DE19847779C1 - p53-Bindungsregionen - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft p53-Bindungsregionen auf einer CD95-Rezeptor-DNA und die Verwendung der p53-Bindungsregionen zur Beeinflussung von Apoptose bzw. zur Identifizierung von hierfür geeigneten Substanzen.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft p53-Bindungsregionen auf einer CD95-Rezep
tor-DNA und die Verwendung der p53-Bindungsregionen zur Beeinflussung von
Apoptose bzw. zur Identifizierung von hierfür geeigneten Substanzen.
p53 ist ein Tumorsuppressor, der bei DNA-Schäden induziert wird. Er aktiviert
dann Zielgene, wodurch ein Wachstumsstillstand bei den die DNA-Schäden auf
weisenden Zeilen mit anschließender Reparatur der DNA-Schäden bzw. dem Tod
der Zellen erreicht wird. Letzteres erfolgt durch Apoptose.
Eine Chemotherapie zielt darauf ab, in Tumorzellen DNA-Schäden zu verursa
chen. Diese sollen dann zur Induzierung von p53 und letztlich zum Tod der
Tumorzellen führen. Vielfach zeigt sich allerdings, daß bestimmte Tumorzellen
resistent gegen Chemotherapeutika sind oder nach kurzer Behandlungszeit
resistent werden. Die Gründe hierfür sind bisher nicht genau bekannt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu
stellen, mit dem die Resistenz gegen Chemotherapeutika untersucht und gegebe
nenfalls in sie eingegriffen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen
erreicht.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß die
Induktion von p53 durch Chemotherapeutika zu einer direkten Aktivierung von
Apoptose führt. Insbesondere hat er gefunden, daß p53 zu einer Aktivierung von
CD95-vermittelter Apoptose führt, indem p53 sowohl die Expression des CD95-
Liganden als auch des CD95-Rezeptors induziert. Letzeres erfolgt dadurch, daß
p53 über p53-Bindungsregionen an CD95-Rezeptor-DNA bindet. Solche Bin
dungsregionen liegen im Intron 1 bzw. dem Promotor der CD95-Rezeptor-DNA
vor. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß Resistenzen gegenüber Chemothera
peutika darauf beruhen können, daß p53 nicht mehr an die vorstehenden p53-
Bindungsregionen binden kann (vgl. Tabelle 1 und Fig. 1-6).
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, eine p53-
Bindungsregion einer CD95-Rezeptor-DNA bereitzustellen.
Der Ausdruck "p53-Bindungsregion" umfaßt jegliche Region einer CD95-Rezep
tor-DNA, an die ein p53 binden und die CD95-Rezeptor-DNA aktivieren, d. h. zur
Transkription veranlassen, kann. Der Ausdruck "p53" umfaßt ein p53 in Wild
typ-Form wie auch ein p53 in veränderter Form, das vorstehende Funktion noch
aufweist. Eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion kann durch übliche
Verfahren identifiziert und bereitgestellt werden. Günstig ist es, eine CD95-
Rezeptor-DNA (vgl. Behrmann, I. et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994), 3057-3962)
mit Sau 3A1 zu spalten und die Fragmente in die BamHI-Stelle von pBlueScript
II KS+ zu inserieren. Die klonierten CD95-Rezeptor-DNA-Fragmente werden in
DNA-Bindungsexperimente eingesetzt, in denen Zellextrakte aus den Tumorzellen
H1299 verwendet werden, die vorher mit einem für p53 kodierenden Expres
sionsvektor, z. B. pCMVp53wt, transfiziert worden sind. Gebundene DNA-Frag
mente werden mit einer Reporter-DNA, z. B. Luciferase-DNA, fusioniert. Dies
kann z. B. in den Expressionsvektoren pGL3-Basic (Promega) bzw. pTATA-LUC
(Wirth, T., Würzburg, Deutschland) erfolgen. Erhaltene Expressionsplasmide
werden in Luciferase-Aktivitätstests auf ihre Aktivierbarkeit untersucht.
In bevorzugter Ausführungsform umfaßt eine p53-Bindungsregion die Sequenz
von Fig. 4 und/oder Fig. 5 bzw. eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare
unterschiedliche Sequenz. Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaa
re unterschiedliche Sequenz" umfaßt jegliche Sequenz einer CD95-Rezeptor-
DNA, die mit der DNA von Fig. 4 und/oder Fig. 5 hybridisiert und an die ein p53
binden und die CD95-Rezeptor-DNA aktivieren kann. Die Sequenz kann sich von
der DNA von Fig. 4 und/oder Fig. 5 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen
und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Der
Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedin
gungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Sequenz, hin.
Eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion kann als solche oder in Kombination
mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße
p53-Bindungsregion in einem Vektor, gegebenenfalls in Kombination mit einer
Reporter-DNA, z. B. Luciferase-DNA, vorliegen. Bevorzugte Kombinationen sind
die DNA-Konstrukte CD95(Ps)-LUC, CD95(P)-LUC, CD95(I + SV)-LUC und
CD95(Ps + I)-LUC, die in den Expressionsvektoren pGL3-Basic bzw. pTATA-LUC
vorliegen (vgl. nachstehend).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, umfassend eine
erfindungsgemäße p53-Bindungsregion (a) und übliche Hilfsstoffe (b), wie
Puffer, Lösungsmittel, Träger, Kontrollen, etc. Von der p53-Bindungsregion
können ein oder mehrere Vertreter vorliegen. Auch gelten die vorstehenden
Ausführungen entsprechend.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Mechanismen auf molekularer Ebene zu
untersuchen, die sich bei der Schädigung von DNA ergeben. Solche Mechanis
men umfassen die Reaktion der Zellen zur Behebung des DNA-Schadens bzw. zu
ihrer eigenen Abtötung. Letzteres sind apoptotische Vorgänge. Die vorliegende
Erfindung ermöglicht es insbesondere Mechanismen zu untersuchen, die sich bei
einer Chemotherapie ergeben. Ganz besonders können Resistenzen gegen
Chemotherapeutika ursächlich untersucht werden. Beispielsweise kann mit einer
erfindungsgemäßen p53-Bindungsregion festgestellt werden, ob ein aus Tumor
zellen stammendes p53 noch eine Apoptose induzieren kann.
Ferner eignet sich die vorliegende Erfindung Substanzen zu identifizieren, die
Apoptose beeinflussen können. Diese Beeinflussung kann eine Induktion oder
eine Inhibition sein. Hierzu ist es günstig, eine erfindungsgemäße p53-Bindungs
region in Kombination mit einer Reporter-DNA in Zellen einzuführen, diesen die
zu identifizierenden Substanzen zuzugeben, und auf die trans-aktivierende bzw.
trans-inhibierende Wirkung der Substanzen zu selektieren. Mit diesen Substan
zen können p53-Bindungsregionen in einer CD95-Rezeptor-DNA aktiviert bzw.
inhibiert werden, wodurch eine Apoptose induziert bzw. gehemmt werden kann.
Die vorliegende Erfindung liefert somit Mittel, mit denen in apoptotische Vor
gänge eingegriffen werden kann. Insbesondere kann die Resistenz gegen Chemo
therapeutika angegangen werden.
Fig. 1 zeigt die Expression des CD95-Rezeptors in Tumorzellen nach
Behandlung mit Chemotherapeutika. Klinisch relevante Konzen
trationen der Chemotherapeutika sind mit einem Stern gekenn
zeichnet. Die Tumorzellen exprimieren p53, kein p53 (-/- p53) bzw.
p53, das in der Bindung an eine erfindungsgemäße p53-Bindungs
region einer CD95-Rezeptor-DNA gestört ist (mt p53).
Fig. 2 zeigt die Antwort von mit Chemotherapeutika behandelten Tumor
zellen auf die Induktion von Apoptose durch CD95-Rezeptor-Stimu
lation.
Fig. 3 zeigt die Expression des CD95-Rezeptors in mit einem Chemothera
peutikum behandelten Tumorzellen, wobei die Tumorzellen erst
nach Transfektion mit einem für p53 kodierenden Expressionsplas
mid p53 exprimieren.
Fig. 4 zeigt eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion (p53 BE) inner
halb des Introns 1 einer CD95-Rezeptor-DNA.
Fig. 5 zeigt eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion (p53 BE) inner
halb des Promotors einer 9 Exons-umfassenden CD95-Rezeptor-
DNA. Der Promotor weist drei p53-Bindungsregionen auf.
Fig. 6 zeigt die Expression einer Luciferase-DNA nach Bindung von p53
an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion innerhalb eines die
Luciferase-DNA enthaltenden Expressionsplasmids.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
- A) Die Tumorzellen HepG2 (humanes Hepatoblastom), AGS (Colon
karzinom) HS746T (Magenkarzinom), MCF-7 (Brustkrebs), Hep3B
(humanes Hepatoblastom), Huh7 (Hepatocellkarzinom) und HT29
(Colonkarzinom) werden mit den Chemotherapeutika Bleomycin, 5-
Fluorouracil, Methotrexat, Mitomycin und Cisplatin behandelt. Hep-
G2, AGS, HS746T und MC-7 exprimieren ein p53, das an eine
erfindungsgemäße p53-Bindungsregion bindet. Hep3B exprimiert
kein p53. Huh7 und HT29 exprimieren ein p53, das in seiner Bin
dung an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion gestört ist.
Die Expression des CD95-Rezeptors wird durch FACScan be
stimmt. Hierzu werden ein biotinylierter Anti-APO-1 (CD95-Rezep
tor)-Antikörper und Quantum Red-Streptavidin (Sigma) als zweites
Reagens für eine indirekte Immunfluoreszenz verwendet (vgl.
Fig. 1).
Es zeigt sich, daß nur die Tumorzellen HepG2, AGS, HS746T und MCF-7, deren p53 an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion bindet, eine CD95-Rezeptor-Expression aufweisen. - B) Die Tumorzellen HepG2, Huh7 und Hep3B (vgl. (A)) werden mit
den Chemotherapeutika 5-Fluorouracil, Methotrexat, Mitomycin,
Cisplatin, Mitoxantron, Doxorubicin, Etoposid und Cyclophospha
mid 48 h bzw. weitere 24 h in Kombination mit 100 ng/ml IgG3-
Anti-APO-1-Antikörper behandelt. Der Antikörper bewirkt eine
CD95-Rezeptor-Stimulation. Es wird die Lebendzellrate bestimmt.
Hierzu wird der MTT-Test durchgeführt, bei dem die Fähigkeit von
lebenden Zellen bestimmt wird, lösliches gelbes Tetrazoliumsalz
(MTT) in blaue Formazan-Kristalle zu reduzieren (vgl. Fig. 2).
Es zeigt sich, daß nur die Tumorzelle HepG2, deren p53 an eine erfindungsgemäße p53-Bindungsregion bindet, eine verstärkte Antwort auf die Induktion von Apoptose aufweist.
Die Tumorzellen Hep3B (0.6 × 106 Zellen), die normalerweise kein
p53 exprimieren, werden mit 1 µg des für p53 kodierenden Expres
sionsvektors pCMVp53wt mittels des Calciumphosphat-Copräzipi
tationsverfahrens transfiziert. Anschließend werden die Tumorzel
len mit Bleomycin behandelt. Es wird die Expression des CD95-
Rezeptors durch FACScan bestimmt (vgl. Beispiel 1(A); Fig. 3).
Es zeigt sich, daß durch die Expression von p53 eine Expression
des CD95-Rezeptors erhalten wird.
Es werden Expressionsplasmide hergestellt, wobei als Vektor der
Expressionsvektor pGL3-Basic verwendet wird. In diesen Vektor
werden die folgenden CD95-Rezeptor-DNA/Luciferase-DNA-Kon
strukte inseriert:
Die Luciferase-DNA ist verbunden über ihr 5'-Ende mit einer 1.43
kB Promotor-Region und dem 5'-Ende von Exon 1 der CD95-Rezep
tor-DNA (HindIII-SacII-Fragment, vgl. Fig. 5 und 6).
Die Luciferase-DNA ist verbunden über ihr 5'-Ende mit einer 1.9 kB
Promotor-Region und dem 5'-Ende von Exon 1 der CD95-Rezeptor-
DNA (vgl. Fig. 5 und 6).
Die Luciferase-DNA ist verbunden über ihr 5'-Ende mit dem "mini
mal" SV40 Promotor und einem 0.7 kB Intron 1-Fragment der
CD95-Rezeptor-DNA (vgl. Fig. 4 und 6).
Die Luciferase-DNA ist verbunden über ihr 5'-Ende mit einem 0.7
kb Intron 1-Fragment und einer 1.43 kb Promotor-Region der
CD95-Rezeptor-DNA (vgl. Fig. 4 und 6).
Die vorstehenden Expressionsplasmide (jeweils 1 µg) werden in
Hep3B Tumorzellen transfiziert. Ebenfalls wird der Expressions
vektor pCMVp53wt (jeweils 100 ng) transfiziert. Beide Transfektio
nen erfolgen über das Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren.
Es wird ein üblicher Luciferase-Test durchgeführt (vgl. Fig. 6).
Es zeigt sich, daß mittels der DNA-Konstrukte CD95(PS)-LUC und
CD95(P)-LUC eine etwa 2-fache Aktivierung der Luciferase gegen
über einer Kontrolle erreicht wird. Eine noch stärkere Aktivierung
wird erreicht, wenn das DNA-Konstrukt CD95(I + SV)-LUC und
insbesondere das DNA-Konstrukt CD95(PS + I)-LUC verwendet
wird. In letzterem Fall beträgt die Aktivierung etwa den Faktor 50.
Claims (8)
1. p53-Bindungsregion einer CD95-Rezeptor-DNA.
2. p53-Bindungsregion nach Anspruch 1, wobei sie die Sequenz
von Fig. 4 und/oder Fig. 5 bzw. eine hiervon durch ein oder
mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz umfaßt, wobei
letztere Sequenz eine Sequenz einer CD95-Rezeptor-DNA ist,
die mit der DNA von Fig. 4 und/oder Fig. 5 hybridisiert und
an die ein p53 binden und die CD95-Rezeptor-DNA aktivieren
kann.
3. Vektor, umfassend die p53-Bindungsregion nach Anspruch 1
oder 2.
4. Vektor nach Anspruch 3, wobei er ferner eine Reporter-DNA
umfaßt.
5. Verwendung der p53-Bindungsregion nach Anspruch 1 oder 2
bzw. des Vektors nach Anspruch 3 oder 4 zur Identifizierung
von Apoptose beeinflussenden Substanzen.
6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Substanzen im Rahmen
einer Chemotherapie eingesetzt werden.
7. Verfahren zur Beeinflussung von Apoptose, umfassend die
Aktivierung oder Inhibierung der p53-Bindungsregion nach
Anspruch 1 oder 2.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Beeinflussung im
Rahmen einer Chemotherapie erfolgt.
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