DE10106320A1

DE10106320A1 - Erzeugung und Verwendung von Zufallsanordnungen klonaler Nukleinsäureinseln auf einer Oberfläche

Info

Publication number: DE10106320A1
Application number: DE10106320A
Authority: DE
Inventors: Achim Fischer
Original assignee: Axaron Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2002-08-22
Also published as: WO2002072879A3; WO2002072879A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer Zufallsanordnung klonaler Inseln auf einer Oberfläche, umfassend die Schritte DOLLAR A È Bereitstellung einer Oberfläche, aufweisend Primer, die irreversibel an die Oberfläche immobilisiert sind; DOLLAR A È Hybridisierung von zu amplifizierenden Nukleinsäuren mit Primern aus Schritt a); DOLLAR A È Amplifikation der zu amplifizierenden Nukleinsäuren aus Schritt b), wobei der Reaktionsraum der Amplifikation durch einen Raum gebildet wird, der durch die Oberfläche und durch eine an die Oberfläche angrenzende mikrokompartimentierende Matrix begrenzt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer Zufallsanordnung klonaler Inseln auf einer Oberfläche sowie die Anwendung des Verfahrens zur Genanalyse.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung von DNA-Arrays bekannt. Bei spielsweise beschreiben Maier et al. die Herstellung von Membranfiltern mit einer hohen Dichte an cDNA-Klonen (J. Biotechnol. 35 (1994), 191-203). Schena et al. (Science 270 (1995), 467-70) beschreiben die Herstellung von cDNA-Mikroarrays, bei denen bekannte cDNAs auf einem mikroskopischen Objektträger abgelegt und zur Hybridisierung mit aus zu untersuchenden biologischen Proben stammenden, fluoreszenzmarkierten Sonden ein gesetzt werden. Ein alternatives Verfahren zur Mikroarray-Herstellung, welches auf dem Aufbau von Oligonukleotiden an Oberflächen über Photolithographie basiert, wird von McGall et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1996) 13555-60) beschrieben.

Einer der großen Nachteile bei der Herstellung von DNA-Arrays nach dem Stand der Technik ist jedoch die Tatsache, daß die auf die Trägeroberfläche aufzubringenden DNA- Sequenzen zuvor bekannt sein müssen. Dies gilt sowohl für photolithographisch herge stellte Oligonukleotid-Arrays wie auch für "gedottete" Arrays (separate Ablage jeder ein zelnen DNA-Spezies), für die eine normalisierte und charakterisierte Bibliothek von DNA- Klonen vorhanden sein muß. Die Charakterisierung (insbesondere Sequenzüberprüfung der abzulegenden Klone) solcher Banken bedeutet einen enormen Aufwand, der zu hohen Kosten führt und eine deutliche Inflexibilität des Verfahrens nach sich zieht. Insbesondere schließt sich die Anwendung konventioneller Array-Technik nach dem Stand der Technik für molekular nicht sehr gut charakterisierte Organismen aus. Dies folgt aus der sehr hohen Zahl an Genen vielzelliger eukaryontischer Organismen (schätzungsweise 100.000 ver schiedene Gene in Säugern), der extremen Größe vieler eukaryontischer Genome (ca. 10⁹ Basenpaare im Humangenom; ca. 10¹⁰ Basenpaare im Genom mancher agronomisch bedeutender Nutzpflanzen) sowie der sehr unterschiedlichen Expressionsstärke und Expressi onslokalisation der einzelnen Gene. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren führt da zu, daß eine auch nur annähernd vollständige Information über die Sequenz der Transkripte eines Organismus (und damit Zugang zu jedem einzelnen Transkript) mit den heute zur Verfügung stehenden Mitteln kaum erhältlich ist. Lediglich im Falle einiger weniger, be sonders intensiv untersuchter Organismen (insbesondere Mensch, Maus, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, und Arabidopsis thaliana) ist in absehbarer Zeit mit einer weitgehenden Kenntnis der verschiedenen mRNA-Moleküle zu rechnen. Dabei ist aber auch der nächste Schritt, geeignete Nukleinsäuremoleküle zu erzeugen und geordnet in hybridisierungsfähiger Form auf einer Oberfläche abzulegen, mit extrem hohem Auf wand verbunden, wenn nicht lediglich eine kleine Auswahl (beispielsweise einige hundert bis einige tausend) verschiedener Nukleinsäurespezies in Form eines Arrays angeordnet werden soll.

Auch der auf die Herstellung und Charakterisierung einer Bibliothek folgende Schritt der Array-Herstellung selber, also der Übertragung von Aliquots eines jeden Nukleinsäure- Klons der Bibliothek auf einen geeigneten festen Träger, bedarf eines hohen apparativen und zeitlichen Aufwands. Es müssen einige hundert bis einige tausend Pipettierschritte durchgeführt werden, bis Material auf alle Positionen des Arrays übertragen worden ist. Zusätzlich sind Wasch- und Trockenschritte des Pipettierkopfes erforderlich, so daß die Herstellung eines Arrays nach herkömmlicher Technik etwa 12-24 Stunden in Anspruch nimmt. Dabei schlägt in einem gewissen Prozentsatz aller Pipettiervorgänge, beispielswei se wegen unerkannt verstopfter Düsen, die Übertragung von Nukleinsäure fehl, so daß nicht mit Sicherheit davon ausgegangen werden kann, daß sich an allen Positionen des Ar rays zu analysierende Nukleinsäure befindet.

Weiterhin hat sich gezeigt, daß die nach einem feststehenden Pipettierprotokoll auf eine Oberfläche aufgebrachte und insbesondere dort anschließend für Hybridisierungszwecke zur Verfügung stehende Menge an Nukleinsäure stark von den Parametern Temperatur und Luftfeuchtigkeit abhängen, so daß keine gute Reproduzierbarkeit des Verfahrens gewähr leistet ist.

Ein alternatives, auf photolithographischer Festphasensynthese von Oligonukleotiden ba sierendes Verfahren (Lockhart et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996), 1675-80) vermeidet eini ge der obigen Nachteile, insbesondere hinsichtlich Zeitaufwand und mangelnde Reprodu zierbarkeit. Dennoch ist auch hier eine vorherige Sequenzkenntnis der zu immobilisierenden Nukleinsäuren erforderlich. Weiterhin bestehen starke Einschränkungen in Hinblick auf die maximal synthetisierbare Länge der Oligonukleotide; bei Längen über 20 Nukleoti den nimmt der Anteil an Fehlsynthese- und Abbruchprodukten stark zu.

Diese bekannten Verfahren zur Erzeugung von DNA-Arrays weisen also folgende Nachteile auf:

- sehr hoher Aufwand
- hoher Zeitbedarf
- Kenntnis der jeweiligen mRNA-Moleküle wird vorausgesetzt
- Arrays erfassen meist nur kleine Ausschnitte der Gesamtheit der mRNA.

Den genannten Verfahren ist gemeinsam, daß die auf dem Array abzulegenden Proben se parat gehandhabt und prozessiert werden müssen bzw. die an der Oberfläche zu syntheti sierenden Proben einzeln zu ermitteln sind, was sich ungünstig auf den erreichbaren Pro bendurchsatz auswirkt. Daher wäre ein Verfahren wünschenswert, welches eine hochgra dige Parallelisierung der Probenvorbereitung und -Aufbringung ermöglicht, so daß besagte Schritte simultan bei einer Vielzahl von Nukleinsäuren durchgeführt werden können.

In WO 98/44151 wird eine solche Parallelisierung offenbart. Hierzu soll eine Oberfläche mit PCR-Primern beschichtet werden, gefolgt von einer Amplifikation zu sequenzierender Nukleinsäuremoleküle an der Oberfläche. Auf diese Weise werden aus einzelnen, ur sprünglich als Matritze eingesetzten Nukleinsäuremolekülen "DNA-Kolonien" jeweils identischer Moleküle erzeugt, welche nachfolgend sequenziert werden können. Der bereits aus US-A 5 641 658 bekannte Einsatz zweier immobilisierter PCR-Primer zur Amplifika tion hat jedoch gravierende Nachteile: erstens ist die Topologie der an der Oberfläche be ginnenden und zu dieser zurückgekrümmten Nukleinsäurestränge ungünstig für den Prozeß der Primerextension, was sich in einer sehr niedrigen Amplifikationseffizienz auswirkt (Adessi et al., Nucleic Acids Res. 28 (2000), e87). Um diese zu kompensieren, ist eine ungewöhnlich hohe Anzahl von Amplifikationszyklen erforderlich (typischerweise 50), welche wiederum aufgrund der hohen thermischen Belastung der Nukleinsäuren zu Strang brüchen führt. Zweitens sind die Amplifikationsprodukte solange einer weiteren Analyse durch Hybridisierung oder Sequenzierung nicht zugänglich, wie sie mit beiden Enden an der Oberfläche befestigt vorliegen. Es ist daher zunächst eine "halbseitige" Ablösung der Nukleinsäuremoleküle notwendig, also die Abtrennung selektiv eines der beiden Enden von der Oberfläche, bevor mit einer Analyse begonnen werden kann. Diese Ablösung wie derum, welche durch Inkubation mit einem geeigneten Restriktionsenzym erfolgen kann (vgl. WO 98/44151), ist nicht unproblematisch, da Restriktionsenzyme festphasen gebundene Nukleinsäuren oftmals nicht vollständig schneiden können. Ein weiterer Nach teil dieses Verfahrens ist die Tatsache, daß einzelne Nukleinsäureinseln, die etwa aufgrund ihres Hybridisierungsverhaltens von Interesse sind, nicht wiedergewonnen und identifiziert werden können. Weiterhin wird keine Möglichkeit zur Sequenzierung von mehr als nur sehr kurzen Bereichen (etwa 15 bis 20 Basen) der die Inseln bildenden Nukleinsäuren vor gestellt.

Mitra und Church, Nucleic Acids Res. 27 (1999) e34 offenbaren ein Verfahren, bei dem mittels PCR "DNA-Kolonien" im Innern eines Polyacrylamidgels erzeugt werden, wobei einer der beiden eingesetzten Primer in gelöster Form vorliegt, während der Gegenprimer kovalent mit dem Polyacylamid-Netzwerk verbunden ist. Nachteil dieser Methode ist je doch, daß sich die DNA-Kolonien nach Abschluß der Amplifikation im Innern eines Gels befinden und somit weiteren Experimenten nur schwer zugänglich sind. Im Falle der Se quenzierung etwa müßten die hierfür benötigten Reagenzien und insbesondere die Polyme rase die Möglichkeit haben, an den Ort der DNA-Kolonien zu diffundieren. Auch die Zu gänglichkeit der DNA-Kolonien gegenüber Hybridisierungsexperimenten wäre gegenüber einer Hybridisierung von an eine Oberfläche immobilisierten Nukleinsäuren stark beein trächtigt. Dabei würde während der langen für die nötigen Diffusionsprozesse erforderli chen Inkubationszeiten bereits eine Renaturierung der anfänglich denaturierten Hybridisie rungssonde in Konkurrenz mit den erwünschten Hybridisierungsereignissen treten. Das angegebene Verfahren läßt die Sequenzierung der DNA-Kolonien nur mit Methoden zu, die in Kombination mit dem Verfahren so gravierende Nachteile aufweisen, daß sie kaum brauchbar erscheinen. Bei der FISSEQ-Methode (vgl. Ansorge, DE 41 41 178) findet ein früher Verlust an Synchronizität statt, der die Zahl der die Zahl der parallel zu ermittelnden Basen stark begrenzt. Die Methode des pyrosequencing läßt wegen der Diffusibilität des nachgewiesenen Reaktionsprodukts, Pyrophosphat-Ionen, keine zuverlässige ortsaufge löste Detektion des Sequenzierungssignals zu, so daß die Methode sehr störungsanfällig ist.

Danach weisen auch diese Verfahren jeweils mehrere der folgenden Nachteile aus:

- geringe Amplifikationseffizienz,
- schlechte Zugänglichkeit der amplifizierten in ein Gel eingeschlsossenen Nuklein säuren,
- die Wiedergewinnung der amplifizierten Nukleinsäuren ist erschwert,
- es sind keine längere Bereiche sequenzierbar.

Daher bestand die Aufgabe der Erfindung in der Überwindung dieser Nachteile.

Insbesondere ist Aufgabe der Erfindung, bei gegenüber dem Verfahren nach WO 98/44151 gesteigerter Amplifikationseffizienz den Vorteil der leichten Zugänglichkeit der DNA- Kolonien zu erhalten.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Erzeugung einer Zu fallsanordnung klonaler Inseln auf einer Oberfläche, umfassend die Schritte

a) Bereitstellung einer Oberfläche aufweisend Primer, die irreversibel an die Oberflä che immobilisiert sind;
b) Hybridisierung von zu amplifizierenden Nukleinäuren mit Primern aus Schritt a);
c) Amplifikation der zu amplifizierenden Nukleinsäuren aus Schritt b), wobei der Re aktionsraum der Amplifikation durch einen Raum gebildet wird, der durch die O berfläche und durch eine an die Oberfläche angrenzende mikrokompartimentieren de Matrix begrenzt wird.

Der Begriff der Oberfläche bezeichnet eine Fläche eines Körpers aus Glas, Kunststoff, Silicium, Metall oder ähnlich geeigneten Werkstoffen. Vorzugsweise ist diese flach, insbe sondere plan ausgestaltet. Die Oberfläche kann eine quellbare Schicht aufweisen, zum Bei spiel aus Polysacchariden, Polyzuckeralkoholen oder quellbaren Silikaten. Diese Oberflä che ist in der Regel im wesentlichen glatt. Dies bedeutet, daß die Rauheit der Oberfläche in Hinblick auf die Dimensionen des Reaktionsraums in der Regel vernachlässigbar ist.

Der Begriff Zufallsanordnung klonaler Inseln auf einer Oberfläche bezeichnet eine Zufallsanordnung von mindestens zwei Nukleinsäuren verschiedener Sequenz auf einer Oberfläche, wobei die Sequenz der Nukleinsäuren in bestimmten Bereichen der Oberflä che, den sogenannten Inseln, von möglichen Sequenzfehlern abgesehen identisch ist. Dies bedeutet, daß verschiedene Inseln Nukleinsäuren verschiedener Sequenz aufweisen kön nen. Hierbei ist zu beachten, daß in den Inseln Strang und Gegenstrang der betreffenden Nukleinsäuren nebeneinander und gegebenenfalls miteinander hybridisiert vorliegen kön nen, also sich der Sequenzvergleich entweder auf den Vergleich der Stränge oder der Ge genstränge der Nukleinsäuremoleküle bezieht. Die Nukleinsäuren sind auf der Oberfläche irreversibel immobilisiert. Bevorzugt ist nur ein Strang einer doppelsträngigen Nukleinsäu re irreversibel immobilisiert, während der andere durch Hybridisierung, das heißt nicht kovalent, an den immobilisierten Strang gebunden ist. Es ist auch möglich, daß die Zu fallsanordnung klonaler Inseln auf einer Oberfläche nach Entfernung des jeweils nicht irreversibel immobilisierten Strangs der betreffenden doppelsträngigen Nukleinsäure von der Oberfläche im wesentlichen nur einzelsträngige Nukleinsären aufweist.

Der Begriff Primer bezeichnet Nukleinsäuren oder deren Derivate mit einem mehrere, in der Regel mehr als 10 Nukleotidbausteine umfassenden einzelsträngigen Bereich am 3'- Terminus, die in der Lage sind, mit ihrem 3'-Terminus mit anderen Nukleinsäuremolekü len geeigneter Sequenz zu hybridisieren und über den Hybridbereich spezifische Basenpaa rungen mit dem Bindungspartner auszubilden. Primer sind in der Regel einzelsträngig, wenngleich doppelsträngige Bereiche unschädlich sind, solange ein einzelsträngiger Be reich am 3'-Terminus verbleibt. Primer sind in der Regel Desoxynukleinsäuren, jedoch können 2'-Methoxy-Derivate ebenfalls eingesetzt werden, wenn eine erhöhte Schmelztem peratur des Hybrids gewünscht wird.

Die Primer aus Schritt a) sind an die Oberfläche irreversibel immobilisiert. Dies meint das Ausbilden von Wechselwirkungen mit der oben beschriebenen Oberfläche, die bei der üblichen Ionenstärke und den Temperaturen der Amplifikation stabil sind, d. h. etwa im Fall einer Amplifikation mittels PCR im verwendeten Puffer bei 95°C eine Halbwertszeit grö ßer 1 Minute, bevorzugt größer 10 Minuten aufweisen. Bevorzugterweise handelt es sich dabei um kovalente Bindungen, die auch spaltbar sein können, insbesondere durch Einwir kung elektromagnetischer Strahlung sowie durch geeignete Reagenzien. Bevorzugt werden die Primer über die 5'-Termini an der Oberfläche immobilisiert. Alternativ kann eine Im mobilisierung auch über ein oder mehrere Nukleotidbausteine, die zwischen den Termini des betreffenden Primermoleküls liegen, erfolgen, wobei allerdings ein Sequenzabschnitt von in der Regel 10 Nukleotidbausteinen, bevorzugt mindestens 15 Nukleotidbausteinen gerechnet vom 3'-Terminus ungebunden bleiben muß. Aus dem Stand der Technik sind Verfahren bekannt, chemisch geeignet derivatisierte Oligonukleotide an Glasoberflächen zu binden. Besonders geeignet sind hierzu beispielsweise endständige, über einen mehra tomigen Spacer an das 5'-Ende des Oligonukleotids gebundene primäre Aminogruppen ("Aminolink"), welche leicht im Zuge der Oligonukleotidsynthese inkorporiert werden können und gut mit Isothiocyanat-modifizierten Oberflächen reagieren können. Beispiels weise beschreiben Guo et al. (Nucleic Acids Res. 22 (1994), 5456-65) ein Verfahren, Glasoberflächen mit Aminosilan und Phenylendiisothiocyanat zu aktivieren und anschlie ßend 5'-aminomodifizierte Oligonkleotide hieran zu binden. Besonders bevorzugt ist die Carbodiimid-vermittelte Bindung 5'-phosphorylierter Oligonukleotide an aktivierte Po lystyrolträger (Rasmussen et al., Anal. Biochem. 198 (1991), 138-142). Ebenfalls möglich ist die Verwendung kommerziell erhältlicher Glasträger, welche einerseits zur Bindung von Aminolink-modifizierten Oligonukleotiden aktiviert sind und andererseits eine strukturierte Oberfläche aufweisen, welche gegenüber einer planen Oberfläche eine größere Bindungs kapazität besitzt (Fa. Surmodics, Eden Prairie, Minnesota, USA). Ein anderes bekanntes Verfahren nutzt die hohe Affinität von Gold für Thiolgruppen zur Bindung von Thiol modifizierten Oligonukleotiden an Goldoberfächen aus (Hegner et al., FEBS Lett. 336 (1993), 452-456).

Hybridisierung von zu amplifizierenden Nukleinäuren mit Primern aus Schritt a) bedeutet die Ausbildung einer Hybridstruktur zwischen den Primern und einzelsträngigen Bereichen von zu amplifizierenden Nukleinsäuren. Hierbei handelt es sich um ein Gemisch aus min destens zwei Nukleinsäuren unterschiedlicher Sequenz, die amplifiziert werden sollen und deren Sequenz sich als Folge der Amplifikation in den klonalen Inseln wiederfindet. Die zu amplifizierenden Nukleinsäurefragmente können im Reaktionsraum frei (d. h. nicht im mobilisiert) hydratisiert vorliegen. Es ist aber ebenso möglich, die zu amplifizierenden Nukleinsäuren bereits vor dem Zusammenfügen von Oberfläche und Matrix auf die Ober fläche aufzubringen, gegebenenfalls dort zu immobilisieren oder mit den immobilisierten Primern zu hybridisieren sowie gegebenenfalls durch eine erste Strangverlängerung an den auf diese Weise gebildeten Hybriden die Primer komplementär zu den zu amplifizierenden Nukleinsäuren zu verlängern. Dabei wird in der Regel die Konzentration der zu amplifizie renden Nukleinsäurefragmente im Reaktionsraum beziehungsweise ihre Dichte auf der Oberfläche so eingestellt, daß der mittlere Abstand der in (c) durch Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle entstehenden klonalen Inseln mindestens einen Mikrometer, min destens zehn Mikrometer, mindestens hundert Mikrometer oder mindestens tausend Mik rometer beträgt.

Bei den zu amplifizierenden Nukleinäuren handelt es sich vorzugsweise um DNA, wel che als genomische DNA gewonnen wurde, welche aus Klonen (etwa Plasmiden, viralen Vektoren, künstlichen bakteriellen oder Hefe-Chromosomen oder dergleichen) stammt, welche mittels Amplifikation erzeugt wurde oder welche als cDNA durch "Umschreiben" von RNA, insbesondere Boten-RNA, erhalten wurde. Eine nachträgliche Fragmentierung kann sowohl durch sequenzunspezifische Verfahren, beispielsweise Scherung, als auch durch sequenzspezifische Verfahren, insbesondere die Behandlung mit Restriktionsendo nukleasen, erfolgen. Natürlich kann es sich bei den zu amplifizierenden Nukleinsäuren auch um Nukleinsäureabschnitte handeln, die ohne vorhergegangene künstliche Fragmen tierung bereits eine für eine Amplifikation geeignete Größe aufweisen, also beispielsweise Nukleinsäureabschnitte bis zu einer Länge von 2000 Basenpaaren. Diese Voraussetzung erfüllen beispielsweise zahlreiche Boten-RNA-Moleküle sowie die aus ihrer Umschreibung resultierenden cDNA-Moleküle. Jedenfalls liegen die Nukleinsäuren bevorzugterweise in Form einer Bibliothek vor. Es ist zweckmäßig die zu amplifizierenden Nukleinsäuren so zu behandeln, daß diese Enden mit bekannten Sequenzen aufweisen, welche vorzugsweise in Form von sog. Linkem oder Adaptoren in die Nukleinsäuren eingeführt wurden oder wel che den ein "insert" flankierenden Vektorregionen der sogenannten multiple cloning site entsprechen können. Beide Enden eines Fragments können identisch oder voneinander ver schieden sein und können gegebenenfalls als Bindungsstelle für Primer dienen. Ein Ende oder beide können Erkennungsstellen für eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen aufweisen. Die Präparation von cDNA-Fragmenten kann beispielsweise wie in der US-A 5 876 932 beschrieben vorgenommen werden, so daß die zu amplifizierenden Nukleinsäuren auf einer Seite von einer allen Fragmenten gemeinsamen Linkersequenz und auf der ande ren Seite von einer durch den verwendeten cDNA-Primer bestimmten Sequenz flankiert werden.

Die Amplifikation erfolgt mit Hilfe bekannter Verfahren. Der Einsatz der Polymeraseket tenreaktion, PCR, ist bevorzugt. Bei der PCR werden an der Oberfläche immobilisierte Primer inkorporiert und auf diese Weise immobilisierte Kopien der zu amplifizierenden Nukleinsäuren in Form klonaler oberflächengebundener Inseln gebildet. Bevorzugterweise werden Amplifikationsgrad (bei einer PCR-Amplifikation über die Zyklenzahl beeinfluß bar) und Menge der zu amplifizierenden Nukleinsäuren so gewählt, daß der mittlere Insel durchmesser und der mittlere Abstand zweier Inseln in derselben Größenordnung liegen. Dadurch wird sichergestellt, daß sich zwei Inseln in der Regel nicht berühren oder durch dringen, also getrennt voneinander analysiert werden können, daß andererseits aber eine möglichst hohe Inseldichte auf der Oberfläche erreicht wird, so daß eine möglichst große Anzahl von Inseln gleichzeitig analysiert werden kann.

Alternativ zur Amplifikation mittels PCR sind zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auch andere Amplifikationsreaktionen wie RNA-Polymerase-vermittelte lineare Amplifikation (Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 1663-7), strand displacement-Amplifikation (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1992), 392-6), rolling circle-Amplifikation (Walter und Strunk, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 91 (1994), 7937-41), nucleic acid based sequence amplification (NASBA; Compton, Nature 350 (1991), 91-2) etc. einsetzbar, vorausgesetzt, daß die entstehenden Amplifikati onsprodukte entweder durch Inkorporation immobilisierter Primer an der Oberfläche fixiert werden oder durch auf die Amplifikation sowie eine Hybridisierung an immobilisierte Primer folgende "Umschreibung", also eine komplementäre Strangverlängerung, in immobili sierte Kopien überführt werden können. Ferner könnte eine Immobilisierung durch Inkor poration verschiedener Nukleotidbausteine in einem geringen Verhältnis (1 bis 2 Nukleo tidbausteine pro Nukleinsäuremolekül) bewirkt werden.

Der Reaktionsraum der Amplifikation wird durch einen Raum gebildet, der durch die Oberfläche und durch eine an die Oberfläche angrenzende mikrokompartimentierende Mat rix begrenzt wird (1. Kriterium). Der Reaktionsraum ist der Raum, in welchem die Ampli fikation der zu amplifizierenden Nukleinsäuren stattfindet. In einer Raumrichtung ist der Reaktionsraum durch die Oberfläche begrenzt. In der Richtungen parallel zur Oberfläche ist der Reaktionsraum zumindest bei einer ideal planaren Oberfläche prinzipiell unbegrenzt (das heißt nur durch die frei wählbare Größe der Oberfläche begrentzt). Zur der Oberfläche abgewandten Seite ist der Reaktionsraum durch eine an die Oberfläche angrenzende mikrokompartimentierende Matrix begrenzt.

Hierbei ist zu berücksichtigen, daß infolge der irreversiblen Immobilisierung der Primer auf der Oberfläche in Schritt a) und der Hybridisierung der zu amplifizierenden Nuklein säuren an die Primer in Schritt b) die Amplifikationsreaktion im Reaktionsraum nur in ei nem maximalen Abstand von der Oberfläche stattfinden kann, der der Summe aus der Ma ximallänge der zu amplifizerenden Nukleinsäure und der Länge gegebenenfalls zur Immo bilisierung der Primer benutzen Molekülgruppen entspricht (2. Kriterium, das die Defini tion des Reaktionsraums durch das notwendige Kriterium weiter konkretisiert).

Der Reaktionsraum enthält die zur Amplifikation notwendigen Reaktanden, einen oder mehrere Katalysatoren und Hilfsstoffe (Nukleotide, Ionen, Enzyme, gegebenenfalls ein weiterer Primer oder mehrere Primer) in hydratisierter Form. Erfolgt die Amplifikation über PCR, so enthält der Reaktionsraum mindestens einen weiteren Primer, eine thermo stabile Polymerase wie beispielsweise Taq-Polymerase, alle vier Nukleotidbausteine dATP, dCTP, dGTP und dTTP sowie Ionen.

Bei der mikrokompartimentierenden Matrix handelt es sich um einen Festkörper, insbe sondere um einen porösen und/oder gelartigen. Dieser Festköper ist von einer wässrigen Phase derart durchdrungen, daß die Konvektion in der wässrigen Phase weitgehend auf Mikrokompartimente beschränkt und, auf den Gesamtkörper bezogen, stark unterdrückt wird. Ein wesentlicher Beitrag zum Stofftransport innerhalb der wässrigen Phase leistet die Diffusion. In diesem Zusammenhang wird auch auf die US-A 5 958 698 Bezug genommen (speziell auf US-A 5 958 698, Spalte 6 bis 7). Bevorzugt weist die Matrix an der Phasen grenze zur wässrigen Phase hydrophile Gruppen auf, die durch die Ausbildung von Hyd rathüllen eine Feinordnung des Wassers an der Phasengrenze bewirken. Die Matrix kann verschiedenartig geformte innere Oberflächen aufweisen. Sie ist bevorzugt porös. Die Mikrokompartimente können durch gewebeartige Netzwerke aus Fäden, Lamellen, Kapil laren oder näherungsweise runden Körpern gebildet werden oder aus Gemischen davon. Die Matrix kann also aus einem dreidimensionalen Netzwerk aus Polymeren oder Aggre gaten derselben oder auch aus Monolithen oder gesinterten Partikeln oder kompakten Pa ckungen von beliebig geformten Partikeln oder aus Schwämmen bestehen. Im Prinzip kann die Massenverteilung auch rein stochastisch sein. Offenporige Matrizes, bei denen Mikro kompartimente miteinander verbunden sind, eignen sich für das erfindungsgemäße Verfah ren besonders gut. Stoffaustausch zwischen den Mikrokompartimenten soll nämlich zu mindest für kleine Moleküle wie Nukleotide und Ionen idealerweise ungehindert, für grö ßere Moleküle, insbesondere Nukleinsäuren hingegen idealerweise gering bis vernachläs sigbar sein. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das Mikrokompartiment einen durchschnittlichen apparenten Durchmesser ("Poren durchmesser") von 10 nm bis 1 Mikrometer, von höchstens zehn Mikrometern oder von höchstens hundert Mikrometern auf. Jedenfalls muß der Porendurchmesser die enzymati sche Amplifikation der zu amplifizierende Nukleinäuren in einem Mikrokompartiment zulassen, was seine Größe nach unten begrenzt. Besonders geeignet sind Gele wie insbe sondere die aus der elektrophoretischen Auftrennung von Nukleinsäuren bekannten Polyac rylamid-Gele. Auch Agarosegele wären denkbar, vorausgesetzt sie sind unter den Amplifi kationsbedingungen stabil. Eine Stabilisierung von Agarosegelen kann beispielsweise durch Kreuzvernetzung mittels Divinylsulfon erfolgen (Porath et al., J. Chromatogr. 103 (1975), 49-62), so daß eine Kompatibilität mit den bei einer PCR-Amplifikation herr schenden Temperaturbedingungen gegeben wäre.

Oberfläche und Matrix sind so schlüssig auszubilden, daß der Stoffaustausch von Nuklein säuremolekülen entlang ihrer Grenzfläche, also zwischen Oberfläche und Matrix in x-y- Richtung, nicht wesentlich größer ist als senkrecht zur Oberfläche in z-Richtung (3. Krite rium). Dies bedeutet, daß mit dem Merkmal, daß der Reaktionsraum der Amplifikation durch einen Raum gebildet wird, der durch die Oberfläche und durch eine an die Oberflä che angrenzende mikrokompartimentierende Matrix begrenzt wird (notwendiges Kriteri um), nicht die Bildung eines "Reaktorspaltes" gemeint ist, obwohl ein hinreichend schma ler Spalt, der den vorgenannten schlüssigen Abschluß der Oberfläche zuläßt, nicht schäd lich ist und durch die erfindungsgemäße Definition des Reaktionsraumes umfaßt ist. Eine Möglichkeit, einen dichten Abschluß beider Materialien zu schaffen, besteht in der kova lenten Vernetzung von Oberfläche und Matrix. Dies kann beispielsweise geschehen, indem eine Oberfläche aus Glas mit "Bindesilan" (γ-Methacryloxy-propyl-trimethoxysilan) be handelt wird, welches einerseits fest an der Glasoberfläche haftet, andererseits aber mittels der in den Lösungsraum ragenden Acrylfunktion in polymerisierendes Acrylamid einpoly merisieren kann. Dementsprechend kann ein hinreichend dichter Abschluß beispielsweise zwischen einer Glasoberfläche und einer Matrix aus Polyacrylamid geschaffen werden, indem die Polymerisation der Monomere zum polymeren Gel direkt auf der mit Bindesilan beschichteten Oberfläche vorgenommen wird. Dabei kann die kovalente Verbindung zwi schen Oberfläche und poröser Matrix so ausgestaltet werden, daß sie nach der Amplifikati on gezielt (z. B. chemisch oder thermisch) wieder gelöst werden kann. Es ist aber ebenfalls möglich, durch geeignete physikalische Vorbereitung der Oberfläche (insbesondere eine geeignete Rauhheit und/oder ein geeignetes Maß an Hydrophilie bzw. Polarisierbarkeit) einen ausreichend dichten Abschluß mit der porösen Matrix zu schaffen.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, in welcher die PCR zur Amplifikation eingesetzt wird, liegen Gegenprimer im Reaktionsraum vor, die mit den immoblisierten Primern aus Schritt a) in bezug auf die zu amplifizierenden Nukleinsäuren ein oder mehrere PCR-Primerpaare, bestehend aus Primer(n) und Gegenprimer(n), bilden.

Mit dem Begriff PCR-Primerpaar, bestehend aus Primer und Gegenprimer, ist eine Kom bination aus mindestens zwei Primern gemeint, die an Strang und Gegenstrang der konkret zu amplifizierenden Nukleinsäure oder den zu amplifizierenden Nukleinsäuren unter Hybridisierung binden können und dabei eine gegenläufige Orientierung aufweisen, so daß die Amplifikation der durch die Primer flankierten Nukleinsäureabschnitte im Rahmen der PCR möglich ist (siehe zum Überblick Bioanalytik, Lottspeich, Zorbas (Hrsg.) Spektrum Verlag Heidelberg, 1998, Kapitel 24). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bilden die an der Oberfläche immobilisierten Primer aus Schritt a) in bezug auf die zu amplifizierenden Nukleinsäuren kein PCR-Primerpaar. Folglich läuft die PCR ausschließlich über einen immobilisierten und einen nicht immobi lisierten Primer. Unerwünschte Nebenreaktionen lassen sich auf diese Weise unterdrücken.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt d) die Matrix zum Zecke der Exposition der klonalen Inseln auf der Oberfläche im wesentlichen entfernt. In Schritt (d) wird nach erfolgter Amplifikation die der Kompartimentierung dienende Mat rix von der Oberfläche getrennt, so daß die an der Oberfläche gebildeten klonalen Inseln frei zugänglich sind. Die Entfernung der Matrix kann rein mechanisch durch Abheben, Abziehen etc. erfolgen; dabei kann zuvor eine Lockerung der Haftung etwa durch thermi sche oder chemische Einflüsse vorgenommen werden. Ebenfalls denkbar wäre eine Auflö sung der Matrix durch Schmelzen, enzymatische oder chemische Bindungsspaltung o. ä., vorausgesetzt unter den hierfür erforderlichen Bedingungen bleiben die klonalen Inseln im wesentlichen unverändert an die Oberfläche gebunden.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Immoblisierung der Primer aus Schritt a) auf der Oberfläche über Primer und Oberfläche kovalent verknüpfen de Molekülgruppen bewerkstelligt.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die vorgenannten Molekülgruppen unter Bedingungen gespalten, die Nukleinsäuren im wesentlichen nicht zerstören.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen die Molekül gruppen der allgemeinen Formel I,

wobei n und m unabhängig voneinander 1 bis 30 bedeuten, und wobei
R¹ Dimethoxytrityloxy (DMTO) oder eine Gruppe bedeutet, welche die Immo bilisierung an eine Oberfläche ermöglicht oder welche eine Kopplung an ei ne immobilisierbare Verbindung erlaubt, und
R² die Bedeutung -OP(OC₂H₄CN)N(CH(CH₃)₂)₂ oder -OP(OCH₃)N(CH(CH₃)₂)₂,

Die Analyse der klonalen Inseln besteht vorzugsweise in der Feststellung der Identität der eine bestimmte Insel bildenden Nukleinsäuremoleküle, oder auch der Identität vieler oder im wesentlichen aller auf einer Oberfläche gebildeten Inseln. Zur Identifikation von Nuk leinsäuren nach dem Stand der Technik kommen im wesentlichen zwei Verfahren zur An wendung, die Hybridisierung und die Sequenzierung. Hybridisierungsexperimente geben Aufschluß über die Sequenzähnlichkeit zwischen (markierter) Sonde und immobilisierter Nukleinsäure. Mittels Sequenzierung hingegen läßt sich die Identität eines Nukleinsäure moleküls auch de novo, also ohne Vorannahmen und ohne Verfügbarkeit sequenzähnlicher oder sequenzidentischer Sonden bestimmen. Einen Sonderfall stellt die Minisequenzierung (Genomics 34 (1996), 107-13) dar, welche pro Template die Ermittlung lediglich einer Base zuläßt und welche ebenfalls mit den durch Anwendung des erfindungsgemäßen Ver fahrens entstandenen Inseln durchgeführt werden kann.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt e) eine A nalyse der klonalen Inseln durch Hybridisierung mit markierten Nukleinsäuresonden. Zur Hybridisierung der in Schritt (c) gebildeten, in klonalen Inseln vorliegenden Nuklein säuremoleküle ist zunächst dafür zu sorgen, daß die Nukleinsäuremoleküle einzelsträngig vorliegen. Sind durch die Amplifikation doppelsträngige Moleküle entstanden, wie es in der Regel auf PCR-Amplifikationen zutrifft, so ist von diesen in der Regel lediglich ein Strang kovalent immobilisiert (nämlich durch vorherige Inkorporation eines immobilisier ten Oligonukleotidprimers), während der andere, mit diesem immobilisierten Strang hybri disierte Gegenstrang durch Denaturierung entfernt werden kann. Diese Denaturierung er folgt in der Regel durch Hitze oder alkalische Behandlung, gefolgt von oder gleichzeitig mit einem Waschschritt. Danach kann in geeigneter Lösung bei geeigneten Temperatur- und Zeitbedingungen (siehe hierfür etwa Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons) mit einer einfachen oder einer komplexen Sonde hybridisiert werden. Einfache Sonden enthalten i. d. R. lediglich eine einzige oder wenige verschiedene Nukleinsäurespezies, welche auf geeignete Weise (meist fluoreszent oder radioaktiv) markiert wurden. Handelt es sich um ein Gemisch einiger weniger verschiede ner Nukleinsäurespezies, so können diese mit der gleichen oder mit unterscheidbaren Mar kierungen versehen werden. Eine einfache Sonde kann dann eingesetzt werden, wenn man die An- oder Abwesenheit einer bestimmten oder einiger bestimmter Nukleinsäurespezies in den auf der Oberfläche gebildeten Inseln ermitteln möchte. Komplexe Sonden hingegen enthalten eine Vielzahl verschiedener Nukleinsäurespezies, beispielsweise aus einer Um schreibung von aus biologischem Material gewonnener mRNA erhaltenen geeignet markierten cDNA-Molekülen. Häufig werden solche cDNA-Sonden (oder auch durch erneutes Umschreiben und Markieren erhaltene Sonden aus sogenannter cRNA ["copy-RNA"] oder aRNA ["amplified RNA"]) zur Genexpressionsanalyse eingesetzt. In diesen Fällen werden abundante mRNA-Moleküle durch abundante Sondenmolekülspezies und weniger abun dante mRNA-Moleküle durch weniger abundante Sondenmolekülspezies repräsentiert. Die Abundanz einer Sondenmolekülspezies hingegen hat wiederum Einfluß auf die nach er folgter Hybridisierung am Ort der Hybridisierung lokalisierte Menge an Markierungsgrup pen: abundante mRNA-Moleküle führen zu stärkeren Hybridisierungssignalen als weniger abundante mRNA-Moleküle. Werden nun die mit zwei (oder mehr) verschiedenen Sonden erhaltenen, zuvor kalibrierten Hybridisierungsergebnisse miteinander verglichen, so kön nen diejenigen Hybridisierungsorte ermittelt werden, an denen mit einer Sonde stärkere bzw. schwächere Signale erhalten werden als mit der (oder den) anderen Sonde(n). Ein solcher Vergleich kann stattfinden, indem die Hybridisierung mit den dann auf gleiche Weise markierten Sonden unabhängig voneinander stattfindet (Lockhart et al.). Es ist aber ebenfalls möglich, verschiedene Sonden auf voneinander unterscheidbare Weise zu mar kieren, die Sonden miteinander zu vermischen und gleichzeitig zu hybridisieren (sog. "kompetitive Hybridisierung"; vgl. Schena et al.). In jedem Fall repräsentieren diejenigen Orte, an denen mit verschiedenen Sonden unterschiedlich starke Hybridisierungssignale erhalten werden, in beiden Sonden verschieden häufig vertretene mRNA-Spezies und somit differentiell exprimierte Gene.

Da es sich bei den DNA-arrays nach dem Stand der Technik (Lockhart et al., Schena et al.) um "geordnete" arrays handelt, bei denen bekannte Nukleinsäuren in bekannter Anordnung auf einer Oberfläche abgelegt oder erzeugt werden, ist von einem über ein bestimmtes Hybridisierungssignal identifizierten Ort auf der Oberfläche unmittelbar ein Rückschluß auf die an diesem Ort befindliche Nukleinsäurespezies möglich. Bei den nach dem erfin dungsgemäßen Verfahren erhaltenen Anordnungen von Nukleinsäureinseln handelt es sich hingegen um den Regeln der Selbstorganisation folgenden Zufallsanordnungen; die Identi tät der Nukleinsäuremoleküle in einer jeden Insel ist also unbekannt. Wird nun eine dieser Inseln durch Hybridisierung mit einer komplexen Sonde als von Interesse erkannt, bei spielsweise weil sie ein differentiell exprimiertes Gen zu repräsentieren scheint, so ist eine nachfolgende Identifikation ihrer Identität vorzunehmen. Bevorzugterweise geschieht dies durch selektive Ablösung der diese Insel bildenden Nukleinsäuremoleküle, gefolgt von einer Reamplifikation und einer üblichen Technik zur Identifikation, insbesondere einer Sequenzierung.

Um eine selektive Ablösung der Nukleinsäuremoleküle ausgewählter Inseln von der Ober fläche zu ermöglichen, besitzt bevorzugterweise mindestens ein an der Oberfläche immo bilisierter Primer eine Gruppe, welche eine durch Einwirkung elektromagnetischer Strah lung (beispielsweise im UV-Bereich) photochemisch spaltbare Bindung aufweist. Diese Gruppe ist so mit dem Primermolekül zu verbinden, daß das auf einer Oberfläche immobli sierte Primermolekül durch elektromagnetische Strahlung, also photolytisch von der Ober fläche entfernt werden kann.

Bei der photolytisch spaltbaren Gruppe handelt es sich bevorzugt um eine Gruppe der all gemeinen Formel II

Hierbei ist X oder Y mit dem Oberfläche verbunden oder verbindbar, während der jeweils andere Rest mit der 5'-OH-Gruppe des 5'-terminalen Ribosylrestes oder mit einer an den 5'-terminalen Ribosylrest gebundenen Base verbunden ist. n und m sind natürliche Zahlen von 1 bis 30.

Ferner beschreiben Venkatesan und Greenberg (J. Org. Chem. 61 (1996), 525-529) die Synthese photolytisch spaltbarer Verbindungsmoleküle (engl. linker; zu unterscheiden von ebenfalls als linker oder adaptor bezeichneten kurzen synthetischen DNA- Doppelstrangabschnitten) für die Oligonukleotidsynthese, die nach erfolgter Synthese die Abspaltung des Oligonukleotids vom festen Träger erlauben. Auch solche Linker können statt der Gruppierung der allgemeinen Formel II eingesetzt werden, sofern man diese ab weichend von der in Venkatesan und Greenberg vorgeschlagenen Vorgehensweise mit dem 5'-Ende der Oligonukleotide verbindet, so daß eine Verlängerung der Oligonukleotide durch eine Polymerase möglich bleibt.

In einer bevorzugten Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Vergleich ver schiedener Sonden durch kompetitive Hybridisierung werden die auf der Oberfläche statt gefunden habenden differentiellen Hybridisierungsereignisse bestimmt. Differentielle Hybridisierungsereignisse zeigen an, daß eine auf einer Stelle der Oberfläche konzentrierte Sorte von Nukleinsäuremolekülen mit einer Sonde oder mit einem Sondengemisch stärker hybridisiert als mit einer anderen Sonde oder mit einem anderen Sondengemisch.

Besonders zuverlässig lassen sich solche Ereignisse erkennen, wenn wie von Schena et al. beschrieben eine kompetitive Hybridisierung durchgeführt wird, bei der die eingesetzte Sonde aus einem Gemisch von unterschiedlich fluoreszenzmarkierten, aus unterschiedli chen (insbesondere zwei) Proben gewonnenen Nukleinsäuren besteht. Zunächst wird die Oberfläche, auf der die Hybridisierung stattgefunden hat, abgetastet, das heißt es wird die lokal gebundene Sondenmenge (etwa durch Messen der Fluoreszenzaktivität) bestimmt. Bei Einsatz einer Sonde, die aus einem Gemisch von unterschiedlich fluoreszenzmarkier ten, aus unterschiedlichen (insbesondere zwei) Proben gewonnenen Nukleinsäuren besteht, kann Abtasten das zeitgleiche oder nacheinander erfolgende Bestimmen der Fluoreszenz aktivität bei zwei unterschiedlichen Anregungs- und/oder Emissionswellenlängen bedeu ten. Die ortsaufgelösten Fluoreszenzsignale müssen für jeden Fluorophor kalibriert werden. Diese Kalibrierung kann auf unterschiedliche Weise geschehen. Zum Beispiel ist es mög lich, mit einem internen Standard zu arbeiten, wie dies in Schena et al. beschrieben wird. In diesem Fall würde als Sonde ein Gemisch aus unterschiedlich markierter cDNA unter schiedlicher Herkunft eingesetzt, indem man zunächst eine mRNA bestimmter Herkunft zusammen mit einer bekannten mRNA bekannter Konzentration revers transkribiert und Fluoreszenz-markiert (z. B. mit Fluoreszein) und dasselbe mit der mRNA der anderen Her kunft durchführt, aber einen anderen Fluoreszenz-Marker benutzt (z. B. Lissamin). Wenn man eine definierte Menge Nukleinsäure, an welche die unterschiedlich markierten Proben des internen Standards binden können, auf eine definierte Stelle der Oberfläche aufbringt, dann können die durch Abtasten der Oberfläche ermittelten örtlichen Fluorezenzsignale auf den internen Standard bezogen werden, so wie in Schena et al. beschrieben. Alternativ kann man auch den Quotient aus der örtlichen Signalintensität bezüglich beider Fluoropho re bilden und über die Anzahl der Meßorte arithmetisch mitteln. Der auf diese Weise er haltene Selektivitätsfaktor

gibt näherungsweise die relative Sensiti vität der Detektion der beiden Fluorophore a und b an, wenn sich die mRNA-Proben unter schiedlicher Herkunft nicht zu stark unterscheiden (Sa(x, y) = Fluoreszenzintensität, die auf den Fluorophor a zurückgeht am Meßpunkt mit den Koordinaten x, y in einer Matrix von x = 1 bis X und y = 1 bis Y, Sb(x, y) analog). Häufig erscheint es angebracht, Signale, die auf unspezifische Bindung zurückgehen, vom Fluoreszenzsignal abzuziehen, bevor der Selek tivitätsfaktor und alle anderen Daten aus den Rohdaten ermittelt werden. Dies setzt allerdings voraus, daß sich die unspezifische Bindung genau genug bestimmen läßt, was nicht immer der Fall sein wird, so daß bisweilen auf eine solche Korrektur verzichtet wird.

Der Selektivitätsfaktor f_ab kann also in Analogie zu Schena et al. unter Verwendung eines internen Standards berechnet werden, oder es kann die oben genannte vereinfachte Defini tion zugrunde gelegt werden. Ein differentielles Hybridisierungsereignis hat per definitio nem stattgefunden, wenn der örtliche Quotient aus den auf Fluorophor a und Fluorophor b zurückgehenden Fluoreszenzintensitäten größer als g.f_ab oder kleiner als 1/g.f_ab ist, wobei g größer 1,5, bevorzugt größer als 2, vor allem größer als drei ist.

Ein differentielles Hybridisierungsereignis weist am Ort x, y in einer Matrix von x = 1 bis X und y = 1 bis Y einen Quotienten Sa/Sb auf, der durch eine der folgenden Ungleichungen gekennzeichnet ist:

Die Auflösung, das heißt die Werte X und Y der x,y-Matrix werden durch die Auflösung des Abtastvorganges begrenzt. Wird ein CCD-Chip eingesetzt, so kann X.Y die Auflösung des Chips bedeuten.

Wie bereits oben beschrieben, ist es ebenfalls möglich, auf den gleichzeitigen Einsatz zweier oder mehr Fluorophore, die jeweils mit einer mRNA einer bestimmten Herkunft gekoppelt sind, zu verzichten. In diesem Fall müßte man zwei (oder mehr) Sonden einset zen, die denselben Fluorophor tragen, die aber auf mRNA unterschiedlicher Herkunft zu rückgehen. Dann würde man zunächst eine erste Hybridisierung mit Sonde a durchführen, das erste Hybridisierungsergebnis durch ortsaufgelöste Fluorezenzmessung detektieren, die hybridisierte Sonde a entfernen, eine zweite Hybridisierung mit Sonde b durchführen, das zweite Hybridisierungsergebnis detektieren (und gegebenenfalls noch weitere Zyklen be stehend aus Entfernung einer hybridisierten Sonde, Hybridisierung einer weiteren Sonde und Detektion des Hybridisierungsergebnisses durchführen) und die erhaltenen Hybridisie rungsergebnisse miteinander vergleichen. Die oben aufgeführte Gleichung und die Unglei chungen bleiben anwendbar, allerdings bedeuten die Indices a und b dann die jeweiligen Meßdurchgänge bei Anwendung von Sonden a und b, die auf Proben unterschiedlicher Herkunft zurückgehen.

Um zu entscheiden, ob ein Ort x, y Teil eines authentischen differentiellen Hybridisierungs ereignisses ist, sollten die Quotienten Sa(x, y)/Sb(x, y) benachbarter Orte verglichen werden. Flächen, die ein differentielles Hybridisierungsereignis aufweisen, gehen in der Regel auf klonale Inseln auf der Oberfläche zurück und haben somit eine im wesentlichen runde Form und einen Durchmesser größer 0,1 µm, bevorzugt größer 0,75 µm oder 1,0 µm auf der Oberfläche, vor allem 1,2-2,0 µm. Mit diesem Filterkriterium lassen sich Artefakte weitgehend vermeiden.

Die Bereiche, an denen differentielle Hybridisierungsereignisse stattgefunden haben, wer den selektiv derart behandelt, daß die dort immobilisierten Moleküle mindestens zum Teil von der Oberfläche abgelöst werden. Bevorzugt geschieht dies durch lokal begrenzte Ein wirkung elektromagnetischer Strahlung, insbesondere UV-Strahlung oder Strahlung im sichtbaren Bereich, die in der Lage ist, photochemische Spaltung einer photolabilen Grup pe herbeizuführen, über die die immobilisierten Primermoleküle an die Oberfläche gebun den sind. Wichtig hierbei ist, daß lediglich diejenigen Bereiche der elektromagnetischen Strahlung ausgesetzt werden, von denen eine Ablösung und Wiedergewinnung der Nuk leinsäuremoleküle gewünscht ist. Nach selektiver Ablösung der Nukleinsäuremoleküle, die an einem differentiellen Hybridisierungsereignis beteiligt sind, werden diese von der Ober fläche abgewaschen.

Zur Analyse der von der Oberfläche abgelösten sowie in Waschlösung überführten Nuk leinsäuremoleküle wird in der Regel zunächst eine Vervielfältigung erforderlich sein, wel che bevorzugt mittels in vitro-Amplifikation oder über Klonierung oder eine Kombination hiervon erfolgt. Die weiter vorzunehmenden Analyseschritte richten sich im Rahmen der dem Fachmann geläufigen Vorgehensweisen nach der verfolgten Fragestellung, werden aber in der Regel eine Sequenzierung der erhaltenen Nukleinsäuren beinhalten. Oft werden die erhaltenen Nukleinsäuren auch zum Durchsuchen genomischer oder cDNA- Bibliotheken eingesetzt. Bei einer Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Expressionsanalyse wird meist eine Überprüfung der erhaltenen Sequenzen mittels eines Quantifizierungsverfahrens, beispielsweise Northern-Hybridisierung oder quantitative PCR, erfolgen. Weiterhin können die Ergebnisse zur Abfrage elektronischer Datenbanken, beispielsweise Sequenzdatenbanken, eingesetzt oder ihrerseits in Datenbanken eingespeist werden.

In einer weiteren Ausführungsform werden die an nicht-differentiellen Hybridisierungse reignissen beteiligten Nukleinsäuremoleküle und/oder die an sie hybridisierten Sonden moleküle so verändert, daß sie für eine Ablösung und/oder spätere Vervielfältigung nicht mehr zur Verfügung stehen, also entfernt oder inaktiviert werden.

Inaktivierung

Bevorzugt werden die nicht an nicht-differentiellen Hybridisierungsereignis sen beteiligten Nukleinsäuremoleküle mit elektromagnetischer Strahlung geeigneter Wel lenlänge sowie einem Vernetzungsreagenz behandelt, so daß es zu die durch Hybridisie rung entstandenen Doppelstränge vernetzenden Photoreaktionen kommt. Beispielsweise beschreiben Spielmann et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 4514-8) die kovalente Verknüpfung miteinander hybridisierter DNA-Stränge durch Interkalation von 4'- Hydroxymethyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit anschließender Bestrahlung bei 366 nm. Fer ner kann auch auf ein Vernetzungsagens verzichtet werden, indem man die entsprechenden Nukleinsäuremoleküle und Sonden infolge elektromagnetischer Einwirkung irreversibel kreuzvernetzt (Thymidin-Dimer-Bildung). Eine weitere Möglichkeit ist das irreversible Verbinden der entsprechenden Nukleinsäuremoleküle und Sonden mit der Oberfläche durch lokale Erhitzung.

Entfernung

Natürlich können auch zunächst die an nicht-differentiellen Hybridisierungse reignissen beteiligten Nukleinsäuremoleküle und Sonden entfernt werden. Dies kann z. B. durch die Spaltung photolabiler Gruppen inmitten des Linkers bewirkt werden, der die verlängerten Primermoleküle, also die Nukleinsäuremoleküle mit der Oberfläche verbindet. Zum Beispiel könnte ein Konstrukt wie in Formel II angegeben zum Einsatz kommen. Die an differentiellen Hybridisierungsereignissen beteiligten Nukleinsäuremoleküle und Son den werden dann in einem zweiten Schritt entfernt, der nicht mehr selektiv sein muß. Diese in einem zweiten Schritt freigesetzten Nukleinsäuremoleküle und Sonden werden, wie o ben beschrieben, analysiert.

Im Ergebnis äquivalent wäre im übrigen auch der Einsatz von LCM (Laser capture Mikro dissection, Emmert-Buck et al., Science 274 (1996), 998-1001) zur Isolation derjenigen Nukleinsäure-Inseln, an denen differentielle Hybridisierungsereignisse stattgefunden ha ben, sofern die zur Immobilisierung verwandte Oberfläche hierfür geeignete Eigenschaften aufweist. Zur Anwendung von LCM im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens wäre es erforderlich, eine Oberfläche zur Verfügung zu stellen, welche einerseits gegen die wäh rend der Amplifikation und Hybridisierung herschenden Bedingungen beständig ist, sich andererseits aber nach Kontakt mit thermisch erweichter und wieder abgekühlter Poly ethylenvinylacetat-Transferfolie lokal gemeinsam mit dieser vom Träger abziehen läßt. Hierfür könnte beispielsweise eine zur Bindung von Nukleinsäuren chemisch geeignet mo difizierte (Rasmussen et al.) Polystyrolfolie auf einen Kunststoff oder Glasträger auf gepreßt werden. Um die nach erfolgtem Transfer zwischen Transferfolie und und Polysty rolfolie eingeschlossenen Nukleinsäuren zugänglich zu machen, könnte die Polystyrolfolie mit geeigneten Lösungsmitteln, beispielsweise Aceton, aufgelöst werden.

Anwendungsbereiche des erfindungsgemäßen Verfahrens sind insbesondere all diejenigen Fragestellungen, bei denen zwei oder mehrere Nukleinsäuremischungen daraufhin unter sucht werden sollen, ob einzelne Nukleinsäurespezies in den Gemischen in unterschiedli cher Häufigkeit enthalten sind, und die diese Spezies repräsentierenden immobilisierten Nukleinsäuren isoliert werden sollen. Dies ist beispielsweise bei der Expressionsanalyse der Fall, bei der häufig die Zusammensetzung verschiedener cDNA-Präparationen vergli chen wird und die Aufgabe in der Identifikation derjenigen cDNA-Spezies besteht, welche sich in ihrer relativen Häufigkeit zwischen den Präparationen unterscheiden. Eine andere Anwendung ist der Vergleich von Gemischen von aus genomischer DNA gewonnenen DNA-Fragmenten, wobei oftmals bestimmte Fragmente (beispielsweise durch "Doppel restriktionsverdau" mit zwei verschiedenen Restriktionsendonukleasen gewonnen) ledig lich in einem Teil der untersuchten Präparationen vorhanden sind. Derartige Fragmente, die bisher meist über das bekannte RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)- Verfahren (Kiko et al., Mol. Gen. Genet. 172 (1979), 303-12) identifiziert werden, eignen sich beispielsweise für genomische Kartierungen sowie zur Analyse von SNPs (single nucleotide polymorphisms) (Palmatier et al., Biol. Psychiatry 46 (1999), 557-67). Ein wei terer Anwendungsbereich, welcher vor allem in der Pflanzenzüchtung eine wichtige Rolle spielt, besteht in der Untersuchung von genomischen Fragmenten, die auf einer Seite von einer Erkennungsstelle für eine bestimmte Restriktionsendonuklease und auf ihrer anderen Seite von einer aus einem Transposon stammenden Sequenz flankiert werden (Arbuckle et al., WO 99/41415). Da die Insertion bzw. Exzision von Transposons Eigenschaften eines Organismus beeinflussen können, ist die Kenntnis solcher Prozesse und ihrer genauen Lage im Genom, etwa für Züchtungszwecke, von großem Interesse; zudem können Transposons als gut geeignete genomische Marker verwendet werden.

Soll das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise zur vergleichenden Expressionsanaly se zweier biologischer Proben eingesetzt werden, so werden häufig die folgenden Schritte zur Anwendung kommen: zunächst werden Aliquots der aus beiden Proben gewonnenen RNAs vereinigt und in doppelsträngige cDNA überführt. Diese wird einem Restriktions verdau, beispielsweise mit einem häufig schneidenden Enzym wie MboI, unterworfen, ge folgt von der Ligation doppelsträngiger Linker. Hierbei ist bevorzugt, eine Normalisierung der doppelsträngigen cDNA oder der linkerflankierten Fragmente nach einem der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren vorzunehmen (vgl. beispielsweise Bonaldo et al., Genome Res. 6 (1996), 791-806). Anschließend wird eine Festphasenamplifikation gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt. Hierzu werden Primermoleküle, welche an die durch den verwendeten cDNA-Primer eingeführte Sequenz bzw. an die durch die Linker vorgegebene Sequenz binden können, auf einer Oberfläche immobilisiert, wobei die Immobilisierung über eine photolabile, in der Regel kovalente Bindung erfolgt. Nach Auf bringen einer porösen Matrix, welche eine Amplifikationsmischung enthält, sowie der zu amplifizierenden linkerflankierten cDNA-Fragmente werden wie oben beschrieben Nuk leinsäureinseln erzeugt. Dabei ist es selbstverständlich ebenso möglich, anstelle von cDNA-Fragmenten genomische Fragmente einzusetzen, was insbesondere bei kleinen Ge nomen, beispielsweise Bakteriengenomen, gewünscht sein kann. Auch Klone aus bereits existierenden Plasmid-, Phagen-, YAC-, BAC- oder anderen Banken können verwendet werden. Jedenfalls wird nach erfolgter Amplifikation sowie Entfernung der porösen Matrix unter denaturierenden Bedingungen gewaschen, um die die Inseln bildenden Nukleinsäuren in den einzelsträngigen und somit hybridisierungsfähigen Zustand zu überführen.

Zur Identifikation derjenigen Inseln, welche differentiell exprimierte Gene enthalten, wer den Aliquots der zu analysierenden RNAs in Gegenwart von fluoreszenzmarkierten Nukle otidanaloga, beispielsweise Cy3-dUTP oder Cy5-dUTP, separat revers transkribiert. Dabei wird die aus einer Probe gewonnene cDNA mit einer Markierung und die aus der anderen Probe gewonnene cDNA mit der anderen, hiervon unterscheidbaren Markierung versehen. Die Proben werden miteinander vermischt, denaturiert und unter Hybridisierungsbedin gungen mit der vorbereiteten, die nunmehr einzelsträngigen Nukleinsäuren tragenden O berfläche in Kontakt gebracht. Nach Hybridisierung und Waschen werden die von beiden Sondentypen stammenden Fluoreszenzsignale detektiert, und es werden wie in Beispiel beschrieben die Positionen derjenigen Inseln (in Hinblick auf ihre Fluoreszenz oft auch als "spots" bezeichnet) bestimmt, an welchen überdurchschnittlich viel oder überdurchschnitt lich wenig Moleküle des einen Sondentyps im Vergleich zu Molekülen des anderen Son dentyps hybridisiert sind. Diese ausgewählte Inseln, jetzt bestehend aus mit Sondenmole külen hybridisierten immobilisierten Nukleinsäuremolekülen, werden nun photolytisch von der Oberfläche gelöst und abgewaschen. Die Waschlösung enthält dann ein Gemisch von Restriktionsfragmenten, welche in beiden biologischen Proben unterschiedlich stark exprimierte Gene repräsentieren. Um die entsprechenden Gene zu identifizieren, werden die Restriktionsfragmente mittels PCR reamplifiziert; hierbei kommen Primer zur Anwen dung, die die gleiche Sequenz aufweisen wie zuvor die zur Festphasenamplifikation einge setzten Primer. Da es sich in der Regel um ein Gemisch verschiedener Fragmente handeln wird, muß eine Möglichkeit zur Auftrennung geschaffen werden. Diese Auftrennung kann durch Klonierung der Reamplifikationsprodukte erfolgen, es ist aber auch eine Größenauf trennung über präparative Gelelektrophorese, besonders Polyacrylamidgelelektrophorese, möglich. Zur Identifikation werden die aufgetrennten Produkte in der Regel sequenziert und die Sequenz für Datenbankabfragen verwendet. Oft wird auf diese Weise bereits ein deutig klar, welches der bereits beschriebenen und in den abgefragten Datenbanken einge tragenen Gene zu den zwischen den untersuchten Proben differentiell exprimierten Genen gehört. In vielen Fällen führt die Datenbankabfrage allerdings nicht zu einem bereits cha rakterisierten Gen, sondern liefert lediglich sequenzidentische DNA-Abschnitte (sog. ESTs, expressed sequence tags), denen bisher keine Funktion und insbesondere auch noch keine vollständige cDNA bzw. kein korrespondierender genomischer Locus zugeordnet wurde. In noch anderen Fällen führt die Datenbankabfrage zu gar keiner ähnlichen oder signifikant partiell identischen Sequenz. In den beiden letzten Fällen wird man in der Regel versuchen, längere (möglichst vollständige) cDNA-Moleküle des jeweiligen Gens zu er halten. Dies ist über das Durchsuchen von cDNA-Banken möglich, bisweilen wird man aber auch das Durchsuchen genomischer Banken vorziehen. Eine Alternative besteht im von Frohman et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988): 8998-9002) beschriebenen Verfahren des "rapid amplification of cDNA ends", welches die Isolation vollständiger cDNA-Moleküle mittels in vitro-Amplifikation erlaubt. Weiterhin wird man eine Expressi onsquantifizierung der identifizierten Gene anschließen. Da keine eindeutige Zuordnung einer einzelnen der zahlreichen simultan abgelösten Nukleinsäureinseln zu einem nachfol gend identifizierten Gen mehr möglich ist, kann das an einer bestimmten Insel erhaltene Verhältnis der Signalstärken beider Sonden-Fluorophore nicht zur Bestimmung eines Re gulationsfaktors des entsprechenden Gens herangezogen werden. Vielmehr wird man sich der dem Fachmann geläufigen Techniken wie etwa quantitative PCR oder Northern blot ting bedienen, um das Maß der Expressionsveränderung jedes einzelnen identifizierten Gens zu ermitteln. In jedem Fall liefert das Verfahren, wenn es zur vergleichenden Expres sionsanalyse verschiedener Proben eingesetzt wird, ein Gemisch von cDNA-Fragmenten, die zwischen den Proben differentiell exprimierte Gene repräsentieren. Beim analog ver laufenden Einsatz zum Genomvergleich hingegen werden genomische Abschnitte isoliert, welche eine veränderte Kopienzahl aufweisen (z. B. "loss of heterozygosity" oder Amplifi kation bestimmter genomischer Abschnitte in Tumorgewebe) oder auch nur in einem Teil der untersuchten Genome vorkommt (z. B. Insertionen oder Deletionen oder auch Frag mente, die genomische Umlagerungen repräsentieren).

Jedenfalls kann im Rahmen der Erfindung eine photolytisch spaltbare Verbindung einge setzt werden, welche bevorzugterweise während der Oligonukleotidsynthese in das Nuk leinsäure-Rückgrat inkorporiert wird und die nachfolgende photolytische Abspaltung min destens eines Teils des Oligonukleotids von einer Oberfläche ermöglicht. In einer bevor zugten Form weist besagte photolytisch spaltbare Verbindung die o-Nitrobenzyl- Grundstruktur auf, wobei die Verbindung als spaltbarer Linker zwischen der 5'-OH- Gruppe einer Ribose- oder Desoxyribosegruppe und entweder der 3'-OH-Gruppe einer weiteren Ribosegruppe oder einer Atomgruppe, welche die Immobilisierung eines Oligo nukleotids vermitteln kann, positioniert werden kann. Besonders bevorzugt sind Verbin dungen, die mit den bei der automatischen Oligonukleotidsynthese herrschenden Reakti onsbedingungen kompatibel sind und daher bei der automatischen Synthese direkt in das betreffende Oligonukleotid inkorporiert werden können.

Eine solche Verbindung wird durch die allgemeine Formel I beschrieben,

wobei n und m unabhängig voneinander 1 bis 30 bedeuten,
R¹ Dimethoxytrityloxy (DMTO) oder eine Gruppe bedeutet, welche die Immo bilisierung an eine Oberfläche ermöglicht oder welche eine Kopplung an ei ne immobilisierbare Verbindung erlaubt, und
R² die Bedeutung -OP(OC₂H₄CN)N(CH(CH₃)₂)₂ oder -OP(OCH₃)N(CH(CH₃)₂)₂,

trägt, sowie ihre Salze.

Bevorzugt sind Verbindungen bei welchen R¹ die Bedeutung Dimethoxytrityloxy (DMTO), -NH₂, -OH, -OPO₃H₂, -SH, -NCS, -NCO oder

N-Succinimidyloxycarbonyl (siehe oben) trägt.

Ein weiterer Gegenstand ist ferner die Verwendung der beschriebenen Verbindungen als photochemisch spaltbare Gruppe bei der Immobilisierung von Nukleinsäuren. Die Gruppe kann durch Licht einer Wellenlänge von 400 nm gespalten werden.

In einer weiterer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt e) eine Analyse der klonalen Inseln über Parallelsequenzierung.

In einer weiterer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt in Schritt e) Sequenzierung über eine Nukleinsäurepolymerase vermittelte Inkorporation von Abbruchnu kleotiden mit entfernbaren Schutzgruppen.

In einer weiterer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt in Schritt e) die Sequenzierung die Schritte: i) Ligation eines Linkers an die zu analysierende Nuk leinsäure, wobei der Linker eine Restriktionsschnittstelle für eine IIS-Restriktionsendo nuklease aufweist, und ii) Identifikation des Linkers und iii) der Schnitt mit der Restrikti onsendonuklease.

Bei einer ersten hierfür in Frage kommenden Methodik handelt es sich um das Verfahren der Minisequenzierung (Jalanko et al., Clin. Chem. 38 (1992), 39-43), bei welchem von jedem Template (hier also von jeder Nukleinsäureinsel) lediglich eine einzige Base be stimmt wird. Hierzu wird ein Oligonukleotidprimer an die zu sequenzierenden Nukleinsäu remoleküle hybridisiert und mittels einer Polymerase um ein markiertes Nukleotid, i. d. R. ein Abbruchnukleotid, verlängert. Mittels der Markierung läßt sich anschließend ermitteln, welche der vier möglichen Basen inkorporiert wurde. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt auch eine ein- oder mehrfach wiederholte Minisequenzierung der Nukleinsäurein seln, indem nach erfolgter Hybridisierung und Verlängerung eines ersten Oligonukleo tidprimers um eine markierte Base sowie deren Detektion der verlängerte Primer unter de naturierenden Bedingungen wieder entfernt wird (oder aber auch die Markierung entfernt oder verändert wird), gefolgt von einem weiteren Zyklus von Hybridisierung eines zweiten Oligonukleotidprimers sowie seiner Verlängerung und Detektion der inkorporierten Base, etc. So ist es möglich, mit hohem Durchsatz und geringem experimentellen Aufwand ein genotyping zahlreicher verschiedener Templates auf einer einzigen, gemäß dem erfin dungsgemäßen Verfahren erzeugten Oberfläche durchzuführen.

Ein weiteres verwendbares Verfahren zur Sequenzierung der mittels des erfindungsgemä ßen Verfahrens erhaltenen Nukleinsäureinseln wurde von Ansorge (DE 41 41 178) be schrieben. Hierzu werden Hybride aus Sequenzierprimer und einzelsträngigem immobili siertem Template (also den durch Festphasenamplifikation gebildeten Nukleinsäureinseln) mit einer Primerextensionsmischung, enthaltend eine Polymerase und eines der vier Nukleotide in markierter Form, inkubiert. Erfolgte Nukleotid-Inkorporation wird über die Markierung festgestellt, dann wird die Markierung entfernt, und ein nächstes markiertes Nukleotid wird angeboten. Dabei kann zyklisch eine Löschung (d. h. Veränderung oder Entfernung) der Markierungen vorgenommen werden. Ein Nachteil dieser Vorgehensweise ist allerdings, daß die Zahl unmittelbar nacheinander inkorporierter identischer Basen le diglich aus der erhaltenen Signalstärke herleitbar ist, was naturgemäß bei längeren Homo polymer-Sequenzen von beispielsweise 3 oder mehr aufeinanderfolgenden identischen Ba sen stark fehlerbehaftet sein kann. Weiterhin bietet DE 41 41 178 kein überzeugendes Konzept für eine Löschung der Markierungen an: Sofern eine Löschung lediglich durch Ausbleichen eines Fluoreszenzfarbstoffs vorgenommen wird, so verbleibt eine chemisch veränderte, nicht mehr (oder schwächer) zur Fluoreszenz befähigte Markierungsgruppe an jeder Base enthalten. Diese veränderten Gruppen weisen ähnlich den unveränderten Fluo reszenzfarbstoffen eine Raumerfüllung auf, welche mit der gewöhnlichen Doppelhelix- Struktur von DNA nicht kompatibel ist und insbesondere die Erkennung des Primer- Template-Komplexes durch die zur Sequenzierung verwendete Polymerase und die nach folgende Inkorporation einer weiteren Base erschwert oder gar verhindert.

Ein anderes, bevorzugtes Verfahren zur Festphasensequenzierung, welches diese Limitati on nicht aufweist, wurde von Albrecht et al. (US-A 6,013,445) vorgeschlagen. Bei dieser Prozedur des "repeated ligation and cleavage" wird mittels einer Restriktionsendonuklease vom Typ IIs ein Nukleinsäureüberhang bekannter Länge, aber unbekannter Sequenz er zeugt. Aus einem Gemisch von sog. encoded adaptors, welche alle möglichen Überhänge der durch besagtes Enzym vorgegebenen Art (3'- oder 5'-Überhang) und Länge enthalten, wird selektiv derjenige encoded adaptor an den Nukleinsäureüberhang ligiert, dessen Ü berhang komplementär zum zu bestimmenden Nukleinsäureüberhang ist. Anschließend wird über Hybridisierung die Identität des ligierten encoded adaptor und damit auch des Nukleinsäureüberhangs ermittelt. Anschließend wird der encoded adaptor über erneute Behandlung mit einer Typ IIs-Restriktionsendonuklease wieder entfernt. Die Erkennungs sequenz dieser Restriktionsendonuklease ist Bestandteil des encoded adaptor und derart positioniert, daß ein neuer, unmittelbar an die Position des zuvor erzeugten Überhangs grenzender Überhang generiert wird. Dieser Zyklus läßt sich mehrfach wiederholen, so daß ca. 20 Basen der zu sequenzierenden Nukleinsäuren bestimmt werden können. Ein Se quenzabschnitt ("tag") von 20 Basen Länge ist in der Regel hinreichend lang, um ein be stimmtes Transkript eines eukaryotischen Organismus eindeutig zu charakterisieren. Dem entsprechend ist diese Sequenzierstrategie in Verbindung mit der oben beschriebenen Festphasenamplifikation gut zur Expressionsanalyse geeignet: die zu untersuchende mRNA-Population wird in doppelsträngige cDNA überführt, diese mittels einer oder meh rerer Restriktionsendonukleasen fragmentiert, die Fragmente (alle oder von jeder cDNA- Spezies nur ein bestimmtes, beispielsweise wie in EP 0 743 367 beschrieben das 3'- terminale Fragment) würden mit Linkern versehen und anschließend wie beschrieben zu klonalen Nukleinsäureinseln amplifiziert. Nach Entfernung der porösen Matrix können die immobilisierten Nukleinsäuren zur Sequenzierung eingesetzt werden; dabei ist bevorzugt, daß der in den Lösungsraum ragende Terminus der Nukleinsäuremoleküle (dessen Sequenz von einem der beiden ligierten Linker vorgegeben ist) eine Erkennungsstelle für die nach folgend einzusetzende Typ IIs-Restriktionsendonuklease enthält. Weitere Möglichkeiten zur Sequenzierung mittels Linkerligation und -Abspaltung werden in US-A 5 552 278, US- A 5 714 330, US-A 5 888 737, US-A 6 013 445 und US-A 6 175 002 vorgestellt, auf wel che hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.

Besonders bevorzugt ist die Sequenzierung der durch das erfindungsgemäße Verfahren erzeugten Nukleinsäureinseln über eine Inkorporation reversibler Abbruchnukleotide (vgl. US-A 5,302,509 sowie WO 94/23064). Unter reversiblen Abbruchnukleotiden sind Nukle otidbausteine zu verstehen, welche einerseits mittels einer Polymerase in einen wachsenden Nukleinsäurestrang inkorporiert werden können, danach aber eine weitere Verlängerung des Strangs verhindern. Dies geschieht durch Schutzgruppen, welche über das Sauerstoff atom in 3'-Position mit dem Nukleotid verbunden sind, oder welche an anderer Position, bevorzugterweise die 2'-Position, derart an das Nukleotid gebunden sind, daß durch eine Abschirmung der 3'-OH-Gruppe (sterische Hinderung) eine weitere Strangverlängerung unterbunden wird. Nach Inkorporation und Identifikation eines derartigen Nukleotid bausteins wird die Schutzgruppe unter Wiederherstellung der 3'-OH-Gruppe bzw. unter deren "Entschirmung" abgespalten, so daß ein weiteres Nukleotid inkorporiert werden kann. Zur Identifikation tragen besagte "reversible" Abbruchnukleotide ferner eine eben falls löschbare, bevorzugt eine entfernbare Markierungsgruppe, welche bevorzugterweise direkt an besagte Schutzgruppe gebunden ist bzw. einen Teil von dieser darstellt. Aller dings kann die identifizierende Molekülgruppe auch an einer anderen Stelle des Nukleo tids, zum Beipiel an der Base, gebunden sein. In diesem Fall ist es notwendig, das Signal der identifizierenden Molekülgruppe nach erfolgter Identifikation des zugehörigen Nukle otids und vor Strangverlängerung um eine weitere Base zu löschen. Dies kann in der Regel auf zwei Arten erfolgen. Zum Beispiel im Falle eines Fluorophors kann die Molekülgruppe durch Ausbleichen verändern werden. Daneben kann die identifizierende Molekülgruppe auch entfernt werden, zum Beispiel durch photochemische Spaltung einer photolabilen Bindung. Trägt jedes der vier für den Einbau in Frage kommenden Abbruchnukleotide (A, C, G oder T) eine andere Markierungsgruppe, so können die vier Sorten Nukleotide gleich zeitig angeboten und eingebaut werden. Bei besagter Markierungsgruppe kann es sich bei spielsweise um einen Fluorophor oder Chromophor handeln, es sind jedoch auch andere Markierungsverfahren denkbar. Im Falle der Markierung durch bestimmte Isotope ist es natürlich auch oft möglich, auf eine separate Markierungsgruppe zu verzichten und statt dessen ein Atom der Schutzgruppe durch ein entsprechendes Isotop zu ersetzen.

Die Abspaltung der Schutz- und gegebenenfalls der Markierungsgruppe soll schnell (im Sekunden- bis Minutenmaßstab) und vollständig ablaufen und unter Bedingungen vorge nommen werden können, welche weder die Integrität der zu sequenzierenden Nukleinsäu remoleküle noch deren Immobilisierung beeinträchtigt. Eine schonende Abspaltung kann beispielsweise photochemisch erfolgen, wie in der US-A 5,302,509 beschrieben. Auch die alkalische Verseifung einer Esterbindung, wie in WO 94/23064 vorgeschlagen, wäre denkbar; allerdings ist bei den dort vorgestellten veresterten Nukleotiden erstens die Inkorpora tionseffizienz sehr niedrig und zweitens die Abspaltung zu langsam (etwa 2 Stunden), so daß die beschriebenen Verbindungen für eine Sequenzierung längerer DNA-Abschnitte (beispielsweise mehr als 20 Basen) ungeeignet sind.

Als eine Schutzgruppen-Abspaltung ermöglichende Verbindungstypen können (gegebenen falls aktivierte) spaltbare Ester-, Ether-, Anhydrid- oder Peroxid-Gruppen zur Anwendung kommen. Ebenfalls denkbar ist es, die Schutzgruppe über eine Sauerstoff-Silizium- Bindung oder eine Sauerstoff-Metall-Bindung oder eine photolytisch spaltbare Bindung mit dem Nukleotid zu verbinden.

Jedenfalls erfolgt die Detektion der inkorporierten "reversiblen" Abbruchnukleotide so wohl orts- als auch zeitaufgelöst, so daß die auf der Oberfläche befindlichen Inseln ampli fizierter Nukleinsäuremoleküle parallel sequenziert werden können (vgl. Abb. 3-5).

Neben ihrer Analyse können die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugten Nukleinsäureinseln im übrigen auch zu einer in vitro-Translation und damit zur Herstel lung von Protein-Arrays verwendet werden.

Die Erfindung wird durch die Zeichnung näher beschrieben.

Es zeigt

Fig. 1 die Erzeugung linkerflankierter Nukleinsäurefragmente;

Fig. 2 die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Oberflächen- gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nukleinsäu remolekülen;

Fig. 3 die Sequenzierung Oberflächen-gebundener Amplifikationsprodukte;

Fig. 4 die parallele Sequenzierung an einer Oberfläche;

Fig. 5 die Assemblierung der Detektions- und Identifikationsergebnisse zu zusammen hängenden Sequenzen;

Fig. 6 das Ergebnis der Amplikation einzelner Nukleinsäuremoleküle gemäß Fig. 2.

Fig. 1 zeigt die Erzeugung linkerflankierter Nukleinsäurefragmente, wobei 1 die Fragmentierung von Nukleinsäuremolekülen,
2 die Befestigung von Linkem an den Fragmentenden bezeichnet.

Fig. 2 veranschaulicht die Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Ober flächen-gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nukleinsäure molekülen, wobei 1 die poröse Matrix mit Amplifikationsmischung, enthaltend linkerflankierte Fragmente als Templates und freie Primermoleküle (offene Rechtecke);
2 die Oberfläche mit immobilisierten Primermolekülen (schwarze Rechtecke);
3 die Amplifikation der Template-Moleküle unter Inkorporation freier sowie immobilisierter Primermoleküle;
4 die Entfernung der porösen Matrix unter Hinterlassung klonaler Nukleinsäu reinseln auf der Oberfläche

Fig. 3 zeigt die Sequenzierung Oberflächen-gebundener Amplifikationsprodukte, wobei 1 die Inkorporation eines reversiblen Abbruchnukleotids;
2 die Identifikation des Abbruchnukleotids, gefolgt von seiner Entschützung unter Entfernung der Markierung;
3 die Inkorporation eines weiteren reversiblen Abbruchnukleotids;
4 die Wiederholung der Schritte 2 und 3 darstellt.

Fig. 4 beschreibt die parallele Sequenzierung an einer Oberfläche. "Inseln" identischer Nukleinsäuremoleküle sind in dieser Figur vereinfacht durch einen einzigen Strang symbo lisiert. Im einzelnen zeigt 1 die Befestigung eines Sequenzierprimers, Einbau des ersten Abbruchnukleo tids und parallele Detektion und Identifikation des jeweils ersten Nukleotid bausteins,
2 die Entfernung von Schutzgruppe und Markierungsgruppe des ersten Nukleo tids, Einbau des zweiten Abbruchnukleotids und parallele Detektion und Iden tifikation des jeweils zweiten Nukleotidbausteins;
3 das Detektions- und Identifikationsergebnis der ersten Base;
4 das Detektions- und Identifikationsergebnis der zweiten Base.

Fig. 5 beschreibt die Assemblierung der Detektions- und Identifikationsergebnisse zu zu sammenhängenden Sequenzen, wobei 1 die Detektions- und Identifikationsergebnis der ersten Base,
2 die Detektions- und Identifikationsergebnis der zweiten Base,
3 die Detektions- und Identifikationsergebnis der n-ten Base,
4 die assemblierten Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle in einzelnen Inseln bezeichnet.

Fig. 6 zeigt das Ergebnis der Amplifikation einzelner Nukleinsäuremoleküle mittels Ober flächen-gebundener Primer zu Inseln aus jeweils identischen amplifizierten Nukleinsäure molekülen, visualisiert durch Anfärbung mit SYBR Green I.

Die Erfindung wird im folgenden durch die Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Vorbereitung von Nukleinsäuremolekülen

6 µg Gesamt-RNA aus Weizenkeimen wurden mit Ethanol gefällt und in 15,5 µl Wasser gelöst. Es wurden 0,5 µl 10 µM cDNA-Primer CP28 V (5'- ACCTACGTGCAGATTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3') hinzugegeben, 5 Minuten bei 65°C denaturiert und auf Eis gestellt. Die Mischung wurde mit 3 µl 100 mM Dithiothreitol (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 6 µl 5× Superscript-Puffer (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 1,5 µl 10 mM dNTPs, 0,6 µl RNase Inhibitor (40 U/µl; Roche Molecular Bio chemicals) und 1 µl Superscript II (200 U/µl, Life Technologies) versetzt und zur cDNA- Erststrangsynthese 1 Stunde bei 42°C inkubiert. Zur Zweitstrangsynthese wurden 48 µl Zweitstrang-Puffer (vgl. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1999), John Wiley & Sons), 3,6 µl 10 mM dNTPs, 148,8 µl H₂O, 1,2 µl RNaseH (1,5 U/µl, Pro mega) und 6 µl DNA Polymerase I (New England Biolabs GmbH Schwalbach, 10 U/µl) hinzugefügt und die Reaktionen 2 Stunden bei 22°C inkubiert. Es wurde mit 100 µl Phe nol, dann mit 100 µl Chloroform extrahiert und mit 0,1 Vol. Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Vol. Ethanol gefällt. Nach Zentrifugation für 20 Minuten bei 15.000 g und Waschen mit 70% Ethanol wurde das Pellet in einem Restriktionsansatz aus 10 µl 10 × NEBuffer 4, 0,5 µl BSA (20 mg/ml; Roche Molecular Biochemicals), 2U NlaIII (New England Biolabs) und 89 µl H₂O gelöst und die Reaktion 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Es wurde mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das Pellet wurde in einem Ligati onsansatz aus 0,6 µl 10× Ligationspuffer (Roche Molecular Biochemicals), 1 µl 10 mM ATP (Roche Molecular Biochemicals), 1 µl Linker NL2124 (hergestellt durch Hybridisie rung von Oligonukleotiden NL24 (5'-TCACATGCTAAGTCTCGCGACATG-3', ARK) und LN21 (5'-TCGCGAGACTTAGCATGTGAC-3', ARK), 6,9 µl H₂O und 0,5 µl T4 DNA Ligase (Roche Molecular Biochemicals) gelöst und die Ligation 5 h bei 20°C durchgeführt. Die Ligationsreaktion wurde mit Wasser auf 50 µl aufgefüllt, mit Phenol, dann mit Chloroform extrahiert und nach Zugabe von 1 µl Glycogen (20 mg/ml, Roche Molecular Biochemicals) mit 50 µl 28% Polyethylenglycol 8000 (Promega)/10 mM MgCl₂ gefällt. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in 100 µl Wasser aufgenommen.

Beispiel 2 Vorbereitung von poröser Matrix und Oberfläche

Es wurde eine Primerbindungslösung hergestellt, bestehend aus 20 mg 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim), 100 µl 1 M 1-Methylimidazol (Sigma-Aldrich) sowie 20 µl 100 µM aminomodifiziertem Primer Amino-NL24 (5'-Amino- TCACATGCTAAGTCTCGCGACATG-3'; ARK). Je 100 µl dieser Lösung wurden in NucleoLink-Gefäße (Nung GmbH & CO. KG, Wiesbaden) gege ben und über Nacht bei 50°C inkubiert. Anschließend wurde die Primerbindungslösung entfernt und die NucleoLink-Gefäße wurden nach Herstellerangaben gewaschen. Zur Her stellung der porösen Matrix wurde eine 4,5%ige Acrylamidlösung hergestellt, enthaltend 0,2% Bisacrylamid. 100 µl dieser Lösung wurden mit 1 µl 10%iger Ammoniumpersulfat- Lösung sowie 1 µl 10%iger Lösung von Tetramethylethylendiamin in Wasser versetzt und zur Polymerisation je 20 µl hiervon in ein 500 µl-Reaktionsgefäß gegeben.

Beispiel 3 Amplifikation und Detektion

Nach erfolgter Polymerisation wurde das gebildete Polyacrylamidgel gründlich mit Wasser gewaschen und über Nacht bei 4°C mit einer Amplifikationsmischung inkubiert, enthaltend 2 mM MgCl₂, 100 µM dNTPs, 50 U/ml AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin Eimer, Foster City, California, USA), 0,1 mg/ml BSA (Roche), 0,2 µM PCR-Primer CP28V und 0,5 µl/ml der in Beispiel 1 hergestellten linkerflankierten Fragmente in 1 × PCR-Puffer II (Perkin Eimer). Die Gele wurden kurz mit Wasser abgespült, und die Gefäße wurden in einen Gene Amp 9700 Thermocycler überführt (Perkin Eimer) und einem Temperaturpro gramm ausgesetzt, bestehend aus folgenden Schritten: Initiale Denaturierung 1 min. bei 93°C, dann 40 Zyklen aus Denaturierung 15 sec. bei 94°C, Primerbindung 60 sec. bei 55°C und Primerextension 2 min. bei 72°C. Nach erfolgter Amplifikation wurde die Polyacryla midmatrix vorsichtig entfernt, und die Gefäße wurden gründlich mit Wasser ausgespült. Es wurde 1 min. mit einer Lösung von SYBR Green I (Molecular Probes Inc., Eugene, Ore gon, USA) 1 : 10.000 in Wasser behandelt und kurz mit Wasser nachgespült. Die Böden der NucleoLink-Gefäße wurden abgetrennt und auf Objektträgern für die Mikroskopie befes tigt. Die visuelle Untersuchung der durch lokalisierte Amplifikation entstandenen klonalen Nukleinsäureinseln erfolgte mittels eines Konfokalmikroskops (Leica TCS-NT; Leica Mic rosystems Heidelberg GmbH); die Parameter waren: 10fach-Objektiv, Anregungswellen länge 488 nm, Detektionswellenlänge 530 nm, Photomultiplier-Spannung 700 V, Zoom- Einstellung "4", Pinhole-Einstellung "1".

Beispiel 4 Alternative Vorbereitung einer Matrix

Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden NucleoLink-Gefäße mit aminomodifiziertem PCR- Primer NL24 beschichtet. Pro Reaktion wurden 400 µl Polybead Microspheres 1 µ (Polys ciences, Inc., Warrington, PA, USA) dreimal mit je 100 µl einer Amplifikationsmischung wie in Beispiel 3 gewaschen. Die Microsphere-Suspension wurde in NucleoLink-Gefäße überführt und in einer Tischzentrifuge 10 Min. bei Raumtemperatur und 10.000 g abzentri fugiert. Der Überstand wurde abpipettiert, die Gefäße verschlossen, in einen vorgeheizten Thermocycler gestellt und wie in Beispiel 3 einem Temperaturprogramm ausgesetzt. Die sedimentierten Microspheres wurden durch Zentrifugation der invertierten Gefäße entfernt, die Gefäße mit Wasser nachgewaschen und mit SYBR Green I-Lösung behandelt. Weitere Behandlung und Detektion erfolgten wie in Beispiel 3 beschrieben.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung einer Zufallsanordnung klonaler Inseln auf einer Oberfläche, umfassend die Schritte

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation durch PCR bewerkstelligt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Gegenprimer im Reaktions raum vorliegen, die mit den immoblisierten Primern aus Schritt a) in bezug auf die zu amplifizierenden Nukleinsäuren ein oder mehrere PCR-Primerpaare, bestehend aus Primer(n) und Gegenprimer(n), bilden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß an der Oberfläche immobili sierten Primer in bezug auf die zu amplifizierenden Nukleinsäuren kein PCR- Primerpaar bilden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt d) die Matrix zum Zecke der Exposition der klonalen Inseln auf der Oberfläche im we sentlichen entfernt wird.

6. Verfahren nach einem der Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobli sierung der Primer aus Schritt a) auf der Oberfläche über Primer und Oberfläche kova lent verknüpfende Molekülgruppen erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Molekülgruppen unter Bedingungen gespalten werden können, die Nukleinsäuren im wesentlichen nicht zer stören.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Molekülgruppen der allgemeinen Formel I ent sprechen,
wobei n und m unabhängig voneinander 1 bis 30 bedeuten, und wobei
R¹ Dimethoxytrityloxy (DMTO) oder eine Gruppe bedeutet, welche die Immobili sierung an eine Oberfläche ermöglicht oder welche eine Kopplung an eine immo bilisierbare Verbindung erlaubt, und
R² die Bedeutung -OP(OC₂H₄CN)N(CH(CH₃)₂)₂ oder -OP(OCH₃)N(CH(CH₃)₂)₂,

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt e) eine Analyse der klonalen Inseln durch Hybridisierung mit markierten Nukleinsäure sonden erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt e) eine Analyse der klonalen Inseln über Parallelsequenzierung erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzierung über eine Nukleinsäurepolymerase vermittelte Inkorporation von Abbruchnukleotiden mit entfernbaren Schutzgruppen erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzierung die Schritte umfaßt: i) Ligation eines Linkers an die zu analysierende Nukleinsäure, wobei der Linker eine Restriktionsschnittstelle für eine IIS-Restriktionsendonuklease auf weist, und ii) Identifikation des Linkers und iii) der Schnitt mit der Restriktionsendo nuklease.