JP2023046400A - 組織からｍ－ＲＮＡの空間情報およびシークエンシング情報を取得する方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＤＮＡバーコードの生成およびデコーディングを同時に行う、組織のｍ－ＲＮＡ分子のシークエンシングおよび空間デコーディングのための方法を提供する。【解決手段】組織試料上のｍ－ＲＮＡ標的配列の空間位置および配列情報を取得する方法であって、以下の工程ａ．少なくとも１つの基準マーカーを少なくとも有する固体表面を準備する工程ｂ．光切断可能なリンカーおよびアダプター単位を含む複数のアンカー分子を前記固体表面に結合させる工程ｃ．アンカー分子のアダプター単位に結合することが可能な単位、５～３０個のイノシン塩基を有するポリイノシン単位、および１０～５０個のアデニン塩基を有するポリアデニン単位を含む足場分子を前記アンカー分子に結合する工程を含んでよい、方法である。【選択図】なし
Description
背景
本発明は、組織のｍ－ＲＮＡ分子のシークエンシングおよび空間デコーディングのための方法に関する。
本発明は、組織のｍ－ＲＮＡ分子のシークエンシングおよび空間デコーディングのための方法に関する。
潜在的変異体についてこれらの遺伝子の空間情報とその後の配列を維持することにより、組織上の細胞下レベルで発現したすべての遺伝子を検出することは困難であった。細胞下解像度に達することは特に困難である。
例えば、ＤＮＡバーコード分子の空間デコーディングのためのシークエンシングシステムの開発は、“Single-molecule resolution”（Nature, Dec 2020, Yusuke Oguchi）によって記載されている。
組織ＲＮＡ分子がアレイ上に予めスポットされた空間識別子でタグ付けされる際に空間情報が維持される、商業的手法が利用可能である。得られたライブラリーは、後に、標準的なインビトロＮＧＳ（次世代シークエンシング）シークエンシング技術によってシークエンシングされる。スポッティングプロセスにより、シーケンシングプロセスが実行される前に、アレイ上の空間識別子の位置が既知となる。空間識別子のシークエンシング後、対象の連結ＲＮＡ配列を、組織位置に割り当てることができる。この手法の大きな制限の１つは、現在、多細胞レベルのみにあるアレイ上のスポットの特徴サイズに依存するため、技術の解像度である。
シークエンシングおよび空間情報を取得するための技術は、例えば、米国特許出願公開第２０１５０３４４９４２号明細書、国際公開第２０１６１６２３０９号、および国際公開第２０１２／１４０２２４号に公開されている。
単一細胞トランスクリプトーム解析は、ｃＤＮＡライブラリーをインデックスするＤＮＡバーコードによって革命的な進化を遂げ、高度に多重化された解析を実施することが可能になった。さらに、ＤＮＡバーコードが、空間トランスクリプトームに利用されている。空間分解能は、ＤＮＡバーコードをデコードするために使用される方法に依存するが、単一分子（ｍ－ＲＮＡ）デコーディングの実現は、依然として困難な課題である。
概要
したがって、本発明の課題は、ＤＮＡバーコードの生成およびデコーディングを同時に行う、組織のｍ－ＲＮＡ分子のシークエンシングおよび空間デコーディングのための方法を提供することであった。
したがって、本発明の課題は、ＤＮＡバーコードの生成およびデコーディングを同時に行う、組織のｍ－ＲＮＡ分子のシークエンシングおよび空間デコーディングのための方法を提供することであった。
したがって、本発明の対象は、組織試料上のｍ－ＲＮＡ標的配列の空間位置および配列情報を取得する方法であって、以下の工程
ａ．少なくとも１つの基準マーカーを少なくとも有する固体表面を準備する工程
ｂ．光切断可能なリンカーおよびアダプター単位を含む複数のアンカー分子を固体表面に結合させる工程
ｃ．アンカー分子のアダプター単位に結合することが可能な単位、５～３０個のイノシン塩基を有するポリイノシン単位、および１０～５０個のアデニン塩基を有するポリアデニン単位を含む足場分子をアンカー分子に結合する工程
ｄ．任意選択的にシークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の間に足場分子のイノシン塩基を補完するアンカー分子に、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンをランダムに組み込み、それによってアンカー分子上にバーコードを生成する工程であって、核酸塩基は、光検出可能な単位を備えており、バーコードの配列（および任意選択的にそれらの生成）および基準マーカーに対するそれらの空間位置が、空間情報として同時に検出される工程
ｅ．足場分子のポリアデニン単位を補完するアンカー分子にチミンを組み込み、それによってポリＴ単位を生成する工程
ｆ．アンカー分子から足場分子を除去する工程
ｇ．少なくとも１つのｍ－ＲＮＡ鎖を含む組織試料を準備する工程であって、試料の少なくとも１つのｍ－ＲＮＡ鎖が、少なくとも１つのアンカー分子のポリＴ単位に結合する工程
ｈ．ｍ－ＲＮＡ鎖の逆転写を行って固体表面に結合したｃ－ＤＮＡ鎖を生成する工程
ｉ．アンカー分子の光切断可能なリンカーを切断することにより、固体表面からｃ－ＤＮＡ鎖を除去する工程
ｊ．ｃ－ＤＮＡ鎖の配列情報を取得し、空間情報をｃ－ＤＮＡ鎖の配列情報と連結させる工程
を含む方法である。
ａ．少なくとも１つの基準マーカーを少なくとも有する固体表面を準備する工程
ｂ．光切断可能なリンカーおよびアダプター単位を含む複数のアンカー分子を固体表面に結合させる工程
ｃ．アンカー分子のアダプター単位に結合することが可能な単位、５～３０個のイノシン塩基を有するポリイノシン単位、および１０～５０個のアデニン塩基を有するポリアデニン単位を含む足場分子をアンカー分子に結合する工程
ｄ．任意選択的にシークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の間に足場分子のイノシン塩基を補完するアンカー分子に、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンをランダムに組み込み、それによってアンカー分子上にバーコードを生成する工程であって、核酸塩基は、光検出可能な単位を備えており、バーコードの配列（および任意選択的にそれらの生成）および基準マーカーに対するそれらの空間位置が、空間情報として同時に検出される工程
ｅ．足場分子のポリアデニン単位を補完するアンカー分子にチミンを組み込み、それによってポリＴ単位を生成する工程
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ｈ．ｍ－ＲＮＡ鎖の逆転写を行って固体表面に結合したｃ－ＤＮＡ鎖を生成する工程
ｉ．アンカー分子の光切断可能なリンカーを切断することにより、固体表面からｃ－ＤＮＡ鎖を除去する工程
ｊ．ｃ－ＤＮＡ鎖の配列情報を取得し、空間情報をｃ－ＤＮＡ鎖の配列情報と連結させる工程
を含む方法である。
詳細な説明
本明細書に記載された方法は、５０～３００ｎｍの非常に高い空間分解能を有する組織上のｍＲＮＡを検出するために使用されている。
本明細書に記載された方法は、５０～３００ｎｍの非常に高い空間分解能を有する組織上のｍＲＮＡを検出するために使用されている。
本発明の方法は、順序ａ）～ｊ）で実施されなければならないプロセス工程に従って、以下でより詳細に説明される。
工程ａ）少なくとも１つの基準マーカーを少なくとも有する固体表面を準備する工程
固体基質は、好ましくは機能化された表面を備えている。この表面は、光切断可能なリンカーを含むオリゴヌクレオチドの固体支持体の結合に利用可能な一般的に使用されている化学物質で機能化されていてよく、かつ任意選択的に他の部分と一緒に組み立てられ、入口および出口を有するマイクロ流体フローセルを形成する。
機能化された表面は、例えば、活性化カルボキシレート基またはスクシンイミジルエステルに共有結合したアミン変性オリゴマー、ヨードアセトアミドまたはマレイミドなどのアルキル化試薬を介して共有結合したチオール変性オリゴマー、チオエーテルを介して共有結合したアクリダイトＴＭ変性オリゴマー、ジゴキシゲニンＮＨＳエステル、またはビオチンと相互作用することが可能な固定化ストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン変性オリゴマーを含み得る。
任意選択的に、アンカー分子は、分子濃度に対応する密度で固体基質上にランダムに分布している。
アンカー分子は、ローリングサークル増幅が可能なポリメラーゼのための少なくとも１つのプライマー配列をさらに含み得る。
工程ｂ）光切断可能なリンカーを含む複数のアンカー分子を機能化された固体表面に結合させる工程
その後、予め製造されたアンカー分子は、緩衝溶液で固体表面上に負荷される。アンカー分子は、機能化された表面と相互作用し、領域全体にランダムに空間的に分布する。
好ましくは、光切断可能なリンカー、Ｐ５またはＰ７アダプターのようなアダプター単位または他の短配列を有するアンカー分子が生成される。数十億のそのような単一分子を製造することができる。アンカー分子の密度は、負荷される濃度により制御することができる。
工程ｃ）アンカー分子のアダプター単位に結合することが可能な単位、５～３０個のイノシン塩基を有するポリイノシン単位、および１０～５０個のアデニン塩基を有するポリアデニン単位を含む足場分子をアンカー分子に結合する工程
足場分子は、図１ａおよび図１ｂに示されており、アダプター単位を介してアンカー分子に結合される。Ｐ５またはＰ７のような適切なアダプターおよびそれらの対応物は、当業者に公知である。
ポリ－イノシン単位は、ランダム化されたバーコードの生成のためのテンプレートとして機能し、好ましくは５～３０個のイノシン塩基を有し得る。
工程ｄ）任意選択的にシークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）の間に足場分子のイノシン塩基を補完するアンカー分子に、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンをランダムに組み込み、それによってアンカー分子上にバーコードを生成する工程であって、核酸塩基は、光検出可能な単位を備えており、バーコードの配列（および任意選択的にそれらの生成）および基準マーカーに対するそれらの空間位置が、空間情報として同時に検出される工程。
好ましくは、アンカー分子に、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンをランダムに組み込む工程が、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの混合物とポリメラーゼとを供給することにより実施される。
この工程の間に、ランダムなバーコードがアンカー分子上に生成され、これらは、基準マーカーに対するそれらの空間位置を同時に識別して帰属させるために使用される。
この工程では、足場分子のイノシン塩基が、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）でランダムに補完され、バーコード配列を生成する。この目的のために、核酸塩基は、光検出可能な単位を備えている。このような核酸塩基は、シークエンシング・バイ・シンセシスにより知られており、市販されている。ランダムな方式は、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの混合物とポリメラーゼとを試料に供給することによって確立される。
光検出可能な単位により、バーコードの生成は、適切な画像を撮影することによって容易に監視することができる。
空間情報は、好ましくは、核酸塩基の光検出可能な単位を検出することによって、かつ／またはシークエンシング・バイ・シンセシスによって取得される。
図２に示されているように、画像は、各拡張サイクルの後に撮影され、組み込まれた塩基を決定する。各バーコードを識別するために、画像は超解像を有していてよい。
塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔは、各サイクルの個々の各単一分子にランダムに組み込まれ、したがって、一意の空間的な単一分子識別子を生成することになる。また、固体基質には、少なくとも２つの独立した基準マークも含まれ、これらは蛍光性または自動蛍光性マーカーである可能性がある。それらの基準マークの画像も撮影され、組み込まれた塩基のＸ－Ｙ位置がマーカーに対して決定される。このようにして、個々の各単一分子の各配列が記録され、基準マークに対する組み込まれた塩基の空間位置が、特別な情報（Ｘ－Ｙ距離）として記憶される。
工程ｅ）足場分子のポリアデニン単位を補完するアンカー分子にチミンを組み込み、それによってポリＴ単位を生成する工程
シークエンシング後、ポリＡテールの塩基が、標識されていないＴヌクレオチドで満たされる。この工程により、安定な二本鎖ＤＮＡ分子を形成することができる。
当然のことながら、先の工程からの塩基の混合物は、除去する必要があり、任意選択的に洗浄後に、チミンおよびポリメラーゼが供給される。
工程ｆ）アンカー分子から足場分子を除去する工程
次の工程として、二本鎖ＤＮＡ複合体を有する固体基質を熱変性させて足場分子を除去し、固体表面上に一本鎖オリゴヌクレオチドを形成する。
工程ｇ）少なくとも１つのｍ－ＲＮＡ鎖を含む組織試料を準備する工程であって、試料の少なくとも１つのｍ－ＲＮＡ鎖が、少なくとも１つのアンカー分子のポリＴ単位に結合する工程
組織試料を、すべての単一分子が配置され、透過処理されてｍＲＮＡ分子を放出する固体基質と接触させる。次に、近傍に位置するオリゴヌクレオチドの３０～５０塩基のポリＴテールが、標準的なＤＮＡ／ｍＲＮＡ相互作用を介して組織内で発現したｍＲＮＡにハイブリダイズすることになる。
任意選択的に、組織試料は、表面に供給した後、透過処理される。
工程ｈ）ｍ－ＲＮＡ鎖の逆転写を行って固体表面に結合したｃ－ＤＮＡ鎖を生成する工程
次の工程では、ｍＲＮＡを有するすべてのアンカー分子がｃＤＮＡに逆転写され、続いて、酵素を用いてまたは化学反応を介して組織を固体基質から除去することができる。
ｃ－ＤＮＡ鎖を環状化し、次いでローリングサークル増幅が可能なポリメラーゼによって増殖させて複数のＤＮＡコンカテマーにしてもよい。
任意選択的に、ｃＤＮＡ生成の前に標的光を用いて不要な領域を除去することにより、アンカーの予め定められたサブセットのみが維持される場合、ｍＲＮＡのサブセット（関心領域またはＲＯＩ）のみを逆転写することができる。
組織における関心領域（ＲＯＩ）は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を使用して、外部レーザーＵＶ光源を使用して画定することができる。各ＲＯＩは、特定の線量のＵＶレーザー光を得て、固体基質に結合された単一分子のすべての光切断可能な結合が、切断され、除去されることになる。
工程ｉ）アンカー分子のすべての光切断可能なリンカーを切断することにより、固体表面からｃ－ＤＮＡ鎖を除去する工程
任意選択的に、上述したように、固体表面上の関心領域に標的化された外部レーザーＵＶ光源を使用して、ｃＤＮＡのサブセットのみを除去することができる。
工程ｊ）ｃ－ＤＮＡ鎖の配列情報を取得し、ｃ－ＤＮＡ鎖の空間バーコード配列情報を固体表面バーコードに連結させる工程。
シークエンシングライブラリ用のｃＤＮＡを調製するために、さらなるプロセスが実施されてもよい。最後の工程では、一意の空間アンカー分子識別子を有する各単一分子が、インビトロでシークエンシングされ、組織上の元の決定された位置にリンクされる。バーコードの配列および基準マーカーに対するそれらの空間位置は、工程ｄ）からわかっているため、ｍ－ＲＮＡの空間情報は、容易に決定することができる。ｃ－ＤＮＡ鎖の配列情報には、バーコードの配列が含まれており、固体表面上に生成されたバーコードの配列情報は、工程ｄ）およびｉ）からわかるため、２つのバーコード配列を一致させて、組織上のｍＲＮＡの起点／空間情報を同定することができる。
本発明の手法は、捕捉されたｍＲＮＡの３’末端のシークエンシングに最適である。
ｍＲＮＡシークエンシングの多くの用途では、ｍＲＮＡの５’末端を同定することも必要である。以下のワークフロー（固体支持体にも適用可能）は、図２に視覚化されているように、この問題を解決する。Ｂは、イノシンのような普遍的な塩基に逆戻りする。
任意選択的に、組織は、例えば、抗体結合色素を用いて、好ましくはＭＡＣＳｉｍａ技術を用いて、組織上に発現される異なるタンパク質の同定によってさらに特徴付けられてもよい。
本発明の方法は、理論上、約２０ｎｔの平均読み取り長さを有する３０種類のＤＮＡバーコード分子を製造することができ、ヌクレオチド１つあたり５％未満の誤り率を伴う。これは、それらを空間的に同定するのに十分である。さらに、抗体に結合した空間的に同定されたＤＮＡバーコード分子を、単一分子分解能で検出することができる。
ワークフローの例：
イノシンの２０～３０塩基およびポリＡ塩基テールの３０～５０塩基を有するＰ５アダプターを有する光切断可能なリンカーからなるアンカー分子と同一のオリゴヌクレオチドを、機能化された固体表面（例えば標準的なカバーガラス２５×７５×１ｍｍ）に負荷する。
イノシンの２０～３０塩基およびポリＡ塩基テールの３０～５０塩基を有するＰ５アダプターを有する光切断可能なリンカーからなるアンカー分子と同一のオリゴヌクレオチドを、機能化された固体表面（例えば標準的なカバーガラス２５×７５×１ｍｍ）に負荷する。
アンカー分子は、機能化された表面上にランダムに固定化されることになる。表面上のアンカー分子の密度は、濃度により制御される。
アンカー分子は、互いに約５０～３００ｎｍの最小距離を有し得る。
イノシンの２５～３０塩基は、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）を行う場合、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧからなる標識された単一ヌクレオチドをランダムに組み込むことで理論的に１．２×１０＾１５～１．５×１０＾１８の可能な組み合わせを可能にする。
シークエンシング・バイ・シンセシスを２５～３０サイクル行い、イノシンの相補的な塩基の各単一分子に組み込まれた各塩基を決定する。図１は、シークエンシングサイクルを示す。これは、標識されたヌクレオチドの第１ラウンドがイノシン塩基に組み込まれる伸長工程を示す。
シークエンシング・バイ・シンセシスは、専用の超解像光学系で行うことができる。組織スライスホルダ上の各単一分子についての位置情報がデータベースに書き込まれ、ユーザ（ウェブサイト、クラウド）によってダウンロードされるか、消耗品と一緒に出荷され得る。
イノシンのすべての塩基をシークエンシングした後、各単一分子は、空間的に一意の分子識別子を有することになる。
空間的に一意の分子識別子を有する単一分子の各位置は、機能化された固体表面上の相対位置（例えば、基準マーカー）に対して決定することができる。
固体基質は、２つの独立した基準マークも含む。これらの基準マークの画像が撮影され、Ｘ－Ｙ位置が決定される。個々の各単一分子の各配列が記録され、基準マークに対する空間位置がＸ－Ｙ座標として記憶される。
２５～３０塩基のシークエンシング後、ポリＡテール（約３０塩基）が、標識されていないＴヌクレオチドで満たされる。この工程は、安定な二本鎖ＤＮＡ分子を形成することになる：
次の工程として、二本鎖分子を有する固体基質を変性させ、それにより、二本鎖ＤＮＡ分子は、表面に共有結合した一本鎖オリゴヌクレオチドを形成する。
組織試料は、単一分子を含む固体基質と接触し、透過処理される。組織内で発現したｍＲＮＡは、透過処理後に組織から放出され、それらのポリＡテールは、３０～５０塩基のポリＴテールと相互作用することになる。次の工程では、組織が、固体基質から除去されることになる。
ｍＲＮＡは、表面上にアンカーした単一分子をプライマーとして使用して逆転写されることになる。
光切断可能なリンカーを介して固体表面に連結された一意に生成され、シークエンシングされかつプリデコーディングされたバーコードを含むｃＤＮＡは、標的化された外部レーザーＵＶ光源を使用して放出され、固体表面からさらに処理されることになる。
末端修復として一般に知られているアプローチを用いて、シーケンシングライブラリー用のｃＤＮＡを調製するためのさらなるプロセスが行われる。Ａ－テーリングおよびアダプターライゲーション。
最後の工程では、一意の空間的な単一分子識別子を有する各ｃＤＮＡが、インビトロでシークエンシングされ、組織上の元の決定された位置に連結される。
任意選択的に、１つはまた、組織試料をさらに特徴付け、組織上に発現されるいくつかの異なるタンパク質を、例えば、ＭＡＣＳｉｍａ技術を用いて同定することができる。
さらに、組織上の関心領域（ＲＯＩ）は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）を用いる外部ＵＶレーザー光源を使用してｍＲＮＡハイブリダイゼーションに利用可能な不要な部分を除去し、望ましくなかった固体基質に結合した単一分子のすべての光切断可能な結合を除去することにより、画定することができる。逆に、対象のｃＤＮＡは、同じ原理を介して、ただしｃＤＮＡの生成後に、予め決定したＲＯＩからのみ放出させることもできる。
Claims (9)
- 組織試料上のｍ－ＲＮＡ標的配列の空間位置および配列情報を取得する方法であって、以下の工程
ａ．少なくとも１つの基準マーカーを少なくとも有する固体表面を準備する工程
ｂ．光切断可能なリンカーおよびアダプター単位を含む複数のアンカー分子を前記固体表面に結合させる工程
ｃ．アンカー分子のアダプター単位に結合することが可能な単位、５～３０個のイノシン塩基を有するポリイノシン単位、および１０～５０個のアデニン塩基を有するポリアデニン単位を含む足場分子を前記アンカー分子に結合する工程
ｄ．前記足場分子の前記イノシン塩基を補完する前記アンカー分子に、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンをランダムに組み込み、それによって前記アンカー分子上にバーコードを生成する工程であって、前記核酸塩基は、光検出可能な単位を備えており、前記バーコードの配列および前記基準マーカーに対するそれらの空間位置が、空間情報として同時に検出される工程
ｅ．前記足場分子の前記ポリアデニン単位を補完する前記アンカー分子にチミンを組み込み、それによってポリＴ単位を生成する工程
ｆ．前記アンカー分子から前記足場分子を除去する工程
ｇ．少なくとも１つのｍ－ＲＮＡ鎖を含む組織試料を準備する工程であって、前記試料の少なくとも１つのｍ－ＲＮＡ鎖が、少なくとも１つのアンカー分子のポリＴ単位に結合する工程
ｈ．前記ｍ－ＲＮＡ鎖の逆転写を行って、前記固体表面に結合したｃ－ＤＮＡ鎖を生成する工程
ｉ．前記アンカー分子の前記光切断可能なリンカーを切断することにより、前記固体表面からｃ－ＤＮＡ鎖を除去する工程
ｊ．前記ｃ－ＤＮＡ鎖の配列情報を取得し、前記空間情報を、前記ｃ－ＤＮＡ鎖の前記配列情報と連結させる工程
を含む、方法。 - 前記アンカー分子に、核酸塩基としてアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンをランダムに組み込む工程を、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣの混合物とポリメラーゼとを供給することにより実施することを特徴とする、請求項１記載の方法。
- 前記空間情報を、前記核酸塩基の前記光検出可能な単位を検出することによって取得することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
- 前記空間情報を、シークエンシング・バイ・シンセシスによって取得することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
- 前記組織試料を、前記表面から除去することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
- 前記ｃ－ＤＮＡ鎖を環状化し、次いでローリングサークル増幅が可能なポリメラーゼによって増殖させて複数のＤＮＡコンカテマーにすることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
- 前記アンカー分子が、分子濃度に対応する密度で固体基質上にランダムに分布していることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
- 前記組織試料を、前記表面に供給した後に透過処理することを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
- 前記アンカー分子が、ローリングサークル増幅が可能な前記ポリメラーゼのための少なくとも１つのプライマー配列を含むことを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
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