシダーゼレポータープラスミドとしては、
ＰＧおよびＭＧ配列をＳａｌI −ＳｍａI フラグメント
として、ｐＣＺ（Ｂｕｃｈａｎａｎら（１９８８），Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８：５０８０６）のＳａ
ｌI およびフィルイン処理したＸｈｏI 部位に連結し
た。ｐ５３−ｗｔ発現構築物の構築は文献に記載されて
おり（Ｂａｋｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：９１
２）；ミュータントの発現プラスミドは文献記載ｃＤＮ
Ａプラスミド（Ｎｉｇｒｏら，（１９８９），Ｎａｔｕ
ｒｅ，３４２：７０５およびＫｅｒｎら（１９９１），
Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，６：１３１）から同様にして構築す
るか、またはリン酸化部位改変ミュータントにおいて
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏミュータジェネシス法（変更部
位，Ｐｒｏｍｅｇａ）で行い、配列から確認した。ｐＲ
Ｓ３１４を基礎とする酵母ｐ５３発現ベクターの構築
は、文献に記載されている（Ｎｉｇｒｏら，Ｍｏｌ．Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（印刷中））。
【０１３６】ｐ５３結合配列としては、オリゴヌクレオ
チドＰＧ（５’−ＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＣＴ
ＧＧ−３’）のコンカテマーの系列を用いた。これは、
ｉｎｖｉｔｒｏでｐ５３に結合することが以前に示され
たプラスミドＣBEの結合領域を含んでいる。レポーター
および正常ヒト野性型蛋白質（ｐ５３−ｗｔ）をコード
する発現ベクター（図１２Ｂ）を一緒に、ヒト結腸肛門
癌細胞ラインＨＣＴ１１６に形質転換した。この細胞ラ
インは少量の明らかな野性型ｐ５３蛋白質を生産する。
【０１３７】ＨＣＴ１１６のｐ５３遺伝子のエクソン５
−８を、ＰＣＲで増幅し、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙら（１９
９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：７０６に記載された
ようにして配列を決定した。従来は、これらのエクソン
はヒト腫瘍中で９０％を超えるミューテーションを含む
ことが示されていた。ＨＣＴ１１６細胞ではミューテー
ションは観察されなかった。少量の明らかに野性型の蛋
白質が、ＨＣＴ１１６蛋白質のウェスタンブロットによ
り検出された（図１６Ｂ参照）。
【０１３８】正常な野性型ｐ５３蛋白質は、実際に転写
を活性化することが可能であった（図１３）。本発明者
らはＣＡＴ遺伝子トランス活性化のレベルは、上流配列
のｐ５３への結合の強さに依存することを見いだした。
即ち、ＰＧ反復の数が多くなるとｉｎ ｖｉｔｒｏでの
ｐ５３への結合が多くなり（図１３Ａ）、そしてｉｎｖ
ｉｖｏのＣＡＴ発現が強くなる（図１３Ｂ，レーン１−
７）。トランス活性化のレベルは、トランスフェクトし
たｐ５３発現ベクターの量とともに増大した（表３）。
【０１３９】
【表３】 表３ ヒト細胞でのトランスアクティベーション −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ｐ５３ 相対ＣＡＴ活性1/ 発現 実験２ ベクター2/ レポーター 実験１ ．８５μg ２．２５μg 実験３ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ｐ53-wt PG13CAT １００ １００ ２１０ １００ 腫瘍由来ミュータント： ｐ53-143 PG13CAT ３ １ ４ ｐ53-175 PG13CAT ２ ３ ６ ｐ53-248 PG13CAT ２ ４ ７ ｐ53-273 PG13CAT ２ ２ ３ 内在活性： ｐ53-wt MG15CAT3/ ＜１ ２ 不在4/ PG13CAT ２０ ２ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−1/ 全てのトランスフェクションにおいてＨＣＴ１１６
細胞中で１．７μg のレポーターを用いた。トランスフ
ェクションおよびＣＡＴアッセイは、Ｓａｄｒａｎｓｋ
ｙら（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：７０６に
記載されているようにして行った。活性は、アセチル化
型に変換されたクロラムフェニコールを反映し、各実験
での１回のトランスフェクションを暫定的に１００の値
を有するものと設定した相対値である。３回の代表的実
験が示されている。
【０１４０】2/ 実験２では、０．８５および２．５５
μg のレベルの発現要素を用いた。実験１では１．７μ
g および実験３では０．８５μg を用いた。
【０１４１】3/ MG15CATはＤＮＡ結合特異性のコントロ
ールおよびプロモーターと無関係の「読取（リードスル
ー）」転写および／または基礎的プロモーター活性の予
測を提供した。
【０１４２】4/発現要素不在のトランスフェクション
は、ＨＣＴ１１６細胞の内在性の野性型ｐ５３による活
性の予測を提供した。種々のトランスフェクションにお
ける内在性の活性は、トランスフェクションの効率に依
存して、外来野性型ｐ５３でのトランスフェクション後
の活性の２−２０％であった。内在性ｐ５３の活性はオ
ンコジェニックなミュータントｐ５３のトランスフェク
ションにより減少した。
【０１４３】結合配列に対する特異性は、１８塩基対の
オリゴヌクレオチドの６つのＧＣ塩基対を置換してＰＧ
のミュータント型を形成して行った；このミュータント
型をＭＧ（５’−ＣＣＴＴＡＡＴＧＧＡＣＴＴＴＡＡＴ
ＧＧ−３’）と命名した。この配列をマルチマーとし、
そしてＣＡＴレポーターの上流に存在させたとき、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでｐ５３に結合せず（図１４，レーン７お
よび８）、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＴ発現の活性化も生じ
なかった（表３；図１３Ｂ，レーン８；図１５Ａ，レー
ン６；図１５Ｂ，レーン２）。ＣＡＴのトランス活性化
は、ＣＡＴ遺伝子上流のＰＧマルチマーの向きとは無関
係であった（図１３Ｂ）。ＰＧマルチマーとプロモータ
ーの間に追加的に５９−３３３塩基対を存在させること
も、トランス活性化に殆ど影響しなかった（図１５Ａ，
レーン２−５）。しかしながら、ＣＡＴ遺伝子の下流に
ＰＧ結合配列を存在させると、トランス活性化は不可能
であった（図１５，レーン３）。これらの観察結果は、
ＰＧ配列は古典的エンハンサーではないとしても、上流
活性化要素として作用することを示唆している。
【０１４４】ＣＡＴアッセイ：２５cm2 フラスコ中の５
０−８０％コンフルエンス状態のＨＣＴ１１６細胞培養
物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、製造元の指示にしたがっ
て形質転換した。一つの実験内の全てのフラスコは、同
じトータル量のプラスミドにより、「フィラー」として
ｐＣＭＶｎｅｏＢａｍまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＳＫ＋を用いて、形質転換した。２０−２４時間目
に細胞を収穫し、溶解物のＣＡＴ活性を、文献に記載さ
れているようにして（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２），Ｍ
ｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，２：１０４４）、14Ｃ−標
識クロラムフェニコール（ＩＣＮ）のアセチル化によっ
て測定した。溶解物の蛋白質の換算を確実に行うため
に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙを用
いた。切り出したクロマトグラフのスポットをシンチレ
ーション計測により定量化してから、クロラムフェニコ
ールのアセチル化型への変換パーセントを計算した。記
載する結果は別の日に行った少なくとも二回のトラスフ
ェクションからのものである。
【０１４５】実施例１３ 本実施例では、オンコジーンのミュータントｐ５３遺伝
子は、常にトランス活性化をひきおこさないことを証明
する。
【０１４６】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＧマルチマーの結
合（図１３Ａ）と、ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＧn −ＣＡＴ
レポーターからの発現との間の厳密な相関性は、この発
現がｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＧマルチマーに対してｐ
５３が結合したことの直接の結果であることを強く示唆
する。もしそのようなｐ５３の活性がその腫瘍抑制活性
に必須であるとすれば、天然に存在するｐ５３ミュータ
ントはこの機能を欠失しているのであろうと考えられ
る。ｐ５３のミューテーションは一般に４つの異なるｐ
５３「ホットスポット」領域（ｐ５３蛋白質の４つの発
生学的に保存されたドメインに対応する（Ｂａｋｅｒら
（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：２１７，Ｈｏ
ｌｌｓｔｅｉｎら（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５
３：４９，およびＳｏｕｓｓｉら（１９８７），Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅ，１：７１））に発生する。これらホットス
ポットの各々に対応するミュータントｐ５３遺伝子を、
ＰＧ13−ＣＡＴレポータープラスミドと共に、細胞に一
時的トランフェクションさせた。これらのミュータント
発現ベクターで得られた結果は、おどろくほど一致して
いた。調べた全ての腫瘍由来ミューテーションは、ミュ
ーテーションの存在部位が広範囲の位置（コドン１４３
−２７３）であったにかかわらず（表３，および図１６
Ａ）、ＣＡＴのトランス活性化能力を消失していた。少
量の内在性野性型ｐ５３を発現する細胞ラインについて
予測されるであろうが、しばしばＨＣＴ１１６細胞自身
がもっている若干の固有のトランス活性化能力が見られ
た（表３；図１３Ｂ，レーン１；図１６Ａ，レーン
１）；興味深いことに、ミュータントで観察されＣＡＴ
のレベル（表３および図１６Ａ，レーン４−７）は、実
際は外来のｐ５３発現ベクターで観察されたもの以下で
あり、このことはミュータントｐ５３生産物が、内在性
ｐ５３による少量の発現を阻害している可能性を示唆し
ている（後に論じる）。検討したミュータントには、Ｌ
ｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ患者（２４８trp ）（Ｍａｌｋｉ
ｎら，（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１２３
３；Ｓｔｒｉｖａｓｔａｖａら（１９９０），Ｎａｔｕ
ｒｅ，３４８：７４７）のジャームライン（ｇｅｒｍｌ
ｉｎｅ）に見られる典型的ミュータント、および種々の
ヒト腫瘍に共通して見られる三つのミュータント（１４
３val ，１７５his ，２７３his ）（Ｈｏｌｌｓｔｅｉ
ｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：４９）が含
まれていた。イムノブロットにより、ミュータントｐ５
３蛋白質は野性型ｐ５３と匹敵するレベルで発現された
ことが確認された（図１６Ｂ）。
【０１４７】ウェスタンブロットは次のように行った：
各細胞溶解物の蛋白質１００μg を１０％ポリアクリル
アミドＳＤＳゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア，ベ
ッドフォード，ＭＡ）に転写し、５％脱脂ミルクでブロ
ッキングし、１μg ／mlのＰＡｂ１８０１（Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に、次に 125Ｉ標識し
た山羊抗マウス抗体（ＮＥＮ）と共にインキュベート
し、そしてオートラジオグラフィーを施した。この構築
物内の腫瘍由来のミューテーションを含むｐ５３蛋白質
はｐ５３認識配列に特異的結合する能力をもたず（図１
４，レーン３−６）、これは、一貫的なトランス活性の
欠損として反映された。
【０１４８】実施例１４ この実施例では正常ｐ５３が酵母内でトランス活性化す
ることを証明する。
【０１４９】次に本発明者らはｐ５３のこの活性が哺乳
類細胞に限定されるものかどうか調べた。もしｐ５３が
ｉｎ ｖｉｖｏでＤＮＡ配列に結合して隣接する遺伝子
の転写を活性化する能力が、該蛋白質の固有の特性であ
るなら、この活性が類似の真核細胞でも発揮される可能
性が有る。事実、ｐ５３のＮ末端の酸性活性化ドメイン
は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと融合したとき、
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で機能すると報告されてい
る（Ｆｉｅｌｄｓら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
４９：１０４６）。したがって、本発明者らは酵母を、
ＰＧマルチマー（ＰＧn −ＬａｃＺ）の下流に存在させ
たＬａｃＺレポーター遺伝子により、並びにガラクトー
ス−誘導可能ｐ５３発現ベクターにより、安定的に形質
転換した（図１２）。培地へのガラクトースの添加はｐ
５３の発現をもたらし、これにともないβ−ガラクトシ
ダーゼの発現が劇的に増大した（表４）。ＭＣマルチマ
ー（非−ｐ５３結合性）でＰＧマルチマーを置換する
と、活性化は認められなかった（表４）。さらにｐ５３
ミュータントは酵母細胞内でのトランス活性化能力をも
たなかった（表４）。したがって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ内でのこれらの結果は、ヒト細胞内で観察された
結果と類似していた。
【０１５０】
【表４】 表４ ｐ５３による酵母での遺伝子発現活性 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ｐ５３ β−Ｇａｌ活性 発現ベクター レポーター 実験１ 実験２ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 不在 ＰＧ１６−ＬａｃＺ ３ ２ Ｙｐ５３ ＰＧ１６−ＬａｃＺ １３，０００ ８，０００ Ｙｐ５３−１４３ ＰＧ１６−ＬａｃＺ １５０ ８５ Ｙｐ５３−２７３ ＰＧ１６−ＬａｃＺ ５ ２ Ｙｐ５３ ＰＧ４−ＬａｃＺ １５，０００ １１，０００ Ｙｐ５３ ＰＧ１−ＬａｃＺ ２，６００ ３，０００ Ｙｐ５３ ＭＧ１５−ＬａｃＺ １５ ４ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 野性型またはミュータントｐ５３発現ベクターおよびβ
−ガラクトシダーゼレポータープラスミドを、Ｓ．ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換してクローンを得た。ｐ５
３の発現の誘発をガラクトースで誘発し、β−ガラクト
シダーゼ活性を、蛋白質ミリグラム当たりのナノモル／
分の単位で測定した。二つの独立クローンを試験した
（実験１および２）。ガラクトースで誘発しない場合
は、１単位より少ない活性が見られた。Ｙｐ５３−１４
３ミュータントの残存活性は、酵母の増殖に用いた比較
的低温（３０℃）で、バリンからアラニンへの置換ミュ
ータントで観察される若干の野性型活性によるものであ
ろう。
【０１５１】実施例１５ 本実施例は、野性型ｐ５３がＤＮＡと結合して転写を促
進する能力に対する、ｐ５３ミューテーションの支配的
阻止効果を証明する。
【０１５２】もしｐ５３の転写活性化がその生物学的役
割にとって、根本的なものであるとすると、ｐ５３ミュ
ータントはこの活性化を阻害することができるに違いな
い（ｐ５３ミュータントが野性型ｐ５３の腫瘍抑制活性
を、両者が発現する際に阻害できる（Ｌｅｖｉｎｅら
（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ，３５１：４５３）のと同
様に）。この可能性を評価するため、野性型ｐ５３遺伝
子およびミュータントｐ５３遺伝子をＰＧ13−ＣＡＴレ
ポータープラスミドと共に、ＨＣＴ１１６細胞に同時ト
ランスフェクトした（図１７および１８）。同量の野性
型およびミュータントｐ５３発現ベクターを用いた場合
は、野性型ｐ５３単独の場合と比較して、ＣＡＴの発現
は約５０％減少した。ミュータントｐ５３を野性型ｐ５
３の３倍の比率にすると、８４−９５％の現象を生じ
た。この同時トランスフェクション実験において、ミュ
ータントｐ５３を別の野性型ｐ５３に置換すると、期待
したとおりＣＡＴの発現は減少ではなく増大した（図１
８，ｗｔのレーン）。したがって、ＣＡＴレポーターの
発現は細胞内における野性型とミュータントｐ５３の比
率に依存した。
【０１５３】この支配的阻止効果は、ミュータント／野
性型複合体がＤＮＡに結合できないためか、または結合
してもその後に転写を活性化できないためであろう。こ
れら二つの可能性を見分けるため、図１４に示したのと
同様の実験において、野性型ｐ５３およびｐ５３の１７
５his ミュータントを同時翻訳させた。３：１の比率で
同時発現させたとき、ミュータントｐ５３蛋白質は野性
型蛋白質がＤＮＡに結合する能力を９０％以上阻止し
た。
【０１５４】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：４０５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列 AATACGACTC ACTATAGGGC GAATTGGGTA CCGGGCCCCC CCTCGAGGTC GACGGTATCG 60 TTATGCTGAG TGATATCCCG CTTAACCCAT GGCCCGGGGG GGAGCTCCAG CTGCCATAGC ATAAGCTTGA TATTCTCCCC AGATGTAGTG AAAGCAGGTA GATTGCCTTG CCTGGACTTG 120 TATTCGAACT ATAAGAGGGG TCTACATCAC TTTCGTCCAT CTAACGGAAC GGACCTGAAC CCTGGCCTTG CCTTTTCTTT CTTTCTTTCT TTCTTTATTA CTTTCTCTTT TTCTTCTTCT 180 GGACCGGAAC GGAAAAGAAA GAAAGAAAGA AAGAAATAAT GAAAGAGAAA AAGAAGAAGA TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTTTTTTTTT 240 AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAAAAAAAAA GAGACAGAGT TTCACTCTTG TTGCCCAGGC TAGAGGGCAA TGGCGCGATC TCGGCTCACC 300 CTCTGTCTCA AAGTGAGAAC AACGGGTCCG ATCTCCCGTT ACCGCGCTAG AGCCGAGTGG GCACCCTCCG CCTCCCAGGT TCAAGCGATT GGGGGATCCA CTAGTTCTAG AGCGGCCGCC 360 CGTGGGAGGC GGAGGGTCCA AGTTCGCTAA CCCCCTAGGT GATCAAGATC TCGCCGGCGG ACCGCGGTGG AGCTCCAGCT TTTGTTCCCT TTAGTGAGGG TTAAT 405 TGGCGCCACC TCGAGGTCGA AAACAAGGGA AATCACTCCC AATTA 配列番号：２ 配列の長さ：２３８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列 AAGCTTGATA ATCATGGAGG TGAGTTTTTC CAGTGCTGTT CTCATGATAG TGACTAAGTC 60 TTCGAACTAT TAGTACCTCC ACTCAAAAAG GTCACGACAA GAGTACTATC ACTGATTCAG TCCCATGATC TGATGGTTTT ATAAAGGGCA GTCCTTCTAC ACATGCTCTC TTGCTTGCTA 120 AGGGTACTAG ACTACCAAAA TATTTCCCGT CAGGAAGATG TGTACGAGAG AACGAACGAT CCATGTAAGA CATGCCTGTG CTCCTCTTTT GCCTTCTGCC ATGATTGTGA GACCTCCCCA 180 GGTACATTCT GTACGGACAC GAGGAGAAAA CGGAAGACGG TACTAACACT CTGGAGGGGT GCCATGTGGA ACTGTGAGTA TCGAATTCCT GCAGCCCGGG GGATCCACTA GTTCTAGA 238 CGGTACACCT TGACACTCAT AGCTTAAGGA CGTCGGGCCC CCTAGGTGAT CAAGATCT
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫沈降法を利用したｐ５３が結合する断片の
スクリーニングの図である。
【図２】ｐ５３及び特異的抗体依存性テストの結果を示
す図である。
【図３】野生型及び変異型ｐ５３の断片Ａを沈澱させる
相対能力を示す図であり、バキュロウィルス発現システ
ムからアフィニティ精製した野生型及び変異２７３his
ｐ５３の量を増加させて標識したＣBE断片を沈澱するの
に使用した場合の結果を示す図である。
【図４】野生型及び変異型ｐ５３の断片Ａを沈澱させる
相対能力を示す図であり、野生型（ｗｔ）、変異型（１
７５his）ｐ５３、あるいはｐ５３タンパクなし（−）
を生産するワクシニア ウィルス システム（Ｖａｃ）
から調製した破砕液を用いて標識したＣBE断片を免疫沈
降した場合の結果を示す図である。
【図５】７７２ ＣBEの１０ｄサブクローンにおける断
片Ａ及び近傍のベクター配列図である。
【図６】ラムダ５Ｒの８ａサブクローンにおける断片Ｂ
及び近傍のベクター配列図である。
【図７】断片Ａ及びＢのサブ断片のワクシニアウィルス
感染細胞破砕液より得たｐ５３に対する結合を示すもの
で、断片Ａのサブ断片（サブクローン１０ｄ）を免疫沈
降法により、ワクシニアウィルス感染細胞破砕液より得
た野生型ｐ５３に対する結合能についてアッセイを行っ
た結果を示す図である。
【図８】図４Ａに図示されている断片Ａ（パネル１−
４）及び断片Ｂ（パネル５）サブ断片をバンドの左を標
識する。パネル４の”Ｖ”バンドはサブ断片６をクロー
ン化した２．９ｋｂのベクターに対応する。サブ断片８
（パネル５）は断片Ｂのｂｐ１０４−２３８（図３Ｂ参
照）を含んでいる。対照レーン（Ｃ）は、結合アッセイ
（Ｂ）に使用した標識ＤＮＡの２％を含んでいる。
【図９】断片Ａにおけるメチル化及び点変異のＤＮＡ結
合に与える影響を示すための、メチル化阻害アッセイの
結果を示す図である。
【図１０】断片Ａにおけるメチル化及び点変異のＤＮＡ
結合に与える影響を示すために、断片Ａの”変異型”サ
ブ断片（５ｍｕｔ１及び５ｍｕｔ２）の精製バキュロウ
ィルス生産ｐ５３に対する結合を調べた結果を示す図で
ある。
【図１１】トランスフェクトされたクローン系統のＲＮ
aseプロテクション アッセイおよびサザンブロット解
析を示す図である。
【図１２】図７Ａはプールしたクローンの発現を示す図
であり、図７ＢはＳＷ４８０プールのクローンのサザン
ブロット解析を示す図である。
【図１３】ｐ５３に結合するヒトゲノムＤＮＡ断片の単
離及び解析の為の実験概略を示す図である。
【図１４】単離クローン化したｐ５３に結合するヒトゲ
ノムＤＮＡ断片の免疫沈降（ＩＰ）アッセイの結果を示
す図である。
【図１５】ＤＮａｓｅＩプロテクション（ＤＰ）及びメ
チル化阻害（ＭＩ）によるｐ５３結合部位のマッピング
の結果を示す図である。
【図１６】ｐ５３に対する共通結合部位の決定の結果を
示す図である。
【図１７】合成オリゴヌクレオチドの野生型（ｗｔ）及
び変異型ｐ５３タンパクに対する結合において、１０ｂ
ｐの共通モノマー一つでは結合に不十分であったが、１
０ｂｐ共通配列の様々な方向のダイマー、あるいはそれ
以上の重合体は、ｐ５３に強く結合したことを示す図で
ある。
【図１８】合成オリゴヌクレオチドの野生型（ｗｔ）及
び変異型ｐ５３タンパクに対する結合において、共通ダ
イマーに対する野生型及び変異型ｐ５３の結合能を比較
した図である。
【図１９】トランスフェクションに用いたレポーター及
び発現構築を示し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ
＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内のレポーター構
築を示す図である。
【図２０】トランスフェクションに用いた発現ベクター
の構築を示す図である。
【図２１】免疫沈降アッセイを用いた、ｐ５３結合配列
の様々な長さのコンカテマー（ＰＧn シリーズ）の相対
的ＤＮＡ結合能を示す図である。
【図２２】クロラムフェニコール アセチルトランスフ
ェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイによって比較した各種のＰ
Ｇn コンカテマーを含むレポーターのトランス活性化効
率を示す図である。
【図２３】野生型と変異型ｐ５３の、コンカテマー化し
た結合配列（ＰＧ16）に対する結合能の比較とＭＧ15に
対する結合能の欠失を示す図である。
【図２４】ポリオーマウィルスプロモーターから様々な
距離に置かれたＰＧ13を持つレポーター効率を示す図で
ある。
【図２５】ＣＡＴの下流にＰＧ１６を持つ（ＣＡＴ−Ｐ
Ｇ16）レポーターのトランス活性化効率を示す図であ
る。
【図２６】代表的ＣＡＴアッセイ（表１の実験２）の結
果を示す図である。
【図２７】トランスフェクトした細胞におけるｐ５３の
発現のウェスタンブロット解析図である。
【図２８】一緒に発現させた１７５his変異型ｐ５３
が、野生型ｐ５３によるトランス活性化に与える影響を
示す図である。
【図２９】様々な変異型ｐ５３タンパクの優性−不活性
効果を示す図である。
【図３０】ｐ５３変異の影響に対する生化学的モデルの
図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/574 Ｃ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (71)出願人 592128320 ファーマジェニックス・インコーポレーテ ッド ＰＨＡＲＭＡＧＥＮＩＣＳ ＩＮＣＯＲＰ ＯＲＡＴＥＤ アメリカ合衆国ニュージャージー州07401, アレンデール，パール・コート ４ (72)発明者 バート・ヴォーゲルスタイン アメリカ合衆国メリーランド州21208，バ ルティモア，ブレトン・ウェイ 3700 (72)発明者 ケネス・ダブリュー・キンズラー アメリカ合衆国メリーランド州21234，バ ルティモア，ホルステッド・ロード 1348 (72)発明者 マイケル・アイ・シャーマン アメリカ合衆国ニュージャージー州07028, グレン・リッジ，フォレスト・アベニュー 314

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ｐ５３特異結合性ＤＮＡフラグメントをヒ
    トの組織からの細胞溶解物と接触させて、該ＤＮＡフラ
    グメントを該細胞溶解物中に存在する野性型ｐ５３と結
    合させ；該ＤＮＡフラグメントの野性型ｐ５３への結合
    を検出することにより、該細胞中の野性型ｐ５３蛋白質
    の存在を検出する、ことよりなる細胞中における野性型
    ｐ５３蛋白質の存在の検出方法。
  2. 【請求項２】ｐ５３特異結合性ＤＮＡセグメントが、配
    列番号１のヌクレオチド１０３から１３４を含む、請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】ｐ５３特異結合性ＤＮＡセグメントが、配
    列番号１のヌクレオチド１０４から１２３を含む、請求
    項１記載の方法。
  4. 【請求項４】ｐ５３特異結合性ＤＮＡフラグメントが、
    配列：５' −ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ−３' のモノマーを
    一つより多く含む、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】該複数モノマーの間に０ないし４０ヌクレ
    オチドが存在する、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】ＤＮＡフラグメントが、放射活性団、発色
    団または、螢光発生団からなる群から選択される検出可
    能団で標識されている、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】ｐ５３特異結合性ＤＮＡの量を測定する工
    程が、抗−ｐ５３モノクローナル抗体でｐ５３蛋白質を
    免疫沈降させることを含む、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】ヒトの組織片を用意し；該組織片を検出可
    能に標識したｐ５３特異結合性ＤＮＡフラグメントとイ
    ンキュベートして、該ＤＮＡフラグメントを該組織サン
    プル内に存在する野性型ｐ５３と結合させ；未結合ＤＮ
    Ａフラグメントを該組織片から除去し；そして該組織サ
    ンプルに結合したＤＮＡフラグメントの量を測定するこ
    とよりなる細胞内の野性型ｐ５３蛋白質の存在を検出す
    る方法。
  9. 【請求項９】ｐ５３特異結合性ＤＮＡセグメントが、配
    列番号１中のヌクレオチド１０３ないし１３４を含む、
    請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】ｐ５３特異結合性ＤＮＡセグメントが、
    配列番号１中のヌクレオチド１０４ないし１２３を含
    む、請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】ｐ５３特異結合性ＤＮＡフラグメント
    が、次の配列： ５' −ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹ−３’ のモノマーを一つより多く含む、請求項８記載の方法。
  12. 【請求項１２】該複数モノマーの間に０ないし４０のヌ
    クレオチドが存在する、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】ＤＮＡフラグメントが、放射活性団、発
    色団または、螢光発生団からなる群から選択される検出
    可能団で標識されている、請求項８記載の方法。
  14. 【請求項１４】ｐ５３特異結合性部位と特異的にコンプ
    レックスを形成する能力を有する化合物を細胞に供給す
    る工程を含む、細胞に対して野性型ｐ５３蛋白質の生理
    学的効果を付与する方法。
  15. 【請求項１５】化合物が、ｐ５３特異的ＤＮＡ結合部位
    とコンプレックスを形成することができる、一本鎖の線
    状もしくは環状のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌ
    クレオチド含有ヌクレオチド類縁体である、請求項１４
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】化合物がポリペプチドである、請求項１
    ４記載の方法。
  17. 【請求項１７】ポリペプチドがヒト野性型ｐ５３蛋白質
    の全部または一部を含む、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】オリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌク
    レオチド含有ヌクレオチド類縁体が、次式： ＲＲＲＣＷＷＧＹＹ のモノマー配列またはその相補配列を含む、請求項１５
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】該化合物が、モノマー配列：ＲＲＲＣＷ
    ＷＧＹＹの少なくとも一部分と、ヒトゲノム中で該モノ
    マー配列に隣接している配列を含む請求項１４記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】オリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌク
    レオチド含有ヌクレオチド類縁体が、前記配列のモノマ
    ーを一つより多く含む、請求項１８記載の方法。
  21. 【請求項２１】オリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌク
    レオチド含有ヌクレオチド類縁体が、該複数のモノマー
    の間に０ないし４０のヌクレオチドを含有する、請求項
    １８記載の方法。
  22. 【請求項２２】次式：ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹのモノマー
    配列を一つより多く有し、且つ不溶性ポリマー支持体に
    共有結合しているフラグメントからなる、ｐ５３特異的
    ＤＮＡ結合部位を含む二本鎖ＤＮＡフラグメント。
  23. 【請求項２３】ｐ５３特異的ＤＮＡ結合部位と特異的に
    コンプレックスを形成することができ、その際該結合部
    位は次式：ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹのモノマー配列を一つ
    より多く有するものである、一本鎖の線状もしくは環状
    のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド含有
    ヌクレオチド類縁体。
  24. 【請求項２４】下記オリゴヌクレオチドがｐ５３特異的
    結合部位の双方の鎖と複合体を形成することを可能にす
    るスイッチバックリンカーを一つ以上含む、請求項２３
    記載のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド
    含有ヌクレオチド類縁体。
  25. 【請求項２５】メチルホスホネート、アミノメチルホス
    ホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
    ト、置換もしくは未置換ホスホロアミデート、オリゴリ
    ボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、ア
    ルファ−オリゴヌクレオチドおよびこれらの混合物から
    なる群から選択される、請求項２３記載のオリゴヌクレ
    オチドもしくはオリゴヌクレオチド含有ヌクレオチド類
    縁体。
  26. 【請求項２６】３’または５’末端が、オリゴヌクレオ
    チド分解に対する感受性を減少させるか又は細胞による
    取り込みを促進する分子団で終了している、請求項２３
    記載のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド
    含有ヌクレオチド類縁体。
  27. 【請求項２７】前記分子団が、置換もしくは未置換アミ
    ノ、ポリエチレングリコール、ポリリジン、アクリジ
    ン、ドデカノール、およびコレステロールからなる群か
    ら選択される、請求項２６記載のオリゴヌクレオチドも
    しくはオリゴヌクレオチド含有ヌクレオチド類縁体。
  28. 【請求項２８】ｐ５３特異結合性ＤＮＡフラグメント
    を、試験すべき化合物と接触させて、該化合物を該ＤＮ
    Ａフラグメントと結合させ；該ＤＮＡフラグメントと結
    合した試験化合物の量を測定する；ことよりなる、ｐ５
    ３特異的ＤＮＡ結合配列と特異的に結合する化合物を同
    定する方法。
  29. 【請求項２９】可溶性ＤＮＡフラグメントを試験化合物
    および固体支持体に固定化したｐ５３特異結合性ＤＮＡ
    フラグメントとインキュベートし、その際、上記可溶性
    ＤＮＡフラグメントは野性型ｐ５３蛋白質との特異的結
    合能力をもたないものである、請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】固体支持体に固定化したｐ５３特異結合
    性ＤＮＡフラグメントを、試験化合物および野性型ｐ５
    ３蛋白質の双方と接触させ、野性型ｐ５３蛋白質を該Ｄ
    ＮＡフラグメントに結合させ；該ＤＮＡフラグメントに
    結合した野性型ｐ５３蛋白質の量を測定し、試験化合物
    による野性型ｐ５３蛋白質の結合の阻害を、試験化合物
    がｐ５３特異的ＤＮＡ結合配列への結合したことの指標
    とする；ことよりなる、ｐ５３特異的ＤＮＡ結合配列と
    特異的に結合する化合物を同定する方法。
  31. 【請求項３１】野性型ｐ５３遺伝子を、該遺伝子機能を
    失っている細胞に導入して、該遺伝子が該細胞内で発現
    するようにすることからなる、ｐ５３遺伝子の変異のた
    めに該遺伝子の機能を消失した細胞に、野性型ｐ５３遺
    伝子機能を付与する方法。
  32. 【請求項３２】野性型ｐ５３遺伝子が、該細胞内に存在
    するいずれの変異ｐ５３遺伝子よりも高レベルに発現さ
    れる、請求項３１記載の方法。
  33. 【請求項３３】導入された野性型ｐ５３遺伝子が、二重
    組換え現象により、細胞内に存在する内在変異ｐ５３遺
    伝子との組換えを生じて、ｐ５３遺伝子の変異を修正す
    る、請求項３１記載の方法。
  34. 【請求項３４】野性型ｐ５３遺伝子の一部分を、該遺伝
    子機能を失っている細胞に導入して、該遺伝子の一部分
    が該細胞内で発現するようにすることからなり、そして
    該一部分は該細胞の非腫瘍性成長のために要求されるｐ
    ５３蛋白質の一部分をコードするものであることからな
    る、ｐ５３遺伝子の変異のために該遺伝子の機能を消失
    した細胞に、野性型ｐ５３遺伝子機能を付与する方法。
  35. 【請求項３５】次式：ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹのモノマー
    を一つより多く有するコンセンサス結合部位に適合する
    ＤＮＡ分子に対して結合する、患者の癌細胞内に見いだ
    されるミュータント遺伝子にコードされるｐ５３蛋白質
    の量を測定し；試験すべき物質の存在下において、該Ｄ
    ＮＡ分子に対する該ｐ５３蛋白質の結合量を測定し；そ
    して該試験物質の存在下におけるｐ５３蛋白質の結合量
    を、該試験物質の不存在下におけるｐ５３蛋白質の結合
    量と比較し、結合量を増大させる試験物質を癌の治療に
    使用するための候補とする；ことよりなる癌の治療に用
    いるための薬剤を予備スクリーニングする方法。
  36. 【請求項３６】患者の癌細胞内に見いだされるミュータ
    ント遺伝子によりコードされるｐ５３蛋白質を含むトラ
    ンスフェクトされた細胞を、試験すべき物質およびレポ
    ーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物（この遺伝
    子構築物はアッセイ可能な生産物および次式：ＲＲＲＣ
    ＷＷＧＹＹＹのモノマーを一つより多く有するｐ５３コ
    ンセンサス結合部位に適合する配列をコードし、その
    際、該配列は該レポーター遺伝子の上流で且つ該レポー
    ター遺伝子に隣接している）と接触させ；そして該レポ
    ーター遺伝子の発現量が該試験物質によって変化したか
    どうか調べ、該レポーター遺伝子の発現量を変化させる
    試験物質を癌の治療に使用するための候補とする；こと
    よりなる癌の治療に用いるための薬剤を予備スクリーニ
    ングする方法。
  37. 【請求項３７】ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオ
    チドを転写構築物に添加し（この転写構築物は、レポー
    ター遺伝子を含み、該レポーター遺伝子はアッセイ可能
    な生成物および次式：ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹのモノマー
    を少なくとも二つ有するｐ５３コンセンサス結合部位に
    適合する配列をコードし、その際、該配列は該レポータ
    ー遺伝子の上流で且つ該レポーター遺伝子に隣接してい
    る）、この添加工程は試験物質の存在および不存在下に
    行われ；そして試験物質の存在により前記レポーター遺
    伝子の転写量が変化するかどうかを調べ、該レポーター
    遺伝子の転写量を変化させる試験物質を癌の治療に使用
    するための候補とする；ことよりなる癌の治療に用いる
    ための薬剤を予備スクリーニングする方法。
  38. 【請求項３８】アッセイ可能な生産物をコードするレポ
    ーター遺伝子；該レポーター遺伝子の上流に隣接して存
    在する、次式：ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹのモノマーを一つ
    より多く有するｐ５３コンセンサス結合部位と一致する
    配列からなり、前記ＤＮＡ構築物は組換えプラスミド、
    ウイルスベクターまたは単離されたＤＮＡ分子からなる
    群から選択される、化学療法剤候補のスクリーニングに
    用いるためのＤＮＡ構築物。
  39. 【請求項３９】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感
    染している疑いのある患者の細胞または細胞抽出物をｐ
    ５３特異結合性ＤＮＡフラグメントと接触させ；該ＤＮ
    Ａフラグメントに対して結合する細胞または細胞抽出物
    中の野性型ｐ５３の量を検出し、結合ｐ５３の不存在を
    ｐ５３を抑制するＨＰＶ株の感染の指標とする；ことよ
    りなるＨＰＶの腫瘍もしくは過形成誘発株の診断方法。
  40. 【請求項４０】試験すべき物質とトランスフェクトされ
    た細胞を接触させるが、その際、該形質転換細胞は野性
    型ｐ５３蛋白質およびレポーター遺伝子構築物とを含ん
    でおり、該レポーター遺伝子構築物はアッセイ可能な生
    産物をコードするレポーター遺伝子および一つの配列を
    含み、該一つの配列は次式：ＲＲＲＣＷＷＧＹＹＹのモ
    ノマーを一つより多く有するｐ５３コンセンサス結合部
    位に適合するものであり且つ該レポーター遺伝子の上流
    に該レポーター遺伝子に隣接して存在するものであり；
    そして該試験物質により該レポーター遺伝子の発現の量
    が変更されたか否かを調べ、該レポーター遺伝子の発現
    の量を変更する試験物質を、癌療法に用いるための候補
    とする；ことよりなる癌の治療に用いるための薬剤の予
    備スクリーニング方法。
  41. 【請求項４１】癌患者に見られる変異遺伝子によりコー
    ドされるｐ５３蛋白質およびランダムなオリゴヌクレオ
    チドの調製物を、固体支持体に固定化したｐ５３特異結
    合性ＤＮＡフラグメントに添加し；固体支持体に結合し
    たオリゴヌクレオチドを回収する；ことよりなる癌の治
    療に用いるためのオリゴヌクレオチドの予備スクリーニ
    ング方法。
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