Aus
dem Stand der Technik sind Testsysteme und Verbindungen bekannt,
bei denen der Nachweis einer Proteaseaktivität beispielsweise auf der Messung
einer geänderten
Fluoreszenz beruht. Lindsten et al. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
2001, Vol. 45, Seiten 2616–2622)
beschreibt ein chimäres
Nukleinsäurekonstrukt,
bestehend aus dem für
eine inaktive Vorstufe der HIV-1p-Protease kodierenden Bereich und dem
für das
so genannte „Green
Fluorescent Protein" (GFP)
kodierenden Bereich. Nach Einbringen und Expression in einer Zielzelle
werden die beiden fusionierten Anteile des Konstrukts durch die
autokatalytische Aktivität
der HIV-1p gespalten, so dass sich die Wirkung der Protease entfaltet,
was anhand der GFP-basierenden Fluoreszenz bestimmt werden kann.
Mit diesem System lässt
sich die Aktivität
der Protease jedoch nicht direkt nachweisen, sondern nur ihr toxischer
Effekt auf die betroffene Zelle, da die Protease zytotoxisch ist
und die grün
fluoreszierenden Zellen absterben.
Seit
Beginn der neunziger Jahre hat sich eine Fluoreszenz-basierende
Nachweismethode etabliert, die dem Fachmann unter der Bezeichnung „Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer" (FRET) bekannt ist.
Mit der FRET-Methode werden üblicherweise
Distanzen zwischen Molekülen
gemessen. Entweder wird die Distanz zweier fluoreszierender Verbindungen
(Fluorophore) voneinander auf einem einzigen Konstrukt, das heißt der Abstand
zwischen den Enden bestimmt, oder man ermittelt die Distanz zweier
Fluorophore auf zwei verschiedenen Molekülen. In einem typischen FRET-Experiment
werden die interessierenden Moleküle mit zwei unterschiedlichen
Fluorophoren verknüpft.
Ein Fluorophor wird als „Donor", das andere als „Akzeptor" bezeichnet. Die
Lichtabsorption des Donors (z.B. 350 nm) erfolgt bei kürzerer Wellenlänge als
die des Akzeptors (z.B. 450 nm). Beim FRET wird nun die Anregungsenergie
vom Donor über
Fluoreszenz auf den Akzeptor übertragen,
der bis zu 90 Angström
entfernt sein kann. Die übertragene
Energie führt
zur elektronischen Anregung des Akzeptors, wobei die Fluoreszenz
des Donors „gelöscht" wird. Gibt der Akzeptor
seine Anregungsenergie in Form von Fluoreszenzlicht ab, so beginnt
die Verbindung nach dem FRET zu fluoreszieren.
Die
Effizienz des Energietransfers hängt
von der Größe der Überlappung
des Emissionsspektrums des Donors mit dem Absorptionsspektrum des
Akzeptors, der relativen Orientierung der Donor- und Akzeptor-Übergangsdipole
und dem Abstand zwischen Donor und Akzeptor ab. Aus dem letztgenannten
ergibt sich, dass eine experimentell herbei geführte, räumliche Trennung zwischen Donor
und Akzeptor zu einer im Vergleich zur Ausgangssituation verringerten
emittierten Fluoreszenz des Akzeptors führt. Ein Beispiel für eine experimentelle
Ausnutzung dieses physikalischen Prinzips ist in WO-A 02/090987
beschrieben. Die Erfindung offenbart eine zweiteilige Sonde, bestehend
aus einer Zielmolekülbindungsstelle,
welche mit einem ersten fluoreszierenden Polypeptid verknüpft ist,
einem Bindungsmolekül,
welches mit einem zweiten fluoreszierenden Polypeptid verknüpft ist,
und einem so genannten flexiblen Linker, der das erste und das zweite
fluoreszierende Polypeptid miteinander verbindet. Mit Hilfe dieser
Sonde lässt
sich die Bindung einer Testsubstanz untersuchen. Bei erfolgreicher
Bindung einer Testsubstanz wird das Bindungsmolekül der Sonde
von der Bindungsstelle verdrängt,
so dass sich der Abstand zwischen dem ersten und zweiten fluoreszierenden
Polypeptid (Donor und Akzeptor) vergrößert, was eine Fluoreszenzänderung
hervorruft. Die offenbarte Erfindung eignet sich jedoch offenbar
nicht zur Messung einer Proteaseaktivität, auch wenn der Linker eine
Proteaseschnittstelle darstellen würde. Denn in diesem Fall wäre eine
effiziente Trennung der Fluorophore nicht gewährleistet, da die beiden Teile
der Sonde noch über
die Bindungsstelle und das Bindungsmolekül miteinander verbunden wären und
Proteasen klein sind.
Cummings
et al. (Analytical Biochemistry, 1999, Vol. 269, Seiten 79–93) haben
sich das FRET-Prinzip für
die Entwicklung eines In-vitro-Testsystems für HIV-Protease zunutze gemacht.
Bei diesem System ist ein Substrat für die HIV-Protease an einem
Ende mit einer Biotingruppe und am anderen Ende mit einem Phosphotyrosinrest
versehen. Die Erzeugung eines FRET erfolgt durch Bindung eines gegen
Phosphotyrosin gerichteten Antikörper,
an welchem Europium-Cryptat (Donor-Fluorophor) gekoppelt ist, und
durch gleichzeitige Bindung von Streptavidin, an welches XL665 (Akzeptor-Fluorophor)
gekoppelt ist, an die Biotingruppe. Bei erfolgreicher Spaltung des
Substrats mittels einer exogen zugegebenen HIV-Protease werden die
Fluorphore voneinander getrennt, so dass das Fluoreszenzsignal abnimmt.
Nachteil dieser Methode ist die Tatsache, dass sie nur in vitro
angewendet werden kann und infolgedessen sich nicht für Aufnahme-
und Verträglichkeitsstudien
eignet und dass die Fluoreszenz auch vom Bindungsverhalten eines
Fluorophor-Trägers
zu seinem entsprechenden Interaktionspartner an dem Substrat abhängt.
In ähnlicher
Weise beschreibt EP-A 0 428 000 ein fluorogenes Proteasesubstrat
für die
HIV- und AMV-Protease (Avian Myeloblastosis Virus), bei welchem
Donor- und Akzeptorfluorophor jeweils direkt an ein Ende des Substrats
gekoppelt sind. In diesem System wird die emittierte Fluoreszenz
des Donors (z.B. EDANS) gemessen, wobei die Fluoreszenz bei intaktem
Substrat durch die Anwesenheit des „löschenden" Akzeptors (z.B. DABCYL) niedrig ist
und erst nach erfolgreicher Spaltung des Substrats durch eine Protease
und infolgedessen Abtrennung des Akzeptors ansteigt. Auch diese
Verbindungen eignen sich nur für
einen In-vitro-Nachweis von (HIV-) Proteasen. Das gleiche Prinzip
für ein
Proteasesubstrat, nämlich
die Anheftung eines Donors bzw. Akzeptors an je einem Ende einer
proteolytischen Schnittstelle ist in
US
6,291,201 beschrieben.
Verfahren,
bei denen Proteasen durch fluorogene Peptidsubstrate nachgewiesen
werden, sind auch aus Nature Biotechnology 1998, Vol. 16: 547–552 bekannt.
Mit
der vorliegenden Erfindung kann das zugrunde liegende Problem unter
Vermeidung der vorstehend genannten Nachteile gelöst werden.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist eine proteinhaltige Zusammensetzung,
die
- (a) ein erstes Fusionsprotein, enthaltend
eine Interaktionsdomäne
A und ein Fluorophor B
und
- (b) ein zweites Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A' und ein Fluorophor
B' umfasst,
dadurch
gekennzeichnet, dass A und A' aneinander
binden können,
und dass zwischen A und B oder zwischen A' und B' die Schnittstelle für eine Protease eingefügt ist.
Die
Erfinder haben erkannt, dass bei vorhandener Proteaseaktivität durch
Schnitt der Schnittstelle ein Fluorophor abgetrennt wird, so dass
kein FRET mehr erfolgen kann. Für
die Wirkungsweise der Zusammensetzung ist es gegebenenfalls unerheblich,
ob B der Donor und B' der
Akzeptor oder ob B' der
Donor und B der Akzeptor ist. Demnach ist es außerdem unerheblich, ob durch
die Aktivität
der Protease der Donor oder der Akzeptor abgetrennt wird, da für einen
erfolgreichen Energietransfer die Anwesenheit beider Fluorophore erforderlich
ist. Bevorzugt für
die vorliegende Erfindung ist es allerdings, wenn die Schnittstelle
auf dem den Akzeptor enthaltenden Fusionsprotein platziert ist,
so dass der Akzeptor abgetrennt wird.
Wird
durch entsprechende Platzierung der Schnittstelle der Akzeptor abgetrennt,
nimmt das Fluoreszenzsignal proportional zur Proteaseaktivität ab, sofern
die emittierte Fluoreszenz des Akzeptors gemessen wird. Das Fluoreszenzsignal
nimmt bingegen zu, wenn die emittierte, aber infolge des fehlenden
Akzeptors nicht mehr übertragbare
Fluoreszenz des Donors gemessen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine zur Proteaseaktivität
proportionale Abnahme des Fluoreszenzsignals gemessen.
Die
Schnittstelle kann eine Schnittstelle für jede dem Fachmann bekannte
Protease sein. Dazu zählen alle
sauren, neutralen und alkalischen Proteasen, welche zu den Gruppen
der Serin-, Cystein-, Aspartat- oder Metallproteasen gehören. Eine
umfangreiche Liste von Proteasen (auch bekannt als Peptidasen),
deren Aktivität
mittels der vorliegenden Erfindung getestet oder nachgewiesen werden
kann, ist auf der ExPASy-Internetseite (Expert Protein Analysis
System) unter http://ca.expasy.org/cgi-bin/enzyme-search-ful?peptidase zu finden.
Des Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung Schnittstellen für sowohl
tierische, pflanzliche, bakterielle als auch virale Proteasen.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Schnittstelle um eine Schnittstelle für eine virale
Protease. Besonders günstig
für die
vorliegende Erfindung ist es, wenn die Schnittstelle die Schnittstelle
für die
HIV-Protease ist.
Als
Donor oder Akzeptor (B oder B')
eignen sich für
die vorliegende Erfindung alle dem Fachmann bekannten Fluorophore,
welche die zuvor beschriebenen Eigenschaften aufweisen. Dabei hängt es gegebenenfalls
von der zu untersuchenden Protease ab, welches Donor/Akzeptor-Paar
sich zur Durchführung
der Erfindung am besten eignet. Bei der Wahl eines für die vorliegende
Erfindung günstigen
Donor/Akzeptor-Paares ist außerdem
darauf zu achten, dass die zu untersuchende Protease kein intrinsisches
Chromophor (Farbträger) besitzt,
welches als Donor oder Akzeptor dienen könnte. Dazu gehören, unter
anderem, aromatische Molekülbestandteile
wie z.B. Tryptophan, Pyrimidinbasen, Albumin, reduzierte Nicotin-Adenin-Nukleotide,
oxidierte Flavin-Mononukleotide, Pyridoxalphosphat, Häm-Gruppe,
Retinalgruppe im Rhodopsin. Geeignete Donor/Akzeptor-Paare können beispielsweise
sein: Phycoerythrin/Cyan-5, FITC (Fluoreszeinisothiocyanat)/Cyan-3, Fluoreszein/Hexafluoreszein,
Lucifer-Yellow/DNP (2,4-Dinitrophenyl), EDANS/DABCYL, Coumarin/DABCYL, Europiumkryptat/XL665,
BFP/GFP, CFP/YFP oder GFP/Rhodamin, sowie weitere unterschiedliche
Kombinationen der genannten oder anderer, dem Fachmann bekannten
Fluorophore. BFP, GFP, CFP und YFP sind die gebräuchlichen Abkürzungen
für Blue,
Green, Cyan und Yellow Fluorescent Protein. Bevorzugt sind die Donor/Akzeptor-Paare
BFP/GFP und CFP/YFP, besonders bevorzugt BFP/GFP.
Es
ist auch möglich,
dass der Akzeptor B oder B' ein
nicht-fluoreszierender Farbstoff ist. Damit lässt sich beispielsweise Hintergrundfluoreszenz,
die auf einer direkten, nicht über
den Donor erfolgten Anregung des Akzeptors basiert, minimieren.
Beispiele hierfür
sind die so genannten QSY-7-Farbstoffe (Molecular Probes), die im
Allgemeinen in Kombination mit grün- oder orange-fluoreszierenden
Donoren wie Fluoreszein, Oregon Green, Alexa Fluor, BODIPY FL oder
Tetramethylrhodamin eingesetzt werden.
Zur
Anregung des Donors kann jede geeignete Lichtquelle, wie z.B. eine
Wolframlampe, Xenonlampe, Quecksilber-Argon-Lampe, Deuteriumbogenlampe,
Halogenlampe, ein Laser oder eine LED (Licht-Emittierende Dioden)-Lichtquelle
dienen. Die Messung erfolgt mittels gebräuchlicher Detektoren, beispielsweise
eine Photomultiplierröhre,
Photodioden (Diodenzeile), Siliziumdetektor oder Charge-Couple-Device-Detektoren. Zur
Erzielung optimaler Wellenlängen
können
verschiedene, dem Fachmann bekannte Interferenzfilter, z.B. Bandpassfilter,
Kantenfilter, Konversionsfilter, Wärmereflexionsfilter, UV-Sperrfilter,
UV-Spiegel, Kaltlichtspiegel, achromatische Strahlteiler, dichroitische
Spiegel, Farbteiler, Fluoreszenz-Anregungs- und Sperrfilter zum Einsatz
kommen.
In
einer weiteren Ausführungsform
handelt es sich bei dem Donor B oder B' um einen so genannten biolumineszenten
Donor, der nicht durch absorbierte Lichtenergie angeregt werden
muss. Prinzipiell ist diese Vorgehensweise, die der Fachmann unter
der Bezeichnung Biolomineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET)
kennt, mit FRET vergleichbar. Der biolumineszente Donor ist dabei üblicherweise
die Luciferase des Seestiefmütterchens
Renilla reniformis, welche in Anwesenheit von Sauerstoff ihr Substrat
Coelenterazin zu Coelenteramid oxidiert, wobei Lichtenergie entsteht,
die wiederum auf den fluoreszierenden Akzeptor, z.B. GFP oder YFP, übertragen
wird. Coelenterazin ist zellpermeabel, so dass diese Methode auch
in vivo angewendet werden kann.
Als
Interaktionspartner A oder A' eignen
sich für
die vorliegende Erfindung alle dem Fachmann für solche Zwecke gebräuchlichen
Moleküle,
die natürlicherweise
miteinander interagieren. Es kann sich hierbei beispielsweise um
Antigen/Antikörper-Paare
handeln, oder um die Bindungs- und Aktivatordomäne eines ausgewählten Proteins,
z.B. Lex-A/B42 oder
GAL4-Bindedomäne/VP16.
Andere Beispiele umfassen Myo-D/Id, EVH-1/Act-A, und Biotin/(Strept-)Avidin.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich
bei den Interaktionspartnern um das so genannte Large-T-Antigen
des SV40-Virus und da Proto-Onkogen p53.
Die
gegenseitige Bindung der Interaktionspartner A und A' aneinander kann
als Haupt- oder
Nebenvalenzbindung stattfinden. Als Hauptvalenzbindungen kommen
unter anderem kovalente (Atombindungen), ionische und metallische
Bindungen sowie Übergänge dazwischen
in Frage. Als Nebenvalenzbindungen (Van der Waals-Bindungen) kommen
elektrostatische Wechselwirkungen wie Dipol-Dipol- oder Dipol-Quadrupol-Wechselwirkungen
und indirekte Wechselwirkungen infolge gegenseitiger Polarisation
der Ladungsverteilung in Frage. Ein Beispiel für eine Nebenvalenzbindung stellt
die Ausbildung einer Wasserstoffbrückenbindung dar.
Die
proteinhaltige Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann nach
jedem dem Fachmann zugänglichen
Verfahren hergestellt werden. Denkbar sind vor allem chemische Peptidsyntheseverfahren
sowie gentechnologische Verfahren. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen, proteinhaltigen
Zusammensetzung mittels gentechnologischer Verfahren ist die Bereitstellung
der für
die proteinhaltige Zusammensetzung kodierenden Nukleinsäure erforderlich.
In
einer weiteren Ausführungsform
richtet sich die vorliegende Erfindung demnach auf eine Nukleinsäure bzw.
nukleinsäurehaltige
Zusammensetzung, die für
die proteinhaltige Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kodiert.
Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw.
nukleinsäurehaltige
Zusammensetzung besteht demnach aus
- (a) einer
ersten Nukleinsäure,
die für
ein erstes Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A und ein
Fluorophor B, kodiert
und
- (b) einer zweiten Nukleinsäure,
die für
ein zweites Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A' und ein Fluorophor
B', kodiert,
dadurch
gekennzeichnet, dass die von der Nukleinsäure kodierten Bereiche A und
A' aneinander binden,
und dass zwischen den von der Nukleinsäure kodierten Bereichen A und
B oder zwischen A' und
B' der kodierende Bereich
für eine
Proteaseschnittstelle eingefügt
ist.
Als
Fluorophore werden in diesem Fall vorzugsweise Renilla-Luciferase,
BFP, GFP, CFP und YFP gewählt,
da niedermolekulare, fluoreszierende Verbindungen wie z.B. DNP nur
nachträglich
nach Transkription und Translation am fertigen Protein angebracht
werden können.
Vorzugsweise
wird die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur
Expression des von ihr kodierten Proteins in Zellen eingesetzt,
die gleichzeitig oder anschließend
mit einer für
eine Protease, insbesondere HIV-Protease, kodierenden Nukleinsäure transfiziert
werden können.
Als Zellen in Frage kommen alle Zellen, in denen eine Proteaseaktivität verifiziert
oder inhibierte werden soll. Beispielhaft kann die vorliegende Erfindung
in T-Zellen ausgeführt
werden.
Als
besonderen Vorteil der vorliegenden Erfindung kann auch gesehen
werden, dass die erfindungsgemäße Nukleinsäure nach
Transfektion der Zielzellen im Kern lokalisiert, das von der Protease
abgetrennte Fluorophor nach Transkription und Translation jedoch
im Cytoplasma nachgewiesen wird. Durch die räumliche Abtrennung des Fluorophors
in ein anderes Zellkompartiment ist eine Änderung der Fluoreszenz nach
erfolgreicher Spaltung durch eine Protease gewährleistet.
Zum
Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die
Wirts- bzw. Zielzelle (Transformation oder Transfektion) stehen
dem Fachmann zahlreiche Verfahren – abhängig von der gewählten Wirtszelle – zur Verfügung. Die
einfachste Methode für
den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe/Zielzellen.
Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen
Zelle durch so genannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den
Zellkern. Besonders günstig
ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, sowie beliebige Kombinationen
davon, die ausgewählt
sind aus der Gruppe bestehend aus Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid,
Lithiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, kationische Lipide,
biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation
und Elektroporation.
Für die Expression
und das Einbringen der Nukleinsäure
in die Zielzelle ist es von Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw.
nukleinsäurehaltige
Zusammensetzung in einem so genannten Expressionsvektor inseriert
ist. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine rekombinante
DNA und einen Expressionsvektor, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Expressionsvektor um einen eukaryontischen,
insbesondere menschlichen, bakteriellen oder einen retroviralen
Vektor, Plasmid, Bacteriophagen oder um andere in der Gentechnik übliche Vektoren,
z.B. Liposomen, die zur Expression von Proteinen bzw. Peptiden geeignet
sind. Falls gewünscht
oder erforderlich, kann die Nukleinsäuresequenz im erfindungsgemäßen Vektor
mit regulatorischen Elementen, die Transkription und Synthese einer
translatierbaren mRNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten,
operativ verbunden sein. Derartige regulatorische Elemente sind
Promotoren, Enhancer oder Transkriptionsterminationssignale, können aber
auch Introns oder ähnliche Elemente
sein, wie Elemente, welche die Stabilität und Vermehrung des Vektors,
die Selektion und/oder die Integration in das Wirtsgenom ermöglichen
oder dazu beitragen.
Die
Erfindung umfasst außerdem
ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, eines Fragments
oder Derivats davon, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert
wird. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Einbringen
eines erfindungsgemäßen Vektors,
der die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, in eine
geeignete Wirtszelle mittels geeigneter Methoden, wobei die Wirtszelle
pro- oder eukaryontisch sein kann, (b) Kultivierung der transfizierten
Wirtszelle und (c) Isolierung des rekombinanten Proteins aus der
Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium.
Falls
gewünscht
oder erforderlich können
die gemäß Schritt
(c) isolierten Proteine für
andere Zwecke weiter aufgereinigt werden. Der Fachmann kennt hierfür zahlreiche
Methoden, wie z.B. Salzfraktionierung, Größenausschlusschromatografie,
Ionenaustauschchromatografie, Reverse-Phase-Chromatografie, Affinitätschomatografie
und ähnliches.
Durch
das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die
Zielzellen können
durch Auswahl eines geeigneten, dem Fachmann bekannten, Selektionsmarkers
sogenannte stabile Zelllinien generiert werden, d.h. die erfindungsgemäße Nukleinsäure bleibt
im Genom der Zielzelle zur dauerhaften Expression vorhanden (stabile
gegenüber
transienter Transfektion). Gegensand der vorliegenden Erfindung
ist demzufolge auch eine Wirtszelle bzw. eine Zelllinie, welche
mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure transfiziert
ist.
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Proteaseaktivität in einer
Zielzelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Transfektion mindestens einer Zielzelle
mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen
Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für einen
für die
Schnittstelle der nachzuweisenden Protease enthält,
- (b) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen
Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die Schnittstelle
der nachzuweisenden Protease enthält, und Transfektion der selben
Zielzelle mit einer für
die nachzuweisende Protease kodierenden Nukleinsäure als Positivkontrolle,
- (c) Herstellung eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (a)
und eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (b)
und
- (d) Messung der Fluoreszenz der Zelllysate aus Schritt (c) der
Zielzellen aus Schritt (a) und aus Schritt (b) und Vergleich der
erhaltenen Fluoreszenzwerte.
Verhält sich
die Fluoreszenz der Zielzellen aus (a) ähnlich wie die Fluoreszenz
der Zielzellen aus (b), ist davon auszugehen, dass die Zielzellen
aus (a) die gesuchte Protease enthalten. Damit ist das erfindungsgemäße Verfahren
für diagnostische
Zwecke geeignet, insbesondere, wenn damit virale oder bakterielle
Proteasen bzw. im allgemeinen organismusfremde Proteasen nachgewiesen
werden sollen. Eine mit der Positivkontrolle vergleichbare Fluoreszenz
könnte
demnach auf eine Virusinfektion oder andere Art von Kontamination
der betroffenen Zelle hindeuten. In einer besonderen Ausführungsform
ist die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
nachzuweisende Protease die HIV-Protease. Ein diagnostisches Kit
könnte
somit eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, eine
für eine
Protease kodierende Nukleinsäure,
Transfektionsreagenzien, bereits transfizierte Zellen als Kontrollen,
sowie für
die Durchführung
des Verfahrens geeignete Puffer und Enzyme enthalten. In einer bevorzugten
Ausführungsform
des Kits enthält
dieses zusätzlich
Puffer und Enzyme.
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von
Proteaseinhibitoren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte
umfasst:
- (a) Transfektion mindestens einer
Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen
Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die Schnittstelle
der zu inhibierenden Protease enthält, und Transfektion der selben
Zielzelle mit einer für
die zu inhibierende Protease kodierenden Nukleinsäure,
- (b) Zugabe einer Testsubstanz zu einer Teilpopulation der transfizierten
Zielzellen aus (a),
- (c) Herstellung eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (a)
und eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (b)
und
- (d) Messung der Fluoreszenz der Zelllysate aus Schritt (c) der
Zielzellen aus Schritt (a) und aus Schritt (b) und Vergleich der
erhaltenen Fluoreszenzwerte.
Sollte
die mit der Testsubstanz behandelte Teilpopulation der transfizierten
Zielzellen eine im Vergleich zur unbehandelten Teilpopulation veränderte Fluoreszenz
aufweisen, könnte
dies auf eine erfolgreiche Inhibition der betreffenden Protease
hindeuten. In entsprechender Weise ist es auch denkbar, dass das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Identifizierung eines Proteaseaktivators geeignet ist. Bevorzugt
wird das vorstehende Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren
der HIV-Protease eingesetzt.
Darüber hinaus
ist es möglich,
unter Einsatz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw.
des davon kodierten Polypeptids zu bestimmen, ob eine bestimmte
Sequenz eine Proteaseschnittstelle darstellt. Zu diesem Zweck kann
man zwischen die für
den Interaktionspartner A oder A' und
für das
Fluorophor B oder B' kodierende
Nukleinsäuresequenz
mittels dem Fachmann bekannter, gängiger Klonierungsmethoden
eine bestimmte Nukleinsäuresequenz
einfügen,
die für
eine etwaige Proteaseschnittstelle kodiert.
Die
vorliegende Erfindung betrifft demzufolge ein Verfahren zum Nachweis
einer Proteaseschnittstelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte
umfasst:
- (a) Transfektion mindestens einer
Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen
Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die nachzuweisende
Schnittstelle einer bekannten Protease enthält, und Transfektion der selben
Zielzelle mit einer für
die bekannte Protease kodierenden Nukleinsäure,
- (b) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen
Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die bekannte
Schnittstelle einer bekannten Protease enthält, und Transfektion der selben
Zielzelle mit einer für
die bekannte Protease kodierenden Nukleinsäure,
- (c) Herstellung eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (a)
und eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (b)
und
- (d) Messung der Fluoreszenz der Zelllysate aus Schritt (c) der
Zielzellen aus Schritt (a) und aus Schritt (b) und Vergleich der
erhaltenen Fluoreszenzwerte.
Der
Fachmann weiß,
wie man die vorstehend beschriebenen Verfahren (Nachweis einer Proteaseaktivität, Identifizierung
von Proteaseinhibitoren und Nachweis einer Proteaseschnittestelle)
auch in vitro durchführen
kann, indem nämlich
statt der nukleinsäurehaltigen
Zusammensetzung die erfindungsgemäße, proteinhaltige Zusammensetzung
eingesetzt wird. Diese kann direkt im Reagenzgefäß in einem geeigneten Puffer
mit einer nachzuweisenden Protease, und gegebenenfalls einem entsprechenden
Inhibitor, in Kontakt gebracht werden. Der Nachweis einer veränderten
Fluoreszenz aufgrund vorhandener oder inhibierter Proteaseaktivität erfolgt
entsprechend.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG:
1: Erfindungsgemäße Konstrukte
(A)
Die
Zeichnung zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen, proteinhaltigen
Zusammensetzung. In der abgebildeten Konstruktion ist A beispielhaft
SV40-Large-T-Antigen (LT), A' ist
beispielhaft p53, B ist beispielhaft GFP und B' ist beispielhaft BFP. Die Schere bzw.
C (für „cleavage
site") kennzeichnet die
Schnittstelle für
eine Protease. Die Wellenlänge
der absorbierten und emittierten Lichtenergie ist in Nanometer (nm)
angegeben.
(B)
In
(B) ist der Aufbau einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure (oben),
sowie der der Aufbau einer für eine
Protease kodierenden Nukleinsäure
(unten) dargestellt. P steht für „Promotor", A steht für einen
beliebigen Interaktionspartner, C steht für „cleavage site", B steht für Fluorophor,
E steht für
HcRED oder DSRed2 (BD Biosciences), IRES steht für „internal ribosomal entry
site" (Neustart
der Translationsinitiation) und F bezeichnet eine beliebige Protease.
2: Messung der Proteaseaktivität in Abhängigkeit
von Proteaseinhibitoren
FRET
(380/508 nm) wurde in Lysaten von Zellen, die mit pGFP-C-LT und
pBFP-p53 transfiziert worden waren, und entweder ohne (Spur 1) oder
mit einer für
eine HIV-Protease
kodierenden Nukleinsäure
transfiziert (Spuren 2–6)
sind, gemessen. Zwei Stunden nach der Transfektion wurden ansteigende
Konzentrationen Saquinavir (Spuren 3–6) zugegeben.
3: Einfluss der HIV-Protease auf den
FRET
Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind
entweder in HIV-Wildtyp-infizierte Zellen oder in Zellen, die mit
einer HIV-Mutante, welche eine Mutation im katalytischen Zentrum
der Protease aufweist (HIV delta-PR, HIVΔPR), eingebracht.
4: Die Spaltung von GFP-C-LT ist spezifisch
für die
HIV-Protease
GFP-Nachweis
mit anti-GFP-Antikörper
im Lysat aus transfizierten 293-T-Zellen mit GFP-C-LT (Spur 1),
GFP-C-LT plus HIV delta-PR (HIVΔPR)
(Spur 2) und GFP-C-LT plus HIV (Wildtyp).
Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:
BEISPIEL 1:
293-T-Zellen
wurden mit den entsprechenden Vektoren ko-transfiziert und die aus
den transfizierten Zellen hergestellten Zelllysate einen Tag nach
der Transfektion im Fluorometer (380/507 nm) gemessen. Die Vektoren
pGFP-LT und pGFP-C-LT unterscheiden sich durch eine zwischen GFP
und LT klonierte HIV-Proteaseschnittstelle. Wird diese von der HIV-Protease
geschnitten, findet kein FRET mehr statt. Das Kontrollexperiment
ist pGFP-C-LT ohne HIV-Protease und pGFP-LT ohne Schnittstelle mit
HIV-Protease. In beiden Fällen wurde
ein FRET nachgewiesen. Zur Expression der HIV-Protease in den Zellen,
die die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten
wurden subvirale HIV-Klone (Sicherheitsstufe I) und ein Konstrukt,
welches DsRed2 oder Far-Red unter der Kontrolle des CMV-I.E.-Promotors
exprimiert (z.B. pCMV-DsRed-Express von BD Biosciences). Am 3'-Ende von DsRed wurde
eine Interne Ribosomale Eintritts-Stelle (Translationsinitiation;
IRES) (z.B. pIRES2-DsRed2 BD Biosciences) und die HIV-I-Protease kloniert,
so dass die Protease etwa zwanzigfach niedriger als DsRed exprimiert
wird. Dies erlaubt eine niedrige Proteaseexpression und eine interne Transfektionskontrolle.
BEISPIEL 2: Wirkung eines
HIV-Proteaseinhibitors
FRET
(380/508 nm) wurde in Lysaten von Zellen, die mit pGFP-C-LT und
pBFP-p53 transfiziert worden waren, und entweder ohne (2, Spur 1) oder mit einer
für eine
HIV-Protease kodierenden Nukleinsäure transfiziert (2, Spuren 2–6) sind,
gemessen. Zwei Stunden nach der Transfektion wurden ansteigende Konzentrationen
Saquinavir (2, Spuren
3–6) zugegeben.
Die Abnahme der Fluoreszenz aufgrund der aktiven HIV-Protease und
erfolgreicher Abtrennung des Fluorophors wird mit steigernder Saquinavirkonzentration
verhindert, d.h. die Protease wird durch den Inhibitor erfolgreich
inaktiviert, so dass eines der beiden Fluorphore nicht abgetrennt
wird und ein FRET nach wie vor erfolgen kann.
BEISPIEL 3: Die Veränderung
des FRET und die Abspaltung des Fluorophors beruht spezifisch auf
HIV-Proteaseaktivität
Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind
entweder in HIV-Wildtyp-infizierte Zellen oder in Zellen, die mit
einer HIV-Mutante, welche eine Mutation im katalytischen Zentrum
der Protease aufweist (HIV delta-PR, HIVΔPR), eingebracht. Da nur im
Wildtyp-HIV-Klon,
aber nicht im mutanten HIV-Klon eine Verringerung der Emission beobachtet
werden kann, wird deutlich, dass nur die HIV-Protease und nicht
ein anderes HIV-Protein den FRET vermindert, d.h. die Reaktion ist
spezifisch (3). Der
GFP-Nachweis mit anti-GFP-Antikörper
im Lysat aus transfizierten 293-T-Zellen mit GFP-C-LT (4, Spur 1), GFP-C-LT plus
HIV delta-PR (HIVΔPR)
(4, Spur 2) und GFP-C-LT
plus HIV (Wildtyp) verdeutlicht, dass nur in Gegenwart von HIV-Wildtyp,
der die funktionelle Protease exprimiert, GFP abgespalten wird.
