CN116144734A - 甲基化转化组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本文提供了甲基化转化组合物，包括亚硫酸氢盐和保护剂，其中所述保护剂包括碳酸乙烯酯。本文还提供了包括该甲基化转化组合物的甲基化转化试剂盒。本文提供的基于重亚硫酸盐的转化组合物或试剂盒，衔接甲基化建库试剂盒，可完成甲基化测序文库的构建。本文提供的甲基化转化组合物能够很好地改善高投入量样本下低GC覆盖较差的情况，使得测序数据利用率较高。本文提供的试剂盒采用磁珠纯化方案，还能够实现自动化应用方案。

Description

甲基化转化组合物及其应用
技术领域
本文涉及甲基化转化组合物，尤其是其中包括碳酸乙烯酯的甲基化转化组合物。本文还涉及该甲基化转化组合物在DNA甲基化检测中的应用。
背景技术
甲基化修饰是一种重要的表观遗传学修饰方式，承载着大量的生物学信息。一般的测序技术只能区分ATCG四种碱基序列，不能区分甲基化或未发生甲基化修饰的C碱基。1992年，Frommer将重亚硫酸盐处理结合测序进行DNA甲基化检测(Bisulfite Sequencing，BS-seq)，通过化学方法将未发生甲基化修饰的胞嘧啶转化成尿嘧啶，测序后未发生甲基化修饰的C碱基读为T碱基，发生甲基化修饰的C碱基保持不变，检测基因组中发生甲基化修饰的C碱基水平，BS-seq成为甲基化测序的金标准。基于亚硫酸盐转化的甲基化二代测序技术主要包括全基因组亚硫酸盐测序(Whole genome Bisulfite Sequencing，WGBS)、简化型亚硫酸盐测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing，RRBS)、基于多重PCR扩增的靶向甲基化测序技术(Target Bisulfite Sequencing，TBS)和基于液相杂交捕获靶向甲基化检测技术等。这些测序技术均需要借助转化模块，才能够完成相应甲基化文库的构建。
目前市面上基于重亚硫酸盐原理的转化试剂盒种类较多，Zymo的EZ DNAMethylation GoldTM Kit和Qiagen的EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit都是比较成熟的商品化产品。这些产品主要基于柱纯化的方式进行转化，转化流程较为繁琐，转化时间较长。随着表观遗传学技术的发展，甲基化检测技术在癌症早筛早诊领域发挥着越来越重要的作用，对于转化模块的便捷性以及操作灵活性提出了更高的要求。
市面上主流的重亚硫酸盐转化模块主要采用柱纯化方案，转化流程较为繁琐，转化时间较长，对样本损伤较为严重，复杂区域转化不完全。随着NGS测序技术的发展，自动化工作站已经完全能够替代人工操作，完成常规DNA文库构建流程，但是基于亚硫酸盐转化的甲基化二代测序技术流程较为繁琐，目前尚未完全实现自动化。主流的柱纯化亚硫酸氢盐转化需要借助离心机才能够完成整个实验流程，因此此种转化方案是限制甲基化测序文库落地自动化工作站的主要限制因素。
发明内容
在一方面，本文提供了甲基化转化组合物，包括亚硫酸氢盐和保护剂，其中所述保护剂包括碳酸乙烯酯。
在一些实施方案中，以重量计，碳酸乙烯酯在所述甲基化转化组合物中的含量为5-10％，优选5％。
在一些实施方案中，所述亚硫酸氢盐在所述甲基化转化组合物中的浓度为4-9M，优选4.5-6.3M，更优选5.25M。
在一些实施方案中，所述亚硫酸氢盐选自亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵及其组合，优选亚硫酸氢钠与亚硫酸氢铵的组合。
在一些实施方案中，所述甲基化转化组合物的pH值为4.9-5.5。
在一些实施方案中，所述保护剂还包括0.1M水溶性维生素E和/或0.2M盐酸胍和/或2-2.5mM对苯二酚。
另一方面，本文提供了甲基化转化试剂盒，其包括上述甲基化转化组合物。
在一些实施方案中，所述甲基化转化试剂盒还包括磁珠纯化试剂和/或脱磺酸试剂和/或洗脱试剂。
在一些实施方案中，所述磁珠纯化试剂包括磁珠和磁珠结合缓冲液，所述磁珠优选Bis-Beads；所述结合缓冲液包括30-50％(wt)PEG、1.0-2.0M的NaCl和0.2M的Tris-HCl，pH 5.0。
在一些实施方案中，所述脱磺试剂包括2.8-3.6M的NaOH、1.2-1.5M的Tris-HCl和0.2M的EDTA，pH为13-14。
在一些实施方案中，所述洗脱试剂为去离子水。
另一方面，本文提供了对DNA分子进行甲基化转化的方法，包括让所述DNA分子与上述甲基化转化组合物接触或者使用上述甲基化转化试剂盒。
在一些实施方案中，所述接触指的是75℃转化，时间40min。
在一些实施方案中，所述甲基化转化包括将所述DNA分子置于所述甲基化转化组合物中，并且于95℃处理10min，于75℃处理40min。
本文提供的基于重亚硫酸盐的转化组合物或试剂盒，衔接甲基化建库试剂盒，可完成甲基化测序文库的构建。本文提供的试剂盒采用磁珠纯化方案，能够实现自动化应用方案。创新的磁珠产品能够对转化文库实现最大程度的抓取，回收效率相较SPRI Beads系列至少提高60％。特殊的磁珠脱磺技术，避免了重复移液带来的损失。此外，转化试剂能够很好地改善高投入量样本下低GC覆盖较差的情况，使得测序数据利用率较高。试剂盒适用于10-1000ng样本转化，文库转化率达到99％以上，整个转化试剂盒操作时长不超过2h。
附图说明
图1为甲基化转化过程中的C-T转化示意图。
图2显示了甲基化转化的化学步骤。
图3为本文实施例实验操作的流程示意图。
图4显示了保护剂测试结果。A：文库产出；B：Lambda DNA CpG Conversion，LambdaDNA CpG区域中C碱基转化效率，该参数大于99％表明转化率合格，使用该参数评估转化效率。C：GC覆盖度，人全基因组中不同GC区域偏好性分析。横坐标代表GC含量的百分比；左纵坐标表示均一化的测序深度；右纵坐标表示不同GC百分比的碱基数。
图5显示了以靶向甲基化文库评估转化试剂的转化效率结果。A和B：未加入保护剂的人源DNA不同CHG和CHH位点的甲基化水平。C和D：加入保护剂的人源DNA不同CHG和CHH位点甲基化水平。注：人源DNA CHG和CHH中C碱基均未发生甲基化修饰，C碱基甲基化水平＜1％，若该参数远高于1％，表明转化试剂转化不完全。
图6显示了不同pH值脱磺酸试剂测试结果。A：文库产出。B：Lambda DNA CpGConversion，Lambda DNA CpG区域中C碱基转化效率。Lambda DNA基因组中所有C碱基均未发生甲基化修饰，使用该参数评估转化效率。C：GC覆盖度，人DNA全基因组中GC含量偏好性分析。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
除非上下文明确地另外指出，术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
术语“包含”或“包括”指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。
“甲基化转化”在本文中指将DNA分子中的未甲基化胞嘧啶(C)进行脱氨基处理，转变为尿嘧啶(U)，而甲基化胞嘧啶(C)在该过程中保持不变。图1示意性显示了该甲基化转化步骤。目前已经有多种方法可以进行甲基化转化，本文尤其关注并采用重亚硫酸盐进行该转化。重亚硫酸盐转化过程如图2所示，大体包括磺化、脱氨和脱磺过程。样本DNA中的胞嘧啶在使用重亚硫酸盐处理时，会发生脱氨基反应，最终从胞嘧啶(C)转换成尿嘧啶(U)；如果胞嘧啶发生了5mC甲基化修饰，这个转换则无法发生，处理之后仍然是胞嘧啶。经重亚硫酸盐转化过的DNA，再经过PCR扩增，PCR新合成出来的链，对应U碱基的位置就会被替换成了“T”。
“甲基化转化组合物”指用于上述甲基化转化目的的组合物，其中包括重亚硫酸盐，并优选地，还包括保护剂。
“重亚硫酸盐”，也称为“亚硫酸氢盐”，在本文中指可以与非甲基化胞嘧啶进行磺化反应的试剂，例如NaHSO3、Mg(HSO3)2、NH4HSO3等。“重亚硫酸盐”还包括不同重亚硫酸盐形成的混合物(或混合溶液)，例如包括NaHSO3和NH4HSO3的溶液。
“保护剂”在本文中指在甲基化转化过程中降低DNA损伤(如断链)的试剂或试剂组合。本领域已知的保护剂包括水溶性维生素E和对苯二酚等。
“磁珠纯化试剂”在本文中指能够吸附DNA分子的磁珠和适用于该吸附过程的磁珠结合缓冲液。例如，常用的分离或纯化DNA分子的磁珠包括基于SPRI(Solid PhaseReversible Immobilization)技术的商品化磁珠。DNA在一定浓度的PEG以及NaCl或MgCl2时，DNA分子构象会发生变化，暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团，与表面带负电荷的羧基磁珠结合。目前认为这种负负电荷间的作用是由于带正电荷的盐离子的作用(如Na+)。带负电磷酸基团借由解离的盐离子(如Na+)与羧基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。在一个实施方案中，所用的磁珠结合缓冲液包括30-50％(wt)的PEG、1.0-2.0M的NaCl和0.2M的Tris-HCl，pH 5.0左右。
“脱磺试剂”本文中指用于甲基化转化过程中形成的5，6二氢尿嘧啶-6-磺酸盐(见图2)脱去磺酸基的试剂。在一个实施方案中，脱磺试剂包括2.8-3.6M的NaOH、1.2-1.5M的Tris-HCl和0.2M的EDTA，pH为13-14。
“甲基化转化试剂盒”在本文中指用于甲基化转化的试剂或组合物组合，这些试剂可以在同一个包装盒(或包装物)中提供，也可以在分开的包装盒(或包装物)中提供。在一个实施方案中，本文提供的甲基化转化试剂盒包括上述甲基化转化组合物，以及磁珠纯化试剂、脱磺试剂和洗脱试剂。
本发明至少部分地基于这样的发现，当采用的保护剂包括碳酸乙烯酯(例如，在甲基化转化组合物中的浓度为5-10％(wt))时，可以有效降低DNA损伤，提高转化效率，改善基因组DNA中高GC区域的测序覆盖度。
本文提供的甲基化转化试剂盒搭配磁珠纯化操作，弥补了柱式纯化不能兼容自动化工作站的弊端。
本文提供的甲基化转化试剂盒可以与甲基化建库试剂盒组合使用，通过构建甲基化文库，评估转化模块的转化效率。
本文涉及的甲基化文库构建及测序实验流程可参见图3。
甲基化文库的构建：基因组DNA使用超声打断的方式，打断至200-250bp的DNA片段；使用
Figure BDA0004092903360000041
甲基化文库构建试剂盒(for/>
Figure BDA0004092903360000042
)#1002141构建甲基化文库。对打断后的基因组DNA进行末端修复&加A、甲基化接头连接，接头连接产物的转化。该连接产物作为以下实施例中的DNA文库进行转化，转化产物进行PCR扩增，PCR扩增循环数均为11，扩增产物进行磁珠纯化，纯化产物送Illumina Nova-Seq测序仪进行全基因组测序。
甲基化液相杂交捕获：使用
Figure BDA0004092903360000051
Hybrid Capture Reagents#1005102进行杂交捕获，操作步骤依次是甲基化文库真空浓缩，链霉亲和素磁珠捕获与文库洗脱，洗脱完毕进行PCR扩增，扩增产物进行磁珠纯化，纯化产物送IlluminaNova-Seq测序仪进行测序。
实施例1提高文库转化率的保护剂
重亚硫酸氢缓冲液转化时会给样本DNA带来较大损伤，高GC区域未发生甲基化修饰的位点容易发生断裂，发生甲基化修饰的位点容易形成发夹结构，导致DNA片段转化不完全，通过体系中加入保护剂，可解决复杂区域转化问题。
步骤一：亚硫酸氢盐转化
1.实验准备
根据上文所提到的甲基化文库构建方式，构建10ng投入量的甲基化文库。
注意：甲基化转化试剂盒中Bisulfite Reagent(重亚硫酸盐)需避光保存。
2.实验分组
根据不同的保护剂浓度，将实验分为4组(详见表1)。
表1不同实验组对应的重亚硫酸盐和保护剂的浓度
分组 组1 组2 组3 组4
碳酸乙烯酯 5％ 5％ / /
重亚硫酸钠浓度 9M 5.25M 9M 5.25M
其余组分均为本文所提供的甲基化转化试剂盒中的剩余组分，包括磁珠纯化试剂(Bis-Beads)、脱磺试剂(Desulf Buffer)和洗脱试剂(Nuclease Free Water)。
3.转化实验
27μL Bisulfite Reagent、2μL保护剂和上述甲基化文库(≤11μL)，共计40μL甲基化转化组合物，添加在200μL的低吸附离心管中，涡旋混匀，瞬时离心后置于PCR仪上进行反应，此时碳酸乙烯酯和重亚硫酸钠终浓度如表1所示，转化程序为95℃变性10min，75℃40min。
步骤二：亚硫酸氢盐转化DNA的脱磺和纯化
1.脱磺缓冲液的配置：
Figure BDA0004092903360000052
2.脱磺与纯化
1)向步骤一的反应体系中加入160μL的Bis-Beads(即AMPure XP磁珠，Beckman)，缓慢吹吸混匀，室温孵育5min。
2)将PCR管放在磁力架上，在室温下孵化至少15min，以完全澄清溶液，移弃上清，注意勿吸到磁珠。
3)将PCR管从磁力架上移出。向每个反应体系中加入200μL的70％乙醇。用移液器将磁珠完全悬浮起来。将PCR管放在磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清，注意勿吸到磁珠。
4)将PCR管从磁力架上移出。向每个反应体系中加入200μL的脱磺缓冲液。用移液器将磁珠完全悬浮起来。将PCR管放在磁力架上，在室温下孵化5min，待溶液完全澄清后，弃上清，注意勿吸到磁珠。
5)将PCR管从磁力架上移出。向每个反应体系中加入200μL的70％乙醇。用移液器将磁珠完全悬浮起来。将PCR管放在磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清，注意勿吸到磁珠。
6)重复步骤5)。使用10μL吸头移去少量残留乙醇，注意勿吸到磁珠。
7)将PCR管放在磁力架上，打开PCR管盖，室温静置2-3min，至乙醇挥发完全。
8)将PCR管从磁力架上移出。向PCR管中加入21μL Nuclease Free Water洗脱转化产物。
结果分析：
使用加入或者不加保护试剂的转化试剂，进行甲基化文库的构建，获得对应的数据表现。对Lambda DNA和人基因组DNA进行上述处理，结果显示组2的转化产出较高(图4A)，不同分组中的Lambda DNA的转化率都合格，大于99％(图4B)，并且对于人基因组DNA，组1和组2的GC覆盖均一性较优(图4C)。组3和组4在高GC处凸出，表示文库转化不完全。原因推测是高GC区域在高温强碱条件下形成一种特殊的二级结构，不能维持反应所需的单链状态，导致转化不完全。
结论：
重亚硫酸盐转化试剂必须要达到一定的浓度，确保转化效率达到标准，但是转化试剂浓度太高会导致转化损伤，文库产量偏低，本发明人发现在转化体系中加入碳酸乙烯酯能够打开高GC区域形成的二级结构，使转化产物维持单链状态，保证高甲基化区域转化效率。
实施例2构建靶向甲基化文库评估转化试剂的转化效率
设计靶向捕获探针对感兴趣的区域进行捕获，通过检测靶区域C碱基转化效率，评估转化模块的转化效率是否合格。我们在实施例1中观察到不添加保护剂的实验组全基因组GC覆盖，偏好高GC区域。本实施例通过液相杂交捕获实验分析高GC区域的转化效率。
步骤一：文库杂交
1.实验分组
构建甲基化文库，文库构建步骤参见实施例1，构建的样本来源是100％HumanMethylated DNA与Non-Methylated DNA的混合样本(ZYMO，D5041)，构建的甲基化文库分为2组，一组添加保护剂碳酸乙烯酯，另外一组不添加该保护剂(详见表2)，构建完成的甲基化文库进行液相杂交捕获实验。
表2不同实验组对应的保护剂及其浓度
分组 组1 组2
碳酸乙烯酯 5％ /
重亚硫酸钠浓度 5.25M 5.25M
2.准备工作
具体操作步骤参照
Figure BDA0004092903360000071
Hybrid Capture Reagents#1005102试剂说明书进行。
3.真空浓缩发
具体操作步骤参照
Figure BDA0004092903360000072
Hybrid Capture Reagents#1005102试剂说明书进行。
步骤二：文库洗脱
具体操作步骤参照
Figure BDA0004092903360000073
Hybrid Capture Reagents#1005102试剂说明书进行。
步骤三：PCR扩增
具体操作步骤参照
Figure BDA0004092903360000074
Hybrid Capture Reagents#1005102试剂说明书进行。
步骤四：文库纯化和定量
具体操作步骤参照
Figure BDA0004092903360000075
Hybrid Capture Reagents#1005102试剂说明书进行。
结果分析：
本实施例使用加入或者不加保护试剂的转化试剂，进行甲基化液相杂交捕获实验，获得对应的数据表现。人源DNA CHG和CHH中C碱基均未发生甲基化修饰，C碱基甲基化水平＜1％，若该参数远高于1％，表明转化试剂转化不完全。组2(图5A和图5B)的人源DNA CHG和CHH的转化率不完全，很大一部分数值大于1％；组1(图5C和图5D)的人源DNA CHG和CHH的转化率小于1％，转化合格。表明转化试剂中加入保护剂可以提高高GC区域C碱基转化效率。
结论：
发明人推测，高GC区的复杂片段在高温强碱处理后会形成一种发夹结构，此时该片段无法维持单链状态。本文提供的保护剂能够在极端反应环境中，打开上述的特殊结构，使得样本的转化更彻底。
实施例3不同pH值脱磺酸试剂测试
步骤一：亚硫酸氢盐转化
1.准备工作
参照实施例1(与实施例1一致)。
2.实验分组
根据脱磺缓冲液配方的不同，将实验分为4组(详见表3)。
表3不同实验组对应的脱磺缓冲液pH值
分组 Desul-A Desul-B Desul-C Desul-D
NaOH 2.1M 2.5M 2.8M 3.6M
EDTA 0.2M 0.2M 0.2M 0.2M
pH值 11 12 13 14
3.转化实验
参照实施例1(与实施例1一致)。
步骤二：亚硫酸氢盐转化DNA的脱磺和纯化
1.脱磺缓冲液配置：
按照表3的分组配制脱磺缓冲液，每60μL的脱磺缓冲液中加入140μL的无水乙醇。
2.脱磺与纯化
参照实施例1(与实施例1一致)。
结果分析：
亚硫酸氢盐转化后的文库在碱性条件下去硫酸化形成尿嘧啶，本实施例对同一条件下转化的甲基化文库进行纯化回收，采取不同pH值的脱磺酸溶液，获得对应的数据表现。相同试验条件下，Desul-C的转化产出最高(图6A)。所有分组的转化率都合格(图6B)。所有分组的GC覆盖情况基本一致(图6C)。
结论：
在碱性条件下去硫酸化(脱磺基)，在这个过程中5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。高温强碱转化条件对样本造成的损伤比较严重，此环节考虑转化效率的前提条件下，回收效率越高越好。本次测试条件下转化率都达标，根据回收率越高越优的原则选择：脱磺缓冲液pH值范围为：13-14。
本文提供的甲基化转化组合物的优点包括但不限于，
1.所需的转化时间短。例如，Zymo的EZ DNA Methylation GoldTM Kit的转化时长2.5h，而本转化模块的转化时长只需50min，大大节约了时间成本。
2.适用于自动化工作站。市面上大都采用的是柱层析进行脱磺与纯化，它的局限性就是必须搭配离心机进行纯化，不适用于自动化工作站，一旦样本数量巨大，其操作繁琐，极易出现操作失误。本文提供的转化组合物或试剂盒创新使用磁珠替代柱层析进行脱磺与纯化步骤，回收率高，且能够与自动化工作站灵活搭配使用，操作简便，实验结果准确，避免了由于手动操作造成的误差。
3.降低DNA损伤和优化高GC区域覆盖度。绝大多数试剂在处理高投入量样本时，对高GC区域低甲基化修饰区域转化损伤较为严重或者高甲基化区域转化不完全，导致高GC区域转化不完全或者覆盖度较差，本文提供的转化试剂转化损伤较小，同时转化试剂加入保护剂，确保复杂结构维持单链状态，确保转化完全，有效解决高GC区域转化不完全或者覆盖度较差的问题，提高原始样本信息利用率。

Claims (10)

1.甲基化转化组合物，包括亚硫酸氢盐和保护剂，其中所述保护剂包括碳酸乙烯酯；优选地，所述保护剂还包括0.1M水溶性维生素E和/或0.2M盐酸胍和/或2-2.5mM对苯二酚。
2.如权利要求1所述的甲基化转化组合物，其中，以重量计，碳酸乙烯酯在所述甲基化转化组合物中的含量为5-10％，优选5％。
3.如权利要求1或2所述的甲基化转化组合物，其中，所述亚硫酸氢盐在所述甲基化转化组合物中的浓度为4-9M，优选4.5-6.3M，更优选5.25M。
4.如权利要求1或2所述的甲基化转化组合物，其中所述亚硫酸氢盐选自亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵及其组合，优选亚硫酸氢钠与亚硫酸氢铵的组合。
5.如权利要求1或2所述的甲基化转化组合物，其pH值为4.9-5.5。
6.甲基化转化试剂盒，包括权利要求1-5任一项所述的甲基化转化组合物。
7.如权利要求6所述的甲基化转化试剂盒，还包括磁珠纯化试剂和/或脱磺酸试剂和/或洗脱试剂；
优选地，所述磁珠纯化试剂包括磁珠和磁珠结合缓冲液，所述磁珠优选Bis-Beads；所述结合缓冲液包括30-50％(wt)PEG、1.0-2.0M的NaCl和0.2M的Tris-HCl，pH 5.0；
优选地，所述脱磺试剂包括2.8-3.6M的NaOH、1.2-1.5M的Tris-HCl和0.2M的EDTA，pH为13-14；
优选地，所述洗脱试剂为去离子水。
8.对DNA分子进行甲基化转化的方法，包括让所述DNA分子与权利要求1-5任一项所述的甲基化转化组合物接触或者使用权利要求6或7所述的甲基化转化试剂盒。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述接触指的是75℃转化，时间40min。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述甲基化转化包括将所述DNA分子置于所述甲基化转化组合物中，并且于95℃处理10min，于75℃处理40min。
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