CN110314673A

CN110314673A - 一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱及其制备方法

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Publication number: CN110314673A
Application number: CN201910730172.7A
Authority: CN
Inventors: 齐国敏
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2019-10-11
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: CN110314673B

Abstract

本发明属于材料化学领域，具体涉及一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化的亲和整体柱及其制备方法。所述的聚合柱是基于光引发剂和催化剂作用，以笼型低聚倍半硅氧烷单体为骨架、以含有环氧和烯键的双功能基团试剂为功能单体，以磺酸盐离子单体为离子化试剂，在石英毛细管中发生巯烯点击、烯基自聚、巯基‑环氧开环混杂固化。所制备的亲和聚合柱具有低聚倍半多聚硅氧烷单体多作用位点，通过自由基聚合、点击化学和开环反应，以巯烯点击和烯烃自由基聚合混杂聚合形成聚合物骨架、以巯烯点击修饰强阴离子、以巯基‑环氧开环和巯‑烯点击反应键合核酸适配体的有机‑无机杂化亲和整体柱。

Description

一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱及其制备方法

技术领域

本发明属于材料化学领域，具体涉及一种基于光引发聚合的核酸适配体功能化的阴离子电荷型亲和整体柱及其制备方法。

背景技术

核酸适配体功能化的亲和整体柱具有传质阻力快、亲和力好、易于制备等优点，作为新兴的亲和技术在复杂样品中目标分析物的选择性萃取、分离和检测中应用广泛。然而，由于疏水作用和硅羟基带来的非特异性吸附这两大因素，非特异性吸附会对分析物的特异性识别造成一定的干扰，并影响目标物的定量和定性分析。理想的核酸适配体亲和整体柱材料需要具有高的亲和性、选择性和高的稳定性，同时，还应该避免可能存在的非特异性吸附作用。

目前，核酸适配体修饰的亲和整体柱可分为有机聚合亲和整体柱和有机-硅胶杂化亲和整体柱。Zhao等以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为功能单体和三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）为交联剂制备了有机聚合整体柱，利用链霉亲和素-生物素连接法将核酸适配体固载于聚合整体柱上[ Analytical Chemistry, 2008, 80(10): 3915-3920]。有机整体柱固定相具有较强的疏水作用，与赭曲霉毒素等疏水性目标物产生一定的非特异性吸附作用。为了减少由疏水作用带来的非特异性吸附，极性硅氧烷的有机-硅胶杂化整体柱作为另一种理想的色谱固定相已经被应用于固定核酸适配体，如Brothier F等以正硅酸乙酯TEOS和γ-氨丙基三乙氧硅烷APTES为前驱体原料通过“溶胶-凝胶”法制备了表面杂化硅胶整体柱，通过戊二醛连接法将核酸适配体固定化[Analytical and BioanalyticalChemistry, 2014, 406(30): 7875-7886]。

近年来，基于特殊的多面体低聚倍半硅氧烷POSS成为一种新的杂化材料被广泛应用于整体柱的制备中，得到的整体柱具有高的机械稳定性能、独特的多孔骨架结构且表面无裸露的硅羟基，同时，基于含有巯基和缩水甘油酯基团的POSS试剂，聚合产物具有良好的紫外透过率，在光聚合树脂应用较多，但是该类整体材料具有较高的疏水性质，非特异性吸附比较明显。需要进一步研发提高聚合柱作用表面的亲水性、高透光的核酸适配体修饰的有机-无机杂化硅胶亲和整体柱用于高特异识别目标物。

研究发现在光聚合反应中，加入巯基时可以产生反应速度快的巯烯反应，该反应产生的自由基可以加快烯烃-烯烃的自聚合反应。另外，巯基在不饱和烯基的点击反应只能在一端产生自由基，导致烯烃的自由基链增长受到影响，含有单个巯基基团的试剂在聚合物中不饱和键上的加成反应与聚合物自由基链增长两者相互矛盾，需要引入其他基团加以辅助解决。由于单纯烯烃的光引发聚合反应效率较低、有机单体与POSS试剂聚合物疏水作用强、巯-烯点击加成巯基适配体可能引起烯烃聚合度降低等问题。

发明内容

本发明的目的是在于提出了一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱及其制备方法，基于光引发剂和产碱剂的催化作用，以含有环氧和烯键的双功能基团试剂为功能单体，以笼型低聚倍半硅氧烷单体为交联剂、以磺酸盐离子单体为离子化修饰试剂，在毛细管中产生巯基-烯烃、烯烃-烯烃、巯基-环氧反应，制备亲和整体柱。其中，巯基-烯烃反应最快，将会快速反应并产生自由基，促进单体间不饱和烯基-烯基的聚合反应，形成稳定的聚合物骨架；在此过程中含有烯基的磺酸盐离子单体以烯基-烯基反应结合在骨架表面，实现疏水性骨架的表面修饰；而巯基-环氧反应活性较低，在巯基-烯烃-烯烃聚合反应生成一定聚合物后、在光产碱试剂的催化下反应，可以将含巯基修饰核酸适配体修饰在聚合物表面的环氧基团上，形成有机-无机杂化亲和整体柱。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明将基于光引发剂和含氮杂环烯烃的催化作用，以含有环氧和烯键双基团的试剂为功能单体、刚性结构纳米化合物为交联剂、强阴离子单体为表面修饰试剂、三元溶剂体系为致孔剂，在毛细管内混杂聚合，综合制得的以巯烯点击和烯烃自由基聚合混杂聚合形成聚合物骨架、以巯烯点击修饰强阴离子、以巯基-环氧开环和巯-烯点击反应键合核酸适配体的有机-无机杂化亲和整体柱。

所述的光引发剂为2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，所述的含氮杂环烯烃为1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐；所述的双功能基团试剂为甲基丙烯酸缩水甘油酯，所述的纳米化合物为甲基丙烯酸甲酯基笼状低聚倍半硅氧烷POSS-MA，所述的强阴离子单体为2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸，所述的三元溶剂体系由四氢呋喃、聚乙二醇-20000和溶解有核酸适配体的水溶液组成。

所述1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐是在10wt%盐酸中与四苯基硼酸钠反应得到的1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐，具体参考文献制备，文献出处X. Sun, J. P. Gao and Z. Y. Wang, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130,8130–8131。

所述的基于光引发聚合的核酸适配体功能化的阴离子电荷型亲和整体柱的制备方法，包括以下步骤：

（1）按上述的比例称取笼状低聚倍半多聚硅氧烷POSS-MA、甲基丙烯酸缩水甘油酯、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐、四氢呋喃和聚乙二醇于2mL的离心管中振荡20min，使其形成均一溶液。

（2）将巯基修饰的核酸适配体使用前用8000r/min离心5分钟，加入水稀释到100μmol/L，90℃加热3分钟，冷却至室温后，按比例称取核酸适配体溶液加入步骤（1）制得的溶液中，超声脱气，将得到的聚合溶液注入采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷预处理好的毛细管中，用橡胶塞封端，放入紫外交联仪中，在紫外光辐照下反应7 min。制备好的整体柱连接至高压泵，采用甲醇水冲洗。

（3）步骤（2）所制备的核酸适配体修饰整体柱放在缓冲液中，于4℃下保存。

所述制备方法中各组分的比例关系具体为：按聚合反应物溶液质量百分数之和为100 %计，引发剂2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮20.0％，催化剂1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐5.0%，交联剂笼状低聚倍半多聚硅氧烷POSS-MA 0.53 %，单体甲基丙烯酸缩水甘油酯6.30%，单体2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸3.68%，三元体系致孔剂占63.05%，其中：四氢呋喃48.38~53.21%，聚乙二醇-20000为4.84~9.68%，水溶液为6.88%~6.45%，其中水溶液中核酸适配体的浓度为100μmol。

步骤（2）中所述的紫外光波长为365nm。

步骤（3）所述的缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl₂组成。

所述的核酸适配体的碱基序列为5'-SH-C6-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGGGAG CAT CGG ACA-3'。

本发明的显著优点在于：

本发明针对单纯烯烃的光引发聚合反应效率较低、有机单体与POSS试剂聚合物疏水作用强、巯-烯点击加成巯基适配体可能引起烯烃聚合度降低等问题，提出了一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱及其制备方法。本发明基于光引发剂和产碱剂的催化作用，以含有环氧和烯键双基团的试剂为功能单体、笼型低聚倍半硅氧烷单体为交联剂，每个笼型聚倍半硅氧烷单体分子上具有多个支化独立分布的烯基作用位点，结合含有环氧和烯烃双功能基团的聚合单体，以磺酸盐离子单体为离子化试剂，该聚合体系可以在光引发剂的催化作用下迅速产生巯烯反应，产生自由基引发加速烯基之间的聚合反应，快速形成固定相（7min），并在产碱剂的催化下发生巯基-环氧开环反应，键合修饰核酸适配体，形成有机-无机杂化硅胶亲和整体柱。

所制备的亲和聚合柱具有低聚倍半多聚硅氧烷单体多作用位点，不含无机硅羟基；所制备的聚合物表面具有烯基和环氧基，可以逐步发生巯基-烯烃“点击反应”、巯基-环氧键合修饰核酸适配体，形成表面具有负电荷、核酸适配体高表面覆盖密度的功能化聚合柱，提供一种具有负电荷离子作用和核酸适配体亲和识别的复合作用层，可有效降低疏水性物质在柱体基质上非特异性吸附，同时保持带有磷酸负电荷基团的核酸适配体保持分散状态，有利于实现折叠结构的产生和识别作用，可以实现对疏水性物质（如：赭曲霉毒素A）的高特异识别。

附图说明

图1为空白对照柱对赭曲霉毒素A的特异识别色谱分离图；

图2为所制备的阴离子电荷型亲和整体柱对赭曲霉毒素A的特异识别色谱分离图；

峰0：背景物质；1：赭曲霉毒素A(10 ng/mL)。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

一种基于光引发聚合的核酸适配体功能化的阴离子电荷型亲和整体柱的制备方法为：

按表1中比例称取笼状低聚倍半多聚硅氧烷（POSS-MA）、甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸（AMPS）、催化剂1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐、四氢呋喃（THF）、聚乙二醇（PEG）、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮于2 mL离心管中振荡20 min至澄清聚合液（其中1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐用量占5%；2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮用量占20%），然后加入核酸适配体溶液，震荡超声充分混匀，最后注入透明毛细管中，用橡胶塞封端，放入紫外交联仪中，在波长为365 nm条件下反应7 min。将制备好的整体柱连接至高压泵，用甲醇:水=1:1 (v:v) 溶液冲洗约2 h，制备好的亲和杂化整体柱通入pH 8.5的缓冲液后，于4 ℃下保存备用，所述缓冲液由10 mmol/LTris-HCl、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl₂组成。

表1核酸适配体键合亲和整体柱组分含量表^a

实施例2

选用表1中的配方C分别制备未修饰核酸适配体的空白柱，分别修饰抗赭曲霉毒素A核酸适配体核酸适配体的亲和聚合柱，柱长5cm，分别进行平衡、上样、清洗和洗脱，其具体步骤为：(1)亲和整体柱的平衡：用10 mM Tris-HCl缓冲溶液平衡亲和整体柱30-40 min，将亲和整体柱活化，实验条件：压力为500psi，流速为0.05mL/min。(2) 上样：将注入定量环中的10 ng/mL赭曲霉毒素A（OTA）样品溶液以0.05mL/min的流速通入亲和整体柱内。(3) 清洗：定量环中待样品全部流经亲和整体柱后，用10 mM Tris-HCl缓冲液将柱内残留和未被特异性捕获的赭曲霉毒素A淋洗下来，收集液体。(4) 洗脱：用含有40%乙腈的Tris-HCl-EDTA缓冲溶液将被亲和整体柱捕获的赭曲霉毒素A洗脱，收集液体。采用高效液相色谱串联荧光检测器检测收集液体。结果见图1。空白柱对OTA未见保留，亲和聚合柱中的OTA被有效洗脱下来，说明本发明中核酸适配体键合亲和整体柱可实现对OTA的特异性识别。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱及其制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

Claims

1.一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱，其特征在于：所述的亲和整体柱是一种基于光引发剂和含氮杂环烯烃的催化作用，以含有环氧和烯键双基团试剂为功能单体、刚性结构纳米化合物为交联剂、强阴离子单体为表面修饰试剂、三元溶剂体系为致孔剂，在毛细管内混杂聚合制得的以巯烯点击和烯烃自由基聚合混杂聚合形成聚合物骨架、以巯烯点击修饰强阴离子、以巯基-环氧开环和巯-烯点击反应键合核酸适配体的有机-无机杂化亲和整体柱。

2.根据权利要求1所述的一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱，其特征在于：所述的光引发剂为2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，所述的含氮杂环烯烃为1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐。

3.根据权利要求1所述的一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱，其特征在于：所述的含有环氧和烯键双基团试剂为甲基丙烯酸缩水甘油酯。

4.根据权利要求1所述的一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱，其特征在于：所述的刚性结构纳米化合物为甲基丙烯酸甲酯基笼状低聚倍半硅氧烷POSS-MA。

5.根据权利要求1所述的一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱，其特征在于：所述的强阴离子单体为2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸。

6.根据权利要求1~5任一权利要求所述的一种基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱，其特征在于：按聚合反应物溶液质量百分数之和为100 %计，引发剂2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮20.0%，催化剂1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐5.0%，交联剂笼状低聚倍半多聚硅氧烷POSS-MA 0.53 %，单体甲基丙烯酸缩水甘油酯6.30%，单体2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸3.68%，三元体系致孔剂占63.05%；所述的三元溶剂体系由四氢呋喃、聚乙二醇-20000和溶解有核酸适配体的水溶液组成，具体为：四氢呋喃48.38~53.21%，聚乙二醇-20000为4.84~9.68%，水溶液为6.88%~6.45%，其中水溶液中核酸适配体的浓度为100 μmol。

7.一种制备如权利要求6所述的基于光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱，其特征在于：包括以下步骤：

（1）按比例依次称取笼状低聚倍半多聚硅氧烷POSS-MA、甲基丙酸酸缩水甘油酯、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]-5-癸烯的四苯基硼酸盐、四氢呋喃和聚乙二醇于2mL的离心管中，振荡20min，形成均一溶液；

（2）将巯基修饰的核酸适配体使用前用8000r/min离心5分钟，加入水稀释到100 μmol/L，90℃加热3分钟，冷却至室温后，按比例称取核酸适配体溶液加入步骤（1）制得的溶液中，超声脱气20min，将得到的聚合溶液注入采用3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷预处理好的石英毛细管中，毛细管两端用橡胶塞封端，放入紫外交联仪中，在紫外光辐照下反应7min，在石英毛细管中发生巯烯点击、烯基自聚、巯基-环氧开环混杂固化；制备好的整体柱连接至高压泵，采用甲醇水冲洗；

（3）步骤（2）所制备的核酸适配体修饰整体柱放在缓冲液中，于4℃温度下保存。

8.根据权利要求7所述的一种光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱的制备方法，其特征在于：步骤（2）紫外交联仪中的紫外光波长为365nm。

9.根据权利要求7所述的一种光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、5mmol/L KCl和20mmol/L CaCl₂组成。

10.根据权利要求7所述的一种光引发混杂聚合的核酸适配体功能化亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述的核酸适配体的碱基序列为5'-SH-C6-GAT CGG GTG TGG GTGGCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3'。