CN114682309A

CN114682309A - 芯片、制备芯片的方法及芯片的用途

Info

Publication number: CN114682309A
Application number: CN202011591819.1A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 何晨菲; 江湘儿; 林玉彬; 原超峰; 沈玥
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN114682309B

Abstract

本发明提出了一种芯片，该芯片包括：基底，所述基底上连接有连接分子，所述连接分子远离所述基底的一端携带羟基，所述羟基被酸不稳定基团保护，所述连接分子通过起始分子和间隔分子与所述基底相连，其中，所述起始分子与所述基底相连，所述间隔分子与所述起始分子形成共价连接，所述连接分子的一端与所述间隔分子远离所述起始分子的一端相连，所述间隔分子包括至少一个选自下列的单体：氨基庚酸、丁二酸酐‑己二胺和TESHBA。该芯片表面的修饰分子分布均匀，能够保证后续生物大分子合成的需求，并且该芯片制备的方法简单、步骤简短，利于大规模生产。

Description

芯片、制备芯片的方法及芯片的用途

技术领域

本发明涉及生化领域，具体地，涉及芯片及其制备方法和用途。

背景技术

生物芯片，又称蛋白芯片或基因芯片，通常也简称为芯片，一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白质、糖分子、组织等)的微阵列杂交型芯片(micro-arrays)，阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的序列点阵，是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。生物芯片具有高通量、高灵敏度、高集成度等特点，因此广泛应用于分子生物学、生物医学、药物研发等多个领域。

然而，目前用于合成生物大分子的芯片仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决以上技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种芯片。根据本发明的实施例，所述芯片包括：基底，所述基底上连接有连接分子，所述连接分子远离所述基底的一端携带羟基，所述羟基被酸不稳定基团保护，所述连接分子通过起始分子和间隔分子与所述基底相连，其中，所述起始分子与所述基底相连，所述间隔分子与所述起始分子形成共价连接，所述连接分子的一端与所述间隔分子远离所述起始分子的一端相连，所述间隔分子包括至少一个选自下列的单体：氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺和TESHBA(N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺)。

根据本发明的实施例，本发明的发明人意外地发现，通过采用间隔分子修饰芯片表面，尤其是采用氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺、TESHBA(N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺)的至少之一所形成的间隔分子，能够有效地提高采用该生物芯片进行生物大分子合成时的合成效率，并且能够有效地降低错误率。根据本发明的实施例，该芯片可以用于制备的生物大分子包括但不限于包括蛋白质、核酸、多肽、多糖和多磷酸酯的至少之一。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备前面所述芯片的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：(1)使起始分子与基底相连；(2)使间隔分子与所述起始分子形成共价连接；(3)使所述间隔分子远离所述起始分子的一端与连接分子相连，以便获得所述芯片，其中，所述连接分子远离所述基底的一端携带羟基，所述羟基被酸不稳定保护，其中，所述间隔分子包括至少一个选自下列的单体：氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺和TESHBA。

根据本发明的实施例，该方法能够有效地制备前面所述的芯片，如前所述，本发明的发明人发现，通过采用间隔分子修饰芯片表面，尤其是采用氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺、TESHBA的至少之一所形成的间隔分子，能够有效地提高采用该生物芯片进行生物大分子合成时的合成效率，并且能够有效地降低错误率。根据本发明的实施例，该芯片可以用于制备的生物大分子包括但不限于包括蛋白质、核酸、多肽、多糖和多磷酸酯的至少之一。

本发明的发明人在实践本发明的技术方案时，发现采用本发明的芯片，由于其表面能够设置有足够多的修饰分子，因而能够保证生物大分子的合成或检测量；芯片表面具有占位分子，可以避免因空间位阻过大造成的生物大分子合成效率降低；连接分子末端的酸不稳定保护基团使芯片便于进行芯片修饰质量的表征检测。此外，可以采用简单便捷的制备工艺进行本发明芯片的大规模生产，所得到的芯片能够满足后续的使用需求。

在本发明的第三方面，本发明提出了上述芯片在合成生物大分子中的用途，本发明的芯片可以广泛应用于基于单体多聚合成的多种生物大分子的低成本、高通量合成，如DNA合成、RNA合成、多肽合成、多糖合成、多磷酸酯合成等，也可在生物检测领域有巨大应用潜力。本发明的芯片，其特殊的化学修饰结构分布均匀、空间位阻可调节，羟基保护基团设计巧妙，能够保证高通量、低成本、低错误率的生物大分子合成。

附图说明

图1为根据本发明一个实施例的基于浸泡-识别-分选的寡核苷酸合成方法示意图；

图2为本发明实施例1的芯片修饰流程；

图3为本发明实施例2的芯片修饰流程；

图4为本发明实施例3的芯片修饰流程；

图5为本发明实施例4的芯片修饰流程；

图6为本发明实施例5的T₃₀标样的HPLC标准谱图谱；

图7为本发明实施例5中以一个Boc-7-氨基庚酸作为间隔分子的T₃₀产物的HPLC分析图谱；

图8为本发明实施例5中以两个Boc-7-氨基庚酸作为间隔分子的T₃₀产物的HPLC分析图谱；和

图9为本发明实施例6的PCR产物凝胶电泳图；

图10为根据本发明一个实施例的基底表面占位分子与起始分子的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种芯片。根据本发明的实施例，该芯片包括：基底，所述基底上连接有连接分子，所述连接分子远离所述基底的一端携带羟基，所述羟基被酸不稳定基团保护，所述连接分子通过起始分子和间隔分子与所述基底相连，其中，所述起始分子与所述基底相连，所述间隔分子与所述起始分子形成共价连接，所述连接分子的一端与所述间隔分子远离所述起始分子的一端相连，所述间隔分子包括至少一个选自下列的单体：氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺和TESHBA(N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺)。

根据本发明的实施例，本发明的发明人意外地发现，通过采用间隔分子修饰芯片表面，尤其是采用氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺和TESHBA的至少之一所形成的间隔分子，能够有效地提高采用该生物芯片进行生物大分子合成时的合成效率，并且能够有效地降低错误率。根据本发明的实施例，该芯片可以用于制备的生物大分子包括但不限于包括蛋白质、核酸、多肽、多糖和多磷酸酯的至少之一。其中，优选采用的间隔分子为Boc-7-氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺和TESHBA，尤其是1～2个Boc-7-氨基庚酸所形成的间隔分子。

根据本发明实施例的芯片，其结构和修饰效果好，并且芯片便于表征，只需紫外分光光度计即可定量分析芯片表面修饰的分子载量，合成后的芯片具有酸不稳定基团，在酸的作用下可水解暴露出被保护的羟基，从而进行后续生物样大分子合成，并且使用HPLC即可定量检测酸不稳定基团的含量，进而分析修饰后芯片的合成效果，利于在商业化大规模生产中进行质控。

需要说明的是，在本文中所采用的术语“芯片”如无特别说明是指生物芯片，尤其是用于生物分子诸如生物大分子合成的生物芯片。通常而言，在本文中可以采用的生物芯片的基材可以包括但不限于硅晶圆、玻璃或高分子材料。

根据本发明的实施例，起始分子与基底通过下列至少之一相连：Si-O-Si,Al-O-Si,Zr-O-Si,Fe-O-Si,Si-OH----HO-Si氢键键合,Si-OH----OEt-Si和Si-O^-----NH₃ ⁺；起始分子的另一端通过氨基和羟基的至少之一与间隔分子形成共价连接。根据本发明的实施例，起始分子可以是通过采用硅烷化试剂对基底表面进行处理而得到，根据本发明的实施例，可以采用的对基底表面进行硅烷化处理且末端可与其他分子键合的硅烷化试剂，包括但不限于APTMS(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)、APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)、AEAPTES(N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三乙氧基硅烷)、AEAPTMS(N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷)和AHAMTES(N-(6-氨基己基)氨基甲基三乙氧基硅烷)，其中，优选APTMS和/或APTES。

根据本发明的具体实施例，当起始分子为具有乙氧基的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)时，乙氧基可与芯片表面的Si-OH键直接进行缩醇反应，形成Si-O-Si键连接在芯片表面，且在无水条件下APTES分子之间无法进行缩水反应，形成的分子层为单分子层，较为规则，有利于下一步反应。

另外，根据本发明的实施例，连接分子携带羧基，羧基与间隔分子的末端氨基形成共价连接。根据本发明的具体实施例，连接分子可以具有任选被取代的下列结构式：

另外，需要说明的是，芯片表面可以进一步携带占位分子，占位分子的一端通过烷氧基硅基团与基底相连，占位分子的另一端携带烷基。换句话说，芯片表面在连接起始分子之外的其他位置，也可以被占位分子修饰，占位分子修饰后无法进行后续反应，即不可以进一步连接间隔分子和连接分子，进而不能连接生物大分子。由此，可以保证修饰后的芯片空间位阻适宜，避免因空间位阻太大影响生物大分子的合成效率。

根据本发明的实施例，芯片表面所携带的占位分子也可以是由硅烷化试剂对基底表面进行改性处理而形成的，这里所使用的硅烷化试剂称为第二硅烷化试剂，第二硅烷化试剂与用于形成起始分子的第一硅烷化试剂不同，第二硅烷化试剂为一端为烷氧基硅基团，另一端为烷基的硅烷化试剂，烷基末端无法继续与其他间隔分子或连接分子键合，终止了反应，不可以进一步连接间隔分子和连接分子，进而不能连接生物大分子。由此，可以保证修饰后的芯片空间位阻适宜，避免因空间位阻太大影响生物大分子的合成效率。基底表面占位分子与起始分子的结构如图10所示。发明人经过大量的实验研究发现，当占位分子与起始分子的摩尔比为约1:1时，芯片表面上羟基(或氨基)与烷基各占一半，而羟基(或氨基)可继续反应，烷基则停止反应，从而使得芯片表面空间位阻较为合理。这里需要说明的是，这里所使用的术语“约”为在本数基础上上下浮动10％。

需要说明的是，在本文中“芯片表面”与“基底表面”是可以互相交换使用的。

根据本发明的实施例，可以使用的酸不稳定保护基团为三苯甲基。由此，可以实现通过“脱保护-连接反应”的循环来实现可控多轮反应，从而得到期望的生物大分子。

根据本发明的实施例，该芯片可以用于制备的生物大分子包括但不限于蛋白质、核酸、多肽、多糖和多磷酸酯的至少之一。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备前面所述芯片的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：

(1)使起始分子与基底相连；

(2)使间隔分子与所述起始分子形成共价连接；

(3)使所述间隔分子远离所述起始分子的一端与连接分子相连，以便获得所述芯片，其中，所述连接分子远离所述基底的一端携带羟基，所述羟基被酸不稳定保护；

其中，

所述间隔分子包括至少一个选自下列的单体：

氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺和TESHBA。

根据本发明的实施例，起始分子的一端与基底相连，起始分子的另一端通过氨基和羟基的至少之一与间隔分子形成所共价连接。

根据本发明的实施例，起始分子与基底通过下列至少之一相连：Si-O-Si,Al-O-Si,Zr-O-Si,Fe-O-Si,Si-OH----HO-Si氢键键合,Si-OH----OEt-Si和Si-O^-----NH₃ ⁺。

根据本发明的实施例，采用第一硅烷化试剂对基底表面进行处理，以使起始分子与基底相连，其中，第一硅烷化试剂的始端携带烷氧基硅基团，第一硅烷化试剂的末端携带氨基和羟基的至少之一，基底与第一硅烷化试剂始端的烷氧基硅基团形成Si-O-Si键，间隔分子与第一硅烷化试剂的末端形成共价连接。

根据本发明的实施例，第一硅烷化试剂包括选自APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)、APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷)、AEAPTES(N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三乙氧基硅烷)、AEAPTMS(N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷)和AHAMTES(N-(6-氨基己基)氨基甲基三乙氧基硅烷)的至少之一，优选地，第一硅烷化试剂为APTES和/或APTMS。根据本发明的具体实施例，第一硅烷化试剂为APTES，溶剂为丙酮，APTES在无水的环境下，其始端的乙氧基可与芯片表面的Si-OH键直接进行缩醇反应，形成Si-O-Si键连接在基底表面，且在无水条件下APTES分子之间无法进行缩水反应，形成的分子层为单分子层，较为规则，有利于后续间隔分子连接于其上。

根据本发明的实施例，使占位分子与基底相连，占位分子的一端通过烷氧基硅基团与所述基底相连，所述占位分子的另一端携带烷基；优选地，所述占位分子与所述起始分子的摩尔比为约1:1。

根据本发明的实施例，芯片表面所携带的占位分子也可以是由硅烷化试剂对基底表面进行处理而形成的，这里所使用的硅烷化试剂称为第二硅烷化试剂，第二硅烷化试剂与用于形成起始分子的第一硅烷化试剂不同，第二硅烷化试剂始端可以与基底形成Si-O-Si键，进而连接于基底表面，但第二硅烷化试剂的末端携带烷基，不可以再进一步进行化学反应，不会与间隔分子相连，进而不会衔接连接分子。在硅烷化反应中加入第二硅烷化试剂，可以保证芯片空间位阻适宜，避免因空间位阻太大影响生物大分子合成效率，即：修饰后的芯片上携带有连接于基底表面的第二烷基化试剂，同时携带有完整的化学修饰(第一烷基化试剂形成的起始分子、与起始分子相连的间隔分子、与间隔分子相连的连接分子)，避免了芯片空间位阻过大的情况。基底表面占位分子与起始分子的结构如图10所示。

根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括：利用第二硅烷化试剂对基底表面进行处理，以便使基底表面携带占位分子，占位分子的一端通过烷氧基硅基团与基底相连，占位分子的另一端携带烷基。

根据本发明的实施例，所述基底表面同时被第一硅烷化试剂和第二硅烷化试剂处理，优选地，所述第一硅烷化试剂与第二硅烷化试剂的摩尔比约为1:1。发明人发现，采用摩尔比为1：1的第一烷基化试剂与第二烷基化试剂，同时对芯片进行处理，可以保证芯片表面的空间位阻合适，利于芯片用于核酸合成。

根据本发明的实施例，间隔分子为寡聚物，寡聚物的单体包括选自丁二酸酐-己二胺、氨基庚酸和TESHBA的至少之一。根据本发明实施例的芯片，间隔分子始端需带有可与起始分子末端反应的基团，与硅烷化试剂的末端相连，末端一般为氨基，可以与连接分子相连。优选地，单体为Boc-7-氨基庚酸，去除Boc-7-氨基庚酸的Boc保护基，可以进行进一步接枝，即：继续连接一个或多个单体，以便延长间隔分子，也可以与连接分子进行连接。

根据本发明实施例的芯片，间隔分子可以通过连接不同个数的单体调节其长度，进而调节芯片表面化学修饰结构的长度，从而改变芯片的空间位阻。根据本发明的实施例，寡聚物携带1-2个单体，优选1-2个Boc-7-氨基庚酸，空间位阻更合适，用于核酸合成效率更高。

根据本发明的实施例，所述连接分子携带羧基，所述羧基与所述间隔分子的末端氨基形成共价连接。根据本发明实施例的芯片，连接分子始端为带有可与氨基反应的官能团，可以与间隔分子的末端相连，优选地，始端官能团为羧基；连接分子的末端为带有酸不稳定性保护基的羟基，用酸处理时可将羟基保护基去除以暴露出羟基，以便能够进行生物大分子合成；连接分子的中间可以是酯基、脂基、硫酯基、邻硝基苄基、香豆素基团、羟基、巯基、巯醚基、羧基、醛基、氨基、胺基、酰胺基、烯基、炔基中任意一种或多种官能团的化合物。当后续合成的生物大分子为核酸时，核酸合成在芯片上完成后，连接分子与核酸连接，进行氨解处理时，连接分子可以容易地与核酸断开、脱掉，以便获得合成的核酸。

根据本发明的实施例，连接分子具有任选被取代的下列结构式：

根据本发明的实施例，所述酸不稳定保护基团为三苯甲基。根据本发明实施例的芯片，酸不稳定保护基团可以为4,4’-二甲氧基三苯甲基，酸不稳定基团可以用酸试剂去除，酸试剂可以是二氯乙酸、三氯乙酸或三氟乙酸。酸不稳定基团去除后，连接分子的羟基可以用于生物大分子合成，此外，还可以收集酸不稳定基团溶液，利用分光光度计检测酸不稳定基团的含量，进而判断芯片表面的连接分子的数目。

根据本发明的具体实施例，芯片可以采取多种方法进行检测分析及定量。通过加入酸进行脱保护，对收集溶液的颜色进行定性观测，溶液为红色表明连接分子连接成功，即芯片修饰成功，进一步的，对收集的红色溶液进行定量，即通过紫外可见分光光度计进行定量，进一步定量芯片表面连接分子的分子数，以确定芯片表面分子载量。当需要合成的生物大分子为核酸时，为了定性检测芯片用于核酸合成的效果，修饰后的芯片上机合成T₃₀引物，下机氨解后使用Nanodrop检测寡核苷酸的合成量，使用高效液相色谱仪(HPLC)检测其纯度，进一步推算核酸合成的单循环效率。当需要合成的生物大分子为多肽、多糖等物质时，也可以使用液相色谱、质谱等方法检测所合成的生物大分子的纯度及合成量。根据本发明实施例的芯片表面连接分子密度可达2.89pmol/mm²，连接分子密度高，并且分布均匀，适合核酸合成。

根据本发明的具体实施例，芯片制备过程中的所有反应过程均选择浸泡超声处理，保证反应完全，芯片的化学修饰分布均匀，稳定性高。

本发明的芯片制备方法简单、便捷，适用于大规模芯片生产，且所得到的芯片能够满足后续的使用需求。如前所述，本发明的发明人意外地发现，通过采用间隔分子修饰芯片表面，尤其是采用氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺和TESHBA的至少之一所形成的间隔分子，能够有效地提高采用该生物芯片进行生物大分子合成时的合成效率，并且能够有效地降低错误率。

在本发明的第三方面，本发明还提出了上述芯片在合成生物大分子中的用途，可选的，生物大分子包括选自蛋白质、核酸、多肽、多糖和多磷酸酯的至少之一。参考图1，如前所述采用保护基团对连接分子的羟基进行保护。由此，可以实现通过“脱保护-连接反应”的循环来实现可控多轮反应，从而得到期望的生物大分子。

关于合成生物大分子的方法和步骤，本领域技术人员可以采用本领域中公知的手段进行，也可以参考本发明的具体实施例中所列出的方法，在此不再赘述。

下面将结合具体实施例对本发明进行进一步解释说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

本发明中的实施例所使用试剂均购买于供应商，且无需做进一步纯化。

主要试剂、耗材：

合成固相载体：1000nm氧化硅片(2*2*0.45mm)

ACN(乙腈)：北京迪纳兴科

去保护试剂：3％TCA Deblock北京迪纳兴科

活化剂：0.25M Activator北京迪纳兴科

亚磷酰胺单体A、T、C、G:Sigma Aldrich

氧化剂：0.05M Oxidizing北京迪纳兴科

CAP A：乙酸酐/吡啶/四氢呋喃1/1/8，北京迪纳兴科

CAP B：17.6％w/v氮-甲基咪唑/乙腈，北京迪纳兴科

氨水：国药

T₃₀标样：国家基因库

TA克隆试剂盒：pMDTM19-T，TaKaRa

主要仪器：

高效液相色谱：Agilent 1260

电热恒温水槽：上海精宏，DK-8D

真空离心浓缩仪：Eppendorf,Concentrator plus

离心机：湘仪，H1650R

微量紫外分光光度计：Thermo Scientific,Nanodrop 2000

PCR仪：Tiobot

超声仪：新芝，SB-120DT

寡核苷酸合成实验方案：

对于以下实施例中获得的芯片，基于附图1所示的基于浸泡-识别-分选的寡核苷酸合成方法，分别在芯片上进行寡核苷酸合成，并通过对得到的寡核苷酸产物(T₃₀)进行Nanodrop定量及HPLC分析验证、对比合成效果，特别是单步合成效果，最后通过对合成的一系列寡核苷酸产物进行小片段基因组装、Sanger测序进一步确定本发明的可行性。

实施例1：Boc-7-氨基庚酸作为间隔分子的芯片修饰

芯片修饰的过程如图2所示，具体步骤如下：

1、将二维码裸芯片(2*2*0.45mm)置于50mL离心管中，加入25mL去离子水，盖紧密封封口膜，超声震荡清洗10min，使用去离子水清洗三次，丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

2、配制10mL 1％的硅烷化试剂(APTES:PTES＝1:1)，放入200片清洗过的二维码芯片，于超声仪超声45min，丙酮清洗5次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

3、取82mg Boc-7-氨基庚酸、120mg 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)于15mL离心管中，加入300μL N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)及15mL乙腈，摇匀后放入200片硅烷化的二维码芯片，于超声仪中超声4h，反应完成后，收集芯片，分别用乙腈、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

4、取2mL TFA(不饱和脂肪酸)、2mL二氯甲烷于5mL离心管，加入干燥后的二维码裸芯片，于超声仪中超声1h脱去Boc保护基，反应完成后，收集芯片，分别用二氯甲烷、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

5、取206mg连接分子、120mg HATU于15mL离心管中，加入300μL DIPEA及15mL乙腈，摇匀后放入干燥后的二维码裸芯片，于超声仪中超声4h，反应完成后，收集芯片，分别用乙腈、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min；连接分子如下：

6、取30片修饰的二维码芯片，使用TCA脱保护溶液洗脱芯片表面的4,4’-二甲氧基三苯甲基，使用紫外可见分光光度计测定4,4’-二甲氧基三苯甲基的浓度，测定芯片的连接分子接枝密度。

7、将修饰完毕，干燥后的芯片收集至1.5mL离心管中，待用，此为Boc-7-氨基庚酸接枝一次的间隔分子芯片。

另外，在步骤4结束之后，重复步骤3-4，再进行步骤5-7可获得Boc-7-氨基庚酸接枝两次的长间隔分子芯片。

实施例2：无间隔分子的芯片修饰

芯片修饰的过程如图3所示，具体步骤如下：

1、将二维码裸芯片(2*2*0.45mm)置于50mL离心管中，加入50mL去离子水，盖紧密封封口膜，超声震荡清洗15min，使用去离子水清洗三次，丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

2、取丙酮200mL，APTES 1000μL，PTES 1000μL，按顺序依次加入到保鲜盒中，分成两盒，每盒混匀配制成100ml 1％的硅烷化试剂。将已晾干的5000芯片转移到保鲜盒，每盒2500片。加入100mL硅烷化试剂，盖紧，于超声仪超声45min。反应完成后转移到50mL离心管，沥干溶液，丙酮清洗5次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

3、取2.04g连接分子(结构同实施例1)、2.4g HATU、6mL DIPEA加入100mL乙腈中，摇匀后分装于两个50mL离心管中,每个离心管放入2500片硅烷化的二维码芯片，于垂直搅拌仪搅拌过夜，反应完成后，收集芯片，分别用乙腈、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

4、取30片修饰的二维码芯片，使用TCA deblock洗脱芯片表面DMT，使用紫外可见分光光度计测定DMT的浓度，测定修饰二维码芯片的Linker接枝密度。

5、将修饰完毕，干燥后的芯片收集至50mL离心管中，待用。

实施例3：丁二酸酐-己二胺作为间隔分子的芯片修饰

芯片修饰的过程如图4所示，具体步骤如下：

1、将二维码裸芯片(2*2*0.45mm)置于50mL离心管中，加入25mL去离子水，盖紧密封封口膜，超声震荡清洗10min，使用去离子水清洗三次，丙酮清洗三次，晾干。

2、配制5mL 1％的硅烷化试剂(APTES:PTES＝1:1)，放入150片清洗过的二维码芯片，于超声仪超声45min，丙酮清洗5次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

3、取17mg丁二酸酐溶于3mL DMF，摇匀后放入150片硅烷化的二维码芯片于垂直搅拌仪搅拌24h。反应完成后，收集芯片，分别用乙醇、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

4、取19mg己二胺、60mg HATU、150μL DIPEA溶于8mL乙腈，摇匀后放入150片硅烷化的二维码芯片于垂直搅拌仪过夜。反应完成后，收集芯片，分别用乙腈、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

5、取103mg Linker、60mg HATU、150μL DIPEA加入8mL乙腈中，摇匀后放入150片硅烷化的二维码芯片于垂直搅拌仪过夜。反应完成后，收集芯片，分别用乙腈、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

7、将修饰完毕，干燥后的芯片收集至1.5mL离心管中，待用。

实施例4：TESHBA作为间隔分子的芯片修饰

芯片修饰的过程如图5所示，具体步骤如下：

2、取丙酮5mL，TESHBA 50μL于15mL离心管中，放入100片清洗过的二维码芯片，于超声仪超声45min，丙酮清洗5次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

3、取38mg EDCI、24mg DMAP于15mL离心管中，加入8mL三氯甲烷搅拌15min，混合物加入103mg Linker，摇匀后放入100片硅烷化的二维码芯片搅拌30min，再加入10mg DMAP，于垂直搅拌仪搅拌过夜。反应完成后，收集芯片，分别用乙腈、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10min。

4、取30片修饰的二维码芯片，使用TCA脱保护溶液洗脱芯片表面的4,4’-二甲氧基三苯甲基，使用紫外可见分光光度计测定4,4’-二甲氧基三苯甲基的浓度，测定芯片的连接分子接枝密度。

5、将修饰完毕，干燥后的芯片收集至1.5mL离心管中，待用。

实施例5：基于修饰芯片的寡核苷酸T₃₀合成

使用浸泡-分选寡核苷酸合成法进行寡核苷酸的合成，如图1所示。其中方块为八种“合成池”(图示省略清洗步骤)，箭头为合成流程，通过识别分选、移动装置以控制芯片的移动、浸入和收集，合成完毕后可获得寡核苷酸库或单独寡核苷酸片段。具体步骤如下：

分别取20片上述5种不同修饰方法修饰后1000nm氧化硅芯片(规格：2*2*0.45mm,双面具有二维码)，加入75μL Cap A和75μL Cap B组成的盖帽试剂盖帽一次，再重复一次，共40s，乙腈清洗3次，然后加入去保护试剂TCA 150μL，15s，再重复一次，完成去保护步骤后，乙腈清洗3次，之后加入40μL亚磷酰胺单体T和60μL活化剂，反应60s，重复2次，共120s，完成偶联步骤，然后加入75μL Cap A和75μL Cap B组成的盖帽试剂盖帽一次，再重复一次，共40s，乙腈清洗，之后加入150μL氧化剂，氧化20s，重复一次，共40s，乙腈清洗3次，至此一个循环完成，将上述合成步骤循环30次，最后去保护(生化合成条件见表1)，氨水氨解，处理后得到T₃₀产物，进行Nanodrop定量及HPLC分析，HPLCT₃₀标样及以一个和两个Boc-7-氨基庚酸作为间隔分子的分析图谱见图6-8，多次实验得到的平均数据如表3所示。从表3的结果可知使用Boc-7-氨基庚酸作为间隔分子延长一次的芯片合成的T₃₀引物纯度更高，单循环效率可达98.6％。

表1生化合成条件

实施例6：基于1000nm氧化硅片的60nt寡核苷酸合成及基因组装测试、测序结果分析

为了进一步确认最佳合成载体，以明确本发明的可行性，基于浸泡-识别-分选的策略，参考附图1，分别合成8条60nt长度的寡核苷酸(序列如表2所示)，并进行基于一步法PCA/PCR反应策略的小片段基因组装、电泳验证目标条带正确性，最后通过切胶回收、TA克隆转化、菌落PCR、送Sanger测序，通过分析比对测序结果，最终确定最佳生化反应条件及固相合成载体。

表2寡核苷酸序列

分别取3片1000nm氧化硅片(规格：2*2*0.45mm,双面具有二维码)，合成8条目标60nt长度的寡核苷酸序列，上述5种修饰芯片中，每种修饰芯片总计24片，加入75μL Cap A和75μL Cap B组成的盖帽试剂盖帽一次，再重复一次，共40s，乙腈清洗3次，然后加入去保护试剂TCA 150μL，15s，再重复一次，完成去保护步骤后，乙腈清洗3次，之后加入40μL亚磷酰胺单体T和60μL活化剂，反应60s，重复2次，共120s，完成偶联步骤，然后加入75μL Cap A和75μL Cap B组成的盖帽试剂盖帽一次，再重复一次，共40s，乙腈清洗，之后加入150μL氧化剂，氧化20s，重复一次，共40s，乙腈清洗3次，至此一个循环完成，基于浸泡-识别-分选的策略，参考附图1，将上述合成步骤循环60次，最后去保护，8条引物(60nt-1-60nt-8)1片/条混合，分成3组(8片/组)氨解，处理后得到目标3组60nt混合产物各50μL。取10μL样品，分别加入4μL dNTPs、5μL Buffer、4μL首尾引物、0.5μL DNA聚合酶，用水将其体积补至50μL混匀，进行一步法PCA/PCR反应。使用降落PCR扩增35个循环后，产物于12℃保存。取2μL PCR产物点样至胶孔中，调节电压为180V，电泳时间为30min，进行电泳检测，参考附图9，Ctrl为标准合成引物对照,1-3为混合产物1组-3组,4-6为混合产物1组-3组。从图9可以看出，基于1000nm氧化硅片合成的60nt引物，组装成的315bp基因条带，与标准合成引物对比清晰、正确。

另外将条带正确的PCR产物切胶回收后，利用TaKaRa公司的TA克隆试剂盒(pMDTM19-T)进行克隆转化实验，菌落PCR验证条带正确的TA克隆转化子送Sanger测序，得到的错误率数据如表3所示。从表3结果可以看出，测序得到的错误率显示，Boc-7-氨基庚酸接枝一次的芯片平均错误率更低，为0.46％。

表3

总之，经过对1000nm氧化硅片进行不同长度的芯片表面化学修饰，以及基于修饰芯片进行基于浸泡-识别-分拣的一系列60nt寡核苷酸合成、基因合成测试，并对不同修饰长度的芯片合成HPLC分析结果进行对比，表明：本发明的芯片可以进行寡核苷酸的合成，且与其他Spacer结构的修饰及无Spacer的修饰芯片对比，Boc-7-氨基庚酸接枝一次的芯片合成效果最好，相应的T₃₀引物的平均单步合成效率达到98.60％，最终通过8条60nt引物合成、小片段组装、Sanger测序进一步验证了Boc-7-氨基庚酸接枝一次(间隔分子具有1个单体)的芯片(即芯片表面修饰长度更长的芯片)效果更佳，且混合组测序结果错误率为0.46％。以上实施例及实验结果均表明该发明的芯片可以用于生物大分子合成，且可以实现高通量、低成本的生物大分子合成，同时芯片制备步骤简单、操作简便，有利于大规模生产芯片。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 芯片、制备芯片的方法及芯片的用途

<130> PIDC3203423

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 60 nt-1

<400> 1

gtgccaattg tcaagctaag ttcagaataa ttttgtttaa cttttagaga ccaaggaggt 60

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 60 nt-2

<400> 2

agaagcaaga aaaatacgga gtacagcctt gtcatttttt acctccttgg tctctaaaag 60

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 60 nt-3

<400> 3

tccgtatttt tcttgcttct ggccttggtg gtggagcccg gtgtccgtgc gtggtctaag 60

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 60 nt-4

<400> 4

ataagtcctg tgctatttgg caggtcatta cgtgcccctc cttagaccac gcacggacac 60

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 60 nt-5

<400> 5

ccaaatagca caggacttat tggagcctga agcggctcac gccgtaaaga tgctgcttcc 60

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 60 nt-6

<400> 6

ccatacacac agggacgaga ggttcccatt ggcatagtca ggaagcagca tctttacggc 60

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 60 nt-7

<400> 7

tctcgtccct gtgtgtatgg cctgaccaaa ttaggcattg gtacaagtat gtagactgaa 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 60 nt-8

<400> 8

gatcaggtgc caatgttcag tctacatact tgtaccaatg cctaatttgg tcaggccata 60

Claims

1.一种芯片，其特征在于，包括：

基底，所述基底上连接有连接分子，

所述连接分子远离所述基底的一端携带羟基，所述羟基被酸不稳定基团保护，

所述连接分子通过起始分子和间隔分子与所述基底相连，

其中，所述起始分子与所述基底相连，

所述间隔分子与所述起始分子形成共价连接，所述连接分子的一端与所述间隔分子远离所述起始分子的一端相连，

所述间隔分子包括至少一个选自下列的单体：

氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺和TESHBA。

2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述氨基庚酸为Boc-7-氨基庚酸；

优选地，所间隔分子包括1～2个Boc-7-氨基庚酸。

3.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述起始分子的一端与所述基底通过下列至少之一相连：Si-O-Si,Al-O-Si,Zr-O-Si,Fe-O-Si,Si-OH----HO-Si氢键键合,Si-OH----OEt-Si和Si-O^-----NH₃ ⁺；

可选的，所述起始分子的另一端通过氨基和羟基的至少之一与所述间隔分子形成共价连接。

4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述连接分子携带羧基，所述羧基与所述间隔分子的末端氨基形成共价连接；

所述连接分子具有任选被取代的下列结构式：

5.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片表面进一步携带占位分子，所述占位分子的一端通过烷氧基硅基团与所述基底相连，所述占位分子的另一端携带烷基。

6.根据权利要求5所述的芯片，其特征在于，所述占位分子与所述起始分子的摩尔比为约1:1。

7.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述酸不稳定保护基团为三苯甲基。

8.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于，进一步包括：

生物大分子，所述生物大分子与所述连接分子的羟基相连，所述生物大分子包括蛋白质、核酸、多肽、多糖和多磷酸酯的至少之一。

9.一种制备权利要求1～8任一项所述的芯片的方法，其特征在于，包括：

(1)使起始分子与基底相连；

(2)使间隔分子与所述起始分子形成共价连接；

(3)使所述间隔分子远离所述起始分子的一端与连接分子相连，以便获得所述芯片，其中，所述连接分子远离所述基底的一端携带羟基，所述羟基被酸不稳定保护，

其中，

所述间隔分子包括至少一个选自下列的单体：

氨基庚酸、丁二酸酐-己二胺和TESHBA。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述起始分子与所述基底通过下列至少之一相连：Si-O-Si,Al-O-Si,Zr-O-Si,Fe-O-Si,Si-OH----HO-Si氢键键合,Si-OH----OEt-Si和Si-O^-----NH₃ ⁺。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，采用第一硅烷化试剂对所述基底表面进行处理，以使所述起始分子与基底相连，所述第一硅烷化试剂的始端携带烷氧基硅基团，所述第一硅烷化试剂的末端携带氨基和羟基的至少之一，所述基底与所述烷氧基硅基团形成Si-O-Si键，所述间隔分子与所述第一硅烷化试剂的末端形成共价连接。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括：使占位分子与基底相连，所述占位分子的一端通过烷氧基硅基团与所述基底相连，所述占位分子的另一端携带烷基；

优选地，所述占位分子与所述起始分子的摩尔比为约1:1。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，采用第二硅烷化试剂对所述基底表面进行处理，以使所述占位分子与基底相连；

优选地，同时采用所述第一硅烷化试剂和第二硅烷化试剂对所述基底表面进行处理，以使所述起始分子和占位分子与基底相连；

优选地，所述第一硅烷化试剂和第二硅烷化试剂的摩尔比约1:1。

14.根据权利要求11或13所述的方法，其特征在于，所述第一硅烷化试剂包括选自下列的至少之一：APTES、APTMS、AEAPTES、AEAPTMS和AHAMTES；

优选地，所述第一硅烷化试剂为APTES和/或APTMS；

任选地，所述第二硅烷化试剂包括选自PTES和/或PTMS。

15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述氨基庚酸为Boc-7-氨基庚酸；

优选地，所述间隔分子包括1～2个Boc-7-氨基庚酸。

16.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述连接分子具有任选被取代的下列结构式：

17.权利要求1～7所述的芯片在合成生物大分子中的用途，

任选地，所述生物大分子包括蛋白质、核酸、多肽、多糖和多磷酸酯的至少之一。