DE19715683C2 - Neue Reportervektoren für One-Hybrid und Two-Hybrid Systeme - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Reportervektor, der eine regula­ torische Nukleinsäuresequenz umfaßt, die einen Operator und einen Promotor verknüpft mit einem Reportergen enthält, das für ein Photoprotein kodiert, dessen Expression durch Bestrah­ lung nachweisbar ist. Ferner betrifft die Erfindung ein Ver­ fahren zum Nachweis von molekularen Wechselswirkungen, tran­ sient oder stabil transformierte Zellen, sowie die Verwendung dieser Zellen zur Untersuchung von molekularen Wechselwirkun­ gen.

Reportervektoren sind Plasmide, die neben den für ein Plasmid allgemein üblichen Komponenten (Replikationsursprung, Selek­ tionsmarker etc.) ein Reportergen unter Kontrolle eines Promo­ tors tragen. Als Promotoren für Reportervektoren werden im allgemeinen starke, konstitutive Promotoren wie beispielsweise der CMV-Promotor (Cytomegalovirus) oder der CaMV 35S (Cauli­ flower-Mosaik-Virus) verwendet. Reportergene sollen leicht nachweisbar sein. Deshalb werden Gene verwendet, deren Expres­ sionsprodukt leicht durch eine einfach durchführbare chemische Reaktion nachweisbar ist, wie beispielsweise eine Farbreak­ tion. Beispiele für solche Reportergene sind das LacZ-Gen oder das CAT-Gen (Chloroamphenicol-Acetyltransferase). Eine andere Gruppe von Reportergenen stellen Photoproteine dar, wie z. B. das aus Aequorea victoria isolierte GFP (Green Fluorescent Protein).

Derartige Reportervektoren werden beispielsweise zur Überprü­ fung der Transfektionseffektivität bei der Transfektion von Zellen verwendet.

Auch bei anderen Untersuchungsverfahren werden Reportervekto­ ren verwendet. Sie sind durch entsprechende Modifikationen an das jeweilige Verfahren angepaßt.

Ein solches Verfahren ist beispielsweise die Untersuchung von molekularen Wechselwirkungen. Unter molekularen Wechselwirkun­ gen ist in diesem Zusammenhang eine Wechselwirkung zwischen Polypeptiden und Nukleinsäuren bzw. die Wechselwirkung von zwei oder mehreren Polypeptiden miteinander zu verstehen. Es werden entweder diese Wechselwirkungen an sich untersucht oder man will Moleküle identifizieren, die spezifisch mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz bzw. mit einem bestimmen Poly­ peptid wechselwirken können.

Bis vor kurzem wurden diese Untersuchungen lediglich in in vitro Systemen durchgeführt. Beispielsweise wurden Proteine dadurch identifiziert, daß sie mit Hilfe eines Antikörpers, der ein bekanntes Protein erkennt, koimmunopräzipitiert wurden. Einerseits beinhaltet dieses Verfahren den Nachteil, daß der Nachweis der molekularen Wechselwirkungen nicht unter physio­ logischen, d. h. in vivo Bedingungen stattfindet. Andererseits erfordert es weitere aufwendige Verfahrensschritte von den so identifizierten Proteinen zu dem entsprechenden Gen zu gelan­ gen.

S. Fields und O. Song (Nature 340, 1989, Seite 245-246) entwickelten eine Methode, die es erlaubt, molekulare Wechsel­ wirkungen auch unter in vivo Bedingungen zu untersuchen. Die­ ses als Two-Hybrid System oder "interaction trap" bezeichnete Verfahren stellt eine einfache Methode zur Identifizierung und Klonierung dar.

Bei dieser Methode wird ein Reportervektor mit dem oben be­ zeichnetem LacZ-Reportergen verwendet und in eine Hefezelle transformiert. Zwei weitere Expressionsvektoren werden in dieselbe Zelle transformiert, wobei eine Wechselwirkung der beiden Expressionsprodukte dieser Vektoren zur Aktivierung der Expression des Reportergens des Reportervektors führt.

Im Unterschied zu den oben genannten Reportervektoren, muß ein Reportervektor im vorliegenden Verfahren erhöhten Anforderun­ gen genügen.

Da es sich hierbei um einen induzierbaren Promotor handelt, d. h. die Expression durch die Wechselwirkungen von zwei Molekü­ len in Verbindung mit einer Binde- und einer Aktivator-Domäne vermittelt wird, sollte der Promoter "dicht" sein. Es sollte also ohne Vorliegen von molekularen Wechselwirkungen nur zu sehr geringer oder am besten zu keiner Expression kommen, um ein gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis sicherzustellen.

Nur so ist es möglich, sicher zwischen positiven und negativen Kolonien zu differenzieren und das Vorliegen von molekularen Wechselwirkungen festzustellen.

Die Expression wird dann durch Zugabe eines chemischen Induk­ tors, z. B. IPTG, sichtbar gemacht. Der Nachweis der Expres­ sion kann auch mit Hilfe des Filterassays nachgewiesen werden. Hierbei wird ein Abdruck der Kolonien von der Kulturplatte genommen und die Farbreaktion mit einer X-Gal-Lösung (5-Brom- 4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) durchgeführt. Zum quantita­ tiven Nachweis müssen die betreffenden Kolonien gepickt und in Kulturmedium angimpft werden. Die Quantifizierung der Ex­ pression kann erst dann nach einer angemessenen Kulturzeit in einem weiteren Verfahrensschritt erfolgen.

Die Bestimmung der Expressionshöhe ist somit Zeit- und Kosten­ intensiv. Außerdem ist die Anzahl der Kolonien, die so ge­ testet werden können, begrenzt.

Die Verwendung von teuren Chemikalien bei diesem Nachweisver­ fahren ist außerdem nachteilig. Zudem kann aufgrund des hohen Zeitaufwands bei der Durchmusterung einer Genbank nur eine begrenzte Anzahl von Klonen in einem Durchgang untersucht werden. Zur Identifizierung von seltenen Transkripten ist es jedoch notwendig, eine große Anzahl von Klonen zu untersuchen. Bei Verwendung des beschriebenen Reportervektors müssen des­ halb unter Umständen mehrere Verfahrenszyklen durchlaufen werden bis die nötige Anzahl von Kolonien getestet wurde. Des weiteren können die Klone nur in einer relativ geringen Dichte auf die Kulturplatten aufgebracht werden, da eine zu hohe Koloniedichte pro Kulturplatte zu Problemen bei der Erstellung von Abdrücken führen würde.

Es bestand daher das Bedürfnis einen Reportervektor bereitzu­ stellen, der die Nachteile der bekannten Reportervektoren zumindest teilweise überwindet und ein schnelles, wirtschaft­ liches und wirkungsvolles Nachweisverfahren zur Untersuchung von molekularen Wechselwirkungen in vivo erlaubt.

Diese Aufgabe wird durch den erfindungsgemäßen Reportervektor gelöst, der eine regulatorische Nukleinsäuresequenz umfaßt, die einen Operator und einen Promotor enthält, operativ ver­ knüpft mit einem Reportergen, der dadurch gekennzeichnet ist, daß das Reportergen für ein Photoprotein kodiert, dessen Ex­ pression durch Bestrahlung nachweisbar ist.

Durch den erfindungsgemäßen Reportervektor wird es möglich, positive Klone durch Bestrahlung nachzuweisen, wobei überra­ schenderweise der Hintergrund des Systems in vivo sehr gering ist und ein gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis aufweist. Der große Vorteil liegt darin begründet, daß für den Nachweis einer Expression des Reportergens weder Filterabdrücke ange­ fertigt werden müssen, noch daß in einem weiteren Arbeits­ schritt eine chemische Reaktion durchgeführt werden muß. Die Kolonien können nun dichter auf die Kulturplatten aufgebracht werden, so daß weniger Kulturplatten notwendig sind und gleichzeitig eine größere Anzahl von Kolonien in einem Arbeitsschritt durchgemustert werden können. Ein weiterer Vorteil ist, daß durch den erfindungsgemäßen Reportervektor die Verwendung von teuren Chemikalien zum Nachweis positiver Klone entfällt. Dadurch werden Materialien und kostspielige Arbeitszeit eingespart. Vor allem reduziert sich jedoch die nötige Arbeitszeit zur Identifizierung positiver Klone.

Der erfindungsgemäße Reportervektor kann grundsätzlich ein beliebiger Vektor sein, z. B. ein extrachromosomaler oder chromosomaler Vektor. Weiterhin kann der Vektor ein viraler Vektor, ein Plasmid oder ein künstliches Chromosom sein. Vor­ zugsweise ist der Reportervektor ein Plasmid. Er enthält zweckmäßigerweise die für die Propagierung in der vorgesehenen Wirtszelle erforderlichen Komponenten. Sie beinhalten einen Replikationsursprung z. B. einen bakteriellen Replikations­ ursprung wie etwa Col E 1 oder p5A oder einen eukaryontischen Replikationsursprung wie etwa den Hefe 2 micron Replikations­ ursprung. Weiter kann der Reportervektor einen oder mehrere Selektionsmarker wie etwa Ampicillin, Penicillin, Tetracyclin zur Selektion in Bakterienzellen oder/und Selektionsmarker enthalten, die eine Selektion in Hefezellen möglich machen, wie beispielsweise das Gen für Ura3, Leu2, Lys2, Trp1, Cys3 oder Ade2. Diese Selektionsmarker werden in Verbindung mit entsprechenden auxotrophen Hefe-Stämmen und geeigneten Hefe- Kulturmedien verwendet. Man bezeichnet die Kulturmedien auch als "dropout" Medien. Durch ihren Einsatz kann die Anzahl der falsch-positiven Klone reduziert werden. Außerdem enthält der Reportervektor eine Transkriptionstermiationssequenz wie bei­ spielsweise eine ADH1-Sequenz. Es war überraschend, daß der erfindungsgemäße Reportervektor nach Transfektion in der Zelle keine Basalexpression des Reportergens zeigte. Dies führt vorteilhafter Weise bei seinem Einsatz zu einem sehr guten Signal/Hintergrund-Verhältnis. Darüber hinaus korreliert die Signalstärke bei Bestrahlung mit der Expressionsstärke und läßt somit auch einen Rückschluß auf die Stärke der molekula­ ren Wechselwirkung zu.

Als Promotor kann jeder geeignete Promotor in dem Reportervek­ tor verwendet werden, der operativ mit dem Reportergen ver­ knüpft ist. Vorzugsweise beinhaltet der Reportervektor den Gal1,10 Minimalpromotor. Der Operator kann weitere ver­ schiedene Sequenzmotive enthalten, vorzugsweise umfaßt er mindestens ein Gal4-Bindungsmotiv oder/und mindestens ein LexA-Bindungsmotiv.

Als Reportergen kann jedes photoaktivierbare Protein verwendet werden. Vorzugsweise ist es ein Ca²⁺-aktivierbares Photoprotein ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aequorin, Obelin, Clytin, Mitrocomin, Berovin, Mnemiopsin und Thalassicolin. Am meisten bevorzugt ist das Photoprotein ein GFP (Green Fluorescent Pro­ tein).

Weiter weist der Reportervektor gegebenenfalls singuläre Klo­ nierungsstellen auf. Unter singulärer Klonierungsstelle ist zu verstehen, daß ein Restriktionsenzym nur an einer Stelle in dem Reportervektor schneiden kann.

Die singuläre Klonierungsstelle befindet sich vorzugsweise 5'- seitig des ATG-Startcodons des Reportergens. Der Abstand zwi­ schen ATG und singulärer Klonierungsstelle beträgt dabei vor­ zugsweise 50 bis 4.000 bp. Die singuläre Klonierungsstelle kann eine Schnittstelle für jedes beliebige Restriktionsenzym sein, vorzugsweise enthält die singuläre Klonierungsstelle Schnittstellen für Restriktionsenzyme mit einer 6 bis 8 bp langen Erkennungssequenz, z. B. NotI, NruI oder/und SpeI.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist in der singulären Klonierungsstelle ein heterologes Nukleinsäurefragment inse­ riert. Dieses kann in seiner Größe variieren, vorzugsweise hat es eine Größe von 20 bp bis 4 kbp.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, die transient oder stabil mit einem wie oben beschriebenen Repor­ tervektor transformiert ist.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen einer Nukleinsäure und einem Polypeptid, wobei ein Reportervektor, in den eine erste heterologe Nukleinsäuresequenz inseriert ist, in eine Zelle transformiert wird, mindestens ein zweiter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der eine zweite heterologe Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines Promotors enthält, die transformierte Zelle unter solchen Bedingungen kultiviert wird, daß eine Expression der zweiten Nukleinsäure­ sequenz stattfinden kann und die Expression des Reportergens in der Zelle untersucht wird, wobei durch einen Anstieg der Expression des Reportergens das Auftreten einer Wechselwirkung zwischen dem Expressionsprodukt der zweiten Nukleinsäurese­ quenz und der ersten Nukleinsäuresequenz auf dem Reportervek­ tor nachweisbar ist.

Die in dem Verfahren, das als One-Hybrid Verfahren bezeichnet wird, verwendeten Vektoren werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren in die Zellen transformiert. Um die Zahl der Falsch­ positiven Klone zu minimieren, wird gegebenenfalls eine Selek­ tion mit geeigneten Selektionsverfahren durchgeführt. Beispielsweise die Verwendung von auxotrophen Hefestämmen in Verbindung mit geeigneten Medien und entsprechenden Genen, die in den transformierten Vektoren enthalten sind.

Bei dem Transformationsverfahren kann der Reportervektor und der zweite Vektor gleichzeitig oder nacheinander in die Zelle transformiert werden. Die Vektoren können dabei transient oder stabil in die Zelle transformiert sein. Es ist auch möglich zuerst den Reportervektor in die Zelle zu transformieren und stabil transformierte Zellen herzustellen. In einer zweiten Transformation werden diese Zellen dann mit dem zweiten Vektor transient oder stabil zur Untersuchung der molekularen Wech­ selwirkung transformiert.

Üblicherweise liegt in dem Reportervektor eine erste hetero­ loge Nukleinsäuresequenz vor, deren Wechselwirkung mit Poly­ peptiden untersucht werden soll. Das Verfahren kann dazu ver­ wendet werden, Nukleinsäuresequenzen zu isolieren, die für Polypeptide kodieren, die mit einer ersten gegebenen heterolo­ gen Nukleinsäuresequenz, welche in dem Reportervektor inseriert ist, wechselwirken können. Hierzu kann die zweite heterologe Nukleotidsequenz aus einer Sequenzbibliothek, die eine Viel­ zahl von verschiedenen, potentiell wechselwirkenden Sequenzen enthält, z. B. aus einer genomischen Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek, stammen.

Auf diese Weise ist es möglich die Expressionsprodukte der Sequenzbibliothek auf das Vorhandensein von Polypeptiden zu untersuchen, welche mit einer ersten gegebenen heterologen Nukleinsäuresequenz in dem Reportervektor wechselwirken kön­ nen.

Es ist aber auch möglich, für eine gegebene zweite heterologe Nukleinsäuresequenz, die in dem zweiten Vektor enthalten ist und exprimiert wird, Nukleinsäuresequenzen aus einer Sequenz­ bibliothek zu bestimmen, die mit diesem Expressionsprodukt wechselwirken. Dazu stammt vorzugsweise die erste heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer genomischen oder cDNA Biblio­ thek.

Auf diese Weise wird die Wechselwirkung des Expressionspro­ dukts aus dem zweiten Vektor mit allen aus der Genbank stam­ menden heterologen Nukleinsäuresequenz untersucht.

Das vorliegende Verfahren bietet den Vorteil, daß eine Viel­ zahl von Klonen und unterschiedliche Genbanken auf das Vorhan­ densein von Expressionsprodukten, welche mit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz wechselwirken, untersucht werden können. Andererseits können auch für ein gegebenes Expressionsprodukt einfach und schnell Nukleinsäuresequenzen identifiziert wer­ den, die mit dem gegebenen Polypeptid wechselwirken können.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zelle, die transient oder stabil transformiert ist, mit einem wie oben dargestellten Reportervektor und mindestens einem zweiten wie oben dargestellten Vektor. Die Zelle ist vorzugsweise eine Hefezelle.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen zwischen zwei Polypeptiden, wobei ein Reportervektor, der gegebenenfalls eine heterologe Nukleinsäueresequenz enthält, in eine Zelle transformiert wird, mindestens ein zweiter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der ein Fusionsgen aus einer ersten heterologen Nukleinsäuresequenz und einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Bindedomäne des Operators auf dem Reportervektor kodiert, unter Kontrolle eines Promotors enthält, mindestens noch ein dritter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der ein Fusionsgen aus einer zweiten heterologen Nukleinsäuresequenz und einer Nukleinsäuresequenz, die für einen Transkriptions-Aktivator des Reportergens kodiert, unter Kontrolle eines Promotors enthält, die transfor­ mierte Zelle unter solchen Bedingungen kultiviert wird, daß eine Expression der heterologen Nukleinsäuresequenzen stattfinden kann und die Expression des Reportergens in der Zelle untersucht wird, wobei durch einen Anstieg der Expression des Reportergens das Auftreten einer Wechselwirkung zwischen dem Expressionsprodukt der ersten Nukleinsäuresequenz und dem Expressionsprodukt der zweiten Nukleinsäuresequenz nachweisbar ist.

In diesem Verfahren werden molekulare Wechselwirkungen zwischen zwei Polypeptiden untersucht. Man will für eine gegebene Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid kodiert, herausfinden, welche anderen Polypeptide mit diesem Polypeptid wechselwirken können. Um die Expressionsprodukte einer Zelle oder eines Gewebes zu untersuchen, stammt vorzugsweise die erste oder zweite heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer Genbank. Das Verfahren wird in mit den verwendeten Vektoren kompatiblen Zellen durchgeführt. Vorzugs­ weise verwendet man eine Hefezel­ le. Bezüglich möglicher Hefestämme und Selektionsmarker sowie geeigneter Kulturmedien wird auf die Veröffentlichen von P. L. Bartel et al., (Cellular Interactions in Development-A Practical Approach, Ed. D. A. Hartley IRL Press, 1993) verwiesen, die hiermit Bestandteil dieser Anmeldung ist.

Der zweite Vektor beinhaltet ein Fusionsgen, das eine Bindedomäne enthält. Diese Bindedomäne kann an eine Sequenz des Operators des Reportervektors binden. Vorzugsweise umfaßt die Bindedomäne eine LexA-Sequenz.

Der dritte Vektor, der in diesem Verfahren verwendet wird, enthält ein Fusionsgen, das für einen Transkriptions-Aktivator des Reportergens kodiert. Dieser Aktivator kann jeder geeignete Aktivator sein, vorzugsweise umfaßt er eine B42-, GAL4- Sequenz oder/und eine VP16 (Herpex-Simplex)-Sequenz.

Es ist auch möglich, daß sich der eine oder beide Wechselwirkungspartner aus zwei oder mehreren Untereinheiten zusammensetzen. Die einzelnen Untereinheiten können von verschiedenen Vektoren kodiert sein oder deren kodierende Sequenzen können gemeinsam auf einem Vektor vorhanden sein.

Zum Nachweis der Expression des Reportergens, deren Anstieg durch das Auftreten der DNA-Proteine bzw. Protein-Protein-Wechselwirkungen bedingt ist, werden die Zellen bestrahlt, was zu einem Farbsignal führt. Vorzugsweise umfaßt die Bestrahlung eine Wellenlänge von 280 nm bis 400 nm. Am meisten bevorzugt umfaßt sie 350 nm bis 375 nm.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zelle, die transient oder stabil transformiert ist, mit einem wie oben beschriebenen Reportervektor und mit mindestens einem zweiten wie oben beschriebenen Vektor oder/und mit mindestens einem dritten wie oben beschriebenen Vektor.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer transient oder stabil transformierten wie oben beschriebenen Zelle, zur Untersuchtung von molekularen Wechselwirkungen.

Die Beispiele zusammen mit Fig. 1 beschreiben die Erfindung genauer.

Beispiele 1. Hefestämme und Plasmide

Es wurde der Saccharomyces cerevisiae Stamm EGY48 (ura3, trp1, his3, lexA Operator-LEU2) (2) und die Hefe-Shuttle-Vektoren, die die lexA DNA-Bindedomäne (pEG202) und die B42 Aktivatordo­ mäne (pJG4-5) (3) verwenden. Das Plasmid pVA3, das für Maus p53 (72-390) kodiert, pTDI, daß für das large-T Antigen (84-­ 708) (LTA) kodiert und pGAD424 wurden von Clontech Laborato­ ries (Palo Alto, Kalifornien, USA) erhalten. Ein EcoRI-SalI Fragment, daß das p53-Gen von pVA3 enthält, wurde zwischen die singulären Restriktionsstellen EcoRI und SalI in pEG202 sub­ kloniert. Ein BamHI Fragment, das das LTA-Gen von pTDI ent­ hält, wurde in derselben Orientierung in die singuläre Re­ striktionsschnittstelle BamHI von pJG4-5 subkloniert. Das rekombinante Plasmid wurde mit EcoRI linearisiert, dann mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt und mit T4 DNA-Ligase rezirkulari­ siert, um das LTA-Gen "in-frame" zu setzen.

2. Herstellung der Vektoren

Die Reportervektoren pGNG1 und pGNG2 sind in Fig. 1 darge­ stellt. Die minimal Gal1,10-Promotorsequenz in pSH18-34 (2) enthält 4 Kopien der LexA-Bindestelle. Sie wurde mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (4) amplifiziert. Der erste Primer wurde 2 Basenpaare 5'-seitig des LexA-Operators positioniert und mit einer HindIII Restriktionsschnittstelle an seinem 5'- Ende versehen. Der zweite Primer war komplementär zu der Gal1,10-Sequenz bis zu dem ATG-Startcodon für das LacZ-Gen, ohne sie zu enthalten und er enthielt eine XbaI Restriktions­ schnittstelle an seinem 5'-Ende. Das PCR-Produkt wurde zwi­ schen die singulären Restrikionsschnittstellen HindIII und XbaI in das Plasmid pGFPuv (Clontech, Palo Alto, Kalifornien, USA) subkloniert. Von diesem Konstrukt wurde ein HindIII-EcoRI DNA- Fragment, das das Minimalpromotor-GFP Fusionsgen enthielt in den Hefe-Shuttle-Vektor YEp357R (5) zwischen die HindIII und EcoRI Restriktionsschnittstellen der "Multiple Cloning Site" subkloniert, um den Vektor pPGNG1 zu ergeben. Die komp­ lementären Desoxyribonukleotide MCS1 (5'-AGCTTGCGGCCGCTCGCGAC­ TAGT und MCS2 (5'-AGCTACTAGTCGCGAGCGGCGCA) mit kompatiblen HindIII Enden wurden hybridisiert und dann in die singuläre Restriktionsschnittstelle HindIII von pPGNG1 kloniert, um den Vektor pPGNG2 zu ergeben. Schließlich wurde ein 625 bp EcoRI­ XmnI Fragment, das den ADH1-Terminator aus pGAD424 (6) enthält in das 6-kbp EcoRI-PvuII Fragment von pPGNG1 bzw. pPGNG2 klo­ niert, um die Reprotervektoren pGNG1 bzw. pGNG2 zu ergeben.

3. Transformation der Hefezellen

Der S. cerevisiae Stamm EGY48 wurde mit der Lithiumacetat Me­ thode (7) mit pGNG1 transformiert und auf synthetischem drop­ out-uracil (SD-Ura) Platten, die 2% (w/v) Galactose und 1% (w/v) Raffinose enthielten, selektiert. Der so erhaltene Stamm wurde dann mit unterschiedlichen auf pEG202 basierenden "bait" und pJG4-5 basierenden "prey" Plasmiden transformiert und auf geeignetem SD-Medium enthaltend Galactose und Raffinose selek­ tiert. Kulturplatten, die Hefetransformanten aufwiesen, wurden unter einer UV-Lampe (366 nm) untersucht. Zusätzlich wurden dieselben "bait" und "prey" Plasmide mit pSH18-34 in EGY48 kotransformiert und auf SD-Mediumkulturplatten, welche X-Gal enthielten, aufgebracht, um das Ausmaß der β-Galactosidaseak­ tivität sichtbar zu machen.

Ergebnisse pGNG1 und pGNG2

Ein Reportervektor für das Two-Hybrid System (interaction trap), pGNG1 (Fig. 1) wurde hergestellt, welcher das GFP-Gen (Green Fluorescent Protein) enthält. Das Vektorgrundgerüst war abgeleitet von YEp357R, welches den URA3 Selektionsmarker und ein 2 Micron Replikationsursprung enthält. Das GFPuv-Gen, welches in dem Vektor verwendet wurde, ist eine "cycle3" Va­ riante des GFP, welches 18 × heller ist als das Wild-Typ-Pro­ tein (8). Ein Minimalpromotor des Hefe GAL1,10-Gens, welches 8 Kopien der LexA-Sequenz enthielt, wurde 5'-seitig mit dem GFPuv-Gen verbunden und 3'-seitig des GFPuv-Gens wurde der ADH1-Terminator mit ihm verbunden.

Ähnlich wurde der Reportervektor für das One-Hybrid System, pGNG2 (Fig. 1) konstruiert. Dieser enthält ungefähr 450 bp 5'- seitig des ATG Startkodons des GFPuv-Gens eine "Multiple Clo­ ning Site". Der Reportervektor pGNG2 enthält die singulären Klonierungsstellten NotI, NruI und SpeI. Hier kann eine "bait" DNA-Sequenz zur Untersuchung im One-Hybrid System inseriert sein.

Aktivierung des GFPuv Reporter-Gens

Um die Brauchbarkeit des Vektors pGNG1 für das Two-Hybrid System zu untersuchen, wurde es mit verschiedenen "bait" und "prey" Kontrollplasmiden (Tabelle) in S. cerevisiae EGY48 transformiert. Da das B42-Aktivator-Hybridprotein, das von pJG4-5 kodiert wird und seine Abkömmlinge Galactoseinduktion für ihre Expression erfordern, wurden alle Hefetransformanten auf SD-Medium kultiviert, das diese Kohlenstoffquelle ent­ hielt. Hefezellen, welche den pGNG-Vektor alleine enthielten, zeigten keine sichtbare Fluoreszenz, wenn sie unter eine UV- Lampe gehalten wurden. Jedoch zeigten Hefezellen, die pGNG1 und "bait" Vektoren (pEG202) enthielten, welche in der Lage waren, das von pESH18-34 kodierte LacZ-Reportergen zu akti­ vierten, auch die Fähigkeit, das GFPuv-Gen zu aktivieren. Hefezellen, die "Bait1" exprimierten, fluoreszierten deutlich stärker unter UV-Licht als diejenigen, welche "Bait2" expri­ mierten. Dies deutet darauf hin, daß die Transaktivierung des "Bait1" stärker als die des "Bait2" war.

Two-Hybrid System und das GFPuv-Reportergen

Hefezellen wurden auch kotransformiert mit Vektoren, die ein p53-LexA Bindedomänen Hybridprotein und das Large-T Antigen (LTA, von SV-40), das mit der B42-Aktivatordomäne fusioniert war, exprimiert. Das Standard Two-Hybrid System von Fields et al. zeigte, daß p53 und LTA wechselwirken (9). Die p53-LTA Wechselwirkung wurde auch beobachtet, wenn LacZ als Reporter­ gene verwendet wurde (Tabelle, Zeile 5). Diese Wechselwirkung war auch in der Lage das GFPuv-Reportergen des erfindungsgemä­ ßen Reportervektors zu aktivieren (Zeile 5), während der "Bait" Vektor alleine zu keinem Signal führte.

Drei weitere Proteinpaare wurden auf ihre Fähigkeit getestet, das GFPuv-Reportergen des erfindungsgemäßen Reportervektors zu aktivieren. Prey1, Prey2 und Prey3 wurden ursprünglich mit Hilfe des Standard Two-Hybrid Systems isoliert und es wurde festgestellt, daß sie "Bait4" binden, da jedes Proteinpaar das LacZ-Reportergen aktivierte (Tabelle, Zeilen 7 bis 9). Die­ selben "Bait" Proteinkombinationen aktivierten das GFPuv-Re­ portergen, wenn sie in Gegenwart von pGNG1 (Zeilen 7 bis 9) koexprimiert wurden. "Bait4" alleine konnte keines der Repor­ tergene aktivieren (Zeile 6).

Die Ergebnisse zeigen, daß die Verwendung des erfindungsgemä­ ßen Reportervektors eine deutliche Verbesserung des bekannten Two-Hybrid Systems zur Durchmusterung von cDNA Genbanken dar­ stellt. Der Reportervektor pGNG1 zeigt keine nachweisbare basale Expression des GFP in Abwesenheit der "Bait" und "Prey" Vektoren. Jedoch wird in Gegenwart von molekularen Wechselwir­ kungen oder transaktivierenden "Bait" Proteinen genügend viel GFP in den Hefezellen exprimiert, um ihren Nachweis zu erlau­ ben. Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Reportervektors ist geringer als die der bekannten LacZ-Reportervektoren, welche durch denselben Minimalpromotor reguliert werden. Die bereits mit anderen Reportergenen nachgewiesene Wechselwirkung zwischen p53 und dem Large-T Antigen und den anderen drei Pro­ teinpaaren (Bait und Prey) wurde auch mit Hilfe des erfin­ dungsgemäßen Reportervektors nachgewiesen. Die geringere Sen­ sitivität gegenüber den bekannten Reportervektoren stellt dabei einen Vorteil dar, da dadurch die Zahl der Falschpositi­ ven-Klone reduziert werden kann. Die Variabilität in der In­ tensität der Fluoreszenz für jedes Paar der getesteten Pro­ teine stellt dabei eine qualitative Messung der Stärke der Wechselwirkungen dar. Dies wurde in gleicher Weise mit den anderen Reportergenen beobachtet. Von praktischem Vorteil des erfindungsgemäßen Reportervektors gegenüber den bekannten Reportervektoren in dem Verfahren des One- und Two-Hybrid Systems stellt dabei die Tatsache dar, daß die erhaltenen Kolonien direkt unter eine UV-Lampe (366 nm) gehalten werden können und sofort die positiven Klone sichtbar gemacht werden können ohne sie nochmals zu kultivieren. Damit entfallen die bei den bisher gebräuchlichen Reportervektoren nötigen Ar­ beitsschritte des Pickens der Kolonien, Testen der Aktivität bzw. Kultivieren auf X-Gal enthaltenden Kulturplatten oder nochmaliges Kultivieren zum quantitativen Nachweis. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn eine Vielzahl von Kolonien getestet werden müssen. Außerdem ist es beim bisher verwende­ ten Reportervektoren üblich, nur Hefekulturen mit einer be­ stimmten Größe für die weitere Untersuchung auszuwählen. Damit werden mögliche positive Kolonien nicht berücksichtigt. Bei dem Verfahren, das den erfindungsgemäßen Reportervektor ver­ wendet, werden alle Kolonien mit Hilfe der Fluoreszenz sicht­ bar gemacht und können weiter untersucht werden.

Auch der Reportervektor pGNG2 für das One-Hybrid System zeigte keine basale Expression von GFP in Hefezellen.

Reportergene, die mit unterschiedlichen "Bait" und "Prey" Vektoren in S. cerevisiae EGY48 kotransformiert wurden

Literatur

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Claims (23)

1. Reportervektor umfassend eine regulatorische Nukleinsäu­ resequenz, die einen Operator und einen Promotor enthält, operativ verknüpft mit einem Reportergen, dadurch gekennzeichnet, daß das Reportergen für ein Photoprotein kodiert, dessen Expression durch Bestrahlung nachweisbar ist.

2. Reportervektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor den GAL1,10-Minimalpromotor und der Operator mindestens ein GAL4-Bindungsmotiv oder/und min­ destens ein LexA-Bindungsmotiv umfaßt.

3. Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Photoprotein ein Ca²⁺-aktivierbares Photoprotein ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aequorin, Obelin, Clytin, Mitrocomin, Berovin, Mnemiopsin oder Thalassico­ lin ist.

4. Reportervektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Photoprotein ein GFP (Green Fluorescent Protein) ist.

5. Reportervektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß 5'-seitig des ATG-Startcodons des Reportergens eine singuläre Klonierungsstelle enthalten ist.

6. Reportervektor nach Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand ATG zu singulärer Klonierungsstelle von 50 bis 4.000 bp beträgt.

7. Reportervektor nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die singuläre Klonierungsstelle Schnittstellen für die Restriktionsenzyme NotI, NruI oder/und SpeI enthält.

8. Reportervektor nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in der Klonierungsstelle ein heterologes Nukleinsäu­ refragment inseriert ist.

9. Reportervektor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Nukleinsäurefragment eine Größe von 20 bp bis 4 kbp hat.

10. Zelle, die transient oder stabil mit einem Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 transformiert ist.

11. Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) ein Reportervektor nach Anspruch 8 oder 9, in den eine erste heterologe Nukleinsäuresequenz inseriert ist, in eine Zelle transformiert wird,
• b) mindestens ein zweiter Vektor in diese Zelle trans­ formiert wird, der eine zweite heterologe Nuklein­ säuresequenz unter Kontrolle eines Promotors enthält,
• c) die transformierte Zelle unter solchen Bedingungen kultiviert wird, daß eine Expression der zweiten Nukleinsäuresequenz stattfinden kann, und
• d) die Expression des Reportergens in der Zelle unter­ sucht wird, wobei durch einen Anstieg der Expression des Reportergens das Auftreten einer Wechselwirkung zwischen dem Expressionsprodukt der zweiten Nuklein­ säuresquenz und der ersten Nukleinsäuresequenz auf dem Reportervektor nachweisbar ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer Genbank stammt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die erste heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer Genbank stammt.

14. Zelle, die transient oder stabil transformiert ist, mit

• a) einem Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und
• b) mindestens einem zweiten Vektor nach Anspruch 11(b).

15. Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) ein Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in eine Zelle transformiert wird,
• b) mindestens ein zweiter Vektor in diese Zelle trans­ formiert wird, der ein Fusionsgen aus einer ersten heterologen Nukleinsäuresequenz und einer Nuklein­ säuresequenz, die für eine Bindedomäne des Operators auf dem Reportervektor kodiert, unter Kontrolle ei­ nes Promotors enthält,
• c) mindestens noch ein dritter Vektor in diese Zelle transformiert wird, der ein Fusionsgen aus einer zweiten heterologen Nukleinsäuresequenz und einer Nukleinsäuresequenz, die für einen Transkriptions- Aktivator des Reportergens kodiert, unter Kontrolle eines Promotors enthält,
• d) die transformierte Zelle unter solchen Bedingungen kultiviert wird, daß eine Expression der heterologen Nukleinsäuresequenzen stattfinden kann und
• e) die Expression des Reportergens in der Zelle unter­ sucht wird, wobei durch einen Anstieg der Expression des Reportergens das Auftreten einer Wechselwirkung zwischen dem Expressionsprodukt der ersten Nuklein­ säuresequenz und dem Expressionsprodukt der zweiten Nukleinsäuresequenz nachweisbar ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die erste oder zweite heterologe Nukleinsäuresequenz aus einer Genbank stammt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Hefezelle ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindedomäne eine LexA-Sequenz umfaßt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Aktivator eine B42-, Gal4- oder/und VP16-Sequenz umfaßt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung bei einer Expression des Reportergens zu einem Farbsignal führt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlung eine Wellenlänge von 280 nm bis 400 nm umfaßt, vorzugsweise 350 nm bis 375 nm.

22. Zelle, die transient oder stabil transformiert ist mit

• a) einem Reportervektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und
• b) mit mindestens einem zweiten Vektor nach Anspruch 15(b) oder/und
• c) mit mindestens einem dritten Vektor nach Anspruch 15(c).

23. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 14 oder 22 zur Untersuchung von molekularen Wechselwirkungen.