DE19847779C1 - p53-Bindungsregionen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft p53-Bindungsregionen auf einer CD95-Rezeptor-DNA und die Verwendung der p53-Bindungsregionen zur Beeinflussung von Apoptose bzw. zur Identifizierung von hierfür geeigneten Substanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft p53-Bindungsregionen auf einer CD95-Rezep­ tor-DNA und die Verwendung der p53-Bindungsregionen zur Beeinflussung von Apoptose bzw. zur Identifizierung von hierfür geeigneten Substanzen.

p53 ist ein Tumorsuppressor, der bei DNA-Schäden induziert wird. Er aktiviert dann Zielgene, wodurch ein Wachstumsstillstand bei den die DNA-Schäden auf­ weisenden Zeilen mit anschließender Reparatur der DNA-Schäden bzw. dem Tod der Zellen erreicht wird. Letzteres erfolgt durch Apoptose.

Eine Chemotherapie zielt darauf ab, in Tumorzellen DNA-Schäden zu verursa­ chen. Diese sollen dann zur Induzierung von p53 und letztlich zum Tod der Tumorzellen führen. Vielfach zeigt sich allerdings, daß bestimmte Tumorzellen resistent gegen Chemotherapeutika sind oder nach kurzer Behandlungszeit resistent werden. Die Gründe hierfür sind bisher nicht genau bekannt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem die Resistenz gegen Chemotherapeutika untersucht und gegebe­ nenfalls in sie eingegriffen werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß die Induktion von p53 durch Chemotherapeutika zu einer direkten Aktivierung von Apoptose führt. Insbesondere hat er gefunden, daß p53 zu einer Aktivierung von CD95-vermittelter Apoptose führt, indem p53 sowohl die Expression des CD95- Liganden als auch des CD95-Rezeptors induziert. Letzeres erfolgt dadurch, daß p53 über p53-Bindungsregionen an CD95-Rezeptor-DNA bindet. Solche Bin­ dungsregionen liegen im Intron 1 bzw. dem Promotor der CD95-Rezeptor-DNA vor. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß Resistenzen gegenüber Chemothera­ peutika darauf beruhen können, daß p53 nicht mehr an die vorstehenden p53- Bindungsregionen binden kann (vgl. Tabelle 1 und Fig. 1-6).

Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, eine p53- Bindungsregion einer CD95-Rezeptor-DNA bereitzustellen.

Der Ausdruck "p53-Bindungsregion" umfaßt jegliche Region einer CD95-Rezep­ tor-DNA, an die ein p53 binden und die CD95-Rezeptor-DNA aktivieren, d. h. zur Transkription veranlassen, kann. Der Ausdruck "p53" umfaßt ein p53 in Wild­ typ-Form wie auch ein p53 in veränderter Form, das vorstehende Funktion noch aufweist. Eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion kann durch übliche Verfahren identifiziert und bereitgestellt werden. Günstig ist es, eine CD95- Rezeptor-DNA (vgl. Behrmann, I. et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994), 3057-3962) mit Sau 3A1 zu spalten und die Fragmente in die BamHI-Stelle von pBlueScript II KS⁺ zu inserieren. Die klonierten CD95-Rezeptor-DNA-Fragmente werden in DNA-Bindungsexperimente eingesetzt, in denen Zellextrakte aus den Tumorzellen H1299 verwendet werden, die vorher mit einem für p53 kodierenden Expres­ sionsvektor, z. B. pCMVp53wt, transfiziert worden sind. Gebundene DNA-Frag­ mente werden mit einer Reporter-DNA, z. B. Luciferase-DNA, fusioniert. Dies kann z. B. in den Expressionsvektoren pGL3-Basic (Promega) bzw. pTATA-LUC (Wirth, T., Würzburg, Deutschland) erfolgen. Erhaltene Expressionsplasmide werden in Luciferase-Aktivitätstests auf ihre Aktivierbarkeit untersucht.

In bevorzugter Ausführungsform umfaßt eine p53-Bindungsregion die Sequenz von Fig. 4 und/oder Fig. 5 bzw. eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz. Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaa­ re unterschiedliche Sequenz" umfaßt jegliche Sequenz einer CD95-Rezeptor- DNA, die mit der DNA von Fig. 4 und/oder Fig. 5 hybridisiert und an die ein p53 binden und die CD95-Rezeptor-DNA aktivieren kann. Die Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 4 und/oder Fig. 5 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedin­ gungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Sequenz, hin.

Eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion kann als solche oder in Kombination mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion in einem Vektor, gegebenenfalls in Kombination mit einer Reporter-DNA, z. B. Luciferase-DNA, vorliegen. Bevorzugte Kombinationen sind die DNA-Konstrukte CD95(Ps)-LUC, CD95(P)-LUC, CD95(I + SV)-LUC und CD95(Ps + I)-LUC, die in den Expressionsvektoren pGL3-Basic bzw. pTATA-LUC vorliegen (vgl. nachstehend).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, umfassend eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion (a) und übliche Hilfsstoffe (b), wie Puffer, Lösungsmittel, Träger, Kontrollen, etc. Von der p53-Bindungsregion können ein oder mehrere Vertreter vorliegen. Auch gelten die vorstehenden Ausführungen entsprechend.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Mechanismen auf molekularer Ebene zu untersuchen, die sich bei der Schädigung von DNA ergeben. Solche Mechanis­ men umfassen die Reaktion der Zellen zur Behebung des DNA-Schadens bzw. zu ihrer eigenen Abtötung. Letzteres sind apoptotische Vorgänge. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es insbesondere Mechanismen zu untersuchen, die sich bei einer Chemotherapie ergeben. Ganz besonders können Resistenzen gegen Chemotherapeutika ursächlich untersucht werden. Beispielsweise kann mit einer erfindungsgemäßen p53-Bindungsregion festgestellt werden, ob ein aus Tumor­ zellen stammendes p53 noch eine Apoptose induzieren kann.

Ferner eignet sich die vorliegende Erfindung Substanzen zu identifizieren, die Apoptose beeinflussen können. Diese Beeinflussung kann eine Induktion oder eine Inhibition sein. Hierzu ist es günstig, eine erfindungsgemäße p53-Bindungs­ region in Kombination mit einer Reporter-DNA in Zellen einzuführen, diesen die zu identifizierenden Substanzen zuzugeben, und auf die trans-aktivierende bzw. trans-inhibierende Wirkung der Substanzen zu selektieren. Mit diesen Substan­ zen können p53-Bindungsregionen in einer CD95-Rezeptor-DNA aktiviert bzw. inhibiert werden, wodurch eine Apoptose induziert bzw. gehemmt werden kann.

Die vorliegende Erfindung liefert somit Mittel, mit denen in apoptotische Vor­ gänge eingegriffen werden kann. Insbesondere kann die Resistenz gegen Chemo­ therapeutika angegangen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Expression des CD95-Rezeptors in Tumorzellen nach Behandlung mit Chemotherapeutika. Klinisch relevante Konzen­ trationen der Chemotherapeutika sind mit einem Stern gekenn­ zeichnet. Die Tumorzellen exprimieren p53, kein p53 (-/- p53) bzw. p53, das in der Bindung an eine erfindungsgemäße p53-Bindungs­ region einer CD95-Rezeptor-DNA gestört ist (mt p53).

Fig. 2 zeigt die Antwort von mit Chemotherapeutika behandelten Tumor­ zellen auf die Induktion von Apoptose durch CD95-Rezeptor-Stimu­ lation.

Fig. 3 zeigt die Expression des CD95-Rezeptors in mit einem Chemothera­ peutikum behandelten Tumorzellen, wobei die Tumorzellen erst nach Transfektion mit einem für p53 kodierenden Expressionsplas­ mid p53 exprimieren.

Fig. 4 zeigt eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion (p53 BE) inner­ halb des Introns 1 einer CD95-Rezeptor-DNA.

Fig. 5 zeigt eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion (p53 BE) inner­ halb des Promotors einer 9 Exons-umfassenden CD95-Rezeptor- DNA. Der Promotor weist drei p53-Bindungsregionen auf.

Fig. 6 zeigt die Expression einer Luciferase-DNA nach Bindung von p53 an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion innerhalb eines die Luciferase-DNA enthaltenden Expressionsplasmids.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1: Nachweis der Expression des CD95-Rezeptors in mit Chemothera­ peutika behandelten Tumorzellen (A) sowie der Antwort dieser Tumorzellen gegenüber der Induktion von Apoptose durch CD95- Rezeptor-Stimulation (B).

• A) Die Tumorzellen HepG2 (humanes Hepatoblastom), AGS (Colon­ karzinom) HS746T (Magenkarzinom), MCF-7 (Brustkrebs), Hep3B (humanes Hepatoblastom), Huh7 (Hepatocellkarzinom) und HT29 (Colonkarzinom) werden mit den Chemotherapeutika Bleomycin, 5- Fluorouracil, Methotrexat, Mitomycin und Cisplatin behandelt. Hep- G2, AGS, HS746T und MC-7 exprimieren ein p53, das an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion bindet. Hep3B exprimiert kein p53. Huh7 und HT29 exprimieren ein p53, das in seiner Bin­ dung an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion gestört ist. Die Expression des CD95-Rezeptors wird durch FACScan be­ stimmt. Hierzu werden ein biotinylierter Anti-APO-1 (CD95-Rezep­ tor)-Antikörper und Quantum Red-Streptavidin (Sigma) als zweites Reagens für eine indirekte Immunfluoreszenz verwendet (vgl. Fig. 1).
  Es zeigt sich, daß nur die Tumorzellen HepG2, AGS, HS746T und MCF-7, deren p53 an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion bindet, eine CD95-Rezeptor-Expression aufweisen.
• B) Die Tumorzellen HepG2, Huh7 und Hep3B (vgl. (A)) werden mit den Chemotherapeutika 5-Fluorouracil, Methotrexat, Mitomycin, Cisplatin, Mitoxantron, Doxorubicin, Etoposid und Cyclophospha­ mid 48 h bzw. weitere 24 h in Kombination mit 100 ng/ml IgG3- Anti-APO-1-Antikörper behandelt. Der Antikörper bewirkt eine CD95-Rezeptor-Stimulation. Es wird die Lebendzellrate bestimmt. Hierzu wird der MTT-Test durchgeführt, bei dem die Fähigkeit von lebenden Zellen bestimmt wird, lösliches gelbes Tetrazoliumsalz (MTT) in blaue Formazan-Kristalle zu reduzieren (vgl. Fig. 2).
  Es zeigt sich, daß nur die Tumorzelle HepG2, deren p53 an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion bindet, eine verstärkte Antwort auf die Induktion von Apoptose aufweist.

Beispiel 2: Nachweis der Expression des CD95-Rezeptors in mit Bleomycin behandelten Tumorzellen, wobei die Tumorzellen erst nach Trans­ fektion p53 exprimieren.

Die Tumorzellen Hep3B (0.6 × 10⁶ Zellen), die normalerweise kein p53 exprimieren, werden mit 1 µg des für p53 kodierenden Expres­ sionsvektors pCMVp53wt mittels des Calciumphosphat-Copräzipi­ tationsverfahrens transfiziert. Anschließend werden die Tumorzel­ len mit Bleomycin behandelt. Es wird die Expression des CD95- Rezeptors durch FACScan bestimmt (vgl. Beispiel 1(A); Fig. 3).

Es zeigt sich, daß durch die Expression von p53 eine Expression des CD95-Rezeptors erhalten wird.

Beispiel 3: Nachweis der Expression von Luciferase-DNA durch Bindung von p53 an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion.

Es werden Expressionsplasmide hergestellt, wobei als Vektor der Expressionsvektor pGL3-Basic verwendet wird. In diesen Vektor werden die folgenden CD95-Rezeptor-DNA/Luciferase-DNA-Kon­ strukte inseriert:

CD95(Ps)-LUC

Die Luciferase-DNA ist verbunden über ihr 5'-Ende mit einer 1.43 kB Promotor-Region und dem 5'-Ende von Exon 1 der CD95-Rezep­ tor-DNA (HindIII-SacII-Fragment, vgl. Fig. 5 und 6).

CD95(P)-LUC

Die Luciferase-DNA ist verbunden über ihr 5'-Ende mit einer 1.9 kB Promotor-Region und dem 5'-Ende von Exon 1 der CD95-Rezeptor- DNA (vgl. Fig. 5 und 6).

CD95(I + SV)-LUC

Die Luciferase-DNA ist verbunden über ihr 5'-Ende mit dem "mini­ mal" SV40 Promotor und einem 0.7 kB Intron 1-Fragment der CD95-Rezeptor-DNA (vgl. Fig. 4 und 6).

CD95(Ps + I)-LUC

Die Luciferase-DNA ist verbunden über ihr 5'-Ende mit einem 0.7 kb Intron 1-Fragment und einer 1.43 kb Promotor-Region der CD95-Rezeptor-DNA (vgl. Fig. 4 und 6).

Die vorstehenden Expressionsplasmide (jeweils 1 µg) werden in Hep3B Tumorzellen transfiziert. Ebenfalls wird der Expressions­ vektor pCMVp53wt (jeweils 100 ng) transfiziert. Beide Transfektio­ nen erfolgen über das Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren. Es wird ein üblicher Luciferase-Test durchgeführt (vgl. Fig. 6).

Es zeigt sich, daß mittels der DNA-Konstrukte CD95(PS)-LUC und CD95(P)-LUC eine etwa 2-fache Aktivierung der Luciferase gegen­ über einer Kontrolle erreicht wird. Eine noch stärkere Aktivierung wird erreicht, wenn das DNA-Konstrukt CD95(I + SV)-LUC und insbesondere das DNA-Konstrukt CD95(PS + I)-LUC verwendet wird. In letzterem Fall beträgt die Aktivierung etwa den Faktor 50.

Claims (8)

1. p53-Bindungsregion einer CD95-Rezeptor-DNA.

2. p53-Bindungsregion nach Anspruch 1, wobei sie die Sequenz von Fig. 4 und/oder Fig. 5 bzw. eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz umfaßt, wobei letztere Sequenz eine Sequenz einer CD95-Rezeptor-DNA ist, die mit der DNA von Fig. 4 und/oder Fig. 5 hybridisiert und an die ein p53 binden und die CD95-Rezeptor-DNA aktivieren kann.

3. Vektor, umfassend die p53-Bindungsregion nach Anspruch 1 oder 2.

4. Vektor nach Anspruch 3, wobei er ferner eine Reporter-DNA umfaßt.

5. Verwendung der p53-Bindungsregion nach Anspruch 1 oder 2 bzw. des Vektors nach Anspruch 3 oder 4 zur Identifizierung von Apoptose beeinflussenden Substanzen.

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Substanzen im Rahmen einer Chemotherapie eingesetzt werden.

7. Verfahren zur Beeinflussung von Apoptose, umfassend die Aktivierung oder Inhibierung der p53-Bindungsregion nach Anspruch 1 oder 2.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Beeinflussung im Rahmen einer Chemotherapie erfolgt.