CN110115992B - 一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其制备方法 - Google Patents

一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其制备方法，所述的聚合柱是一种以有机硅氧烷凝胶缩聚形成的表面富含巯基的有机‑无机杂化硅胶聚合物作为基质，在此基础上修饰丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子，在钠盐纳米粒子上修饰带巯基的抗霉菌毒素核酸适配体，从而制得的亲和柱材料。本发明中制备的亲和聚合柱具有刚性硅胶基质，通过柱后修饰，表面富含巯基结构、低聚倍半多聚硅氧烷单体多作用位点；通过点击化学可在桥联位点上键合抗霉菌毒素核酸适配体，形成表面高亲水、负电荷的适配体亲和作用层，分类实现对不同霉菌毒素的特异识别。

Description

一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其 制备方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其制备方法。
背景技术
开展目标物选择性识别是实现复杂样品准确分析的关键技术之一。核酸适配体功能化的亲和整体柱具有传质阻力快、亲和力好、易于制备等优点，作为新兴的亲和技术在复杂样品中目标分析物的选择性萃取、分离和检测中应用广泛。然而，由于疏水作用和硅羟基带来的非特异性吸附这两大因素，非特异性吸附会对分析物的特异性识别造成一定的干扰，并影响目标物的定量和定性分析。理想的核酸适配体亲和整体柱材料需要具有高的亲和性、选择性和高的稳定性，同时，还应该避免可能存在的非特异性吸附作用。
目前，核酸适配体修饰的亲和整体柱可分为有机聚合亲和整体柱和有机-硅胶杂化亲和整体柱。Zhao等以GMA为功能单体和TRIM为交联剂制备了poly(GMA-EDMA)有机聚合整体柱，利用链霉亲和素-生物素连接法将核酸适配体固载于聚合整体柱上。有机整体柱固定相具有较强的疏水作用，与赭曲霉毒素等疏水性目标物产生一定的非特异性吸附作用。为了减少由疏水作用带来的非特异性吸附，极性硅氧烷的有机-硅胶杂化整体柱作为另一种理想的色谱固定相已经被应用于固定核酸适配体，如Brothier等以TEOS和APTES为前驱体原料通过“溶胶-凝胶”法制备了表面杂化硅胶整体柱，通过戊二醛连接法将核酸适配体固定化。
近年来，基于特殊的多面体低聚倍半硅氧烷POSS成为一种新的杂化材料被广泛应用于整体柱的制备中，得到的整体柱具有高的机械稳定性能、独特的多孔骨架结构且表面无裸露的硅羟基，该亲和整体柱仍具有一定的疏水性质，非特异性吸附还是比较明显。有必要进一步改善提高聚合柱作用表面的亲水性，开发高亲水的核酸适配体修饰的有机-无机杂化硅胶亲和整体柱用于高特异识别目标物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其制备方法，所述的聚合柱是一种基于硅氧烷凝胶缩聚形成的表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合物作为基质，在此基础上修饰丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷（POSS）纳米粒子，在所述钠盐纳米粒子上修饰带巯基的抗霉菌毒素核酸适配体，从而制得的高亲水亲和聚合柱材料。本发明所制备的亲和聚合柱具有刚性硅胶基质，通过柱后修饰，表面富含巯基结构、低聚倍半多聚硅氧烷单体多作用位点；通过点击化学在丙烯酸钠盐纳米粒子上键合抗霉菌毒素核酸适配体，形成表面高亲水、负电荷的适配体亲和作用层，分类实现对不同霉菌毒素的特异识别。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱，所述的聚合柱是一种基于有机硅氧烷凝胶缩聚形成的表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合物作为基质，依次与丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子、带巯基的抗霉菌毒素核酸适配体进行柱后修饰制得的亲和柱材料。所述的聚合柱包括：（1）以硅氧烷单体凝胶缩聚反应形成的具有-Si-O-Si-刚性结构、表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合基质；（2）以“巯烯”点击反应在聚合基质上键合的丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子；（3）在所述纳米粒子表面“巯烯”点击反应键合的抗霉菌毒素核酸适配体亲和作用层。
所述有机硅氧烷单体由四甲氧基硅氧烷和3-巯丙基三乙氧基硅烷组成；
所述的霉菌毒素包括赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1；
所述的抗霉菌毒素核酸适配体的碱基序列依次分别为5'-SH-C6-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'，5'-SH-C6-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATAT-3' ，5'-SH-C6-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3'。
所述的用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱的制备方法，包括以下步骤：
（1）有机-无机杂化硅胶聚合基质的制备：
将一定质量的聚乙二醇和尿素溶于10mL乙酸水溶液中，加入一定比例的四甲氧基硅烷和3-巯丙基三乙氧基硅烷混合物，在冰水浴下搅拌45分钟，制得溶胶溶液；将所制备的溶胶溶液，置于离心管中混匀，超声脱气后注入石英毛细管中，两端密封后置于50 ℃水浴锅中恒温反应16 h，之后除去柱内的残留试剂，即得到表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合基质；
（2）丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子POSS-MNa的制备：
（2.1）在室温下，将0.179g 氨丙基三乙氧基硅烷溶解于3.0mL的0.50 mol/L三氟乙酸水溶液，强烈搅拌，制得丙基三氟甲基磺酸铵取代的低聚倍半硅氧烷（YoshiroKaneko,* Miki Shoirikia and Tomonobu Mizumo，Preparation of cage-like octa(3-aminopropyl)silsesquioxane trifluoromethanesulfonate in higher yield with ashorter reaction time, J. Mater. Chem., 2012, 22, 14475–14478）；将1.227 g三乙胺和1.981 g马来酸酐分别加入到12.0 mL的溶解有1.041 g 丙基三氟甲基磺酸铵取代的低聚倍半多聚硅氧烷的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，大力搅拌，制得八-[3-（丙基氨基甲酰）丙烯酸]取代的低聚倍半多聚硅氧烷POSS-MA（Makoto Yanagie and Yoshiro Kaneko，Preparation of irrefrangible polyacrylamide hybrid hydrogels using water-dispersible cyclotetrasiloxane or polyhedral oligomeric silsesquioxanecontaining polymerizable groups as cross-linkers, Polym. Chem., 2018, 9,2302–2312）；
（2.2）将所制备的POSS-MA加入到20 mL的氢氧化钠-甲醇溶液中，搅拌5分钟，在敞开体系中60℃加热至蒸干，加入20 mL乙醇将残渣溶解，将所得溶液中不溶物质过滤，所得到的产物在室温下减压蒸馏至干，得到丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子POSS-MNa（Makoto Yanagie and Yoshiro Kaneko，Preparation of irrefrangiblepolyacrylamide hybrid hydrogels using water-dispersible cyclotetrasiloxane orpolyhedral oligomeric silsesquioxane containing polymerizable groups ascross-linkers, Polym. Chem., 2018, 9, 2302–2312）；
（3）POSS-MNa修饰的杂化硅胶聚合柱的制备：
将步骤（2）得到的POSS-MNa在室温下加水溶解，加入2 μL的NaOH溶液调节pH为8.5，注入步骤（1）所得表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合基质中，置于40 ℃的水浴锅进行反应8 h，通过基质固定相表面巯基与POSS-MNa烯烃基团的点击反应进行表面化学修饰，制得POSS-MNa修饰的杂化硅胶聚合柱；
（4）抗霉菌毒素核酸适配体的制备：
将抗霉菌毒素的核酸适配体溶液用8000 r/min离心10分钟，然后加入pH 7.4的缓冲液A进行稀释，放置于90 ℃加热3 分钟，冷却至室温后形成浓度为100 μmol/L的核酸适配体储备溶液；按体积比40：60往40 μL的核酸适配体储备溶液中加入5 mmol/L 三羧基乙基膦，置于摇床中室温孵育1 小时以降解二硫键，加入一定浓度的NaOH调节pH为8.5，得到抗霉菌毒素核酸适配体溶液；
（5）抗霉菌毒素核酸适配体修饰的硅胶聚合柱
将步骤（4）得到的抗霉菌毒素核酸适配体溶液在室温下注入步骤（3）所得POSS-MNa修饰的杂化硅胶聚合柱中，置于40 ℃的水浴锅进行反应8 h，通过核酸适配体表面巯基与POSS-MNa烯烃基团的点击反应进行点击化学修饰，得到抗霉菌毒素核酸适配体修饰的硅胶聚合柱，通入pH 8.5的缓冲液B后，于4 ℃下保存备用。
步骤（1）中，四甲氧基硅烷/3-巯丙基三乙氧基硅烷单体的体积比（v/v）为3:1~5:1，聚乙二醇用量为880 mg，尿素用量为900 mg，乙酸水溶液浓度为0.01mol/L，用量为10mL；所述聚乙二醇的分子量为10000；
步骤（2.2）中，所述氢氧化钠-甲醇溶液的浓度为0.10 mol/L；所述POSS-MA的用量为0.416 g（0.25 mmol）。
所述缓冲液A由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl和1 mmol/L KCl组成；所述缓冲液B由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成。
本发明的显著优点在于：
本发明所述的用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱，是以有机硅氧烷凝胶缩聚形成表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合物作为基质，在基质表面修饰丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子，在纳米粒子上修饰带巯基的抗霉菌毒素核酸适配体，所制备的聚合柱内核骨架是刚性的硅胶基质，通过在基质表面修饰上丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子，使得聚合柱表面具有超高亲水性，而且每个笼型聚倍半硅氧烷单体分子上具有八个支化独立分布的烯基作用位点，作为桥联位点可立体地固定化巯基核酸适配体，从而形成表面具有POSS-MNa超高亲水性、核酸适配体高表面覆盖密度的功能化聚合柱，提供一种具有高亲水、负电荷的核酸适配体亲和作用层，可有效降低疏水性霉菌毒素在柱体基质上非特异性吸附，同时保持带有磷酸负电荷基团的核酸适配体保持分散状态，有利于实现折叠结构的产生和高密度负载，从而实现对不同霉菌毒素的高特异识别。
附图说明
图1为所制备的聚合柱对赭曲霉毒素A的特异识别色谱分离图，
（a）空白对照柱，（b）修饰抗赭曲霉毒素A核酸适配体，
峰1：赭曲霉毒素A (10 ng/mL)；
图2为所制备的聚合柱对玉米赤霉烯酮的特异识别色谱分离图，
（a）空白对照柱，（b）修饰抗玉米赤霉烯酮核酸适配体，
峰1：玉米赤霉烯酮 (10 ng/mL)；
图3为所制备的聚合柱对黄曲霉毒素B1的特异识别色谱分离图，
（a）空白对照柱，（b）修饰抗黄曲霉毒素B1核酸适配体，
峰1：黄曲霉毒素B1 (10 ng/mL)。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及制备方法具体步骤为：
（1）有机-无机杂化硅胶聚合基质的制备
按表1 比例称取聚乙二醇（PEG-10000）880 mg，尿素用量为900 mg溶于25 mL的0.01mol/L乙酸水溶液中，加入体积比（v/v）为3:1~5:1的四甲氧基硅烷（TMOS）和3-巯丙基三乙氧基硅烷（MPTMS）混合物，在冰水浴下搅拌45分钟，制得溶胶溶液；将所制备的溶液置于离心管中混匀，超声脱气后注入石英毛细管中，两端密封后置于50 ℃水浴锅中恒温反应16 h；将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱仪用高压溶剂泵，在泵压11.0 Mpa的状态下以甲醇为流动相冲洗毛细管2 h，除去柱内的残留试剂，即得到表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合基质。
表1 有机-无机杂化硅胶聚合基质的组成
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（2）丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子POSS-MNa的制备：
在室温下，将0.179g 氨丙基三乙氧基硅烷溶解于3.0mL的0.50 mol/L三氟乙酸水溶溶液，搅拌2小时，制得丙基三氟甲基磺酸铵取代的低聚倍半硅氧烷；
将1.227 g三乙胺和1.981 g马来酸酐分别加入到12.0 mL的溶解有1.041 g 丙基三氟甲基磺酸铵取代的低聚倍半多聚硅氧烷的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，大力搅拌，制得八-[3-（丙基氨基甲酰）丙烯酸]取代的低聚倍半多聚硅氧烷POSS-MA；在室温下，称取POSS-MA 0.416 g（0.25 mmol），加入到20 mL浓度为0.10 mol/L的氢氧化钠-甲醇溶液中，搅拌5分钟，在敞开体系中60℃加热至蒸干；加入20 mL乙醇将残渣溶解，将所得溶液中不溶物质过滤，室温下减压蒸馏至干，得到丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子POSS-MNa。
（3）POSS-MNa修饰的杂化硅胶聚合柱的制备：
将步骤（2）得到的POSS-MNa在室温下加水溶解，加入2 μL一定浓度的NaOH调节pH为8.5，注入步骤（1）所得表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合基质中，置于40 ℃的水浴锅进行反应8 h，通过基质固定相表面巯基与POSS-MNa烯烃基团的点击反应进行表面化学修饰，制得表面带有强负电荷的POSS-MNa 衍生聚合柱。
（4）抗霉菌毒素核酸适配体的制备：
将抗霉菌毒素的核酸适配体溶液用8000 r/min离心10分钟，然后加入pH 7.4的缓冲液A进行稀释，所述缓冲液A由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl和1 mmol/L KCl组成；将配制的核酸适配体溶液放置于90 ℃加热3 分钟，冷却至室温后形成浓度为100 μmol/L的核酸适配体储备溶液；按体积比40：60往40 μL的核酸适配体储备溶液中加入5mmol/L三羧基乙基膦，置于摇床中室温孵育1 小时以降解二硫键，加入一定浓度的NaOH调节pH为8.5，制备相应的抗霉菌毒素核酸适配体溶液。
（5）抗霉菌毒素核酸适配体修饰的硅胶聚合柱
将步骤（4）得到的抗霉菌毒素核酸适配体溶液在室温下注入步骤（3）所得POSS-MNa修饰的杂化硅胶聚合柱中，置于40 ℃的水浴锅进行反应8 h，通过核酸适配体表面巯基与POSS-MNa烯烃基团的点击反应进行点击化学修饰，得到抗霉菌毒素核酸适配体表面修饰的POSS-MNa 衍生聚合柱，通入pH 8.5的缓冲液B后，于4 ℃下保存备用，所述缓冲液B由10mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成。
实施例2
选用表1中的配方C分别制备未修饰核酸适配体的空白柱，分别修饰抗赭曲霉毒素A核酸适配体、抗玉米赤霉烯酮核酸适配体、抗黄曲霉毒素B1核酸适配体的亲和聚合柱，柱长5cm，分别进行平衡、上样、清洗和洗脱，其具体步骤为：（1）平衡：先用pH 8.50的缓冲液平衡30min，其流速0.10 mL/min，压力500psi，所述缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，120 mmol/LNaCl，5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成；（2）上样：分别注入20 μL 10 ng/mL赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、黄曲霉毒素B1（AFB1）溶液，使其在整体柱上富集1h，注入条件为流速0.05 mL/min，压力500psi；（3）清洗：将富集柱装到液相色谱泵上，用pH 8.50的缓冲液分别清洗，清洗流速0.1 mL/min，压力1000psi，收集最后的清洗液待查；（4）洗脱：以30%ACN-70%TE缓冲液（10mM pH8.5的Tris-HCl中含2.5mM EDTA）作为洗脱液将OTA、ZEN、AFB1从聚合柱上洗脱下来，色谱条件为1000psi反压阀，流速0.1mL/min。采用HPLC-荧光检测器检测收集液，结果见图1-3。空白柱分别对OTA、ZEN、AFB1未见有效保留，亲和聚合柱中的OTA、ZEN、AFB1被有效洗脱下来，证明本发明聚合柱可分别实现对OTA、ZEN、AFB1的特异识别分离。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱及其制备方法
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcatctatct atggtacatt actatctgta atgtgatatg 40
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggccc 47

Claims (6)

1.一种用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱，其特征在于：所述的聚合柱是一种以硅氧烷凝胶缩聚形成的表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合物作为基质，在基质表面修饰丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子，最后在丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子上修饰带巯基的抗霉菌毒素核酸适配体；所述的聚合柱包括：（1）以硅氧烷凝胶缩聚反应形成的具有-Si-O-Si-刚性结构、表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合基质；（2）以“巯烯”点击反应在聚合基质上键合丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子；（3）所述纳米粒子表面以“巯烯”点击反应键合抗霉菌毒素核酸适配体亲和作用层。
2.根据权利要求1所述的用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱，其特征在于：所述硅氧烷单体由四甲氧基硅氧烷和3-巯丙基三乙氧基硅烷组成；所述的霉菌毒素包括赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1；
抗赭曲霉毒素A核酸适配体的碱基序列为5'-SH-C6-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3'；
抗玉米赤霉烯酮核酸适配体的碱基序列为5'-SH-C6-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG -3'；
抗黄曲霉毒素B1核酸适配体的碱基序列为5'-SH-C6-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3'。
3.一种制备如权利要求1所述的用于霉菌毒素特异识别的核酸适配体功能化聚合柱的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）有机-无机杂化硅胶聚合基质的制备：
将一定质量的聚乙二醇和尿素溶于10mL乙酸水溶液中，加入一定比例的四甲氧基硅烷和3-巯丙基三乙氧基硅烷混合物，在冰水浴下搅拌45分钟，制得溶胶溶液；将所制备的溶胶溶液，置于离心管中混匀，超声脱气后注入石英毛细管中，两端密封后置于50 ℃水浴锅中恒温反应16 h，之后除去柱内的残留试剂，即得到表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合基质；
（2）丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子POSS-MNa的制备：
（2.1）在室温下，将0.179g 氨丙基三乙氧基硅烷溶解于3.0mL的0.50 mol/L三氟乙酸水溶液，强烈搅拌，制得丙基三氟甲基磺酸铵取代的低聚倍半硅氧烷；将1.227 g三乙胺和1.981 g马来酸酐分别加入到12.0 mL的溶解有1.041 g 丙基三氟甲基磺酸铵取代的低聚倍半多聚硅氧烷的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中，大力搅拌，制得八-[3-（丙基氨基甲酰）丙烯酸]取代的低聚倍半多聚硅氧烷POSS-MA；
（2.2）将所制备的POSS-MA加入到20 mL的氢氧化钠-甲醇溶液中，搅拌5分钟，在敞开体系中60℃加热至蒸干，加入20 mL乙醇将残渣溶解，将所得溶液中不溶物质过滤，所得到的产物在室温下减压蒸馏至干，得到丙烯酸钠盐取代的低聚倍半硅氧烷纳米粒子POSS-MNa；
（3）POSS-MNa修饰的杂化硅胶聚合柱的制备：
将步骤（2）得到的POSS-MNa在室温下加水溶解，加入2 μL的NaOH溶液调节pH为8.5，注入步骤（1）所得表面富含巯基的有机-无机杂化硅胶聚合基质中，置于40 ℃的水浴锅进行反应8 h，通过基质固定相表面巯基与POSS-MNa烯烃基团的点击反应进行表面化学修饰，制得POSS-MNa修饰的杂化硅胶聚合柱；
（4）抗霉菌毒素核酸适配体的制备：
将抗霉菌毒素的核酸适配体溶液用8000 r/min离心10分钟，然后加入pH 7.4的缓冲液A进行稀释，放置于90 ℃加热3 分钟，冷却至室温后形成浓度为100 μmol/L的核酸适配体储备溶液；按体积比40：60往40 μL的核酸适配体储备溶液中加入5 mmol/L 三羧基乙基膦，置于摇床中室温孵育1 小时以降解二硫键，加入一定浓度的NaOH调节pH为8.5，得到抗霉菌毒素核酸适配体溶液；
（5）抗霉菌毒素核酸适配体修饰的硅胶聚合柱
将步骤（4）得到的抗霉菌毒素核酸适配体溶液在室温下注入步骤（3）所得POSS-MNa修饰的杂化硅胶聚合柱中，置于40 ℃的水浴锅进行反应8 h，通过核酸适配体表面巯基与POSS-MNa烯烃基团的点击反应进行点击化学修饰，得到抗霉菌毒素核酸适配体修饰的硅胶聚合柱，通入pH 8.5的缓冲液B后，于4 ℃下保存备用。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，四甲氧基硅烷与3-巯丙基三乙氧基硅烷单体的体积比为3:1~5:1，聚乙二醇用量为880 mg，尿素用量为900 mg，乙酸水溶液的浓度为0.01mol/L；所述聚乙二醇的分子量为10000。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（2.2）中所述氢氧化钠-甲醇溶液的浓度为0.10 mol/L；所述POSS-MA的用量为0.25 mmol。
6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液A由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl和1 mmol/L KCl组成；所述缓冲液B由10 mmol/L Tris-HCl、120mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112316492A (zh) * 2020-10-22 2021-02-05 厦门华厦学院 可同时用于多种真菌毒素特异性识别的核酸适配体亲和整体柱及其制备方法
CN114184775B (zh) * 2021-11-15 2023-10-31 中山大学 基于三螺旋dna结合级联信号放大策略检测黄曲霉毒素b1的方法
CN114875034A (zh) * 2022-05-09 2022-08-09 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种同时检测赭曲霉毒素a和玉米赤霉烯酮的三维dna纳米镊子及其制备方法和应用
CN115430464A (zh) * 2022-08-15 2022-12-06 河南工业大学 一种选择性降解真菌毒素的光催化剂、制备方法及其应用
CN115990355A (zh) * 2022-10-13 2023-04-21 福州大学 一种核酸适配体有序功能化的亲和整体柱及其制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103626933A (zh) * 2013-10-14 2014-03-12 杭州师范大学 一种聚倍半硅氧烷-聚丙烯酸酯-纳米SiO2复合乳液及其制备方法与应用
CN105289536A (zh) * 2011-02-14 2016-02-03 迪奥内克斯公司 液相色谱柱
CN106832157A (zh) * 2017-01-03 2017-06-13 华南理工大学 一种含poss含氟三嵌段丙烯酸酯共聚物及其制备方法
CN108107144A (zh) * 2017-12-29 2018-06-01 福州大学 一种核酸适配体功能化的poss交联有机-硅胶杂化整体柱及其制备方法
CN108211424A (zh) * 2018-02-08 2018-06-29 福州大学 一种用于赭曲霉毒素特异识别的poss基有机-无机杂化硅胶整体柱及其制备方法
CN109126749A (zh) * 2018-09-30 2019-01-04 河北大学 一种多面体低聚倍半硅氧烷为壳的核壳型色谱固定相及其制备方法与应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105289536A (zh) * 2011-02-14 2016-02-03 迪奥内克斯公司 液相色谱柱
CN103626933A (zh) * 2013-10-14 2014-03-12 杭州师范大学 一种聚倍半硅氧烷-聚丙烯酸酯-纳米SiO2复合乳液及其制备方法与应用
CN106832157A (zh) * 2017-01-03 2017-06-13 华南理工大学 一种含poss含氟三嵌段丙烯酸酯共聚物及其制备方法
CN108107144A (zh) * 2017-12-29 2018-06-01 福州大学 一种核酸适配体功能化的poss交联有机-硅胶杂化整体柱及其制备方法
CN108211424A (zh) * 2018-02-08 2018-06-29 福州大学 一种用于赭曲霉毒素特异识别的poss基有机-无机杂化硅胶整体柱及其制备方法
CN109126749A (zh) * 2018-09-30 2019-01-04 河北大学 一种多面体低聚倍半硅氧烷为壳的核壳型色谱固定相及其制备方法与应用

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