CN101281164B - 制备双分子修饰的纳米探针的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
制备双分子修饰纳米探针的方法，其中一种分子是识别分子，另一种分子是编码分子；得到的两种分子修饰的纳米探针通过夹心式结合的方式检测的生物分子；夹心式结合由三种不同作用的成分组成：(1)产生信号的检测探针，(2)与固相支持物连接的捕获探针，(3)靶部分，通过加入能与该生物分子形成夹心式结合的检测探针和捕获探针，拟检测生物分子与捕获探针、检测探针形成夹心式结构，洗脱去除杂质后通过检测能得到一个清晰的检测信号；通过夹心式杂交的方法，拟检测的生物分子就与能识别它的纳米探针结合，分离样品，然后采用质谱检测编码分子，从而快速地定性和定量检测鉴定样品中的生物分子。
Description
技术领域
本发明属于生物分子检测领域，利用纳米技术和分子自组装技术，制备同时携带识别分子和编码分子的纳米探针，采用质谱仪器检测编码分子，从而快速地定性和定量检测鉴定样品中的生物分子。
背景技术
生物分子检测指的是对核酸、蛋白质和糖类等生物大分子的检测。举例说明，比如在分子诊断领域。随着80年代中期聚合酶链反应(PCR)技术的问世以及90年代初人类基因组计划的启动，到目前人类基因组计划的初步完成和其他组学研究的进行，使在疾病诊断方面，目前已经发展了一个比较成熟的学科——分子诊断学。目前，分子诊断的内容从传统的DNA诊断发展到核酸及其表达产物(mRNA、蛋白质)的全面诊断。分子诊断已经从定性诊断发展到半定量和定量诊断，核酸标记技术，特别是荧光标记技术的发展，荧光定量PCR技术等方法日益成熟是实现这一发展的技术保证。但是，在分子诊断领域，真正应用临床使患者受益，开展的还比较局限。因此建立费用低廉、结果可靠的、操作方便、能同时进行多种疾病诊断的高通量分子诊断技术是迫切需要解决的问题。材料学、方法学、传感器和装置等成为分子诊断发展的制约因素。其他，比如在抗体、抗原检测方面也有这方面的要求。
生物分子由于本身可供检测分析的性质较弱，要获得高灵敏度和精确度的检测，就需要借助生物分子标记技术和检测标记物的技术。生物分子标记技术常用的方法有放射标记、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和氧化还原活性分子标记等技术，而检测技术通常有荧光检测、同位素检测和电化学检测等。生物分子标记技术和检测标记物的技术决定了生物分子检测结果的优劣。而目前的这些标记、检测手段在解决高通量分析方面还是有明显的不足。例如荧光标记系统受限于荧光物质的数量和荧光检测的波长范围，目前至多四种荧光探针能够同时检测；杂交酶法至多能同时检测9种病原体，但是它需要麻烦的后置放大处理[Grondahl B，Puppe W，Hoppe A，Kuhne I，Weigl JA，Schmitt HJ.Rapid identification of nine microorganisms causing acute respiratory tractinfections by single-tube multiplex reverse transcription-PCR：feasibility study[J].J ClinMicrobiol.1999，37，1-7]。生物分子标记技术随着高通量检测的需要，要求有一个与之配套的标记库和快速检测技术。近年来，纳米科技正逐渐成为生命科学研究的工具，在生物分子的标记和检测、纳米生物传感器、纳米生物芯片等技术的开发和运用方面已取得了重要的进展，显示出光明的发展前景。
纳米粒子是指颗粒尺寸在1～100nm范围内的超微粒子，由于其处于微观区域，具有许多与同质分子不同的物理化学性质，是一种优良的生物分子标记物。在最近的十年里，将纳米探针用于检验DNA的方法引起了分子诊断学领域的广泛关注[Nathaniel L.Rosi & Chad A.Mirkin，Nanostructures in Biodiagnostics.Chem.Rev.2005，105，1547-1562]。
纳米金是研究较早的一种纳米材料，具有优良的生物相容性。近10多年来纳米金探针在生物分析领域的研究得到迅速发展，并越来越受到相关研究领域的重视，成为生物分析化学的有力工具[Nathaniel L.Rosi & Chad A.Mirkin，Nanostructures inBiodiagnostics[J].Chem.Rev.2005，105，1547-1562和Daniel M.C.，Astruc D.Goldnanoparticles：assembly，supramolecular chemistry，quantum-size-related properties，andapplications toward biology，catalysis，and nanotechnology[J].Chem.Rev.2004，104，293-346]。20世纪末美国西北大学Mirkin等在用纳米金做标记物检测核酸分子方面取得了一系列重要进展，开发了金纳米粒子DNA探针技术[Thaxton C.S.，GeorganopoulouD.G.，Mirkin C.A.Gold nanoparticle probes for the detection of nucleic acidtargets[J].Clinica Chimica Acta 2006，363，120-126；Elghanian，R.，Storhoff，J.J.，Mucic，R.C.，Letsinger，R.L.& Mirkin，C.A.Selective colorimetric detection of polynucleotidesbased on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles.Science，1997，277，1078-1081；Storhoff，J.J.，Elghanian，R.，Mucic，R.C.，Mirkin，C.A.& Letsinger，R.L.One-pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfections usinggold nanoparticle probes[J].J.Am.Chem.Soc.1998，120，1959-1964.]该技术利用了金纳米表面巯基分子自组装的特性，通过使用在直径十几纳米的均匀金纳米粒子上结合DNA探针，来检测DNA分子是否有检测的碱基排列。与普通的DNA探针相比，采用金纳米粒子，检测灵敏度得到了飞跃性提高。同时对DNA碱基排列中单碱基不同的SNP(单核苷酸多态性，也称作SNPs)的检测灵敏度也很高[Taton，T.A.，Mirkin，C.A.&Letsinger，R.L.Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes.Science 289，1757-1760(2000)]。与普通使用的PCR(聚合酶链反应、Polymerase Chain Reaction)法相同，金纳米粒子DNA探针技术的目的在于提高检测精度，这是一种能够将检测对象的DNA分子放大到几百万倍的技术，采用的是bio-bar-code方法进行DNA的检测和信号放大[11]，拥有与PCR法相同或更高的的放大能力，而且在整个过程中无需象PCR法那样升降温度，因而效率更高。但在高通量检测方面，需要借助于芯片阵列技术，很难达到实际的高通量检测要求.[Vet JA，Majithia AR，Marras SA，Tyagi S，Dube S，Poiesz BJ，et al.Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons[J].ProcNatl.Acad.Sci.USA.1999，96，6394-6399.Verweij JJ，Blange RA，Templeton K，Schinkel J，Brienen EA，van Rooyen MA，et al.Simultaneous detection of Entamoebahistolytica，Giardia lamblia，and Cryptosporidium parvum in fecal sam-ples by usingmultiplex real-time PCR[J].J Clin Microbiol.2004，42，1220-1223.]
近年来，质谱技术得到迅速发展，已被广泛应用于化工、石油、医药、生物等领域，成为科研和生产中十分重要的工具。特别是软电离技术的发展，在20世纪80年代中期出现的两种新的电离技术：电喷雾电离(Electrospray Ionization，ESI)和基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)，这两种技术具有检测范围广、灵敏度高、速度快、操作简便、自动化程度高等特点，目前，这两种技术广泛用于生物学、生物医学、生物化学等科学领域的研究。目前，德国Qiagen公司开发了一套有机分子编码核酸的编码技术，制备了64个编码核酸的标记库，利用质谱技术 能同时检测22种病原体[Thomas Briese，et al.Diagnostic system for rapid and sensitivedifferential detection of pathogens.[J].Emerging inferctious diseases，2005，11(2)，310-313.Kokoris，Mark，et al.High-throughput SNP genotyping with the Masscode system.[J].Molecular Diagnosis，2000，5(4)，329-340.]。该方法把小分子标记物通过可控的光切断的连接臂连接到核酸上，然后经过聚合酶链式反应扩增，进行生物方面的识别，最后通过光照把标记物释放出来，通过质谱检测标记物从而判断生物分子的情况。但是该方法需要把标记物通过化学的方法连接到生物分子上，而且检测时还需要通过化学反应释放出来才能检测，不仅繁琐而且费时、费力。
目前，纳米材料用于生物分子检测，主要还是利用纳米材料本身做标记，通过检测纳米材料的情况得到生物分子检测的结果。而在利用纳米材料做载体，通过携带便于检测的小分子编码生物分子，利用质谱来检测的方法还没有报道。
根据以上的现状，本发明将现代生物技术、纳米技术、质谱技术等有机的结合在一起，制备质量编码的纳米生物探针：将不同分子量的有机分子和相应的生物探针同时修饰到纳米材料表面。并且通过夹心式杂交的方法，不同拟检测生物分子就与不同编码的纳米探针结合，利用负载捕获探针的固相支持物分离样品，然后采用质谱检测编码分子，即而实现对生物分子快速的定性和定量检测。本发明满足了这一需要及这一技术领域的其它需要。[Nam，J.M.，Stoeva，S.I.& Mirkin，C.A.Bio-bar-code-based DNAdetection with PCR-like sensitivity[J].J.Am.Chem.Soc.2004，126，5932-5933.Stoeva S.I.，Lee J.-S.，Thaxton C.S.，Mirkin C.A.Multiplexed DNA detection with biobarcodednanoparticle probes[J].Angew.Chem.Int.Ed.2006，45，3303-3306]
发明内容
本发明的目的是为了获得对生物分子的检测，满足了这一需要及这一技术领域的其它需要。把现代生物技术、纳米技术、表面化学技术、质谱检测技术等有机的结合在一起，克服现有技术的不足。制备了双分子修饰纳米探针，其中一种分子特异性地识别拟检测的生物分子，另一种分子用于编码，采用质谱仪器检测编码分子，从而快速地定性和定量检测鉴定样品中的生物分子。
本发明是这样实现的：一种制备双分子修饰纳米探针的方法，其中一种分子是识别分子，一种分子是编码分子，识别分子是能特异识别并与拟检测生物分子结合在一起；同时识别分子含有或修饰有与纳米材料表面结合、组装或修饰的官能团。识别分子可以是核酸、寡核苷酸、蛋白质、多肽等生物分子。
编码分子，指的是与识别分子相对应的，编码识别分子的分子。主要是有机分子，含有与纳米材料表面结合或组装的官能团，同时能被质谱仪器检测。
检测生物分子：所述夹心式结合指的是核酸夹心式杂交法、双抗体夹心法或双抗原夹心法等构成的夹心式结合。夹心式结合由三种不同作用的成分组成：(1)产生信号的检测探针，这里指识别分子和编码分子修饰的纳米探针；(2)与固相支持物连接的捕获探针，指含有与拟检测生物分子特异识别并结合的除识别分子以外的另外一部分结构的固体支持物；(3)靶部分，即拟检测生物分子；
当检测样品中存在的拟检测生物分子，通过加入能与该生物分子形成夹心式结合 的检测探针和捕获探针，拟检测生物分子与捕获探针、检测探针形成夹心式结构，洗脱去除杂质后通过检测能得到一个清晰的检测信号；所述识别分子可以是核酸、寡核苷酸、蛋白质、多肽等生物分子，含有或修饰有与纳米材料表面结合、组装或修饰的官能团；所述编码分子是与识别分子相对应的编码识别分子的编码分子：具体指的是含有与纳米材料表面结合、组装或修饰的官能团的有机分子，同时能被质谱仪器检测。
本发明通过表面自组装反应(技术)，把两种不同的分子修饰到同一种纳米材料上，使每一个纳米材料同时携带有两种不同的分子，一种分子是识别分子；另一种分子是编码分子。同时，编码分子的数量远远多于识别分子的数量，起到信号放大的作用。另外，可以根据识别分子和编码分子的组合得到纳米探针库。
通过现代生物技术，使用纳米探针标记，利用纳米探针中的识别分子特异性地与检测样品中的生物分子识别，通过夹心式结合把与样品中生物分子特异性识别的纳米探针固定到含有与靶部分另一部分特异识别结构的固相支持物上，然后通过这种固相支持物把与样品中生物分子特异性识别的纳米探针从检测溶液中分离出来。
将上述步骤分离出来的纳米探针进行检测。根据编码分子的检测要求，采用不同质谱仪器的进行检测，得到编码分子信号，进而判断检测样品中的生物分子情况。
本发明的制备方法中，识别分子可以是核酸、寡核苷酸、蛋白质、多肽等生物分子，含有或修饰有与纳米材料表面结合、组装或修饰的官能团。编码分子指的是与识别分子相对应的编码识别分子的分子。主要是有机分子，具有与纳米材料表面修饰的官能团，同时能被质谱仪器检测。编码分子尤其是硫醇、硫醚或二硫化物。利用该纳米探针，通过质谱仪器检测编码分子，通过质谱信号的测定值对拟检测生物分子进行定性和定量分析。样品可以是人为设计的结构，也可以是从动物或人体上采集的样本。
所述质谱仪器指的软电离质谱，尤指基质辅助激光解析—飞行时间质谱，电喷雾质谱等。
在检测编码分子时，可以直接在捕获探针的固相支持物上检测，也可以释放纳米探针到溶液中再检测，或者把编码分子从纳米探针上释放到溶液中检测。
纳米材料指的是纳米粒子，尤其指的是金纳米粒子；纳米粒子粒径在1-1000nm，尤其指10-100nm。溶剂包括各种缓冲盐溶液、有机溶剂和水，尤其指水，柠檬酸钠溶液和磷酸缓冲盐溶液。(在说明书实施例中多有选择)。
所述捕获探针的固相支持物，尤其指的是硅片和各种磁珠。固相支持物上负载了与拟检测生物分子特异识别的捕获探针，能够把检测样品中与拟检测的生物分子特异性识别并结合的纳米材料从溶液中分离出来，达到分离和纯化的目的，然后进行质谱检测。
本发明的特点及有益效果是：通过编码的纳米探针，得到编码库，实现信号的编码和放大；检测时可以直接检测整个探针，不需把编码分子从整个纳米探针上释放出来，方便了操作；质谱检测编码分子，灵敏度高、速度快、操作简便、自动化程度高，进而灵敏、精确和高通量地检测鉴定样品中的生物分子。
附图说明
图1双分子修饰纳米探针的制备示意图
图2纳米探针1中识别分子的检测：斑点试验(Spot test)
图3纳米探针1中编码分子的检测：质谱图
图4硅片作固相支持物制备捕获探针过程
图5硅片作固相支持物夹心式杂交和质谱检测示意图
图6寡核苷酸3量为1×10-6M(a)和空白(b)时，杂交后硅片的扫描电镜图
图7寡核苷酸3量为1×10-6M时，杂交后直接在硅片上质谱检测时得到的质谱图
图8寡核苷酸7量为1×10-6M时，杂交后直接在硅片上质谱检测时得到的质谱图
图9寡核苷酸3和寡核苷酸7的两重杂交检测的情况
图10硅片作固相支持物时寡核苷酸3的质谱检测限图
图11磁性粒子作固相支持物夹心式杂交和质谱检测示意图
图12磁性粒子作固相支持物时寡核苷酸3的质谱检测限图
具体实施方式
提供以下实施例是为了阐述而不是限制本申请的发明范围。
1、双分子修饰纳米探针的制备。(见附图1)
第一步，13nm左右的金纳米溶液的制备
精确称量氯金酸133.1mg，加入320ml超纯水，加热，回流。快速加入32ml含368.6mg柠檬酸钠的水溶液，继续回流15分钟，降到室温，备用。
第二步，双分子修饰金纳米探针的制备
A)、纳米探针1的制备
寡核苷酸2：(5′HS(CH2)6-A10 ATC CTT ATC AAT ATT 3′)和编码分子4([S(CH2)11(OCH2CH2)5OH]2，分子量846)修饰的金纳米粒子的制备
取识别分子1OD寡核苷酸2用200μl超纯水溶解，加入到2ml第一步制备的金纳米溶液中，24小时后加入磷酸盐缓冲溶液，使整个溶液为0.1M NaCl。继续反应36小时后加入10mM的编码分子4，反应12小时后15000rpm离心25分钟，吸去上层清液后用磷酸盐缓冲溶液2ml分散，再15000rpm离心25分钟，重复3次。最后分散于磷酸盐缓冲溶液。4℃条件下保存。
B)、纳米探针2的制备
寡核苷酸6：(5’HS(CH2)6-A10 TAA CTA TTC CTA TAT 3’)和编码分子8([S(CH2)11(OCH2CH2)6OH]2，分子量934)修饰的金纳米粒子的制备
取识别分子1OD寡核苷酸6用200μl超纯水溶解，加入到2ml第一步制备的金纳米溶液中，24小时后加入磷酸盐缓冲溶液，使整个溶液为0.1M NaCl。继续反应36小时后15000rpm离心25分钟，吸去上层清液后用磷酸盐缓冲溶液2ml分散，再15000rpm离心25分钟，重复3次。最后分散于磷酸盐缓冲溶液。加入10mM的编码分子8，反应12小时后15000rpm离心25分钟，吸去上层清液后用磷酸盐缓冲溶液2ml分散，再15000rpm离心25分钟，重复3次。最后分散于磷酸盐缓冲溶液。4℃条件下保存。
第三步，双分子修饰纳米探针的检测
首先，纳米探针1中识别分子的检测
采用斑点试验(spot-test)来检测。用寡核苷酸1(5’TAA CAA TAA TCC A10-(CH2)3SH 3′)修饰金纳米粒子，得到捕抓探针，加入或不加入目标寡核苷酸3(5′GGATTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT 3′)，进行杂交。取少量得到的溶液，点在薄层硅胶板上，如果没有加入寡核苷酸3，则可以看到红色的斑点a，说明没有形成夹心式结构，也就是没有杂交。如果加入寡核苷酸3，则可以看到蓝色的斑点b，说明夹心式杂交发生了，引起金纳米粒子的集聚，所以发生颜色变化。把加入寡核苷酸3的溶液加热到75℃，5分钟，趁热点在薄层板上，得到红色斑点c，说明解杂交了。冷却后再点，则重新得到蓝色斑点d。证明识别分子已经组装到了金纳米粒子上，而且性质保持，同时证明双分子修饰金纳米粒子在高温下(75℃)也保持不变，说明纳米探针比较稳定。见附图2。
其次，纳米探针1中编码分子的检测
采用激光解析飞行时间质谱检测。取纳米粒子溶液，直接点在质谱仪的样品盘上，晾干后用质谱仪检测。结果得到编码分子的质谱信号，有(869，[4+Na]+；837，[4+Na-S]+；825，[4+Na-CH2CH2O]+)的峰，证明了分子4的存在，证明编码分子已经组装到纳米探针上了，见附图3。
2、以硅片为固相支持物的捕获探针的制备(见附图4)
A)、寡核苷酸1(5’TAA CAA TAA TCC A10-(CH2)3SH 3′)修饰的硅片
具体操作如下：硅片用浓硫酸∶双氧水＝3∶1处理，纯水清洗，用N-(20-胺基乙基)-3-胺基丙基三甲氧基硅烷修饰硅羟基，再用偶联剂琥珀酰亚胺-4-[马来酰亚胺苯基]叔丁酸酯修饰胺基，最后通过巯基和马来酰亚胺双键的化学反应把寡核苷酸1固定在硅片上。得到以硅片为固相支持物的捕获探针。
B)、寡核苷酸5(5’CAT ACT AAC ATA A10-(CH2)3SH 3’)修饰的硅片
方法同寡核苷酸1修饰的硅片制备
C)、寡核苷酸1和寡核苷酸5同时修饰的硅片
方法同上，只是最后固定寡核苷酸的时候，把两种寡核苷酸一起加到硅片上反应。
3、夹心式杂交(见附图5)
A)、寡核苷酸3(5′GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GAT 3′)的杂交
先把寡核苷酸3(1×10-6M)的溶液加到寡核苷酸1修饰的硅片上，杂交3小时，磷酸盐缓冲溶液洗涤一次，吹干。然后把制备的纳米探针1加到该硅片上，杂交2小时。磷酸盐缓冲溶液洗涤3次。这样就杂交好了，把杂交好的硅片进行下一步质谱检测。同时，作对比试验，不加入寡核苷酸3，进行同样操作，得到空白的硅片，一起进行检测。
B)、寡核苷酸7(5’TAT GTT AGT ATG ATA TAG GAA TAG TTA 3’)的杂交
操作同上，得到杂交好的硅片进行下一步质谱检测。同时，作对比试验，不加入寡核苷酸7，进行同样的操作，得到空白的硅片，一起进行检测。
C)、寡核苷酸3和寡核苷酸7的两重杂交
操作同上，分为单独加入寡核苷酸3或寡核苷酸7或同时加入寡核苷酸3和寡核苷酸7时三种情况，但是纳米探针1和纳米探针2则均是一起加入。并作对比试验，不加入寡核苷酸3和寡核苷酸7，进行同样的操作，得到空白的硅片，一起进行检测。
4、检测
A)、通过扫描电镜检测寡核苷酸3杂交的情况，见图6。可以看到没有寡核苷酸3的硅片表面几乎没有金纳米粒子(图6a)，而有寡核苷酸3条件下捕抓硅片表面金纳米粒子密度非常大(图6b)。证明识别分子已经识别了拟检测的分子，通过固相支持物把形成夹心式杂交的探针从溶液中分离出来，从而进行下一步检测，检测编码分子。
B)、通过基质辅助激光解析飞行时间质谱检测(见附图5)。
①寡核苷酸3的检测
通过基质辅助激光解析飞行时间质谱仪检测。结果，没有寡核苷酸3的硅片没有检测到编码分子4的离子信号，有寡核苷酸3的硅片则得到强度很大的编码分子4的离子信号(885，[4+K]+；869，[4+Na]+)，结果见附图7。
②寡核苷酸7的检测
结果类似寡核苷酸3的结果，得到强度很大的编码分子8的离子信号(957，[8+Na]+；925，[8+Na-S]+)，见附图8。
③寡核苷酸3和寡核苷酸7的两重杂交检测(见附图9)
单独加入寡核苷酸3或寡核苷酸7时，分别只得到对应的编码分子4(图9b，869，[4+Na]+；837，[4+Na-S]+；825，[4+Na-CH2CH2O]+)或8(图9c，957，[8+Na]+；925，[8+Na-S]+)的离子信号。
同时加入寡核苷酸3和寡核苷酸7时，同时得到编码分子4和8的离子信号(图9d，957，[8+Na]+；925，[8+Na-S]+；913，[4+8+2Na]2+；869，[4+Na]+；837，[4+Na-S]+)
对比试验，不加入寡核苷酸3和寡核苷酸7，则没有相应的离子信号(图9a)。
5.考察了不同浓度的寡核苷酸3条件下编码分子4的检测信号情况，检测限可以达到100pM。见附图10。
6、以磁性粒子为固相支持物的捕获探针的制备
表面胺基官能化的磁性粒子(2.8μm，聚苯乙烯包裹)，用偶联剂琥珀酰亚胺-4-[马来酰亚胺苯基]叔丁酸酯修饰胺基，然后通过巯基和马来酰亚胺双键的化学反应把寡核苷酸1固定在磁性粒子上。得到以磁性粒子为固相支持物的捕获探针3。
7、以磁性粒子为固相支持物的杂交，见附图11
把不同浓度的寡核苷酸3(1×10-6M，1.0×10-8M，1.0×10-10M，1.0×10-12M，1.0×10-14M)的溶液加到以磁性粒子为固相支持物的捕获探针溶液中，杂交3小时，磷酸盐缓冲溶液洗涤一次。然后把1中制备的纳米探针1加到磁性粒子溶液上，杂交2小时。磷酸盐缓冲溶液洗涤6次。得到杂交后的磁性粒子等进行下一步检测。同时，作对比试验，不加入寡核苷酸3，进行同样的操作，得到空白的磁性粒子。
8、质谱检测
把杂交后的磁性粒子，通过碱性和加热的方法解离出杂交的纳米探针1，分离除去磁性粒子，剩下的溶液用基质辅助激光解析飞行时间质谱检测，检测编码分子，加基质2，4，6-三羟基苯乙酮或不加，从检测得到的编码分子4离子信号(869，[4+Na]+；837，[4+Na-S]+)存在与否及信号强弱，从而判断寡核苷酸3的存在与否和数量。在1.0fM的寡核苷酸3存在下，还能检测到编码分子4的信号，见图12。没有加入寡核苷酸3的没有检测到编码分子的信号。
Claims (7)
1.一种制备双分子修饰纳米探针的方法，其特征是其中一种分子是识别分子，另一种分子是编码分子；得到的两种分子修饰的纳米探针通过夹心式结合的方式检测生物分子；
所述夹心式结合指的是核酸夹心式杂交法、双抗体夹心法或双抗原夹心法构成的夹心式结合，夹心式结合由三种不同作用的成分组成：(1)产生信号的检测探针，这里指识别分子和编码分子修饰的纳米探针；(2)与固相支持物连接的捕获探针，指含有与拟检测生物分子特异识别并结合的除识别分子以外的另外一部分结构的固体支持物；(3)靶部分，即拟检测生物分子：
当检测样品中存在的拟检测生物分子，通过加入能与该生物分子形成夹心式结合的检测探针和捕获探针，拟检测生物分子与捕获探针、检测探针形成夹心式结构，洗脱去除杂质后通过检测能得到一个清晰的检测信号；所述识别分子为核酸、寡核苷酸、蛋白质或多肽，含有或修饰有与纳米材料表面结合、组装或修饰的官能团；所述编码分子是与识别分子相对应的编码识别分子的编码分子：具体指的是硫醇、硫醚或二硫化物，所述的编码分子同时能被质谱仪检测。
2.如权利要求1中所述制备双分子修饰纳米探针的方法，其特征是质谱检测的方法指的软电离质谱。
3.如权利要求2中所述制备双分子修饰纳米探针的方法，其特征是质谱检测的方法指基质辅助激光解析飞行时间质谱或电喷雾质谱。
4.如权利要求1中所述制备双分子修饰纳米探针的方法，其特征是检测编码分子时，直接通过捕获探针的固相支持物检测，或者释放纳米探针到溶液中再检测，或者把编码分子从纳米探针上释放到溶液中检测。
5.如权利要求1中所述制备双分子修饰纳米探针的方法，其特征是纳米材料指的是纳米粒子，纳米粒子粒径在1-1000nm。
6.如权利要求5中所述制备双分子修饰纳米探针的方法，其特征是纳米材料指的是金纳米粒子：金纳米粒子粒径在10-100nm。
7.如权利要求1中所述制备双分子修饰纳米探针的方法，其特征是捕获探针的固相支持物是硅片或各种磁珠，固相支持物上负载了能拟检测生物分子特异识别的捕获探针，这样，就可以利用固体支持物把形成了夹心结构的纳米探针从溶液中分离出来，达到分离和纯化的目的，进行质谱检测。
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