WO2008107104A1

WO2008107104A1 - Isoliertes photoprotein mtclytindecay, sowie dessen verwendung

Info

Publication number: WO2008107104A1
Application number: PCT/EP2008/001561
Authority: WO
Inventors: Stefan Golz; Eugene Vysotski; Svetlana Markova; Natalia Malikova; Ludmila Frank
Original assignee: Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft
Priority date: 2007-03-08
Filing date: 2008-02-28
Publication date: 2008-09-12
Also published as: DE102007011241A1; TW200900418A

Abstract

Die Erfindung betrifft die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtCIytinDecay-182F, deren Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, sowie die Aktivität und Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F.

Description

Isoliertes Photoprotein mtClytinDecay, sowie dessen Verwendung

Die Erfindung betrifft die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay- 182F, dessen Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, sowie die Aktivität und Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay- 182F.

Photoproteine

Als Biolumineszenz bezeichnet man das Phänomen der Lichterzeugung durch Lebewesen. Sie ist das Ergebnis von biochemischen Reaktionen in Zellen, bei denen die chemische Energie in Form von Lichtquanten abgegeben wird (sog. kalte Emission durch Chemolumineszenz). Derartig erzeugtes Licht ist monochromatisch, denn es wird bei einem diskreten Elektronen-Übergang abgestrahlt, kann aber durch sekundäre Leuchtfarbstoffe (z.B. fluoreszierende Proteine bei Leuchtquallen der Gattung Aequoria) in längerwellige Spektralbereiche verschoben werden.

Die biologische Funktion ist vielfältig: In der Meerestiefe zwischen 200 und 1000 m (Mesopelagial) leuchten rund 90% aller Lebewesen. Die Leuchtsignale werden hier zur Partnerwerbung, Täuschung und als Köder eingesetzt. Auch Glühwürmchen und Leuchtkäfer nutzen die Lichtsignale zur Partnersuche. Die Bedeutung des Leuchtens von Bakterien, Pilzen und einzelligen Algen ist dagegen unklar. Es wird vermutet, dass es zur Koordination von vielen Einzel-Individuen einer großen Population eingesetzt wird oder eine Art biologische Uhr darstellt.

Eine Vielzahl an Coelenteraten ist biolumineszent (Morin et al., 1974). Diese Organismen emittieren blaues oder grünes Licht. Das 1962 als erstes Licht produzierendes Protein identifizierte Aequorin aus Aequoria victoria (Shimomura et al., 1969) emittierte als isoliertes Protein ein blaues Licht und nicht grünes Licht wie phänotypisch beobachtet bei Aequoria victoria. Später konnte das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequoria victoria isoliert werden, das aufgrund der Anregung durch das Aequorin die Meduse phänotypisch grün erscheinen lässt (Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969; Inouye et al., 1994). Als weitere Photoproteine konnten noch Clytin (Inouye et al., 1993), Mitrocomin (Fagan et al., 1993) und Obelin (Illarionov et al., 1995) identifiziert und beschrieben werden. Tabelle 1; Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Name, der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist und die Identifikationsnummer (Acc. No.) des Datenbankeintrages.

Tabelle 2; Übersicht über einige Photoproteine. Angegeben sind der Organismus aus dem das Protein isoliert worden ist, der Name des Photoproteins und eine Auswahl an Patenten bzw. Anmeldungen.

Biolumineszenz wird heute in der Technik vielfaltig genutzt, z.B. in Form von Bio- Indikatoren für Umweltverschmutzung oder in der Biochemie zum empfindlichen Nachweis von Proteinen, zur Quantifizierung bestimmter Verbindungen oder als sogenannte "Reporter" bei der Untersuchung zellulärer Gen-Regulation.

Die Photoproteine unterscheiden sich nicht nur aufgrund ihrer Nukleotid- und Aminosäuresequenz, sondern auch aufgrund ihrer biochemischen und physikalischen Eigenschaften.

Es konnte gezeigt werden, dass durch die Veränderung der Aminosäuresequenz von Photoproteinen die physikalischen und biochemischen Eigenschaften verändert werden können. Beispiele von mutagenisierten Photoproteinen sind in der Literatur beschrieben (US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986).

Die Lichterzeugung durch die oben genannten Photoproteine erfolgt durch die Oxidation von Coelenterazin (Haddock et al., 2001 ; Jones et al., 1999).

Reportersysteme

Als Reporter- oder Indikatorgen bezeichnet man generell Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden leicht nachweisen lassen. Man unterscheidet mindestens 2 Typen von Reportergenen.

1. Resistenzgene. Als Resistenzgene werden Gene bezeichnet, deren Expression einer Zelle die Resistenz gegen Antibiotika oder andere Substanzen verleiht, deren Anwesenheit im Wachstumsmedium zum Zelltod führt, wenn das Resistenzgen fehlt.

2. Reportergene. Die Produkte von Reportergenen werden in der Gentechnologie als fusionierte oder unfusionierte Indikatoren verwendet. Zu den gebräuchlichsten Reportergenen gehören die beta-Galaktosidase (Alam et al., 1990), alkalische Phosphatase (Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992), Luciferasen und andere Photoproteine (Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984).

Als Lumineszenz bezeichnet man die Abstrahlung von Photonen im sichtbaren Spektralbereich, wobei diese durch angeregte Emittermoleküle erfolgt. Im Unterschied zur Fluoreszenz wird hierbei die Energie nicht von Außen in Form von Strahlung kürzerer Wellenlänge zugeführt.

Man unterscheidet Chemolumineszenz und Biolumineszenz. Als Chemolumineszenz bezeichnet man eine chemische Reaktion, die zu einem angeregten Molekül führt, das selbst leuchtet, wenn die angeregten Elektronen in den Grundzustand zurückkehren. Wird diese Reaktion durch ein Enzym katalysiert, spricht man von Biolumineszenz. Die an der Reaktion beteiligten Enzyme werden generell als Luziferasen bezeichnet.

Herstellung der Mutante

Zur Herstellung der Mutanten wurden mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an den Position 141 [141F] (SEQ ID 1) und Position 182 [182F] (SEQ ID 3) eingefügt. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stratagene (Katalog

Nummer #200521 ; Revision #063001b; Auflage 2003) verwendet. Als Primer wurden SEQ

ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 verwendet. Die Vektoren wurde als pTriplEx2-mtClytinDecay-141F und pTriplEx2-mtClytinDecay-182F bezeichnet.

mtClytinDecay

In der Literatur wurden bereits Photoproteine beschrieben, die durch Austausch einzelner Aminosäuren verändertete spektrale oder biochemische Eigenschaften aufwiesen. Zu diesen gehört Obelin W92F (Vysotski et al., 2003) und Aequorin (Shrestha et al., 2002; Ohmiya et al., 1993).

Die mtClytin Mutante mtClytinDecay zeigt eine zeitlich veränderte Lichtfreisetzung verglichen mit dem Photoprotein mtClytin oder anderen Photoproteinen. Das Photoprotein mtClytinDecay zeigt überraschenderweise eine bisher noch nicht beschriebene verlangsamte Kinetik der Lichtfreisetzung bzw. Lumineszenz. Diese Eigenschaft ermöglicht die Verwendung des Photoproteins speziell für die Untersuchung von Reaktionen oder Mechanismen mit sehr schneller Kalziumfreisetzungen in eukaryotischen Zellen oder anderen Systemen. Die Kinetik der Lichtfreisetzung von bisher beschriebenen Photoproteinmutanten oder Photoprotein Wildtypproteinen wird als "flash" Kinetik beschrieben, da das Licht nach Aktivierung (z.B. mit Kalzium) in kürzester Zeit freigesetzt wird und die Reaktion anschließend zum Stilstand kommt oder zumindest deutlich schwächer wird. Zur Messung dieser schnellen Kinetik sind besondere Messinstrumente erforderlich. Die beschriebene Photoproteinmutante mtClytinDecay bzw. dessen Äquivalente ermöglicht nicht nur die Verwendung anderer Messinstrumente oder Messverfahren, sondern vor allem die Untersuchung von sehr schnellen Kinetiken. Diese Kinetiken können z.B. bei Ionenkanälen der Familie P2X auftreten.

mtClytinDecay zeichnet sich nicht nur durch eine veränderte Kinetik, sondern überraschenderweise auch durch eine besonders hohe Lichtfreisetzung aus. Diese hohe

Lichtfreisetzung - verglichen mit anderen Mutanten Photoproteinen - ermöglicht die

Verwendung der mtClytinDecay Mutanten als sensitives Reportergen. Die hohe

Lichtfreisetzung ermöglicht auch die Verwendung von Messgeräten oder Verfahren, die mit der Lichtfreisetzung anderen Photoproteine oder Reportersystemen nur unzureichende Ergbenisse liefern.

Das Spektrum von mtClytin wurde im Maximum mit 470 nm beschrieben (Shimomuro et al., 1966). Eine Übersicht über die spektralen Eigenschaften von Coelenterazine wurde in Shinomuro (Shimomura et al., 2000) beschrieben.

Das Photoprotein mtClytinDecay zeigt die höchste Homologie auf Aminosäureebene zu mtClytin aus Clytia gregaria mit einer Identität von 99 %.

Die Erfindung betrifft die Photoproteine mtClytinDecay- 14 IF und mtClytinDecay- 182F mit der Aminosäuresequenz repräsentiert durch SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4. Ebenfalls betrifft die Erfindung die Nukleinsäuremoleküle dargestellt in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3. Die Erfindung betrifft auch funktionelle Äquivalente oder Fragmente von mtClytinDecay- 14 IF und mtClytinDecay-182F. Funktionelle Äquivalente oder Fragmente sind solche Proteine, die vergleichbare funktionelle Eigenschaften aufweisen.

Die Erfindung betrifft mtClytin Photoproteine, die in der Postion 141 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der

Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszenzkinetik führen Hierbei können mtClytin

Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 131-

151, 136-146, bevorzugt 139-143, insbesondere 140-142 eine oder mehrere

Aminosäuremutationen aufweisen, welche zu veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszentkinetik führen.

Desweiteren betrifft die Erfindung mtClytin Photoproteine, die in der Postion 182 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszenzkinetik führen. Hierbei können mtClytin Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche im Bereich der Aminosäuren 172- 192, 177-187, bevorzugt 180-184, insbesondere 181-183 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, insbesondere der Biolumineszenzkinetik führen. Als Bereiche mit ähnlichem Motif gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90%, insbesondere 95 % aufweisen.

Die Erfindung betrifft Kombinationen von mtClytin Photoproteinen, die im Bereich der Aminosäurepositionen 131-151, 136-146, bevorzugt 139-143, insbesondere 140-142 eine oder mehrere Aminosäuremutationen aufweisen, welche zu veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz, führen, mit Mutationen im Bereich Aminosäureposition 182 oder Mutationen im Bereich von Aminosäureposition 182, welche zu einem veränderten Eigenschaften der Biolumineszenz führen. Desweiteren betrifft die Erfindung Kombinationen von mtClytin Photoproteinen, die in der Postion 182 eine Aminosäuremutation aufweisen, welche zu einer veränderten Biolumineszenzreaktion, insbesondere Biolumineszenzkinetik führen, mit Mutationen im Bereich Aminosäureposition 141. Hierbei können Photoproteine auch solche Photoproteine sein, welche in den erfindungsgemäßen Bereichen ein ähnliches Motiv aufweisen. Als Bereiche mit ähnlichem Motiv gelten hier solche Sequenzen, die in diesem Bereich eine Identität von 80%, bevorzugter Weise von 90% , insbesondere 95 % aufweisen.

Desweiteren sind Kombinationen von mutanten mtClytin, die zu veränderten biolumineszenten Eigenschaften, insbesondere der Biolumineszenzkinetik, fuhren mit Mutationen oder Derivaten von mtClytin oder Clytin, die zu veränderten physikochemischen Eigenschaften fuhren, insbesondere spektrale Eigenschaften, Kalziumsensitivität oder Substratbindung.

Ebenfalls sind funktionelle Fragmente des mtClytinDecay Proteins bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren erfindungsgemäß.

Ebenfalls sind verkürzte funktionelle Fragmente weiterer erfindungsgemäßer Proteine bzw. für solche kodierende Nukleinsäuren Bestandteil der Erfindung.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene für zelluläre Systeme speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren oder für induzierbare Systeme.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich auch als Reportergene durch Markierung, Identifizierung und Charakterisierung von Zellorganellen speziell für Mitochondrien.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich auch als Reportergene zur Bestimmung von Parametern innerhalb und ausserhalb von Zellorganellen, speziell von Mitochondrien, speziell von Kalziumkonzentrationen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene in bakteriellen und eukaryotischen Systemen speziell in Säugerzellen, in Bakterien, in Hefen, in Bacculo, in Pflanzen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene für zelluläre Systeme in Kombination mit biolumineszenten oder chemolumineszenten Systemen, speziell Systemen mit Luziferasen, mit Oxy genasen, mit Phosphatasen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Fusionsproteine speziell für Rezeptoren, für Ionenkanäle, für Transporter, für Transkriptionsfaktoren, für Proteinasen, für Kinasen, für Phosphodiesterasen, für Hydrolasen, für Peptidasen, für Transferasen, für Membranproteine und für Glykoproteine.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Immobilisierung speziell durch Antikörper, durch Biotin, durch magnetische oder magnetisierbare Träger.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Proteine für Systeme des Energietransfers speziell der FRET- (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET- (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), FET (field effect transistors), FP (fluorescence polarization), HTRF (Homogeneous time-resolved fluorescence) Systemen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Markierung von Substraten oder Liganden speziell für Proteasen, für Kinasen, für Transferasen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Expression in bakteriellen Sytemen speziell zur Titerbestimmung, als Substrat für biochemische Systeme speziell für Proteinasen und Kinasen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker speziell gekoppelt an Antikörper, gekoppelt an Enzyme, gekoppelt an Rezeptoren, gekoppelt an Ionenkanäle und andere Proteine.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche speziell im HTS (High Throughput Screening).

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reportergene bei der Charakterisierung, Identifizierung und Untersuchung von Ionenkanälen, speziell des Typs P2X, TRP, SCN, KCN, CNG, ACCN.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Komponenten von Detektionssystemen speziell für ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), für Immunohistochemie, für Western-Blot, für die konfokale Mikroskopie.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker für die Analyse von Wechselwirkungen speziell für Protein-Protein-Wechselwirkungen, für DNA-Protein- Wechselwirkungen, für DNA-RNA-Wechselwirkungen, für RNA-RNA- Wechselwirkungen, für RNA-Protein-Wechselwirkungen (DNA: deoxyribonucleic acid; RNA: ribonucleic acid; ).

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker oder Fusionsprotein für die Expression in transgenen Organismen speziell in Mäusen, in Ratten, in Hamstern und anderen Säugetieren, in Primaten, in Fischen, in Würmern, in Pflanzen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker oder Fusionsprotein zur Analyse der Embryonalentwicklung.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Marker über einen Kopplungsvermittler speziell über Biotin, über NHS (N-hydroxysulfosuccimide), über CN-Br.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reporter gekoppelt an Nukleinsäuren speziell an DNA, an RNA.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reporter gekoppelt an Proteine oder Peptide.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Reporter zur Messung von intra- oder extrazellulären Calziumkonzentrationen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Charakterisierung von Signalkaskaden in zellulären Systemen.

Die an Nukleinsäuren oder Peptiden gekoppelten Photoproteine mtClytinDecay eignen sich als Sonden speziell für Northern-Blots, für Southern-Blots, für Western-Blots, für ELISA, für Nukleinsäuresequenzierungen, für Proteinanalysen, Chip- Analysen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Markierung von pharmakologischen Formulierungen speziell von infektiösen Agentien, von Antikörpern, von „small molecules".

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich für geologische Untersuchungen speziell für Meeres-, Grundwasser- und Flussströmungen. Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Expression in Expressionssystemen speziell in in-vitro Translationssystemen, in bakteriellen Systemen, in Hefe Systemen, in Bacculo Systemen, in viralen Systemen, in eukaryotischen Systemen.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur Visualisierung von Geweben oder Zellen bei chirurgischen Eingriffen speziell bei invasiven, bei nicht-invasiven, bei minimal- invasiven.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich auch zur Markierung von Tumorgeweben und anderen phänotypisch veränderten Geweben speziell bei der histologischen Untersuchung, bei operativen Eingriffen.

Die Erfindung betrifft auch die Reinigung der Photoproteine mtClytinDecay speziell als wildtyp Protein, als Fusionsprotein, als mutagenisiertes Protein.

Die Photoproteine mtClytinDecay eignen sich zur gleichzeitigen Messung verschiedener Reportergene in einem Expressionsystem (multiplexing).

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay auf dem Gebiet der Kosmetik speziell von Badezusätzen, von Lotionen, von Seifen, von Körperfarben, von Zahncreme, von Körperpudern.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay zur Färbung speziell von Nahrungsmitteln, von Badezusätzen, von Tinte, von Textilien, von Kunststoffen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay zur Färbung von Papier speziell von Grußkarten, von Papierprodukten, von Tapeten, von Bastelartikeln.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoprotein mtClytinDecay zur Färbung von Flüssigkeiten speziell für Wasserpistolen, für Springbrunnen, für Getränke, für Eis.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay zur Herstellung von Spielwaren speziell von Fingerfarbe, von Schminke.

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 2 bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente desselben kodieren. Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die das Polypeptid offenbart durch SEQ ID NO: 4 bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente desselben kodieren.

Die Erfindung bezieht sich des weiteren auf Nukleinsäuremoleküle bzw. funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente derselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4 beinhaltet;

b) Nukleinsäuremolekülen, welche die durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz enthalten;

c) Nukleinsäuremolekülen, deren komplementärer Strang mit einem Nukleinsäuremolekül aus a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert und deren Expressionsprodukt die biologische Funktion eines Photoproteins aufweisen;

Eine stringente Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen wird in einer wässrigen Lösung, die 0,2 x SSC (Ix Standard saline-citrate = 150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat) enthält, bei 68 ⁰C durchgeführt (Sambrook et al., 1989).

d) Nukleinsäuremolekülen, welche sich auf Grund der Degenerierung des genetischen Kodes von den unter c) genannten unterscheiden.

Die Erfindung betrifft die oben genannten Nukleinsäuremoleküle, bei denen die Sequenz einen funktionalen Promotor 5' zu der das Photoprotein kodierenden Sequenz bzw. der das Leader- oder Signalsequenz kodierenden Sequenz enthält.

Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle wie vorhergehend beschrieben, die Bestandteil von rekombinanten DNA oder RNA Vektoren sind.

Die Erfindung betrifft Organismen, die einen solchen Vektor enthalten.

Die Erfindung betrifft Photoproteine, die durch die vorhergehend beschriebenen Nukleotidsequenzen kodiert sind. Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Photoprotein Polypeptides.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, für Photoproteine kodierende Nukleinsäuren als Marker- oder Reportergene, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Photoproteine bzw. eine erfindungsgemäße, für ein Photoprotein kodierende Nukleinsäure als Marker oder Reporter bzw. als Marker- oder Reportergen.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der Photoproteine mtClytinDecay (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4) oder seiner funktionellen Fragmente oder Äquivalente bzw. die Verwendung einer für das Photoprotein mtClytinDecay kodierenden Nukleinsäure oder ihrer funktionellen Fragmente oder Äquivalente als Marker oder Reporter bzw. als Marker oder Reportergen insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.

Die Erfindung betrifft die Verwendung der in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 dargestellten Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen, insbesondere für die pharmakologische Wirkstoffsuche und Diagnostik.

Gegenstand der Erfindung sind auch polyklonale oder monoklonale Antikörper, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid erkennen.

Die Erfindung betrifft auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die das Photoprotein mtClytinDecay (SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO: 4) erkennen.

Die Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure wie in den vorangehenden Absätzen beschrieben, welche einen funktionalen Promotor 5' zur kodierenden Sequenz enthält.

Die Erfindung beinhaltet rekombinante DNA oder RNA Vektoren, welche die vorangehend beschriebenen Nukleinsäuren enthalten. Organismen, die einen wie vorangehend beschriebenen Vektor enthalten, sind ebenfalls erfindungsgemäß .

Ein Polypeptid, das durch eine wie oben beschriebene Nukleinsäuresequenz kodiert ist, ist ebenfalls Teil der Erfindung.

Erfindungsgemäß ist auch ein Verfahren zur Expression der vorangehend genannten Polypeptide in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.

Bestandteil der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines erfindungsgemäßen Polypeptides.

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure als Marker- oder Reportergen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Photoproteins als Marker oder Reporter.

Bestandteil der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polyppeptids in Kombination mit einer oder mehrerer Luziferasen und/oder einem oder mehrerer Photoproteine.

Erfindungsgemäß ist ein Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Position 131-151, 136-146, bevorzugt 139- 143, insbesondere 140-142 oder eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Position 172-192, 177-187, bevorzugt 180-184, insbesondere 181-183 oder einer Kombination aus beiden, besitzt und welches ein verändertes, speziell verlangsamtes Biolumineszenzsignal aufweist.

Ebenfalls erfindungsgemäß ist ein Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz beinhaltet, die für ein Protein gemäß der beiden vorangehenden Abschnitte kodiert.

Ein weiteres Bestandteil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Photoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Photoprotein in der Region definiert durch Position 131-151, 136-146, bevorzugt 139-143, insbesondere 140-142 oder eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Position 172-192, 177-187, bevorzugt 180-184, insbesondere 181-183 eine oder mehrere Mutationen eingeführt werden, was zu einer Veränderung der Biolumineszenz, insbesondere Biolumineszenzkinetik fuhrt.

Ein Photoprotein, hergestellt durch ein Verfahren wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben ist ebenfalls erfindungsgemäß.

Die Erfindung betrifft auch andere Photoproteine, die durch eine oder mehrere Veränderungen in der Aminosäuresequenz eine veränderte Kinetik der Lichtfreisetzung aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung anderer veränderter Photoproteine für die beschriebenen Verwendungen der Mutanten des Photoproteins mtClytinDecay.

Photoproteine mit veränderter Kinetik der Lichtfreisetzung, besonders einer verlangsamten Lichtfreisetzung oder verlängerten Zeitspanne, in der Licht freigesetzt wird, eignen sich besonders als Reportergene in zeilbasierten Verfahren, speziell in der pharmakologischen Wirkstoffsuche und Charakterisierung, speziell in der Diagnostik.

Photoproteine mit veränderter Kinetik der Lichtfreisetzung, besonders einer verlangsamten Lichtfreisetzung oder verlängerten Zeitspanne, in der Licht freigesetzt wird, eignen sich besonders zur Untersuchung von Ionenkanälen.

Die Erfindung betrifft auch kodonoptimierte Varianten der erfindungsgemäßen Proteine zur Veränderung der biochemischen oder physikochemischen Eigenschaften, speziell der verbesserten Expression, speziell der veränderten Stabilität.

Die Erfindung betrifft auch Fusionen der erfindungsgemäßen Proteine mit Erkennungspeptiden zum Transport oder Lokalisierung der erfindungsgemäßen Proteinen in Zellorganellen oder Kompartimenten.

Die Erfindung betrifft auch Varianten der erfindungsgemäßen Proteine, die zu einer Veränderung der spektralen Eigenschaften, der Lumineszenzintensität, der Substratspezifität, der Verwendung von Cofaktoren, der Kalziumaffinität oder anderer physikochemischen oder biochemischen Eigenschaften führen. Der kinetische Verlauf der Lichtfreisetzung kann in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen variieren. In Abbildung 7 ist der kinetische Verlauf der Lichtfreisetzung für mtClytinDecay beispielhaft gezeigt.

Expression der erfindungsgemäßen Photoproteine

Als Expression bezeichnet man die Produktion eines Moleküls, das nach dem Einbringen des Gens in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in einen Expressionsvektor klonierte Fremdgen erlaubt. Expressionsvektoren enthalten die für die Expression von Genen in Zellen von Prokaryonten oder Eukaryonten erforderlichen Kontrollsignale.

Expressionsvektoren können prinzipiell auf zwei verschiedene Weisen konstruiert werden. Bei den sogenannten Transkriptionsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als authentisches, biologisch aktives Protein synthetisiert. Der Expressionsvektor trägt hierzu alle zur Expression benötigten 5"- und 3^Λ- Kontrollsignale.

Bei den sogenannten Translationsfusionen wird das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein als Hybridprotein zusammen mit einem anderen Protein exprimiert, das sich leicht nachweisen lässt. Die zur Expression benötigten 5'- und 3'- Kontrollsignale inklusive des Startcodons und eventuell ein Teil der für die N-terminalen Bereiche des zu bildenden Hybridproteins codierenden Sequenzen stammen vom Vektor. Der zusätzliche eingeführte Proteinteil stabilisiert nicht nur in vielen Fällen das vom einklonierten Fremdgen codierte Protein vor dem Abbau durch zelluläre Proteasen, sondern lässt sich auch zum Nachweis und zur Isolierung des gebildeten Hybridproteins einsetzen. Die Expression kann sowohl transient, als auch stabil erfolgen. Als Wirtsorganismen eignen sich sowohl Bakterien, Hefen, Viren als auch eukaryotische Systeme.

Reinigung der erfindungsgemäßen Photoproteine

Die Isolierung von Proteinen (auch nach Überexpression) wird häufig als Proteinreinigung bezeichnet. Zur Proteinreinigung steht eine Vielzahl an etablierten Methoden und Verfahren zur Verfügung. Die Fest-Flüssig-Trennung ist eine Grundoperation bei Proteinisolierungen. Sowohl bei der Abtrennung der Zellen vom Kulturmedium als auch bei der Klärung des Rohextraktes nach Zellaufschluss und Entfernung der Zelltrümmer, bei der Abtrennung von Niederschlägen nach Fällungen usw. ist der Verfahrensschritt erforderlich. Er erfolgt durch Zentrifugation und Filtration.

Durch Gewinnung intrazellulärer Proteine muss die Zellwand zerstört bzw. durchlässig gemacht werden. Je nach Maßstab und Organismus werden dazu Hochdruckhomogenisatoren oder Rührwerkskugel- bzw. Glasperlenmühlen eingesetzt. Im Labormaßstab kommen u. a. mechanische Zellintegrationen und Ultraschallbehandlung zum Einsatz.

Sowohl für extrazelluläre als auch intrazelluläre Proteine (nach Zellaufschluss) sind verschiedene Fällungsverfahren mit Salzen (insbesondere Ammoniumsulfat) oder organischen Lösungsmitteln (Alkohole, Aceton) eine schnelle und effiziente Methode zur Konzentration von Proteinen. Bei der Reinigung intrazellulärer Proteine ist die Entfernung der löslichen Nukleinsäuren erstrebenswert (Fällung z.B. mit Streptomycin- oder Protaminsulfat). Bei der Gewinnung extrazellulärer Proteine werden häufig Träger (z.B. Stärke, Kieselgur) vor Zugabe der Fällungsmittel zugesetzt, um besser handhabbare Niederschläge zu erhalten.

Für die Feinreinigung stehen zahlreiche chromatographische und Verteilungsverfahren zur Verfügung (Absorptions- und Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Elektrophoresen). Eine Säulenchromatographie wird auch im technischen Maßstab angewandt. Für den Labormaßstab ist vor allem die Affinitätschromatographie von Bedeutung, die Reinigungsfaktoren bis zu mehreren 100 pro Schritt ermöglicht.

Extrazelluläre Proteine fallen in relativ verdünnten Lösungen an. Sie müssen ebenso wie extrazelluläre Proteine vor ihrer weiteren Verwendung konzentriert werden. Neben den schon erwähnten Verfahren hat sich - auch im industriellen Maßstab - die Ultrafiltration bewährt. Anorganische Salze als Begleitstoffe von Proteinen sind für spezifische Anwendungen häufig unerwünscht. Sie können u. a. durch Gelfiltration, Dialyse und Diafiltration entfernt werden.

Zahlreiche Proteine kommen als Trockenpräparate zum Einsatz. Als Trocknungsverfahren sind die Vakuum-, Gefrier- und Sprühtrocknung von Bedeutung.

Nukleotid- und Aminosäuresequenzen

Das Photoprotein mtClytinDecay-141F wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 1):

5 " - GACAGATAAAAAATTCACTCCTTAGATTATTTAGTGAATAAGAGAAAAAAAGGATAAGAAA TCAAGATGCAAAGGTTTACAAATCGTCTTCTTTCCATGTCGGCTTTACGTGCAAGATCAAG ATTGCAACGCACGGCAAATTTTCACACCAGCATACTCTTGGCTACAGATTCAAAATACGCG GTCAAACTCGATCCTGATTTTGCAAATCCAAAATGGATCAACAGACACAAATTTATGTTCA ACTTTTTGGACATAAACGGTAAGGGGAAAATCACATTAGATGAAATCGTCTCCAAAGCTTC AGACGACATTTGTGCTAAACTGGATGCAACACCAGAACAGACCAAACGTCACCAGGATGCT GTTGAAGCCTTTTTCAAGAAAATGGGCATGGATTATGGTAAAGAAGTTGCATTCCCAGAAT TTATTAAGGGATGGGAAGAGTTGGCCGAACACGACTTGGAACTCTGGTCTCAAAACAAAAG TACATTGATCCGTGAATGGGGAGATGCTGTTTTCGACATTTTCGACAAAGACGCAAGTGGC TCAATCAGTTTAGACGAATGGAAGGCTTACGGACGAATCTCTGGAATCTGTCCATCAGACG AAGACGCTGAGAAGACGTTCAAACATTGTGATTTGGACAACAGTGGCAAACTTGATGTTGA TGAGATGACCAGGCAACATTTAGGCTTCTTCTACACATTAGATCCAACTTCTGATGGTCTT TATGGCAATTTTGTTCCCTAAGAAGCGTTCAGTTAAAAACGCTAAACATTGTTCAGTTGTA

AAATTATATTCATTTTCATTTCGTAAAATTAGTATTTATAAATTTGTATCATAAATTGTAT CCATGTTGTAGACTAAATAAGACTCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA - 3~.

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 2):

MQRFTNRLLSMSALRARSRLQRTANFHTSILLATDSKYAVKLDPDFANPKWINRH

KFMFNFLDINGKGKITLDEIVSKASDDICAKLDATPEQTKRHQDAVEAFFKKMGM

DYGKEVAFPEFIKGWEELAEHDLELWSQNKSTLIREWGDAVFDIFDKDASGSISLD EWKAYGRJSGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFFYTLDPTSDG

LYGNFVP Das Photoprotein mtClytinDecay-182F wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 3):

GACAGATAAAAAATTCACTCCTTAGATTATTTAGTGAATAAGAGAAAAAAAGGATAAGAAA TCAAGATGCAAAGGTTTACAAATCGTCTTCTTTCCATGTCGGCTTTACGTGCAAGATCAAG ATTGCAACGCACGGCAAATTTTCACACCAGCATACTCTTGGCTACAGATTCAAAATACGCG GTCAAACTCGATCCTGATTTTGCAAATCCAAAATGGATCAACAGACACAAATTTATGTTCA ACTTTTTGGACATAAACGGTAAGGGGAAAATCACATTAGATGAAATCGTCTCCAAAGCTTC AGACGACATTTGTGCTAAACTGGATGCAACACCAGAACAGACCAAACGTCACCAGGATGCT GTTGAAGCCTTTTTCAAGAAAATGGGCATGGATTATGGTAAAGAAGTTGCATTCCCAGAAT TTATTAAGGGATGGGAAGAGTTGGCCGAACACGACTTGGAACTCTGGTCTCAAAACAAAAG TACATTGATCCGTGAATGGGGAGATGCTGTTTTCGACATTTTCGACAAAGACGCAAGTGGC TCAATCAGTTTAGACGAATGGAAGGCGTTTGGACGAATCTCTGGAATCTGTCCATCAGACG AAGACGCTGAGAAGACGTTCAAACATTGTGATTTGGACAACAGTGGCAAACTTGATGTTGA TGAGATGACCAGGCAACATTTAGGCTTCTGGTACACATTGGATCCAACTTCTGATGGTCTT TATGGCAATTTTGTTCCCTAAGAAGCGTTCAGTTAAAAACGCTAAACATTGTTCAGTTGTA AAATTATATTCATTTTCATTTCGTAAAATTAGTATTTATAAATTTGTATCATAAATTGTAT CCATGTTGTAGACTAAATAAGACTCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 4):

MQRFTNRLLSMSALRARSRLQRTANFHTSILLATDSKYAVKLDPDFANPKWINRH KFMFNFLDINGKGKΓΓLDEIVSKASDDICAKLDATPEQTKRHQDA VEAFFKKMGM

DYGKEVAFPEFIKGWEELAEHDLELWSQNKSTLIREWGDAVFDIFDKDASGSISLD EWKAFGRISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPTSDG LYGNFVP

Das Photoprotein mtClytin wird in Patentanmeldung WO2005035559 beschrieben und wird durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert (SEQ ID NO: 5):

5'-

GACAGATAAAAAATTCACTCCTTAGATTATTTAGTGAATAAGAGAAAAAAAGG ATAAGAAATCAAGATGCAAAGGTTTACAAATCGTCTTCTTTCCATGTCGGCTTT ACGTGCAAGATCAAGATTGCAACGCACGGCAAATTTTCACACCAGCATACTCT TGGCTACAGATTCAAAATACGCGGTCAAACTCGATCCTGATTTTGCAAATCCA AAATGGATCAACAGACACAAATTTATGTTCAACTTTTTGGACATAAACGGTAA GGGGAAAATCACATTAGATGAAATCGTCTCCAAAGCTTCAGACGACATTTGTG CTAAACTGGATGCAACACCAGAACAGACCAAACGTCACCAGGATGCTGTTGAA GCCTTTTTCAAGAAAATGGGCATGGATTATGGTAAAGAAGTTGCATTCCCAGA ATTTATTAAGGGATGGGAAGAGTTGGCCGAACACGACTTGGAACTCTGGTCTC AAAACAAAAGTACATTGATCCGTGAATGGGGAGATGCTGTTTTCGACATTTTC GACAAAGACGCAAGTGGCTCAATCAGTTTAGACGAATGGAAGGCTTACGGAC GAATCTCTGGAATCTGTCCATCAGACGAAGACGCTGAGAAGACGTTCAAACAT TGTGATTTGGACAACAGTGGCAAACTTGATGTTGATGAGATGACCAGGCAACA TTTAGGCTTCTGGTACACATTGGATCCAACTTCTGATGGTCTTTATGGCAATTTT GTTCCCTAAGAAGCGTTCAGTTAAAAACGCTAAACATTGTTCAGTTGTAAAATT ATATTCATTTTCATTTCGTAAAATTAGTATTTATAAATTTGTATCATAAATTGTA TCCATGTTGTAGACTAAATAAGACTCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAA -3^'.

Daraus ergibt sich eine Aminosäuresequenz von (SEQ ID NO: 6):

MQRFTNRLLSMSALRARSRLQRTANFHTSILLATDSKYAVKLDPDFANPKWINRH KFMFNFLDINGKGKITLDEIVSKASDDICAKLDATPEQTKRHQDAVEAFFKKMGM DYGKEVAFPEFIKGWEELAEHDLELWSQNKSTLIREWGDAVFDIFDKDASGSISLD EWKAYGRISGICPSDEDAEKTFKHCDLDNSGKLDVDEMTRQHLGFWYTLDPTSDG LYGNFVP

Das putative Signalpeptide des Photoprotein mtClytin besitzt folgende Sequenz (SEQ ID NO: 7):

MQRFTNRLLSMSALRA

und weist folgende Nukleinsäuresequenz auf:

5'- ATGCAAAGGTTTACAAATCGTCTTCTTTCCATGTCGGCTTTACGTGCA - 3^* (SEQ ID NO 8) Zu Herstellung der Mutante mtClytinDecay-141F wurde folgende primer verwendet :

SEQ ID NO 9 : 5'-GACGAATGGAAGGCGTTTGGACGAATCTCTG-S'

SEQ ID NO 10 : 5'-CAGAGATTCGTCCAAACGCCTTCCATTCGTC-S'

Zu Herstellung der Mutante mtClytinDecay-182F wurde folgende primer verwendet :

SEQ ID NO 11 : 5'-CAACATTTAGGCTTCTTCTACACATTAGATCCAAC-S'

SEQ ID NO 12 : 5'-GTTGGATCTAATGTGTAGAAGAAGCCTAAATGTTG-S '

Diese Sequenzen finden sich im Sequenzlisting wieder.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 : Die Figur 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTriplEx2- mtClytinDecay-141F.

Fig. 2: Die Figur 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTriplEx2-mtClytinDecay-l 82F

Fig. 3: Die Figur 3 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3- mtClytinDecay-141F.

Fig. 4: Die Figur 4 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-182F.

Fig. 5: Die Figur 5 zeigt das Alignment der Photoproteine mtClytin, mtClytinDecay-141F und mtClytin- 182F auf Aminosäureebene.

Fig. 6: Die Figur 6 zeigt die Biolumineszenzreaktion von mtClytinDecay nach bakterieller Expression X-Achse : Zeit in Sekunden; Y-Achse : relative Lichteinheiten (relative light units).

Fig. 7: Die Figur 8 zeigt die Biolumineszenzreaktion von mtClytinDecay nach eukaryotischer Expression. X-Achse : Zeit in Sekunden; Y-Achse : relative Lichteinheiten (relative light units); Die Angaben in der Legende entsprechen der finalen Konzentration an ATP (Adenosintriphosphat) im beschriebenen experimentellen Ansatz. Beispiele

Beispiel 1

Zur Herstellung der Mutante wurde mit Hilfe molekularbiologische Methoden die Mutationen an der Position 141 oder 182 eingefügt. Hierzu wurde das "Quick change" Verfahren der Firma Stragene (USA) verwendet. Als Primer wurden (SEQ ID NO: 9 + 10) und (SEQ ID NO: 11 + 12) verwendet. Die Insertion der cDNA erfolgte in die Schnittstelle SfilA-SfilB des Vektors pTriplEx2. Die Vektoren wurde als pTriplEx2- mtClytinDecay-141F und pTriplEx2-mtClytinDecay-182F bezeichnet.

Die Figur 1 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTirplEx2-mtClytinDecay-141F.

Die Figur 2 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pTirplEx2-mtClytinDecay- 182F.

Beispiel 2

Als Vektor zur Herstellung des im folgenden dargestellten Konstruktes wurde das Plasmid pcDNA3.1(+) der Firma Clontech verwendet. Die Derivate des Vektors wurde als pcDNA3-mtClytinDecay-141F und pcDNA3-mtClytinDecay-182F bezeichnet. Die Vektoren pcDNA3-mtClytinDecay-141F und pcDNA3-mtClytinDecay-182F wurden zur Expression von mtClytinDecay-141F und mtClytinDecay-182F in eukaryotischen Systemen verwendet.

Die Figur 3 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-141F .

Die Figur 4 zeigt die Plasmidkarte des Vektors pcDNA3-mtClytinDecay-182F .

Beispiel 3

Bakterielle Expression

Die bakterielle Expression erfolgte in E. coli durch Transformation der Bakterien mit den Expressionsplasmiden pTriplEx2-mtClytinDecay-141F oder pTriplEx2-mtClytinDecay- 182F. Die transformierten Bakterien wurden in LB-Medium bei 37°C für 3 Stunden inkubiert und die Expression nach Herstellerangaben induziert. Die induzierten Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM Tris/HCl (pH 9,0) + 5 mM EDTA resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. Das Lysat wurde anschliessend für 15 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute (16000 rcf) zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Der Überstand wurde 3 Stunden mit Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in Tris/HCl pH 9,0) im dunkeln inkubiert. Direkt nach der Zugabe von 5 mM Calziumchlorid wurde die Biolumineszenz im Luminometer gemessen. Die Integrationszeit der Messung betrug 60 Sekunden.

Die Figur 6 zeigt die Kinetik der Biolumineszenzmessung von mtClytinDecay in Bakterien.

Beispiel 4

Eukaryotische Expression

Die konstitutive eukaryotische Expression erfolgte in CHO-Zellen durch Transfektion der Zellen mit den Expressionsplasmiden pcDNA3-mtClytinDecay-141F, pcDNA3- mtClytinDecay-182F und pcDNA3.1(+) in transienten oder stabilen Experimenten. Hierzu wurden 10000 Zellen pro Loch in DMEM-F 12 Medium auf 96 Loch Mikrotiterplatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des Fugene 6 Kits (Roche) nach Herstellerangaben. Die transfizierten Zellen wurden über Nacht bei 37°C in DMEM-F 12 Medium inkubiert. Anschliessend wurde das Medium entfernt und durch 50 μl Coelenterazin (10E-07 M Coelenterazine in PBS) ersetzt. Die Zellen wurden für 24 Stunden bei 28 °C inkubiert und anschliessend ATP (Adenosintriphosphat) bis zu einer Finalkonzentration von 5 μM zugegeben. Die Messung wurde direkt nach der Zugabe im Luminometer gestartet. Die Integrationszeit betrug 1 Sekunde, bei einer Gesamtmessdauer von 90 Sekunden.

Die Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der Biolumineszenzmessung von mtClytinDecay in CHO Zellen.

Beispiel 5

Die Figur 5 zeigt das Alignment von mtClytinDecay- 141 F, mtClytinDecay- 182F mit mtClytin (wildtype; wt) auf Aminosäureebene. Beispiel 6

Kinetische Analyse von mtClytinDecay in expremiert in CHO Zellen

Zur kinetischen Analyse der Biolumineszenz von mtClytinDecay- 14 IF, wurden CHO (Chinese Hamster Ovarian Cells) Zellen mit pcDNA3-mtClytinDecay-141F bzw. pcDNA3 (ohne integrierte cDNA) transfiziert. Die Transfektion und Messung erfolgte wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Messdaten wurden für einen Zeitraum von 60 Sekunden mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde erhoben.

Die Figur 7 zeigt die Ergebnisse der kinetischen Analyse von mtClytinDecay in CHO Zellen.

Beispiel 7

Verwendung von mtClytinDecay in multiplexing Experimenten

Die Photoproteine mtClytinDecay-141F und mtClytin-182F eignen sich als Komponenten von multiplexing Readout- Verfahren, in denen mehrere Reportergene (z.B. Luziferasen oder Photoproteine) in einem experimentellen Ansatz verwendet werden. Hierzu wurden mtClytinDecay-141F oder mtClytinDecay- 182F expremierende CHO-Zellen im Verhältnis 1:1 (oder 1 :2, 1:3, ..) mit CHO Zellen gemischt, die das wildtyp Photoprotein mtClytin expremierten. Die Zelle, die das wildtyp mtCyltin expremierten, expremierten zusätzlich einen G-Protein gekoppelten Rezeptor (z.B. Neuromedin U Rezeptor 2). Die Zellmischung wurde auf 96, 384 oder 1536 Loch-Mikrotiterplatten ausgebracht und für 24 Stunden bei 37 ⁰C inkubiert.

Anschliessend wurden die Zellen mit Coelenterazine beladen (wie unter Beispiel 4 beschrieben). Durch die Zugabe des G-Protein Rezeptor Agonisten kommt es zur intrazellulären Kalziumfreisetzung, die durch das wildtyp mtClytin ausgelesen werden kann (Lichtfreisetunzung durch wildtyp Aequorin). Durch die anschliessende Zugabe eines Agonisten, der einen CHO endogenen Rezeptor aktiviert (z. B. ATP), kann das mtClytinDecay-141F oder mtClytin-182F des zweiten Zelltyps aktiviert werden. Literatur / Patente

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Claims

Patentansprüche

1. Nukleinsäuremolekül oder ein funktionelles Fragment desselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nukleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz offenbart durch SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO :4 beinhaltet;

b) Nukleinsäuremolekülen, welche die in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz beinhalten;

c) Nukleinsäuremolekülen, die Fragmente von Nukleinsäuremolekülen gemäß a) oder b) enthalten, wobei die Nukleinsäuremoleküle funktionelle

Photoproteine kodieren und die Fragmente Polypeptide kodieren, die die Aminosäure 141 bezogen auf die SEQ ID NO:2 oder die Aminosäure 182 bezogen auf die SEQ ID NO:4 enthalten.

2. Polypeptid oder ein funktionelles Fragment desselben, das durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 kodiert ist und die Eigenschaft eines

Photoproteins besitzt.

3. Polypeptid, die Sequenzen dargestellt in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 enthaltend.

4. Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine oder mehrere Mutationen in Position 131 bis 152 bezogen auf SEQ ID NO: 2 besitzt und welches eine veränderte zeitliche Biolumineszenz aufweist.

5. Photoprotein oder ein funktionelles Fragment desselben, welches eine Mutation in Position 172 bis 192 bezogen auf SEQ ID NO: 4 besitzt und welches eine veränderte zeitliche Biolumineszenz aufweist.

6. Nukleinsäuremolekül, welches eine Sequenz beinhaltet, die für ein Protein gemäß Ansprüchen 4 oder 5 kodiert.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 6, welche einen funktionalen Promotor 5^* zur kodierenden Sequenz enthält.

8. Rekombinanter DNA oder RNA Vektor, welcher Nukleinsäuren nach Anspruch 7 enthält.

9. Prokaryontische oder eukaryontische Zelle oder ein nicht humaner Organismus, einen Vektor gemäß Anspruch 8 enthaltend.

10. Verfahren zur Expression der Polypeptide gemäss Anspruch 2, 3, 4 oder 5 in Bakterien, eukaryontischen Zellen oder in in vitro Expressionssystemen.

1 1. Verfahren zur Aufreinigung/Isolierung eines gemäß Anspruch 10 expremierten Photoprotein Polypeptides.

12. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß den Ansprüchen 1 oder 6 als Marker- oder Reportergen.

13. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß den Ansprüchen 1 oder 6 als Markeroder Reportergen in Kombination mit anderen Reportergenen.

14. Verfahren zur Herstellung eines Photoproteins, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Photoprotein in der Region definiert durch Position 131 bis 152 bezogen auf SEQ ID NO: 2 eine oder mehrere Mutationen eingeführt werden, was zu einer Veränderung der zeitlichen Biolumineszenz führt.

15. Photoprotein, hergestellt durch ein Verfahren gemäß Anspruch 14.

16. Verwendung eines Photoproteins gemäß Anspruch 2, 3, 4, 5 oder 15 als Marker oder Reporter.

17. Verwendung eines Photoproteins gemäß Anspruch 2, 3, 4, 5 oder 15 als Marker oder Reporter in Kombination mit anderen Reportergenen.

18. Eine Variante des Photoproteins mtClytin, welche eine veränderte zeitliche Bioluminszenz aufweist.