CN116411354A - 固相载体的表面经修饰的基因芯片 - Google Patents

固相载体的表面经修饰的基因芯片 Download PDF

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CN116411354A CN202111669602.2A CN202111669602A CN116411354A CN 116411354 A CN116411354 A CN 116411354A CN 202111669602 A CN202111669602 A CN 202111669602A CN 116411354 A CN116411354 A CN 116411354A
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Abstract

本发明涉及一种固相载体的表面经修饰的基因芯片基底、含有该基底的基因芯片以及其用途。所述基因芯片基底其通过至少一次接枝间隔分子实现其固相载体的表面修饰，使得生物大分子如寡核苷酸可以高效地固定在基因芯片基底表面，并且合成完毕氨解后寡核苷酸仍能固定在基因芯片基底表面。由此，本发明的基因芯片具有提高的合成和扩增效率，适用于单链DNA扩增、捕获探针、杂交测序等，并且具有微型化和并行处理大规模信息的可行性，能够在一次试验中实现对大量核酸分子进行检测分析，比常规方法效率高几十到几千倍。

Description

固相载体的表面经修饰的基因芯片
技术领域
本发明涉及基因芯片领域，具体地，涉及一种固相载体的表面经修饰的基因芯片基底、含有该基底的基因芯片、及其用途。
背景技术
基因芯片是生物芯片的一种，又称DNA芯片(DNA Chip)、DNA微阵列芯片(DNAMicroarray Chip)，是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段。基因芯片主要利用原位合成或将已合成好的一系列寡核苷酸固定在介质上，制备高密度的寡核苷酸阵列，使基因样本与探针在载体表面杂交，可广泛应用于捕获探针、时空组学等方向。
基因芯片基底由于其表面活性位点少，很难与寡核苷酸有效结合，需要在芯片基底的表面进行适当地化学修饰。修饰过程包括硅烷化修饰、间隔分子接枝、连接分子接枝三个主要步骤。
其中，硅烷化修饰通过化学反应在基因芯片基底的表面键合活性基团，以便下一步修饰反应。有些用于活化的双功能硅烷化分子也可以作为间隔分子，如N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(TESHBA)，由于其结构本身易于自身交联形成络合物，且试剂粘稠，给实际生产使用带来了一定的困难。连接分子末端可以带有一个反应性基团，该基团可以与寡核苷酸链反应从而将寡核苷酸链固定在芯片基底上，进而应用于自动商业化DNA合成仪。但是，现有的连接分子如N-甲基-5-(琥珀酰氧基)-6-DMT-7-草酸双环[2.2.1]庚烷-2,3-二甲酰亚胺，在寡核苷酸合成结束后氨解时会与氨水反应并氨解断键，使寡核苷酸从芯片基底上切割下来，得到游离在水溶液中的引物。而一些原位合成的下游应用在合成结束后需要氨解脱去寡核苷酸链上的保护基，但并不期望将寡核苷酸链从芯片基底上切下。比如基因芯片上的单链DNA扩增、固态杂交、捕获探针等应用，需要原位合成的寡核苷酸链保持连接于基因芯片基底上以进行下一步的使用，这时，如果芯片基底上修饰使用的是氨解会断键的连接分子，则该基因芯片无法用于这一类下游应用。
因此，针对上述现有的基因芯片的表面化学修饰，普遍存在的问题包括例如成本高，芯片基底与寡核苷酸固定效果较弱，不利于商业化生产及后续应用等，本领域仍需要更利于基因芯片的不同功能应用的表面修饰方式。
发明内容
针对基因芯片的表面化学修饰普遍存在的问题，本发明的发明人经过筛选，找到一种适于在基因芯片的固相载体进行表面修饰的化学结构，使基因芯片经过本发明的修饰方式，不仅具有提高的合成和扩增效率，适用于如单链DNA扩增、捕获探针、杂交测序等不同功能应用，并且具有微型化和并行处理大规模信息的可行性。
在本发明的第一方面，提供了一种基因芯片基底，其固相载体上顺序连接有至少一个间隔分子，其中，所述间隔分子具有能够彼此偶联的始端基团和末端基团。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种对基因芯片基底的固相载体进行表面修饰的方法，包括：通过至少一次接枝反应使间隔分子顺序连接于所述固相载体表面上硅烷的末端，其中，所述间隔分子具有能够彼此偶联的始端基团和末端基团。
在本发明的第三方面，提供了第一方面所述的基因芯片基底或由第二方面所述的方法得到的基因芯片基底用于合成寡核苷酸的用途。
在本发明的第四方面，提供了一种基因芯片，其包括：
a)第一方面所述的基因芯片基底或由第二方面所述的方法得到的基因芯片基底；以及
b)固定于与所述基因芯片基底上的寡核苷酸片段。
本发明提出的修饰方法简便、步骤简短、反应过程无需特殊仪器，可以根据下游应用的需求更改基因芯片基底上的表面修饰结构的长度，这样的修饰结构由于有比较大的伸展空间，可以降低空间位阻，保证偶联反应效率，并且不会大幅度降低载量，确保了芯片的高效高通量合成。
本发明提出的基因芯片基底的修饰结构可以直接用于寡核苷酸的(原位)合成，并且合成完毕氨解后寡核苷酸仍能固定在芯片表面的修饰方法。由此，使得本发明的基因芯片适合应用于制作捕获探针、杂交测序等一系列微阵列生物芯片，这些微阵列芯片能够微型化和并行处理大规模的信息,比常规方法效率高几十到几千倍,一次试验中可对大量核酸分子进行检测分析。此外，本发明的基因芯片还具有点样密度高、数据准确度高、集成化、自动化、样品用量微量化的优点。
附图说明
本发明附图与本发明的具体实施方式一起提供了对本发明的进一步解释，并且构成说明书的一部分。显而易见地，下面描述的附图仅仅涉及本发明的一些实施方式，而并不构成对本发明的限制。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。
图1示出了根据本发明的一个实施方案对基因芯片的固相载体表面依次进行硅烷化修饰、一次间隔分子接枝、连接分子接枝的反应流程图和表面化学结构。
图2示出了根据本发明的一个实施方案对基因芯片的固相载体表面依次进行硅烷化修饰、两次间隔分子接枝、连接分子接枝的反应流程图和表面化学结构。
图3示出了根据本发明的一个实施方案对基因芯片的固相载体表面依次进行硅烷化修饰、三次间隔分子接枝、连接分子接枝得到的表面化学结构。
图4示出了根据本发明的一个实施方案对基因芯片的固相载体表面依次进行硅烷化修饰、四次间隔分子接枝、连接分子接枝得到的表面化学结构。
图5示出了使用现有技术的无间隔分子的基因芯片和使用根据本发明的不同间隔分子接枝次数(1-4次)的基因芯片扩增得到的目标单链DNA经由凝胶成像仪的电泳成像图，其中X为间隔分子接枝次数。
具体实施方式
下面将对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
另外，除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。应注意，本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，而并非旨在限制本发明。上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。
如上所述，本发明的发明人经过筛选，找到了一种修饰基因芯片的固相载体表面的合适的化学结构。本发明的发明人首次提出一种根据需要适当延长固相载体的表面修饰的长度的基因芯片结构，这样的结构由于有比较大的伸展空间，可以降低空间位阻，保证偶联反应效率，并且不会大幅度降低载量，确保了基因芯片的高效高通量合成。
在第一方面，提供了一种基因芯片基底，其固相载体上顺序连接有至少一个间隔分子，其中，所述间隔分子具有能够彼此偶联的始端基团和末端基团。
在一个具体的实施方案中，所述基因芯片基底的固相载体上顺序连接有至少两个间隔分子。
在又一个具体的实施方案中，所述至少一个间隔分子是1-10个。如本文所用的，至少一个、至少两个或更多个间隔分子的修饰使基因芯片表面的空间位阻适宜，能够防止后续合成过程中基因芯片空间上过于拥挤。在一些情况下，所述至少一个间隔分子如至少两个、三个或四个间隔分子可以是相同或不同的，并且优选是相同的。
在一个实施方案中，所述至少一个间隔分子是1-5个，例如为1个、2个、3个、4个或5个。
在一个实施方案中，所述间隔分子的始端基团选自羟基、羧基、氨基、乙酰基、环氧基；以及末端基团为氨基。
在一个优选的实施方案中，所述间隔分子的末端基团可以为经保护的氨基，例如，叔丁氧羰基(Boc)保护的氨基、对甲苯磺酰基(Tos)保护的氨基、三氟乙酰基(Tfa)保护的氨基、三苯甲基(Trt)保护的氨基等，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，所述间隔分子可以包括C6-C15烷基二胺，如己二胺、十二烷二胺，氨基保护的氨基C6-C15烷基酸、丁二酸酐、(DMT-dT亚磷酰胺)1-10等，但不限于此。
在一个进一步优选的实施方案中，所述氨基保护的氨基C6-C15烷基酸可以选自叔丁氧羰基保护的7-氨基庚酸(Boc-7-氨基庚酸)、对甲苯磺酰基保护的7-氨基庚酸(Tos-7-氨基庚酸)、三氟乙酰基保护的6-氨基己酸(Tfa-6-氨基己酸)、三苯甲基保护的6-氨基辛酸(Trt-6-氨基辛酸)、DMT-dT亚磷酰胺单体等，但不限于此。
在一个最优选的实施方案中，所述间隔分子可以是叔丁氧羰基保护的7-氨基庚酸(Boc-7-氨基庚酸)。当使用Boc-7-氨基庚酸作为间隔分子时，可以理解，由于其始端的羧基与末端的氨基能够发生反应，因此能够根据需要接枝至少一个或更多个Boc-7-氨基庚酸，以进一步延长固相载体表面修饰的长度，进而适应后续各种合成的需要。
在又一个具体实施方案中，所述固相载体为氧化锆片、氧化硅片、氧化铝片、石英片等，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述固相载体可以为氧化硅片。相应地，所述固相载体表面可以具有例如Si-O-、Al-O-，Zr-O-，Fe-O-键。
在又一个具体的实施方案中，所述固相载体的表面依次连接有硅烷、所述间隔分子、以及连接分子；优选地，所述连接分子的末端为羟基，优选为带有保护基的羟基。
在一个具体的实施方案中，所述硅烷选自3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPTES)、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AHAMTES)、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(TESHBA)，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述硅烷可以为APTES。
在一个具体的实施方案中，所述连接分子的末端羟基带有保护基。所述保护基是酸不稳定性的，例如三苯甲基及其衍生物、三甲基矽基(TMS)、甲氧基甲基醚(MOM)、四氢吡喃(THP)，如4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)，但不限于此。当用酸处理时，可以去除该羟基保护基以暴露出羟基，即，脱保护。例如，用脱保护剂如二氯乙酸(DCA)、三氯乙酸(如3％TCABeblock)或三氟乙酸在有机溶剂(如二氯甲烷，乙腈)的溶液处理。观察溶液为红色或橙红色表明基因芯片被脱保护，也表明连接分子连接成功，即基因芯片载体的表面修饰成功。在有些情况下，可能通过肉眼观察不到明显的橙红色，则可以通过紫外分光光度计检测495nm处的吸光度，然后可以通过吸光度计算保护基如DMT的量，进而得出芯片载量。
在一个进一步具体的实施方案中，所述连接分子的始端基团为羧基、氨基、羟基、乙酰基等，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述连接分子的始端基团为羧基。
在一个优选的实施方案中，所述连接分子为在氨解过程中不被切断的连接分子。在一个优选的实施方案中，所述连接分子包括6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸(6-ODMT-己酸)、6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-己胺等，但不限于此。在一个更优选的实施方案中，所述连接分子为6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸(6-ODMT-己酸)。本发明的连接分子的选择避免了在其结构中出现氨解时会断键的基团，或者说本发明的连接分子的结构在氨解过程稳定，这使得与连接分子连接的寡核苷酸在氨解时不会被断键切下。
在第二方面，本发明提供了一种对基因芯片基底的固相载体进行表面修饰的方法，包括：通过至少一次接枝反应使间隔分子顺序连接于所述固相载体表面上硅烷的末端，其中，所述间隔分子具有能够彼此偶联的始端基团和末端基团。
在一个具体的实施方案中，所述固相载体为氧化锆片、氧化硅片、氧化铝片、石英片等，但不限于此。相应地，所述固相载体表面可以具有例如Si-O-、Al-O-，Zr-O-，Fe-O-键。
在一个优选的实施方案中，所述基因芯片的固相载体为氧化硅片。
在一个具体的实施方案中，所述至少一次接枝反应可以是1-10次。
在一个优选的实施方案中，所述至少一次接枝反应可以是1-5次，例如1次、2次、3次、4次或5次。
在一个实施方案中，所述间隔分子的始端基团选自羟基、羧基、氨基、乙酰基、环氧基；以及末端基团为氨基。
在一个优选的实施方案中，所述间隔分子的末端基团可以为经保护的氨基，例如，叔丁氧羰基(Boc)保护的氨基、对甲苯磺酰基(Tos)保护的氨基、三氟乙酰基(Tfa)保护的氨基、三苯甲基(Trt)保护的氨基等，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，所述间隔分子可以包括C6-C15烷基二胺，如己二胺、十二烷二胺，氨基保护的氨基C6-C15烷基酸、丁二酸酐、(DMT-dT亚磷酰胺)1-10等，但不限于此。
在一个进一步优选的实施方案中，所述氨基保护的氨基C6-C15烷基酸可以选自叔丁氧羰基保护的7-氨基庚酸(Boc-7-氨基庚酸)、对甲苯磺酰基保护的7-氨基庚酸(Tos-7-氨基庚酸)、三氟乙酰基保护的6-氨基己酸(Tfa-6-氨基己酸)、三苯甲基保护的6-氨基辛酸(Trt-6-氨基辛酸)、DMT-dT亚磷酰胺单体等，但不限于此。
在一个最优选的实施方案中，所述间隔分子可以是叔丁氧羰基保护的7-氨基庚酸(Boc-7-氨基庚酸)。当使用如Boc-7-氨基庚酸的这类分子作为间隔分子时，可以理解，由于其始端的羧基与末端的氨基能够发生反应，因此能够根据需要进行至少一次或更多次间隔分子的接枝反应，得到顺序连接至少一个或更多个间隔分子，以进一步延长固相载体表面修饰的长度，进而适应后续各种合成的需要。在某些情况下，通过所述至少一次接枝反应接枝的间隔分子可以是相同或不同的。
在又一个具体的实施方案中，所述方法还包括：使连接分子连接于所述间隔分子的末端。
在一个优选的实施方案中，所述连接分子的末端为羟基。这使得基因芯片基底能够通过连接分子上的末段羟基与寡核苷酸偶联。并且，由于本发明的连接分子的选择避免了在其结构中出现氨解时会断键的基团，或者说本发明的连接分子的结构在氨解过程稳定，这使得与连接分子连接的寡核苷酸在氨解时不会被断键切下。
在一个优选的实施方案中，所述连接分子的末端为带有保护基的羟基。这种保护基是酸不稳定性的，例如三苯甲基及其衍生物、三甲基矽基(TMS)、甲氧基甲基醚(MOM)、四氢吡喃(THP)，如4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)，但不限于此。当基因芯片基底用于合成寡核苷酸时，用酸处理，可以去除该羟基保护基以暴露出羟基，即，使所述基因芯片基底脱保护。
例如，用脱保护剂如二氯乙酸(DCA)、三氯乙酸(如3％TCA Beblock)或三氟乙酸在有机溶剂(如二氯甲烷，乙腈)的溶液处理。观察溶液为红色或橙红色表明连接分子连接成功，即基因芯片基底修饰成功。在有些情况下，可能通过肉眼观察不到明显的橙红色，则可以通过紫外分光光度计检测495nm处的吸光度，然后可以通过吸光度计算保护基如DMT的量，进而得出芯片载量。
因此，本发明的基因芯片便于表征，只需紫外分光光度计即可定量分析基底芯片基底的表面修饰的连接分子的载量，并且，合成了寡核苷酸的芯片也同样可以在合成结束前的最后一步脱保护之后，使用紫外分光光度计定量分析合成成功的全长寡核苷酸链的载量，这利于在商业化大规模生产中对合成效率进行质控。
在一个优选的实施方案中，所述连接分子为在氨解过程中不被切断的连接分子。在一个优选的实施方案中，所述连接分子选自6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸、6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-1-胺，但不限于此。
在一个进一步优选的实施方案中，所述连接分子为6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸。
在又一个具体的实施方案中，所述方法还包括：在接枝间隔分子之前，对所述固相载体进行硅烷化修饰。具体地，使硅烷化试剂与所述固相载体反应，使所述硅烷化试剂的一段连接于所述固相载体的表面，另一端与间隔分子相连。所述硅烷化修饰步骤可以采用本领域常用技术实现，例如溶液浸泡超声处理。这是出于表面修饰分子的均一性，同时考虑到高效的硅烷化以及操作的简便性的目的。
在一个优选的实施方案中，所述硅烷选自3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPTES)、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(AHAMTES)、γ-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)、N-(3-三乙氧基硅基丙基)-4-羟基丁酰胺(TESHBA)，但不限于此。
硅烷化试剂可以优选地采用本领域常用的APTES，溶剂为丙酮。APTES在无水的环境下，其一端的乙氧基可与基因芯片的固相载体表面的例如Si-O-键直接进行缩醇反应，形成Si-O-Si键连接在固相载体表面。并且在无水条件下，APTES分子之间无法进行缩水反应，形成的分子层为单分子层，较为规则，有利于下一步反应。
可以理解，当固相载体的表面功能基团密度过大时，DNA合成的空间位阻过大，则会降低偶联反应效率。但当表面基团密度过小时，芯片表面载量太小，则会降低通量。采取的优化方案可以例如本文所采用的，为了适当降低表面基团密度及空间位阻，在芯片表面功能基团上增加一段间隔分子和/或连接分子，并且通过间隔分子的数目去调节这段表面修饰的长度。由于本发明的这种表面修饰有比较大的伸展空间，可以降低空间位阻，保证偶联反应效率，又不至于大幅度降低载量，确保了芯片的高效高通量合成。
又例如，为了保证表面功能基团密度适宜，避免因空间位阻太大影响核酸合成效率，可以在硅烷化步骤中加入一部分占位分子。这种占位分子一端为与所述固相载体表面(如Si-O-、Al-O-，Zr-O-，Fe-O-)直接反应的基团如烷氧基硅基团，另外一端为无法继续反应的烷基链，如甲基、乙基、丙基等。同样可以理解，当占位分子的一端同硅烷化试剂一样与所述固相载体表面直接反应之后，由于其另外一端无法继续与后续修饰的分子进行反应，其阻止了固相载体表面的一部分反应位点进行后续反应，进而能够保证修饰后的基因芯片表面密度合理。
在又一个具体的实施方案中，所述占位分子为正丙基三乙氧基硅烷(PTES)，正丙基三甲氧基硅烷(PTMS)、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、正辛基三乙氧基硅烷、正癸基三甲氧基硅等，但不限于此。
在一个优选的实施方案中，所述占位分子为PTES。
在又一个具体的实施方案中，所述方法还包括在进行烷基化修饰之前，对所述固相载体的表面进行等离子清洗。
在本发明的第三方面，提供了根据第一方面所述的基因芯片基底或根据第二方面所述的方法得到的基因芯片基底用于合成寡核苷酸片段的用途。
本发明提出的在固相载体表面修饰的化学结构，可以根据需要适当延长表面修饰长度的结构，使其适用于不同种类的应用，例如合成寡核苷酸、单链DNA的扩增、捕获探针、杂交测序等，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，所述合成寡核苷酸片段是原位合成寡核苷酸片段。
在一个进一步具体的实施方案中，所述寡核苷酸片段是作为引物分子和/或探针分子，用于扩增单链DNA、捕获探针、和/或杂交测序。
在一个优选的实施方案中，所述扩增单链DNA是原位扩增单链DNA。
本发明的修饰方法简便、步骤简短、无需特殊仪器，经修饰的基因芯片可以直接用于寡核苷酸合成，合成完毕经氨解后寡核苷酸仍能固定在芯片表面，这使得本发明的基因芯片适用于制作扩增单链DNA、捕获探针、杂交测序等应用。
在本发明的第四方面，提供了一种基因芯片，其包括：
a.第一方面所述的基因芯片基底或由第二方面所述的方法得到的基因芯片基底；以及
b.固定于与所述基因芯片基底上的寡核苷酸片段。
在一个具体的实施方案中，所述固定通过在所述基因芯片基底上合成寡核苷酸片段。
在一个进一步具体的实施方案中，所述固定通过在所述基因芯片基底上原位合成寡核苷酸片段。可以理解，所述固定通过基因芯片基底上修饰的连接分子将所述寡核苷酸片段与基因芯片基底连接。
在又一个具体的实施方案中，所述寡核苷酸片段在所述基因芯片经氨解后不会被切下。由此可以直接用于后续应用，例如DNA扩增、固态杂交、捕获探针等。
在又一个具体的实施方案中，所述寡核苷酸片段是作为引物分子和/或探针分子，用于扩增单链DNA、捕获探针、和/或杂交测序。并且，所述寡核苷酸片段的长度可以包含1-100个碱基。
在一个优选的实施方案中，所述扩增单链DNA是原位扩增单链DNA。
由于本发明的前述修饰结构，本发明的基因芯片克服了现有技术中基因芯片难以表征偶联效率、修饰后芯片基底与寡核苷酸的固定量较少、固定效率较低、固相载体表面修饰结构长度不够灵活等缺陷，进而实现不同功能需求的应用，为基因芯片的商业化生产及后续应用提供有利条件。
实施例
为了验证本发明提出的一种在固相载体表面修饰的化学结构的可行性及潜在优势，以下实施例将以氧化锆片作为固相载体，对其采用不同个数的间隔分子进行表面修饰化，并通过表征确定本发明的基因芯片用于下游应用如长的单链DNA或超长的单链DNA的扩增可行性。
另外，如无特殊说明，本发明中采用的试验方法均为常规方法。本发明专利所使用试剂均购自供应商，且无需做进一步纯化。以下实施例中所用的试验材料厂家和货号信息具体如下。对于未列出的原料，均为常规市售产品。
试剂与仪器
ACN(乙腈)：北京迪纳兴科
去保护试剂：3％TCA Deblock，北京迪纳兴科
活化剂：0.25M Activator，北京迪纳兴科
反向亚磷酰胺单体A、T、C、G：Sigma Aldrich
氧化剂：0.05M Oxidizing，北京迪纳兴科
CAP A：乙酸酐/吡啶/四氢呋喃1/1/8，北京迪纳兴科
CAP B：17.6％w/v氮-甲基咪唑/乙腈，北京迪纳兴科
氨水：国药
Ex Taq：TaKaRa
dNTPs：TaKaRa
Sybe Gold：Invitrogen
TA克隆试剂盒：pMDTM19-T，TaKaRa
ssDNA 50 landder：bioruler
合成固相载体：氧化锆芯片(2mm×2mm×0.30mm)
Go Taq：Promega
高效液相色谱：Agilent 1260
电热恒温水槽：上海精宏，DK-8D
真空离心浓缩仪：Eppendorf,Concentrator plus
离心机：湘仪，H1650R
微量紫外分光光度计：Thermo Scientific,Nanodrop 2000
超声仪：新芝，SB-120DT
PCR仪：TROBOT
尿素变性胶电泳槽：BIO-RAD
凝胶成像仪：BIO-RAD
涡旋振荡器：Kylin-Bell
小型离心机：Kylin-Bell
实施例1：使用间隔分子Boc-7-氨基庚酸的修饰
在本实施例中，以APTES：PTES＝1：1为硅烷化试剂，Boc-7-氨基庚酸为间隔分子，6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸为连接分子，以氧化锆片作为固相载体，对其进行多种表面修饰，反应流程图如图1和图2所示，具体步骤如下：
预处理步骤：将固相载体氧化锆芯片(2mm×2mm×0.30mm)置于50mL离心管中，加入25mL去离子水，盖紧密封封口膜，超声震荡清洗3分钟，使用去离子水清洗三次，丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10分钟。
硅烷化修饰：配制5mL 1％的硅烷化试剂(APTES：PTES＝1：1)，放入100片清洗过的氧化锆芯片，于超声仪超声45分钟，丙酮清洗5次，晾干后置于75℃烘箱干燥10分钟。
间隔分子接枝：取41mg间隔分子Boc-7-氨基庚酸、60mg HATU于15mL离心管中，加入150μL DIPEA及7.5mL乙腈，摇匀后放入100片硅烷化的氧化锆芯片，于超声仪超声2h，反应完成后，收集芯片，分别用乙腈、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10分钟。
取1mL TFA、1mL二氯甲烷于5mL离心管，加入干燥后的氧化锆芯片，与超声仪超声1h脱去Boc保护基，反应完成后，收集芯片，分别用二氯甲烷、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10分钟。
连接分子接枝：取73mg连接分子6-ODMT-己酸、60mg HATU于15mL离心管中，加入150μL DIPEA及7.5mL乙腈，摇匀后放入干燥后的氧化锆芯片，于超声仪超声2h，反应完成后，收集芯片，分别用乙腈、丙酮清洗三次，晾干后置于75℃烘箱干燥10分钟。干燥后的芯片收集至1.5mL离心管中，待用。
其中，间隔分子接枝的步骤分别进行一次、两次、三次和四次。由此得到本发明的示例性基因芯片基底。图1给出了对表面带有羟基的固相载体依次进行硅烷化修饰(APTES：PTES＝1：1)、一次间隔分子接枝(Boc-7-氨基庚酸)和连接分子接枝(6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸)的反应流程图和表面化学结构(对比例)。图2给出了对表面带有羟基的固相载体依次进行硅烷化修饰(APTES：PTES＝1：1)、两次间隔分子接枝(Boc-7-氨基庚酸)和连接分子接枝(6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸)的反应流程图和表面化学结构。图3和图4分别示出了接枝三次Boc-7-氨基庚酸和接枝四次Boc-7-氨基庚酸的基因芯片的表面化学结构。
实施例2：31nt寡核苷酸引物的固定
在本实施例中，31nt寡核苷酸引物的序列(5’-3’)为：AGCGGATGAAGCGGATCGAGGAAGGCATTAA(SEQ ID NO:1)。
基于实施例1制备得到的基因芯片基底以及下表1的生化条件及操作步骤，在基因芯片基底进行寡核苷酸片段的固定。取实施例1制备得到的基因芯片基底，每种芯片2组，每组20片，每组加入75μL Cap A和75μL Cap B组成的盖帽试剂盖帽一次，再重复一次，共40秒，乙腈清洗3次，然后加入去保护试剂TCA 150μL，1秒，再重复一次，完成去保护步骤后，乙腈清洗3次，之后加入40μL反向亚磷酰胺单体(化学结构见表2)和60μL活化剂，反应60秒，重复2次，共120秒，完成偶联步骤，然后加入75μL Cap A和75μL Cap B组成的盖帽试剂盖帽一次，再重复一次，共40秒，乙腈清洗，之后加入150μL氧化剂，氧化20秒，重复一次，共40秒，乙腈清洗3次，至此一个循环完成，将上述合成步骤循环30次，所有步骤于无水无氧环境中进行。
表1：氧化锆芯片上合成寡核苷酸引物的生化条件
Figure BDA0003452587990000151
表2：反向亚磷酰胺单体的化学结构
Figure BDA0003452587990000152
合成结束后，所有芯片经氨水氨解，清洗处理后得到固定有31nt寡核苷酸引物的氧化锆基因芯片。
实施例3：经修饰的基因芯片基底和基因芯片的表征
取实施例1中制备得到的每种基因芯片基底和实施例2中固定有31nt寡核苷酸的(未脱保护)的每种基因芯片各30片，使用TCA deblock洗脱氧化锆芯片表面的DMT，使用紫外可见分光光度计测定DMT的浓度，分别测定实施例1中得到的基因芯片基底上连接分子的接枝密度和实施例2中得到的基因芯片上成功固定的31nt寡核苷酸引物的接枝密度，其结果列于下表3中。
表3：不同间隔分子数修饰的基因芯片基底上连接分子的接枝密度及基因芯片上固定的31nt寡核苷酸引物的接枝密度
间隔分子数 1 2 3 4
连接分子数(pmol/片) 47.50 50.19 69.83 47.23
31nt引物数(pmol/片) 34.28 31.78 21.21 28.84
由上可知，本发明的基因芯片可以成功连接不同数量的间隔分子。间隔分子数增加而引物数略有下降是因为化学合成的效率限制，间隔分子接枝反应增多会有一部分损耗，表面功能基团密度下降，合成引物密度也会下降。不希望被理论束缚，首先，有间隔分子修饰的基因芯片比没有间隔分子修饰的基因芯片在后续拼装中效果更佳。其次，不同间隔分子长度的修饰为下游应用提供更多可能性。
实施例4：以21nt为扩增引物对模板链扩增
在本实施例中，为了进一步明确本发明对固相载体表面修饰的方法的可行性，测试对固定有31nt寡核苷酸引物(5’端固定在芯片上，3’端为暴露的羟基)的基因芯片进行扩增的可能性，通过PCR反应扩增出目标单链DNA。基于实施例3中制备的基因芯片，采用的扩增引物的21nt序列(5’-3’)为：TTAATGCCTTCCTCGATCCGC(SEQ ID NO:2)。
目标链扩增体系包括3片连接有31nt模板链的实施例3中制备的基因芯片，10μM21nt的扩增引物1μL，Ex Taq 0.5μL，2.5mM dNTPs2μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，ddH2O补足至50μL。温度为95℃30秒，60℃1秒，50℃1分30秒，0.5℃/秒，72℃40秒，30个循环。
反应结束后取出基因芯片完成模板链与目标链的分离。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE胶)检测产物，分析合成的目标单链DNA的长度，并用凝胶成像仪成像，如图5所示。本实施例证明了使用有间隔分子的基因芯片进行基因扩增比使用无间隔分子的的基因芯片进行基因扩增效果更好，并且还证明本发明的基因芯片表面合成的31nt引物分子有效固定在固相载体上，且可以成功进行引物拼接及扩增，获得221nt长引物。并且，本领域技术人员基于此可以预期，该化学结构的扩增方法有潜力进行长ssDNA、甚至超长ssDNA的合成。

Claims (16)

1.一种基因芯片基底，其固相载体上顺序连接有至少一个间隔分子，其中，所述间隔分子具有能够彼此偶联的始端基团和末端基团。
2.根据权利要求1所述的基因芯片基底，其中，所述至少一个间隔分子是1-10个，优选1-5个。
3.根据权利要求1或2所述的基因芯片基底，其中，所述间隔分子的始端基团选自羟基、羧基、氨基、乙酰基、环氧基；以及末端基团为氨基，优选为经保护的氨基；例如，所述间隔分子包括C6-C15烷基二胺(如己二胺、十二烷二胺)、氨基被保护的氨基C6-C15烷基酸、丁二酸酐、(DMT-dT亚磷酰胺)1-10；优选为叔丁氧羰基保护的7-氨基庚酸(Boc-7-氨基庚酸)、对甲苯磺酰基保护的7-氨基庚酸(Tos-7-氨基庚酸)、三氟乙酰基保护的6-氨基己酸(Tfa-6-氨基己酸)、三苯甲基保护的6-氨基辛酸(Trt-6-氨基辛酸)、DMT-dT亚磷酰胺单体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基因芯片基底，其中，所述固相载体的表面依次连接有硅烷、所述间隔分子、以及连接分子。
5.根据权利要求4所述的基因芯片基底，所述连接分子为在氨解过程中不被切断的连接分子，优选为6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸(6-ODMT-己酸)或6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-己胺；所述连接分子的末端为羟基，优选为带有保护基的羟基。
6.一种对基因芯片基底的固相载体进行表面修饰的方法，包括：通过至少一次接枝反应使间隔分子顺序连接于所述固相载体表面上硅烷的末端，其中，所述间隔分子具有能够彼此偶联的始端基团和末端基团。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述至少一次接枝反应是1-10次，优选1-5次。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述间隔分子的始端基团选自羟基、羧基、氨基、乙酰基、环氧基；末端基团为氨基，优选为经保护的氨基，例如，所述间隔分子包括C6-C15烷基二胺(如己二胺、十二烷二胺)、氨基被保护的氨基C6-C15烷基酸、丁二酸酐、(DMT-dT亚磷酰胺)1-10；优选为叔丁氧羰基保护的7-氨基庚酸(Boc-7-氨基庚酸)、对甲苯磺酰基保护的7-氨基庚酸(Tos-7-氨基庚酸)、三氟乙酰基保护的6-氨基己酸(Tfa-6-氨基己酸)、三苯甲基保护的6-氨基辛酸(Trt-6-氨基辛酸)、DMT-dT亚磷酰胺单体。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括：使连接分子连接于所述间隔分子的末端。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，所述连接分子为在氨解过程中不被切断的连接分子，优选为6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸(6-ODMT-己酸)或6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-己胺；所述连接分子的末端为羟基，优选为带有保护基的羟基。
11.权利要求1-5中任一项所述的基因芯片基底或由权利要求6-10中任一项所述的方法得到的基因芯片基底用于(原位)合成寡核苷酸片段的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述寡核苷酸片段是作为引物分子和/或探针分子，用于(原位)扩增单链DNA、捕获探针、和/或杂交测序。
13.一种基因芯片，其包括：
a)权利要求1-5中任一项所述的基因芯片基底或由权利要求6-10所述的方法得到的基因芯片基底；以及
b)固定于与所述基因芯片基底上的寡核苷酸片段；任选地，所述寡核苷酸片段包含1-100个碱基。
14.根据权利要求13所述的基因芯片，其中，所述固定通过在所述基因芯片基底上(原位)合成寡核苷酸片段。
15.根据权利要求13或14所述的基因芯片，其中，所述寡核苷酸片段在所述基因芯片经氨解后不会被切下。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的基因芯片，其中，所述寡核苷酸片段是作为引物分子和/或探针分子，用于(原位)扩增单链DNA、捕获探针、和/或杂交测序。
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