Isoliertes Photoprotein Aequorin Y89F, sowie dessen Verwendung
Die Erfindung betrifft das Photoprotein Aequorin Y89F, dessen Nukleotid- und Amino- säuresequenz, sowie die Aktivität und Verwendung des Photoproteins Aequorin Y89F.
Photoproteine
Als Biolumineszenz bezeichnet man das Phänomen der Lichterzeugung durch Lebewesen. Sie ist das Ergebnis von biochemischen Reaktionen in Zellen, bei denen die chemische Energie in Form von Lichtquanten abgegeben wird (sog. kalte Emission durch Chemolumineszenz). Derartig er¬ zeugtes Licht ist monochromatisch, denn es wird bei einem diskreten Elektronen-Übergang abge¬ strahlt, kann aber durch sekundäre Leuchtfarbstoffe (z.B. fluoreszierende Proteine bei Leuchtqual- len der Gattung Aequoria) in längerwellige Spektralbereiche verschoben werden.
Die biologische Funktion ist vielfältig: In der Meerestiefe zwischen 200 und 1000 m (Mesopelagi- al) leuchten rund 90% aller Lebewesen. Die Leuchtsignale werden hier zur Partnerwerbung, Täu¬ schung und als Köder eingesetzt. Auch Glühwürmchen und Leuchtkäfer nutzen die Lichtsignale zur Partnersuche. Die Bedeutung des Leuchtens von Bakterien, Pilzen und einzelligen Algen ist dagegen unklar. Es wird vermutet, dass es zur Koordination von vielen Einzel-Individuen einer großen Population eingesetzt wird oder eine Art biologische Uhr darstellt.
Eine Vielzahl an Coelenteraten ist biolumineszent (Morin et al., 1974). Diese Organismen emittie¬ ren blaues oder grünes Licht. Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte Ae¬ quorin aus Aequoria victoria (Shimomura et al., 1969) emittierte als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht grünes Licht wie phänotypisch beobachtet bei Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phänotypisch grün erscheinen lässt (Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al., 1994). Als weitere Photoproteine konnten noch Clytin (Inouye et al., 1993), Mitrocomin (Fagan et al., 1993) und Obelin (Illarionov et al., 1995) identifi- ziert und beschrieben werden.
Tabelle 1: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Name, der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc. No.) des Datenbank¬ eintrages.
Tabelle 2: Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist, der Name des Photoproteins und eine Auswahl an Patenten bzw. An- meidungen.
Biolumineszenz wird heute in der Technik vielfaltig genutzt, z.B. in Form von Bio-Indikatoren für Umweltverschmutzung oder in der Biochemie zum empfindlichen Nachweis von Proteinen, zur Quantifizierung bestimmter Verbindungen oder als sogenannte "Reporter" bei der Untersuchung zellulärer Gen-Regulation.
Die Photoproteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sondern auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften.
Es konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz von Photoprotei¬ nen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften verändert werden können. Beispiele von mutagenisierten Photoproteinen sind in der Literatur beschrieben (US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986).
Die Lichterzeugung durch die oben genannten Photoproteine erfolgt durch die Oxidation von Coe- lenterazin (Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999).
Reportersysteme
Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unter¬ scheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.
1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.
2. Reportergene. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusio¬ nierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehören die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura, 1985; Phil¬ lips GN5 1997; Snowdowne et al., 1984).
Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.
Man unterscheidet Chemolumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion, die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein En¬ zym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.
Herstellung der Mutante
Zur Herstellung der Mutante wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an der Position 89 (GenBank # AAAZIl 16; Position 89 von SEQ ID 5) eingefügt. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stratagene (Katalog Nummer #200521; Revision #063001b; Auflage 2003) verwendet. Als Primer wurden (SEQ ID NO: 3) und (SEQ ID NO: 4) verwendet. Der Vektor wurde als pET22b-AQ_Y89F bezeichnet.
- A -
Aequorin Y89F
In der Literatur wurden bereits Photoproteine beschrieben, die durch Austausch einzelner Amino¬ säuren verändertete spektrale oder biochemische Eigenschaften aufwiesen. Zu diesen gehört Obe- lin W92F (Vysotski et al, 2003) und Aequorin (Shrestha et al., 2002; Ohmiya et al., 1993)
Das Spektrum von Aequorin wurde im Maximum mit 470 nm beschrieben (Shimomuro et al., 1966). Eine Übersicht über die spektralen Eigenschaften von Coelenterazine wurde in Shinomuro (Shimomura et al., 2000) beschrieben und in Fig. 9 gezeigt.
Das Photoprotein Aequorin Y89F zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene zu Aequorin aus Aequoria Victoria mit einer Identität von 99 %. (gezeigt in Beispiel 8; Fig. 8). Zum Sequenz- vergleich wurde das BLAST-Verfahren verwendet (Altschul et al., 1997).
Die Erfindung betrifft das Photoprotein Aequorin Y89F mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2. Ebenfalls betrifft die Erfindung das Nukleinsäuremolekül dargestellt in SEQ ID NO: 1.
Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente von Aequorin Y89F. Funktionelle Äquivalen- te sind solche Proteine, die vergleichbare physikochemische Eigenschaften haben.
Bevorzugt sind solche Äquivalente, die ein Maximum im Fluoreszens- oder Biolumineszens- spektrum im Bereich von 480-520 nm, bevorzugt von 485-515 nm, besonders bevorzugt im Be¬ reich von 490-505 nm, oder insbesondere bei 500 nm aufweisen.
Die Erfindung betrifft Aequorin Photoproteine, die im Bereich der Aminosäurepositionen 79-99, 84-94, bevorzugt 87-91, insbesondere 88-90 (bezogen auf GenBank #AAA27716) eine oder meh¬ rere Aminosäuremutationen aufweisen, welche zu einem veränderten Fluoreszens- oder Biolumi- neszensspektrum führen. Desweiteren betrifft die Erfindung Aequorin Photoproteine, die in der Postion 89 (bezogen auf GenBank #AAA27716) eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Fluoreszens- oder Biolumineszensspektrum führen. Bevorzugt sind dabei solche Photoproteine, die ein Maximum im Fluoreszens- oder Biolumineszensspektrum im Bereich von 480-520 nm, bevorzugt von 485-515 nm, besonders bevorzugt im Bereich von 490-510 nm, 495 bis 505, oder insbesondere bei 500 nm aufweisen. Hierbei können Aequorin Photoproteine auch sol¬ che Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 84-94 ein ähnliches Motif aufweisen wie das verkürzte Aequorin (GenBank #AAA27716). Als Bereiche mit ähnlichem Motif gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90% aufweisen.
Ebenfalls sind funktionelle Fragmente des Aequorin Y89F Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfϊndungsgemäß.
Ebenfalls sind verkürzte funktionelle Fragmente weiterer erfϊndungsgemäßer Proteine bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren Bestandteil der Erfindung.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich auch als Reportergen durch Markierung, Identifizie¬ rung und Charakterisierung von Zellorganellen speziell für Mitochondrien.
Das Photoprotein von Aequorin Y89F eignet sich auch als Reportergen zur Bestimmung von Pa¬ rametern innerhalb und außerhalb von Zellorganellen, speziell von Mitochondrien, speziell von Kalziumkonzentrationen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reportergen in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bakulo, in Pflanzen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reportergen für zelluläre Systeme in Kombinati¬ on mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen, speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxygenasen, mit Phosphatasen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Fusionsprotein speziell für Rezeptoren, für Io¬ nenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phospho- diesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine und für GIy- koproteine.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Protein für Systeme des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET- (Bioluminescence Resonance ]> nergy Transfer), FET (fϊeld effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogene- ous time-resolved fluorescence) Systemen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Markierung von Substraten oder Liganden spe¬ ziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrat für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekop¬ pelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reportergen bei der pharmakologischen Wirk¬ stoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Komponente von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mikroskopie.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein- Wechselwirkungen, für DNA-Protein- Wechselwirkungen, für DNA- RNA-Wechselwirkungen, für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechsel- wirkungen (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid; ).
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker oder Fusionsprotein für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Reporter zur Messung von intra- oder extrazellu- lären Calziumkonzentrationen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Charakterisierung von Signalkaskaden in zellulä¬ ren Systemen.
Das an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelte Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich als Son¬ de speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäu- resequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip-Analysen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Markierung von pharmakologischen Formulie- rungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich für geologische Untersuchungen speziell für Mee¬ res-, Grundwasser- und Flussströmungen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefe Systemen, in Bakulo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal-invasiven.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und ande¬ ren phänotypisch veränderten Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operati- ven Eingriffen.
Die Erfindung betrifft auch die Reinigung des Photoprotein Aequorin Y89F speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.
Das Photoprotein Aequorin Y89F eignet sich zur gleichzeitigen Messung verschiedener Reporter¬ gene in einem Expressionsystem (multiplexing).
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin Y89F auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncre¬ me, von Körperpudern.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin Y89F zur Färbung spe¬ ziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin Y89F zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin Y89F zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Photoprotein Aequorin Y89F zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke.
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 2 bzw funktionelle Äuquivalente oder funktionelle Fragmente desselben kodieren.
Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Nukleinsäuremoleküle bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente derselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 beinhaltet;
b) Nukleinsäuremolekülen, welche die durch SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz enthalten;
c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins aufweisen;
Eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen wird in einer wässrigen Lö¬ sung, die 0,2 x SSC (Ix Standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 680C durchgeführt (Sambrook et al, 1989).
d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden.
Die Erfindung betrifft die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, bei denen die Sequenz einen funktionalen Promotor 5' zu der das Photoprotein kodierenden Sequenz bzw. der das Leader- oder Siganlsequenz kodierenden Sequenz enthält.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren sind.
Die Erfindung betrifft Organismen, die einen solchen Vektor enthalten.
Die Erfindung betrifft Photoproteine, die durch die vorhergehend beschriebenen Nukleotidsequen- zen kodiert sind.
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Pho¬ toprotein Polypeptides.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, für Photoproteine kodierende Nukleinsäuren als Marker- oder Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoff- suche und Diagnostik.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Photoproteine bzw. eine erfin¬ dungsgemäße, für ein Photoprotein kodierende Nukleinsäure als Marker oder Reporter bzw. als Marker- oder Reportergen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung des Photoproteins Aequorin Y89F (SEQ ID NO: 2) oder seiner funktionellen Fragmente oder Äuquivalente bzw. die Verwendung einer für das Photoprote¬ in Aequorin Y89F kodierenden Nukleinsäure oder ihrer funktionellen Fragmente oder Äuquivalen¬ te als Marker oder Reporter bzw. als Marker oder Reportergen insbesondere für die pharmakologi¬ sche Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure als Mar- ker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.
Gegenstand der Erfindung sind auch polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche ein erfin¬ dungsgemäßes Polypeptid erkennen.
Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die das Photoprotein Ae¬ quorin Y89F (SEQ ID NO:2) erkennen.
Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure wie in den vorangehenden Absätzen beschrieben, welche einen funktionalen Promotor 5Λ zur kodierenden Sequenz enthält.
Die Erfindung beinhaltet rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche die vorangehend be¬ schriebenen Nukleinsäuren enthalten.
Organismen, die einen wie vorangehend beschriebenen Vektor enthalten, sind ebenfalls erfin- dungsgemäß.
Ein Polypeptid, das durch eine wie oben beschriebene Nukleinsäuresequenz kodiert ist, ist eben¬ falls Teil der Erfindung.
Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Expression der vorangehend genannten Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfin¬ dungsgemäßen Polypeptides.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Photoproteins als Marker oder Reporter.
Bestandteil der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polyppeptids in Kombination mit einer oder mehrerer Luziferasen und/oder einem oder mehrerer Photoproteine.
Erfindungsgemäß ist ein Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine oder mehrere Mutationen in Position 79 bis 99, 85 bis 91, oder bevorzugt 87 bis 89 bezogen auf SEQ ID NO: 5 besitzt und welches ein Biolumineszenz bzw Fluoreszenzspektrum mit einem Ma¬ ximum zwischen 490nm und 510nm aufweist.
Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Photoprotein oder funktionelle Fragmente desselben, welches eine Mutation in Position 89 bezogen auf SEQ ID NO: 5 besitzt und welches ein Biolumi- neszenz bzw. Fluoreszenzspektrum mit einem Maximum zwischen 490 nm und 510 nm, bevorzugt zwischen 495 nm und 505 nm, besonders bevorzugt zwischen 498 nm und 502 nm aufweist.
Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz beinhaltet, die für ein Protein gemäß der beiden vorangehenden Abschnitte kodiert.
Ein weiteres Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Photoproteins, da- durch gekennzeichnet, dass in einem Photoprotein in der Region definiert durch Position 79 bis 99, bevorzugt 87 bis 91, besonders bevorzugt 88 bis 90 bezogen auf SEQ ID NO: 5 eine oder mehrere Mutationen eingeführt werden, was zu einer Veränderung des Biolumineszenz oder Fluoreszenz¬ spektrums führt.
Ein Photoprotein, hergestellt durch ein Verfahren wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben ist ebenfalls erfindungsgemäß.
Expression der erfindungsgemäßen Photoproteine
Als Expression bezeichnet man die Produktion eines Moleküls, das nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in einen Expressionsvektor klo- nierte Fremdgen erlaubt. Expressionsvektoren enthalten die für die Expression von Genen in ZeI- len von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale.
Expressionsvektoren können prinzipiell auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Bei den sogenannten Transkriptionsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als authentisches, biologisch aktives Protein synthetisiert. Der Expressionsvektor trägt hierzu alle zur Expression benötigten 5Λ- und 3'- Kontrollsignale.
Bei den sogenannten Translationsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein zusammen mit einem anderen Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen lässt. Die zur Expression benötigten 5Λ- und 3λ- Kontrollsignale inklusive des Startcodons und eventuell ein Teil der für die N-terminalen Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen vom Vektor. Der zusätzliche eingeführte Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteasen, sondern lässt sich auch zum Nachweis und zur Isolierung des gebildeten Hybridproteins einsetzen. Die Expression kann sowohl transient, als auch stabil erfolgen. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen, Viren als auch eukaryotische Systeme.
Reinigung der erfindungsgemäßen Photoproteine
Die Isolierung von Proteinen (auch nach Überexpression) wird häufig als Proteinreinigung be¬ zeichnet. Zur Proteinreinigung steht eine Vielzahl an etablierten Methoden und Verfahren zur Ver¬ fügung.
Die Fest-Flüssig-Trennung ist eine Grundoperation bei Proteinisolierungen. Sowohl bei der Ab¬ trennung der Zellen vom Kulturmedium als auch bei der Klärung des Rohextraktes nach Zellauf- Schluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei der Abtrennung von Niederschlägen nach Fällungen usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Er erfolgt durch Zentrifugation und Filtration.
Durch Gewinnung intrazellulärer Proteine muss die Zellwand zerstört bzw. durchlässig gemacht werden. Je nach Maßstab und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rühr¬ werkskugel- bzw. Glasperlenmühlen eingesetzt. Im Labormaßstab kommen u.a. mechanische ZeIl- Integrationen und Ultraschallbehandlung zum Einsatz.
Sowohl für extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln (Alkohole, Aceton) eine schnelle und effiziente Methode zur Konzentration von Proteinen. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung der löslichen Nukleinsäuren erstrebenswert (Fällung z.B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat). Bei der Gewinnung extrazellulärer Proteine werden häufig Träger (z.B. Stärke, Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten.
Für die Feinreinigung stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren zur Verfü¬ gung (Absorptions- und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Elektrophoresen). Eine Säulenchromatographie wird auch im technischen Maßstab angewandt. Für den Labormaßstab ist vor allem die Affinitätschromatographie von Bedeutung, die Reinigungsfak- toren bis zu mehreren 100 pro Schritt ermöglicht.
Extrazelluläre Proteine fallen in relativ verdünnten Lösungen an. Sie müssen ebenso wie extrazel¬ luläre Proteine vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. Neben den schon erwähnten Verfahren hat sich - auch im industriellen Maßstab - die Ultrafϊltration bewährt.
Anorganische Salze als Begleitstoffe von Proteinen sind für spezifische Anwendungen häufig un- erwünscht. Sie können u.a. durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden.
Zahlreiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum Einsatz. Als Trocknungsverfahren sind die Vakuum-, Gefrier- und Sprühtrocknung von Bedeutung.
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
Das Photoprotein Aequorin Y89F wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 1):
ATGTCAGTCAAGCTTACACCAGACTTCGACAACCCAAAATGGATTGGACGACA CAAGCACATGTTTAATTTTCTTGATGTCAACCACAATGGAAGGATCTCTCTTGA CGAGATGGTCTACAAGGCGTCCGATATTGTTATAAACAATCTTGGAGCAACAC CTGAACAAGCCAAACGTCACAAAGATGCTGTAGAAGCCTTCTTCGGAGGAGCT GGAATGAAATATGGTGTAGAAACTGAATGGCCTGAATTTATCGAAGGATGGAA AAGACTGGCTTCCGAGGAATTGAAAAGGTATTCAAAAAACCAAATCACACTTA TTCGTTTATGGGGTGATGCATTGTTCGATATCATTGACAAAGACCAAAATGGA GCTATTTCACTGGATGAATGGAAAGCATACACCAAATCTGCTGGCATCATCCA ATCGTCAGAAGATTGCGAGGAAACATTCAGAGTGTGCGATATTGATGAAAGTG GACAGCTCGATGTTGATGAGATGACAAGACAACATTTAGGATTTTGGTACACC ATGGATCCTGCTTGCGAAAAGCTCTACGGTGGAGCTGTCCCCTAA -3 * .
Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 2):
MSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEJVIVYKASDΓVINNLGATPE QAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEFFFIGWKRLASEELKRYSKNQITLIRLW
GDALFDIIDKDQNGAISLDEWKAYTKSAGIIQSSEDCEETFRVCDIDESGQLDVDEM TRQHLGFWYTMDPACEKLYGGAVP
Primer :
(SEQ ID NO: 3):
5'-GAATGGCCTGAATTTATCGAAGGATGGAA-S'
(SEQIDNO:4):
5'-TTCCATCCTTCGATAAATTCAGGCCATTC -3'
Das Photoprotein Aequorin (Genbank: AAA27716 ) besitzt folgende Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5). Die Position 89 ist fett gedruckt und unterstrichen.
MTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKFIMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVINNL GATPEQAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEYIEGWKRLASEELKRYSKNQI
TLIRLWGDALFDIIDKDQNGAISLDEWKAYTKSDGIIQSSEDCEETFRVCDIDESGQL DVDEMTRQHLGFWYTMDPACEKLYGGAVP
Diese Sequenzen finden sich im Sequenzlisting wieder.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 : Die Fig. 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pET22b-AQ_Y89F.
Fig. 2: Die Fig. 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-AQ_ Y89F
Fig. 3: Die Fig. 3 zeigt das Ergebnis der eukaryotischen Expression von Aequorin Y89F in CHO Zellen. Der Versuchsablauf erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben. (Y = relative light u- nits, RLU; Y = ATP log conc. / mol/1)
Fig. 4: Die Fig. 4 zeigt die kinetische Analyse des expremierten Photoproteins AQ_Y89F. [Y= relative light units (RLU); X= Sekunden]
Fig. 5 : Die Fig. 5 zeigt das Augment von Aequorin und Aequorin Y89F auf Aminosäureebene
Fig. 6 : Die Fig. 6 zeigt das Augment von Aequorin und Aequorin Y89F auf Nukleinsäureebene
Fig. 7 : Die Fig. 7 zeigt die Biolumineszenz nach spektraler Analyse des Photoproteins Aequorin Y89F. [X = Wellenlänge in nm / Y = Intensität]
Fig. 8: Die Fig. 8 zeigt die Fluoreszenz nach spektraler Analyse des Photoproteins Aequorin Y89F. [X = Wellenlänge in nm / Y = Intensität]
Fig. 9 : Die Fig. 9 zeigt die spektralen Eigenschaften von Coelenterazine (aus Shimomura et al. 2000)
Beispiele
Beispiel 1
Zur Herstellung der Mutante wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an der Position 89 (des verkürtzen Aequorins; GenBank #AAA27716) eingefügt. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stragene (USA) verwendet. Als Primer wurden (SEQ ID NO: 3) und (SEQ K) NO: 4) verwendet. Der Vektor wurde als pET22b-AQ_Y89F bezeichnet.
Die Fig. 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pET22b-AQ_Y89F .
Beispiel 2
Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. Das Derivat des Vektors wurde als pcDNA3- AQ_Y89F bezeichnet. Der Vektor pcDNA3-AQ_Y89F wurde zur Expression von Aequorin Y89F in eukaryotischen Systemen verwendet.
Die Fig. 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-AQ_Y89F .
Beispiel 3
Bakterielle Expression
Die bakterielle Expression erfolgte in E. coli durch Transformation der Bakterien mit den Expres- sionsplasmids pET22b-AQ_Y89F. Die transformierten Bakterien wurden in LB-Medium bei 370C für 3 Stunden inkubiert und die Expression nach Herstellerangaben (Novagen) induziert. Die indu¬ zierten Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris/HCl (pH 9,0) + 5 mM EDTA resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. Das Lysat wurde anschliessend für 15 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute (16000 rcf) zentrifugiert und der Überstand ab¬ genommen. Der Überstand (Verdünnungen 1:5; 1:10; 1:20 und 1:50 mit Tris/HCl pH 9,0)) wurde 3 Stunden mit Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in Tris/HCl pH 9,0) im dunkeln inkubiert. Direkt nach der Zugabe von 5 mM Calziumchlorid wurde die Biolumineszenz im Luminometer gemessen. Die Integrationszeit der Messung betrug 40 Sekunden.
Beispiel 4
Eukaryotische Expression
Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-AQ_Y89F und pcDNA3.1(+) in transienten Experimen-
ten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Die transfϊzierten Zellen wurden über Nacht bei 370C in DMEM- F12 Medium inkubiert. Anschliessend wurde das Medium entfernt und durch 50 μl Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in PBS) ersetzt. Die Zellen wurden für 3 Stunden bei 370C inkubiert und anschliessend ATP (Adenosintriphosphat) bis zu einer Finalkonzentration von 1 μM zugege¬ ben. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe im Luminometer gestartet. Die Integrationszeit betrug 1 Sekunde, bei einer Gesamtmessdauer von 60 Sekunden.
Die Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Biolumineszenzmessung von Aequorin Y89F in CHO Zellen.
Beispiel 5
BLAST
Ergebnis einer BLAST- Analyse von Aequorin Y89F auf der Aminosäureebene.
>sp|P07164 |AEQ1_AEQVI Aequorin 1 precursor pir| |A26623 aequorin-1 precursor - hydromedusa (Aequorea victoria) gb|AAA27716.1 | aequo- rin 1 precursor
Length = 196, Score = 397 bits (1019), Expect = e-110, Identities = 188/190 (98%), Positives = 189/190 (99%)
>dbj |BAC81730.1 I apoaequorin [Aequorea victoria] Length = 196, Score = 393 bits (1010), Expect = e-108, Identities = 185/190 (97%), Positives = 190/190 (100%)
>sp|P02592|AEQ2_AEQVI Aequorin 2 precursor pir| |AQJFNV aequorin precursor - hydromedusa (Aequorea victoria) gb|AAA27719.1 | aequo- rin precursor gb|AAA27720.1 | aequorin
Length = 196, Score = 375 bits (964), Expect = e-103, Identities = 172/190 (90%), Positives = 187/190 (98%)
>dbj IBAC81731.il apoaequorin [Aequorea victoria] Length = 196, Score = 375 bits (964), Expect = e-103, Identities = 172/190 (90%), Positives = 187/190 (98%)
>dbj IBAC81729.1 I apoaequorin [Aequorea victoria]
Length = 196, Score = 373 bits (957), Expect = e-102, Identities = 171/190 (90%), Positives = 186/190 (97%)
>pdb|lEJ3|A Chain A, Crystal Structure Of Aequorin pdb| IEJ3 |B Chain B, Crystal Structure Of Aequorin
Length = 191, Score = 372 bits (956), Expect = e-102, Identities = 170/188 (90%), Positives = 185/188 (98%)
>dbj |BAC81732.1 I apoaequorin [Aequorea victoria]
Length = 196, Score = 370 bits (949), Expect = e-101, Identities = 170/190 (89%), Positives = 185/190 (97%)
>gbIAAK02061.1| apoaequorin [Aequorea macrodactyla]
Length = 195, Score = 359 bits (921), Expect = 2e-98, Identities
= 165/190 (86%), Positives = 179/190 (94%) >gb|AAK02060.1 | apoaequorin [Aequorea parva]
Length = 195, Score = 359 bits (921), Expect = 2e-98, Identities = 162/190 (85%), Positives = 182/190 (95%)
>gbIAAO91813.1 I aequorin [Aequorea coerulescens] Length = 195, Score = 356 bits (913), Expect = 2e-97, Identities = 162/190 (85%), Positives = 181/190 (95%)
>gbIAAA27717.il aequorin 2
Length = 177, Score = 350 bits (898), Expect = le-95, Identities = 160/177 (90%), Positives = 174/177 (98%)
>gb|AAA27718.1| aequorin 3
Length = 177, Score = 343 bits (879), Expect = 2e-93, Identities
= 156/177 (88%), Positives = 172/177 (97%)
>sp| P39047 |MYTR_MITCE Mitrocomin precursor pir MS39022 mitrocomin precursor - Mitrocoma cellularia gb|AAA29298.1 | apomitrocomin Length = 198, Score = 298 bits (764), Expect = 3e-80, Identities = 136/190 (71%), Positives = 159/190 (83%)
>pdb|UF0|A Chain A, The Crystal Structure Of Obelin From Obelia
Geniculata At 1.82 A Resolution gb|AAL86372.1 apoobelin [Obelia geniculata]
Length = 195, Score = 272 bits (696), Expect = 3e-72, Identities
= 122/190 (64%), Positives = 155/190 (81%)
>sp|Q27709|OBL_OBELO Obelin precursor (OBL) pdb|lEL4|A Chain A, Structure Of The Calcium-Regulated Photoprotein Obelin Determined By SuIfur Sas gb|AAA67708.1 | unnamed protein product Length = 195, Score = 271 bits (694), Expect = 4e-72, Identities = 124/190 (65%), Positives = 152/190 (80%)
Beispiel6
BLAST
Ergebnis einer BLAST-Analyse von Aequorin Y89F auf Nukleinsäureebene :
>gbIM16103.ilAEVAEQA A.victoria (jellyfish) aequorin 1 mRNA, complete cds
Length = 672, Score = 1085 bits (564), Expect = 0.0, Identities =
570/573 (99%)
>dbj IAB103337.1 I Aequorea victoria mRNA for apoaequorin, clo- ne:UTAEQO4
Length = 591, Score = 981 bits (510), Expect = 0.0, Identities =
552/573 (96%)
>dbj IAB103338.1 I Aequorea victoria mRNA for apoaequorin, clo- ne:UTAEQO9
Length = 591, Score = 819 bits (426), Expect = 0.0, Identities =
524/573 (91%)
>gb|L29571.1|AEVAQ440X Aequorea victoria aequorin (AQ440) mRNA, complete cds
Length = 925, Score = 813 bits (423), Expect = 0.0, Identities =
523/573 (91%)
>gbIM11394.1IAEVAEQD Aequorea victoria (jellyfish) aequorin mRNA, complete cds
Length = 861, Score = 813 bits (423), Expect = 0.0, Identities =
523/573 (91%)
>dbj IAB103336.1 I Aequorea victoria mRNA for apoaequorin, clo- ne:UTAEQ01
Length = 591, Score = 808 bits (420), Expect = 0.0, Identities =
522/573 (91%)
>dbj IAB103339.1 I Aequorea victoria mRNA for apoaequorin, clo- ne:UTAEQIl
Length = 591, Score = 802 bits (417), Expect = 0.0, Identities =
521/573 (90%)
>gb|M16104.1 IAEVAEQB A.victoria (jellyfish) aequorin 2 mRNA, par- tial
Length = 531, Score = 744 bits (387), Expect = 0.0, Identities =
483/531 (90%)
>gb|Ml6105.1 IAEVAEQC A.victoria (jellyfish) aequorin 3 mRNA, par- tial
Length = 531, Score = 710 bits (369), Expect = 0.0, Identities =
477/531 (89%)
>gb|AY013822.1 I Aequorea parva apoaequorin (Aequorin) gene, com¬ plete cds
Length = 588, Score = 592 bits (308), Expect = e-166, Identities
= 484/572 (84%)
>gbIAY013823.1 I Aequorea macrodactyla apoaequorin (Aequorin) gene, complete cds
Length = 588, Score = 479 bits (249), Expect = e-132, Identities
= 455/558 (81%)
>gb|L31623.1|MITMI17 Mitrocoma cellularia' apomitrocomin (MI17) mRNA, complete cds
Length = 727, Score = 185 bits (96), Expect = 8e-44, Identities =
292/390 (74%)
>gb|AF394688.1 I Obelia geniculata apoobelin mRNA, complete cds Length = 802, Score = 91.1 bits (47), Expect = 2e-15, Identities
= 59/65 (90%) >emb1X70221.1 | CGCLYTIN C.gregaria mRNA for clytin
Length = 747, Score = 73.7 bits (38), Expect = 3e-10, Identities = 46/50 (92%)
>gb|U07128.1|OLU07128 Obelia longissima apoobelin mRNA, complete cds
Length = 662, Score = 73.7 bits (38), Expect = 3e-10, Identities = 352/509 (69%)
>gb|L13247.1|CYlAPOCLYT Clytia gregarium apoclytin mRNA, complete cds
Length = 747, Score = 73.7 bits (38), Expect = 3e-10, Identities = 46/50 (92%)
Beispiel7
Die Fig. 6 zeigt das Alignment von Aequorin Y89F mit Aequorin (wildtype; wt) auf Nukleinsäure- ebene.
Beispiel 8
Die Fig. 7 zeigt das Alignment von Aequorin Y89F mit Aequorin (wildtype; wt) auf Aminosäure¬ ebene.
Beispiel 9
Kinetische Analyse von Aequorin Y89F
Zur kinetischen Analyse der Biolumineszenz von Aequorin Y89F, wurden CHO (Chinese Hamster Ovarian Cells) Zellen mit pcDNA3-AQ_Y89F bzw. pcDNA3 (ohne integrierte cDNA) transient transfϊziert. Die Transfektion und Messung erfolgte wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Mess¬ daten wurden für einen Zeitraum von 60 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde erho¬ ben.
Die Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der kinetischen Analyse von Aequorin Y89F.
Beispiel 10
Spektrale Analyse von Aequorin Y89F
Zur spektralen Analyse der Biolumineszenz und Fluoreszens von Aequorin Y89F, wurden das Photoprotein in Bakterien expremiert (Beispiel 3) und die Analyse im Spektrometer durchgeführt.
Die Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der spektralen Analyse von Aequorin Y89F.
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Literatur / Patente
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