TW201315813A - 測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。所述方法包括：對待測樣本中片段化的、源自基因組的DNA雙鏈核酸片段末端添加接頭，並進行富集；用核酸晶片對含接頭的DNA雙鏈核酸片段進行捕獲，將捕獲的片段在高通量測序平臺進行測序。基於已知的基因位點訊息，對測序結果進行分析，可快速、高通量地得到樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列，從而用於例如單基因病的檢測。本發明還提供了可用於所述方法的、固定有數種至數萬種疾病特異性探針的核酸晶片，以及包含所述晶片的試劑盒。

Description

測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法
本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。所述方法包括：設計具有多種疾病特異性探針晶片、對帶有接頭的特異性目的DNA片段進行捕獲和富集、高通量測序、分析基因突變位訊息等步驟。
多種模式生物基因組測序工作的完成，極大地提高了人們在基因水平對疾病致病機理和機體生理狀態的認識，也極大地促進了第二代高通量測序技術的發展。目前完成基因組組測序的生物有：人、小鼠、大鼠、果蠅、水稻、大豆、擬南芥等。然後由於受到測序成本的限制，對個體進行基因組測序和疾病相關基因的鑒定和分析遠不能滿足日益發展的需要。
單基因病是由一對等位基因控制的疾病或病理性狀，又稱孟德爾遺傳病或單基因遺傳病。目前已經發現的單基因病有6000多種，其中表型已知而分子基礎未知的疾病有1700多種，而由於遺傳異質性，表型和致病分子基礎均已知的單基因病(約2900多種)中，還有很多的亞型未被發現。基因是位於染色體上的遺傳單位，染色體有常染色體和性染色體之分，基因也有顯性基因與隱性基因之別，因此位於不同染色體上的致病基因具有不同的遺傳方式。通常，單基因病可分為常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、X伴性顯 性遺傳病、X伴性隱性遺傳病、Y伴性遺傳病等幾類。
單基因病的檢測方法目前主要基於第一代測序技術，主要為以下幾種：系譜分析、染色體核型分析、酶促反應及活性測定、RALF、SSCP(單鏈構象多態性)、MOLDI-TOF、FISH(螢光原位雜交)、a-CGH(a-比較基因組雜交)、qPCR、MLPA(多重連接探針擴增)、Sanger法等。上述方法中存在諸多缺點，比如：系譜分析、染色體核型分析、酶促反應活性測定方法和FISH法分析方法都是染色體水平的檢測，準確性較低；RALF、SSCP和MOLDI-TOF分析方法是間接檢測方法，不能直接反映位點的變化；a-CGH、qPCR、MLPA只能針對特定位點，不能對新發現的突變位點進行檢測，並且以上方法的測序通量都很小，且要先經過PCR擴增過程。因此，雖然以Sanger法為基礎的第一代測序技術是目前單基因病檢測的金標準，但是由於同時測序的樣本數很少，檢測的單基因病種類有限，僅限於一種或幾種，測序成本高昂，不能對多種已知分子基礎的單基因病進行同時檢測，大大限制了個體基因病的鑒定。
目前本領域尚缺乏有效的測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。因此，迫切需要基於已知的多種疾病的基因訊息，開發檢測個體化樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的新方法。
本發明的目的之一是提供一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法及其應用。
本發明的另一目的是提供一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的試劑盒。
在本發明的第一方面，提供了一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法，包括步驟：a.提供一待檢測樣本，所述樣品含有經打斷的、源自基因組的DNA雙鏈核酸片段，並且所述DNA雙鏈核酸片段具有平末端；b.對於上一步驟的所述DNA雙鏈核酸片段，在末端添加接頭連接序列；並且通過所述接頭連接序列，在所述DNA雙鏈核酸片段的兩端添加接頭，其中所述接頭具有引子結合區以及連接互補區，所述的連接互補區與所述的接頭連接序列互補；c.對步驟b獲得的帶有接頭的DNA雙鏈核酸片段，用第一引子和第二引子進行PCR擴增，從而獲得第一PCR擴增產物的混合物，其中所述的第一引子和第二引子具有對應於所述接頭的引子結合區的接頭結合區，以及位於接頭結合區外側的測序探針結合區；d.對所述的第一PCR擴增產物的混合物進行單鏈化，並用封閉分子封閉位於所述PCR擴增產物兩端的、對應於第一引子和第二引子的區域，從而獲得兩端被封閉的單鏈PCR擴增產物的混合物；e.用核酸晶片，從所述的經封閉的單鏈PCR擴增產物的混合物中，捕獲疾病相關的核酸分子；f.對上一步驟中經捕獲的核酸分子，用第三引子和第四引子進行PCR擴增，從而獲得第二PCR擴增產物的混合物，其中第三引子和第四引子分別特異性對應於或結合於所述的第一引子和第二引子；g.對上一步驟獲得的第二PCR擴增產物的混合物進行測序，從 而獲得所述待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
在另一較佳例中，步驟g中將所述的第二PCR擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，並進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；然後對所述測序簇用「邊合成-邊測序」法進行測序，從而得到所述待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
在另一較佳例中，步驟a的所述經打斷的、源自基因組的DNA雙鏈核酸片段長度為100-1000bp或者平均長度為800-1000bp。
在另一較佳例中，所述片段長度為150-500bp，較佳地為200-300bp。
在另一較佳例中，所述DNA雙鏈核酸片段具有的平末端是通過末端修復的方法製備。
在另一較佳例中，步驟b中的接頭連接序列為poly(N)n，其中各個N分別獨立地選自A、T、G或C，n為選自1-20的任一正整數。
在另一較佳例中，所述的接頭連接序列為poly(A)n，其中n為1-20的正整數，較佳地n=1-2。
在另一較佳例中，步驟b中所述的接頭連接互補區序列為poly(N’)m，其中各個N’分別獨立地選自A、T、G或C，m為1-20的正整數，並且poly(N)n和poly(N’)m為互補序列。
在另一較佳例中，m為選自1-3的任一正整數。
在另一較佳例中，所述的接頭連接互補區的長度與所述接頭連接序列的長度相同，即poly(N)n和poly(N’)m為完全互補序列。
在另一較佳例中，所述的接頭連接互補區為poly(T)m，其中m為1-20的正整數，較佳地m=1-2。
在另一較佳例中，步驟c中所述的第一引子和第二引子為長度30-80bp的寡核苷酸。
在另一較佳例中，第一引子和第二引子長度為55-65bp。
在另一較佳例中，所述的第一引子和第二引子是不同的，和/或所述的第三引子和第四引子是不同的。
在另一較佳例中，步驟d所述的封閉分子封閉第一PCR擴增產物中對應於第一引子和第二引子的70%-100%區域。
在另一較佳例中，步驟d中所述的封閉分子封閉第一PCR擴增產物中對應於第一引子和第二引子的100%區域。
在另一較佳例中，步驟e中所述的核酸晶片上固定有5-200,000種對應於所述疾病的特異性探針。
在另一較佳例中，步驟e中所述核酸晶片上特異性探針的種類為50-150,000種，更佳地500-100,000種，最佳地5000-80,000種。
在另一較佳例中，所述特異性探針的序列對應於疾病致病基因的以下區域：外顯子和/或外顯子前後兩端200bp。
在另一較佳例中，所述特異性探針的長度為20-120mer，較佳地，50-100mer，更佳地，60-80mer。
在另一較佳例中，所述特異性探針為全人工合成或體外克隆合成。
在另一較佳例中，步驟f所述的第三引子和第四引子分別特異性結合於所述的第一引子和第二引子的外側，並且長度小於第一引子和第二引子。
在另一較佳例中，所述的第三引子和第四引子長度為15-40bp， 較佳地為20-25bp。
在另一較佳例中，所述待檢測樣本來源於人、動物、植物，或微生物。
在另一較佳例中，所述待檢測樣本來源於人或非人哺乳動物，較佳地，來源於人。
在另一較佳例中，所述待檢測樣本含有人基因組DNA。
在另一較佳例中，所述疾病為孟德爾單基因病。
在另一較佳例中，所述疾病選自下組：家族性腺瘤樣息肉病、軟骨發育不良、家族性高膽固醇血症、多指畸形、馬凡綜合症、遺傳性舞蹈病、禿髮、苯丙酮尿症、胱氨酸尿症、遺傳性高度近視、抗D佝僂病、遺傳性腎炎、血友病、地中海貧血、節性腦硬化綜合症、杜氏肌營養不良、進行性肌營養不良、多囊腎綜合症、性別決定基因突變所致的性反轉，或其組合。
在本發明的第二方面，提供了一種可用於本發明第一方面所述方法的、用於測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的試劑盒，所述試劑盒包括：(1)第一容器以及位於容器內的核酸晶片；(2)第二容器以及位於容器內的接頭；(3)第三容器以及位於容器內的選自下組的引子：(a)第一引子和/或第二引子；或(b)第三引子和/或第四引子；(4)第四容器以及位於容器內的封閉分子；(5)檢測說明書。
在另一較佳例中，所述試劑盒還包括任選自下組的試劑：用於 進行PCR擴增所需的試劑、用於進行封閉反應所需的試劑、用於進行雜交反應所需的試劑、或其組合。
在另一較佳例中，所述疾病為孟德爾單基因病。
在另一較佳例中，所述疾病選自下組：家族性腺瘤樣息肉病、軟骨發育不良、家族性高膽固醇血症、多指畸形、馬凡綜合症、遺傳性舞蹈病、禿髮、苯丙酮尿症、胱氨酸尿症、遺傳性高度近視、抗D佝僂病、遺傳性腎炎、血友病、地中海貧血、節性腦硬化綜合症、杜氏肌營養不良、進行性肌營養不良、多囊腎綜合症、性別決定基因突變所致的性反轉，或其組合。
在另一較佳例中，所述的核酸晶片上固定有選自下組的一個或多個探針：探針1：序列如SEQ ID NO：7所示，捕獲位置112073411，檢測家族性腺瘤樣息肉；探針2：序列如SEQ ID NO：8所示，捕獲位置51479999，檢測多囊腎綜合症；探針3：序列如SEQ ID NO：9所示，捕獲位置135766620，檢測節性腦硬化綜合症；探針4：序列如SEQ ID NO：10所示，捕獲位置103231969，檢測苯丙酮尿症；探針5：序列如SEQ ID NO：11所示，捕獲位置48700368，檢測馬凡綜合症；探針6：序列如SEQ ID NO：12所示，捕獲位置31137199，檢測杜氏肌營養不良。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或較佳的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次建立了一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。具體而言，本發明人根據現有疾病基因的訊息，設計了固定有多種疾病特異性探針的核酸晶片；對待測樣本中片段化的、源自基因組的DNA雙鏈核酸分子的末端添加接頭，並進行富集；用核酸晶片對含接頭的DNA片段進行捕獲，將捕獲的片段在高通量測序平臺進行測序，基於已知的基因位點訊息，對測序結果進行分析，得到樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
術語
本文所用，術語「含有」包括「具有(comprise)」、「基本上由...構成」和「由...構成」的含義。
單基因病
如本文所用，「單基因病」一詞是指由一對等位基因控制的疾病或病理性狀，又稱孟德爾遺傳病，可以分為常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、X伴性遺傳病、Y伴性遺傳病。
常染色體顯性遺傳病致病基因定位於常染色體上，常見的亞 型：完全顯性：正常純合子和雜合子患者在表型上無差異；不完全顯性：雜合子表現介於顯性純合子患者和正常人之間，常表現為輕病型；不規則顯型：由於某種原因可使雜合子的顯性基因不表現出相應的症狀；共顯性：等位基因之間無顯性與隱性之分，在雜合體時都能表現兩種基因作用；延遲顯性：雜合子在生命早期顯性基因不表達，待到某一年齡後才表達；從性顯性：雜合子的表達受性別的影響，在某一性別表達出相應的表現型，在另一性別不表達相應表現型。常染色體隱性遺傳病的常染色體上的致病基因在雜合狀態時不表現相應的疾病，而只在純合子時才致病。定位於X染色體上的致病基因隨X染色體而遺傳疾病，包括X連鎖顯性遺傳和X連鎖隱性遺傳。定位於Y染色體上的致病基因隨Y染色體而遺傳疾病。
適用於本發明檢測方法的單基因病包括但不限於：家族性腺瘤樣息肉病、軟骨發育不良、家族性高膽固醇血症、多指畸形、馬凡綜合症、遺傳性舞蹈病、禿髮、苯丙酮尿症、胱氨酸尿症、遺傳性高度近視、抗D佝僂病、遺傳性腎炎、血友病、地中海貧血、節性腦硬化綜合症、杜氏肌營養不良、進行性肌營養不良、多囊腎綜合症、性別決定基因突變所致的性反轉，或其組合。
外顯子
如本文所用，「外顯子」一詞是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA對應於基因中的部分。內含子是在mRNA加工過程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。外顯子和內含子都是對於基因而言的，編碼的部分為外顯子，不編碼的為內含子， 內含子沒有遺傳效應。
探針
如本文所用，「探針」一詞是指能夠檢測互補核酸序列的簡單DNA或RNA分子。探針必須是純淨的，而且不受其他不同序列核酸的影響。典型的探針是克隆的DNA序列或通過PCR擴增獲得的DNA，人工合成的寡核苷酸或從體外轉錄克隆DNA序列後獲得的RNA，也可以作為探針。探針長度可以從20-120mer，較佳地50-100mer，更佳地60-80mer。探針設計和合成方法為本領域具有通常知識者所熟知，根據單基因病的已知的致病基因的外顯子及其前後兩端序列(較佳地前後200bp左右)，可以設計探針。在一個較佳例中，探針長度50-80mer。可以使用人工化學合成法合成的探針或使用市售探針。典型的探針序列見表4。
晶片
如本文所用，「晶片」一詞是指可以採用微加工技術在晶片的基底材料上加工出多種微細結構，施加必要的生物化學物質並進行表面處理，將多個探針分子與表面固定化，制得含有大量探針的基底材料。
本領域具有通常知識者可以使用通用的方法獲得晶片。DNA晶片製備方法通常有4種。第1種是光引導原位合成法，在微加工技術中用微影(photolithography)工藝與光化學合成法相結合。第2種方法是化學噴射法，將合成好的寡核苷酸探針定點噴射到晶片上並加 以固定化來製作DNA晶片。第3種方法是接觸式點塗法，通過高速精密機械手的精確移動讓移液頭與玻璃晶片接觸而將DNA探針塗敷在晶片上。第4種方法是使用4支分別裝有A，T，G，C核苷的壓電噴頭在晶片上並行合成出DNA探針。
本發明提供了一種表面固定有對應於已知基因特定序列探針的核酸晶片，所述晶片表面的探針種類可達數萬種，能一次對同一個待測樣品檢測多種疾病。
DNA庫及其製備
如本文所用，「DNA庫製備」一詞是指對基因組的目的片段進行打斷，獲得一組具有一定大小的DNA片段混合物。
庫的製備方法為本領域具有通常知識者所熟知，包括(但不局限於)步驟：
1.提供一個待檢測樣本，所述樣品含有經打斷的、源自基因組的DNA雙鏈核酸片段，並且所述DNA雙鏈核酸片段具有平末端；
2.對於上一步驟的所述DNA雙鏈核酸片段，在末端添加接頭連接序列；並且通過所述接頭連接序列，在所述DNA雙鏈核酸片段的兩端添加接頭，其中所述接頭具有引子結合區以及連接互補區，所述的連接互補區與所述的接頭連接序列互補；兩側3’端和5’端的接頭的引子結合區序列不同。
3.對上一步驟獲得的帶有接頭的DNA雙鏈核酸片段，用第一引子和第二引子進行擴增，從而獲得PCR擴增產物的混合物，其中所述引子具有對應於所述接頭的引子結合區的接頭結合區，並且位 於接頭結合區外側的測序探針結合區。
在一個較佳例中，還可以對打斷產物、末端修復產物、接頭產物和富集產物進行純化。純化條件及參數為本領域具有通常知識者所熟知，對反應的條件進行一定的變化或優化也在本領域具有通常知識者能力範圍之內。
外顯子捕獲
如本文所用，術語「外顯子捕獲」，「晶片雜交」可互換使用，指的是用帶有疾病特異性探針的晶片對庫中含有目標外顯子區域的DNA片段進行特異性選擇和結合的過程。
DNA分子正常情況下是雙鏈，因此捕獲之前，DNA分子必須變為單鏈，一般通過加熱變性而達到解鏈目的，解鏈的DNA分子被迅速冷却，即保持單鏈狀態。庫變性後在雜交平臺與晶片進行捕獲雜交。含有目標外顯子區域的DNA片段與固定在晶片上的探針之間在嚴格的條件下進行分子雜交。較佳地，晶片上探針分子的濃度要遠遠高於靶分子濃度。待雜交完畢後，通過變性等方法收集捕獲的序列並純化，得到來自捕獲後的序列混合物。
本領域具有通常知識者可以通過通用的方法進行外顯子捕獲和目的片段的洗脫和純化，也可以應用市售(如：德國Qiagen公司的MinElute PCR Purification kit)試劑盒進行上述過程。
在一個較佳例中，對待檢測的DNA庫的PCR擴增產物的混合物進行單鏈化，並用封閉分子封閉所述PCR擴增產物中對應於第一引子和第二引子的區域，從而獲得兩端被封閉的單鏈PCR擴增產物 的混合物；用核酸晶片從所述的經封閉的單鏈PCR擴增產物的混合物中，捕獲疾病相關的核酸分子；對經捕獲的核酸分子，用第三引子和第四引子進行擴增，從而獲得第二PCR擴增產物的混合物，其中第三引子和第四引子分別特異性對應於或結合於所述的第一引子和第二引子；對上一步驟獲得的第二PCR擴增產物的混合物進行測序，從而獲得所述檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
引子
如本文所用，術語「引子」指的是能與模板互補配對，在DNA聚合酶的作用合成與模板互補的DNA鏈的寡聚核苷酸的總稱。引子可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引子甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。
引子「大致上」(或「基本上」)與模板一條鏈上的一個具體的序列互補。引子必須與模板的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引子的序列不必與模板的序列完全互補。比如，在一個3’端與模板互補的引子的5’端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引子仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引子能與模板充分的結合，非完全互補的引子也可以與模板形成引子-模板複合物，從而進行擴增。
在本發明中，幾類重要示例性引子的序列和名稱見表1。
第一引子(SEQ ID NO：1)和第二引子(SEQ ID NO：2)對帶有接頭的DNA雙鏈核酸片段進行擴增，獲得第一PCR擴增產物，第一引子和第二引子具有對應於所述接頭的引子結合區的接頭結合區，以及位於接頭結合區外側的測序探針結合區。封閉分子1(SEQ ID NO：3)和封閉分子2(SEQ ID NO：4)的作用是在進行序列捕獲時，與接頭互補，避免捕獲非特異性序列。第三引子(SEQ ID NO：5)和第四引子(SEQ ID NO：6)的作用是大量擴增捕獲的特異性DNA片段，以便進行下一步測序。
富集度檢測
本發明還提供了一種檢測擴增產物富集度(Enrichment)的方法，包括：連接介導的聚合酶鏈式反應(Ligation-Mediated PCR,LM-PCR)和qPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System)兩個 步驟。本領域具有通常知識者可以通過螢光定量核酸擴增檢測系統，對富集度進行檢測。qPCR是在PCR反應體系中，加入過量螢光染料(SYBR等)，螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何螢光信號，在PCR指數擴增期間通過連續監測螢光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，並據此推斷目的基因的初始量。
如本文所用，LM-PCR是指連上特異性接頭，專一性地擴增DNA片段，從而達到靈敏檢測核酸片段的目的。此外，LM-PCR檢測是半定量的，因此可進行不同樣品的比較。
在本發明的一個較佳例中，富集度檢測包括步驟：1)將稀釋好的4種NSC Assay mix(購於美國Roche NimbleGen公司)，根據試劑盒內的說明書進行)取出在冰上溶解；2)根據Nanodrop(Thermo Fisher Scientific Inc.型號：Nanodrop 8000)檢測濃度，將未捕獲的以及捕獲的LM-PCR產物稀釋至1 ng/μl，最後體積要求>12 μl；3)按照每個樣品4種NSC Assay，每個樣品包括2種DNA模版，每個樣品需要4×2=8個反應，每個平板需要1個陰性對照共4個反應；4)在1.5ml的離心管中配製QPCR反應混合液；5)將配置好的12μl QPCR反應混合液轉移至96孔QPCR反應板中，向其中加入3μl稀釋的1ng/μl LM-PCR產物，把所有的試劑和樣品加完後使用封口膜將平板封口，4000rpm離心2min；6)將96孔板置於QPCR儀上進行檢測； 7)實驗完成後分析試驗結果，整理QPCR試驗數據，根據公式計算富集度，判斷庫是否合格，合格後能否進行下一步試驗。平均富集度>60時，庫合格，可以進行下一步測序。富集度計算公式見表2。
高通量測序
基因組的「再測序」使得人類能夠儘早地發現與疾病相關基因的異常變化，有助於對個體疾病的診斷和治療進行深入的研究。本領域具有通常知識者通常可以採用三種第二代測序平臺進行高通量測序：454 FLX(Roche公司)、Solexa Genome Analyzer(Illumina公司)和Applied Biosystems公司的SOLID等。這些平臺共同的特點是極高的測序通量，相對於傳統測序的96道毛細管測序，高通量測序一次實驗可以讀取40萬到400萬條序列，根據平臺的不同，讀取長度 從25bp到450bp不等，因此不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取1G到14G不等的鹼基數。
其中，Solexa高通量測序包括DNA簇形成和上機測序兩個步驟：PCR擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，並進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用「邊合成-邊測序法」進行測序，從而得到待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
DNA簇的形成是使用表面連有一層單鏈引子(primer)的測序晶片(flow cell)，單鏈狀態的DNA片段通過接頭序列與測序晶片上的引子通過鹼基互補配對的原理被固定在測序晶片的表面，通過擴增反應，固定的單鏈DNA變為雙鏈DNA，雙鏈再次變性成為單鏈，其一端錨定在測序晶片上，另一端隨機和附近的另一個引子互補從而被錨定，形成「橋」；在測序晶片上同時有上千萬個DNA單分子發生以上的反應；形成的單鏈橋，以周圍的引子為擴增引子，在測序晶片的表面再次擴增，形成雙鏈，雙鏈經變性成單鏈，再次成為橋，稱為下一輪擴增的模板繼續擴增；反復進行了多輪例如30輪擴增後，每個單分子得到例如1000倍擴增，稱為單克隆的DNA簇。
DNA簇在Solexa測序儀上進行邊合成邊測序，測序反應中，四種鹼基分別標記不同的螢光，每個鹼基末端被保護鹼基封閉，單次反應只能加入一個鹼基，經過掃描，讀取該次反應的顏色後，該保護基團被除去，下一個反應可以繼續進行，如此反復，即得到鹼基的精確序列。在Solexa多重測序(Multiplexed Sequencing)過程中會使用Index(標簽)來區分樣品，並在常規測序完成後，針對Index 部分額外進行多個循環例如7個循環的測序，通過Index的識別，可以在1條測序通道中區分例如12種不同的樣品。
本發明提供了一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法。參見第1圖，本發明的一個較佳例包括(但不局限於)以下步驟：將所述待檢測樣本中的基因組打斷成為主帶在200-250bp的雙鏈DNA片段，對這些雙鏈DNA片段進行末端修復成為平末端的雙鏈DNA片段，在每一條鏈的3’端加入一個「A」，並與帶有一個「T」的接頭相連，成為兩端都帶有接頭的雙鏈的DNA片段混合物；將所述混合物與固定有疾病特異性探針的晶片進行雜交，捕獲疾病特異性的DNA片段，將捕獲的DNA片段富集後進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用「邊合成邊測序」的方法，上機測序，最後進行數據分析。
測序結果分析：(1)根據測序儀的使用說明，將測序結果原始read質控，其中原始read質控包括的項目見表3； (2)進行短序列比對，輸出，原始比對結果--SAM文件(BWA軟體(Burrows Wheeler Aligner；http：//sourceforge.net/projects/bio-bwa/)比對後產生的結果文件)；(3)使用samtools工具(http：//sourceforge.net/projects/samtools/)將比對結果處理，包括步驟：格式轉換、壓縮；比對結果按染色體號及座標進行排序；同一個庫的泳道結果進行合並；分別對每一個庫去重複(duplication)；將所有庫合並到一起，最後，使用soapsnp工具(http：//soap.genomics.org.cn/)進行SNP檢測。
試劑盒
本發明還提供了一種用於測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的試劑盒，所述試劑盒包括：(1)第一容器以及位於容器內的核酸晶片；(2)第二容器以及位於容器內的接頭；(3)第三容器以及位於容器內的選自下組的引子：(a)第一引子和/或第二引子；或(b)第三引子和/或第四引子； (4)第四容器以及位於容器內的封閉分子；(5)可選的檢測說明書。
在本發明的一個較佳例中，試劑盒還包括任選自下組的試劑：用於進行PCR擴增所需的試劑、用於進行封閉反應所需的試劑、用於進行雜交反應所需的試劑、或其組合。
本發明的主要優點包括：1.通過固定有核酸探針的晶片對目的DNA片段進行捕獲，覆蓋全面；2.使用特異性與DNA片段兩端接頭結合的一對引子對所有捕獲的片段進行擴增，獲得具有同樣的接頭序列而中間片段不同的擴增混合物；3.將擴增產物先合成測序簇，再進行邊合成邊測序，因此效率高，可以精確讀取重複序列，可以達到很高測序深度；4.可以同時檢測多個待檢測樣品，且沒有螢光背景的干擾；5.試驗費用低，只有傳統方法的1/100；6.不受物種的限制，人、動物、微生物、植物等都可以進行個體式檢測；7.靈敏度高、精確度高、重複性好。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不是用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook 等人，分子克隆：實驗室手冊(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1 建立晶片雜交平臺
探針設計自單基因病已知致病基因的外顯子序列及外顯子前後100bp，共7萬多個探針，其SEQ ID NO.、染色體座標、捕獲位置、長度和所涉及的疾病種類見表4。
實施例2 製備DNA庫
1.基因組DNA獲得 取人的外周血，提取基因組DNA，獲得3μg DNA。
2. DNA片段化 將抽提獲得的人基因組DNA樣品，在Covaris S2儀器(購自美國Covaris公司)上進行片段化，最終打斷成為主帶在200bp的DNA雙鏈片段的混合物，並將片段進行純化，純化過程採用Ampure Beads方法，按照Agencourt AMPure protocol進行(美國Beckman公司)。
3. DNA片段接頭化 將DNA片段進行末端修復，成為帶有平末端的片段混合物，並在每一條單鏈的3'端添加一個「A」，以便於與帶有「T」的接頭相連，連接後進行純化，純化方法採用Ampure Beads，按照Agencourt AMPure protocol(美國Beckman公司)進行。純化後，去除多餘試劑如緩衝物、酶、ATP等，最終只剩下連有接頭的DNA樣品。
4.擴增DNA片段 由於連有接頭的DNA樣品濃度很低，需要進行擴增富集，PCR反應在Bio-Rad公司的PTC-200PCR儀上運行。PCR擴增反應試劑的配置見表5。
PCR反應體系如下：94℃，2 min；94℃變性15 s，62℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共擴增4個循環；最終72℃延伸5 min。
試劑盒
經擴增的DNA都帶有接頭，使用Ampure beads法，按照Agencourt AMPure protocol的程序(美國Beckman公司)純化PCR產物。
5.將純化的產物溶解於25μl純水中，使用NanoDrop1000檢測PCR產物濃度，即構成DNA庫，DNA庫可在4℃保存數天，也可在-20℃保存數周，也可直接用於後續程序。
實施例3 序列捕獲
1.庫變性 將準備好的DNA樣品置於SpeedVac(來自Eppendorf；型號：Concentrator plus 5305)中60℃蒸幹，然後加入11.2 μL的超純水，充分溶解。全速離心樣品30秒，分別加入以下兩種試劑：18.5 μL的2×SC Hybridiation Buffer(購於美國Roche NimbleGen公司)和7.3 μL的1×SC Hybridiation Component A(購於美國Roche NimbleGen公司)。震蕩混勻後置於離心機上全速離心30秒，然後於95℃使DNA充分變性，變性過程10分鐘，得到單鏈的帶有接頭的DNA庫。
2.雜交/序列捕獲 將實施例1中帶有相應探針的晶片固定在雜交儀(美國Roche NimbleGen公司)上，將上一步驟變性後的樣品加入晶片中，封閉晶片，於42℃雜交64小時。在雜交體系中，基因晶片上探針分子的濃度要遠遠高於靶分子濃度。雜交反應體系如表6所示：
其中，Cot-1 DNA可以很好地封閉來自基因組重複序列的非特異性雜交，在最大程度上提高雜交的效率；封閉分子1(SEQ ID NO：3)和封閉分子2(SEQ ID NO：4)可以將實施例2中的第一引子(SEQ ID NO：1)和第二引子(SEQ ID NO：2)封閉，避免非特異性捕獲。
3.晶片洗滌與樣品純化 晶片洗滌與樣品純化根據美國Roche NimbleGen公司的試劑盒(Sequemce Capture Array Hybridization and wash kit Catlog Number：05853257001)說明書進行，具體步驟見表7(緩衝液來自Roche NimbleGen公司的試劑盒)。
將NaOH洗脫液回收後用40 μL的20%冰醋酸中和，中和液用德國Qiagen公司的MinElute PCR Purification Kit進行純化，得到捕獲後的樣品，最後溶解於165 μL純水中。
實施例4 PCR擴增捕獲的序列
由於捕獲的含有特定序列的DNA片段濃度很低，需要進行PCR擴增，每管的反應體系為50 μL，反應組分見表8。
反應條件：
98℃預變性30s，98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環15次；最終72℃延伸5min，可4℃靜置過夜。
PCR產物使用Ampure Beads流程(BECKMAN COULTER；型號：Agencourt AMPurebeads XP)進行純化。
完成後溶於32μl洗脫緩衝液(Elution Buffer(QIAGEN))中，使用NanoDrop(Thermo Fisher Scientific Inc.；型號：Nanodrop 8000)及Bioanalyzer 2100(Agilent；型號：2100)檢測濃度。
實施例5 檢測捕獲序列的富集度
1.將稀釋好的4種NSC Assay mix(購於美國Roche NimbleGen公司)，根據試劑盒內的說明書進行，取出在冰上溶解。將未捕獲的以及捕獲的LM-PCR產物稀釋至20ng/μl，最後體積>5μl。
2.在1.5 ml的離心管中配製qPCR反應混合液，並分配轉移至96孔qPCR反應板中，向其中加入3μl稀釋的1ng/μl LM-PCR產物，把所有的試劑和樣品加完後使用封口膜將平板封口，4000rpm離心2min。
3.將96孔板置於qPCR儀上，按說明書操作手冊進行操作。
4.實驗完成，整理分析qPCR試驗數據，計算富集度(Enrichment)，結果表明，人基因組DNA樣品(n=10)經實施例1-5所述方法處理後，其富集度均>60，可用於後續測序。
實施例6 Solexa高通量測序及數據分析
PCR擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜 交，並進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用「邊合成-邊測序法」進行測序，從而得到所述待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列，包括步驟：Solexa測序專用的測序晶片(flow cell)上連接有單鏈引子，單鏈狀態的DNA片段與測序晶片通過鹼基互補被一端「錨定」在測序晶片上；通過擴增反應的單鏈DNA成為雙鏈DNA；雙鏈DNA再次變性後成為單鏈DNA，其一端「錨定」在測序晶片上，另一端(5’或3’)隨機和附近的另外一個引子互補，被「錨定」住，形成「橋」(bridge)；在測序晶片上同事有上千萬DNA單分子發生以上的反應；形成的單鏈橋，以周圍的引子為擴增引子，在測序晶片表面再次進行擴增，形成雙鏈；雙鏈經變性成單鏈，再次形成橋，成為下一輪擴增的模板繼續擴增反應；在反復進行30輪擴增，每個單分子得到了1000倍的擴增，成為單克隆「DNA簇群」；「DNA簇群」在Solexa測序儀上進行序列分析；測序反應：「可逆性末端終止反應」提高鹼基合成來進行測序。四種鹼基分別標記四種不同螢光，每個鹼基末端被保護基團封閉，單次反應只能加入一個鹼基，經過掃描，讀取該次反應顏色後，該保護基團被除去，下一個反應可繼續進行，如此反復，得出鹼基的精確序列；自動讀取鹼基，數據被轉移到自動分析通道進行二次分析。
實施例7
用四種方法檢測樣本是否攜帶以下三種單基因病。
具體地，重複實施例1-5，其不同點在於測序法和接頭連接區 域。其不同點和檢測結果見表9。
由表9可以看出，本發明的方法制得帶有不同接頭連接區的DNA庫，與二代測序方法結合進行分析，通過Sanger法驗證，表明本發明方法可以獲得準確的篩查結果。
實施例8 試劑盒製備
一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的試劑盒，包括組分：(1)第一容器以及位於容器內的核酸晶片；(2)第二容器以及位於容器內的接頭；(3)第三容器以及位於容器內的第一引子和/或第二引子；和第三引子和/或第四引子；(4)第四容器以及位於容器內的封閉分子；(5)第五容器以及位於容器內的用於進行PCR擴增所需的試劑；(6)第六容器以及位於容器內的用於進行封閉反應所需的試劑；(7)第七容器以及位於容器內的用於雜交反應所需的試劑；(8)任選的檢測說明書。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域具有通常知識者可以對本發明作多種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。
下列圖式用於說明本發明的具體實施方案，而不是用於限定由申請專利範圍所界定的本發明範圍。
第1圖顯示了在本發明一個實例中，可以同時檢測多種單基因病的流程圖。
<110> 深圳華大基因科技有限公司深圳華大基因研究院
<120> 一種同時篩查多種單基因病的方法及其應用
<130> P2011-0366
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 第一引子
<400> 1
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 第二引子
<400> 2
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 封閉分子1
<400> 3
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 封閉分子2
<400> 4
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 第三引子
<400> 5
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 第四引子
<400> 6
<210> 7
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
<210> 9
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
<210> 10
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
<210> 12
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12

Claims (18)

  1. 一種測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的方法，其中，包括步驟：a.提供一待檢測樣本，所述待檢測樣品含有經打斷的、源自基因組的DNA雙鏈核酸片段，並且所述DNA雙鏈核酸片段具有平末端；b.對於步驟a的所述DNA雙鏈核酸片段，在末端添加接頭連接序列；並且通過所述接頭連接序列，在所述DNA雙鏈核酸片段的兩端添加接頭，其中所述接頭具有引子結合區以及連接互補區，所述的連接互補區與所述的接頭連接序列互補；c.對步驟b獲得的帶有接頭的DNA雙鏈核酸片段，用第一引子和第二引子進行PCR擴增，從而獲得第一PCR擴增產物的混合物，其中所述的第一引子和第二引子具有對應於所述接頭的引子結合區的接頭結合區，以及位於接頭結合區外側的測序探針結合區；d.對所述的第一PCR擴增產物的混合物進行單鏈化，並用封閉分子封閉位於所述PCR擴增產物兩端的、對應於第一引子和第二引子的區域，從而獲得兩端被封閉的單鏈PCR擴增產物的混合物；e.用核酸晶片，從所述的經封閉的單鏈PCR擴增產物的混合物中，捕獲疾病相關的核酸分子；f.對步驟e中經捕獲的核酸分子，用第三引子和第四引子進行PCR擴增，從而獲得第二PCR擴增產物的混合物，其中第三引子和第四引子分別特異性對應於或結合於所述的第一引子和第二引子； 以及g.對步驟f獲得的第二PCR擴增產物的混合物進行測序，從而獲得所述待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，在步驟g中，將所述的第二PCR擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，並進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；然後對所述測序簇用「邊合成-邊測序」法進行測序，從而得到所述待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟a中所述的經打斷的、源自基因組的DNA雙鏈核酸片段長度為100-1000bp或者平均長度為800-1000bp。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，所述DNA雙鏈核酸片段具有的平末端是通過末端修復的方法製備。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟b中所述的接頭連接序列為poly(N)n，其中各個N分別獨立地選自A、T、G或C，n為選自1-20的任一正整數。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟b中所述的接頭連接互補區序列為poly(N’)m，其中各個N’分別獨立地選自A、 T、G或C，m為選自1-20的任一正整數，並且poly(N)n和poly(N’)m為互補序列。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟b中所述的接頭連接序列為A，所述的接頭連接互補區序列為T。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟c中所述的第一引子和第二引子為長度30-80bp的寡核苷酸。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，所述的第一引子和第二引子是不同的，和所述的第三引子和第四引子是不同的。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，所述的第一引子和第二引子是不同的，或所述的第三引子和第四引子是不同的。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟d中所述的封閉分子封閉第一PCR擴增產物中對應於第一引子和第二引子的70%-100%區域。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟e中所述的核酸晶片上固定有5-200,000種對應於所述疾病的特異性探針。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟e中所述 的核酸晶片上固定有對應於疾病致病基因的以下區域的特異性探針：外顯子和/或外顯子前後兩端200bp。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，所述方法具有選自下組的一個或多個特徵：所述特異性探針為全人工合成或體外克隆合成；步驟f所述的第三引子和第四引子分別特異性結合於所述的第一引子和第二引子的外側，並且長度小於第一引子和第二引子；所述的第三引子和第四引子長度為15-40bp；所述待檢測樣本來源於人、動物、植物，或微生物；所述待檢測樣本來源於人或非人哺乳動物；所述待檢測樣本含有人基因組DNA；所述疾病為孟德爾單基因病。
  15. 一種可用於申請專利範圍第1項所述方法的、用於測定待檢測樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列的試劑盒，其中，所述試劑盒包括：(1)第一容器以及位於所述第一容器內的核酸晶片；(2)第二容器以及位於所述第二容器內的接頭；(3)第三容器以及位於所述第三容器內的選自下組的引子：(a)第一引子和/或第二引子；和(b)第三引子和/或第四引子；以及(4)第四容器以及位於容器內的封閉分子。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之試劑盒，其中，所述疾病為孟德爾單基因病。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之試劑盒，其中，所述試劑盒還包括選自下組的試劑：用於進行PCR擴增所需的試劑、用於進行封閉反應所需的試劑、用於進行雜交反應所需的試劑、或其組合。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之試劑盒，其中，所述的核酸晶片上固定有選自下組的一個或多個探針：探針1：序列如SEQ ID NO：7所示，捕獲位置112073411，檢測家族性腺瘤樣息肉；探針2：序列如SEQ ID NQ：8所示，捕獲位置51479999，檢測多囊腎綜合症；探針3：序列如SEQ ID NO：9所示，捕獲位置135766620，檢測節性腦硬化綜合症；探針4：序列如SEQ ID NO：10所示，捕獲位置103231969，檢測苯丙酮尿症；探針5：序列如SEQ ID NQ：11所示，捕獲位置48700368，檢測馬凡綜合症；探針6：序列如SEQ ID NO：12所示，捕獲位置31137199，檢測杜氏肌營養不良。
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