CN105854962A - 一种生物识别分子固定到生物芯片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物识别分子固定到生物芯片上的方法，包括如下步骤：1)生物芯片的表面羟基化；2)使用带琥珀酸酐基团的硅烷化试剂将表面羟基化的生物芯片的硅烷化；3)硅烷化后的生物芯片表面琥珀酸酐基团水解形成羧基；4)羧基化的生物芯片使用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺的活化；5)活化后的生物芯片表面连接生物识别分子，得到表面修饰有生物识别分子的生物芯片。该方法采用带琥珀酸酐基团的硅烷化试剂，能够方便、简单连接带氨基的生物识别分子，使生物识别分子能定向排列，形成均匀、致密的单分子结构，提高生物识别分子的识别效率，同时避免了非特异性吸附，从而有效提高生物芯片的检测效果。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片修饰领域，具体涉及一种生物识别分子固定到生物芯片的方法。
背景技术
将生物识别分子高效固定到生物芯片上是发展高灵敏度、高特异性生物分析技术的关键之所在。近年来，基于生物芯片、生物传感器等的生物分析技术由于具有灵敏度高、特异性强、检测通量大等特点，在药物开发、环境监测、食品检测、医疗诊断等领域得到了广泛的应用。绝大多数生物分析技术至关重要的一步就是要把特定的生物识别分子(如DNA、抗体或抗原、核酸适体、分子印迹分子等)固定到生物芯片上，以制备可以特异性识别待测目标物的敏感膜。将生物识别分子固定到生物芯片上的方法包括物理吸附法、包埋法、共价键法等。物理吸附法是将DNA、抗体/抗原等生物识别分子固定到生物芯片上最简单的方法，缺点是固定的生物识别分子量少且易脱落以及生物识别分子不定向吸附导致活性损失等。包埋法是利用高分子有机聚合物将生物识别分子包埋，并固定到生物芯片的方法，该方法的缺点是非常明显的，即高分子有机聚合物可阻碍生物分子的亲和作用，同时非特异性吸附量大，因此在生物芯片的制备过程中应用得较少。共价键法是利用化学键合的方式将抗体/抗原、DNA、分子印迹分子、核酸适体等生物识别分子固定到生物芯片上，其特点是结合牢固、生物芯片可重复使用，但是生物识别分子活性会因化学键合而降低，同时生物识别分子不定向固定到生物芯片可使得其活性损失，从而降低生物分析技术性能。因此，如何获得生物识别分子活性高、均匀性与一致性好、载量大、非特异性吸附弱、可重复利用的生物芯片一直是现代生物分析技术的难点和热点。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种生物识别分子固定到生物芯片的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，包括以下步骤：
1)生物芯片的清洗：将生物芯片浸渍于羟基化试剂中，得到清洁的表面羟基化的生物芯片，之后进行干燥；
2)生物芯片的硅烷化：将步骤1)干燥后的羟基化的生物芯片浸渍于带有琥珀酸酐基团的硅烷化试剂中，进行硅烷化反应，得到硅烷化的生物芯片；
3)将步骤2)得到的硅烷化的的生物芯片冲洗干净后置于水中，进行羧基化反应，得到羧基化的生物芯片；
4)将步骤3)得到的羧基化生物芯片放入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，进行活化羧基反应；
5)将步骤4)得到的活化羧基反应后的生物芯片放入生物识别分子的溶液中，进行缩合反应，得到表面固定有生物识别分子的生物芯片；所述生物识别分子具有氨基。
本发明的有益效果是：
步骤1)中利用利用羟基化试剂将生物芯片羟基化；步骤2)中，将羟基化的生物芯片浸渍于带琥珀酸酐基团硅烷化试剂中进行反应；步骤3)中，硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团；步骤4)中，利用NHS和EDC，活化羧基，有利于与生物识别分子的连接；步骤5)中，生物识别分子的氨基和活化后的羧基进行缩合反应生成酰胺键，实现了生物识别分子直接固定到生物芯片表面，本发明方法修饰的生物芯片由于生物识别分子能定向排列，形成分布均匀、载量大、活性高的单分子结构，且结构致密。
本发明采用带琥珀酸酐基团的硅烷化试剂，能够方便、简单连接带氨基的生物识别分子，使生物识别分子能定向排列，形成均匀、致密的单分子结构，提高生物识别分子的识别效率，同时避免了非特异性吸附，从而有效提高生物芯片的检测效果。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1)中，所述羟基化试剂为浓硫酸和双氧水按体积比2：1至3：1混合后得到的混合物；所述浸渍的温度为15-35℃，时间为25-60min。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述比例有利于生物芯片羟基化，如果浓度过高或过低，导致生物芯片的羟基含量低；如果温度过低、时间较短将导致生物芯片羟基化不完全，如果如果温度过高、时间较长将导致破坏芯片表面结构。
进一步，步骤2)中，所述硅烷化试剂为二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮(简写为TEPSA)的无水丙酮溶液，该溶液中，二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮的体积分数为2％-10％。
采用上述进一步方案的有益效果是：本发明采用TEPSA作为硅烷化试剂，利用其水解生成羧基，生成的羧基能够与生物识别分子的氨基缩合酰胺键，实现了生物识别分子直接固定到生物芯片表面。同时，可以避免因使用带正电荷氨基的硅烷化试剂导致的非特异性吸附，有利于生物芯片在生物分子检测中的应用。
采用体积分数为2％-10％，有利于提高生物识别分子的固定效率，如果浓度过高，容易引起硅烷化试剂自偶联问题；如果浓度过低，会降低生物识别分子的固定效率。
进一步，步骤2)中，所述硅烷化反应的反应温度为10-40℃，反应时间为0.5-4h。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述反应的温度和时间，有利于硅烷化反应的顺利进行；如果温度过低、时间过短，容易导致硅烷化反应进行不彻底，影响后续的反应，导致生物识别分子的固定化的载量小；如果反应温度过高、反应时间过长，容易导致硅烷化试剂自偶联问题。
进一步，步骤2)中，所述硅烷化反应反应温度为25℃，反应时间为为1h。
采用上述进一步方案的有益效果是：采取上述的时间和温度有利于进一步提高硅烷化的效果。
进一步，步骤3)中，所述羧基化反应的反应温度为10-40℃，反应时间为2-8h。
采用上述进一步方案的有益效果是：有利于保证羧基反应的顺利进行；如果温度过低，琥珀酸酐基团水解生成羧基基团的数量较小，影响生物识别分子与生物芯片的连接；如果温度过高，容易导致生物识别分子固定效率低的。
进一步，步骤4)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简写为NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺(简写为EDC)的混合溶液中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：1。
采用上述进一步方案的有益效果是：上述的配比有利于提高生物识别分子的固定效果。
进一步，步骤4)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，所述N-羟基琥珀酰亚胺的体积分数为3％。
采用上述进一步方案的有益效果是：可以进一步提高羧基的活化效果。
进一步，步骤4)中，活化羧基反应的反应温度为10-40℃，反应时间为0.5-4h。
采用上述进一步方案的有益效果是：可以进一步提高羧基的活化效果。
进一步，步骤5)中，所述生物识别分子为带氨基的DNA片段、包被抗原、抗体或核酸适体；DNA片段的浓度为0.5-3μg/mL、包被抗原的浓度为1-5μg/mL、抗体的浓度为0.5-5μg/mL、核酸适体的浓度为0.5-3μg/mL；所述缩合反应的反应温度为10-40℃，反应时间为8-15h。
采用上述进一步方案的有益效果是：合适的缩合反应温度和时间有利于提高生物识别分子固定量；合适的生物识别分子的浓度有利于形成单分子层结构；如果浓度过低，导致固定后的生物芯片的载量较小；如果浓度过高，导致试剂浪费。
进一步，步骤5)中，所述缩合反应的反应温度为20-30℃，反应时间为10-15h。
采用上述进一步方案的有益效果是：
发明人在研究中发现，采用反应温度为20-30℃，反应时间为10-15h，可以进一步提高缩合反应的效率。
进一步，步骤1)中，得到清洁的表面羟基化的生物芯片之后且在干燥之前，还包括以下步骤：将得到清洁的表面羟基化的生物芯片于超纯水中超声洗涤，直至超声洗涤后所得溶液的pH为中性，然后用氮气吹干。
采用上述进一步方案的有益效果是提高芯片的清洁效果。
进一步，步骤1)中，所述干燥的方法为：在105℃的干燥箱干燥2-4h。
采用上述进一步方案的有益效果是有利于生物芯片的硅烷化。
进一步，步骤2)中，得到硅烷化后的生物芯片后还包括以下步骤：将硅烷化后的生物芯片用无水丙酮溶液进行清洗，并用氮气吹干，于150-250℃下烘烤10-60min。
采用上述进一步方案的有益效果是：充分去除反应副产物，避免副产物对后续反应的影响。
进一步，步骤3)中，硅烷化后的生物芯片用无水甲苯或丙酮冲洗三遍，用水冲洗三遍，然后放入超纯水中，硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团。
采用上述进一步方案的有益效果是：充分去除反应副产物，避免副产物对后续反应的影响。
进一步，所述生物芯片的材质为石英玻璃。
附图说明
图1为实施例1、实施例2和实施例3中生物芯片固定生物识别分子过程示意图。
图2为实施例4中生物芯片固定包被抗原的特异性反应和非特异性吸附的信号响应曲线。
图3为实施例5中生物芯片固定抗体的特异性反应和非特异性吸附的响应信号。
图4为实施例6中生物芯片固定DNA的互补DNA片段和非互补DNA片段杂交的响应曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1将包被抗原直接固定在生物芯片表面：
本实例以微囊藻毒素-LR包被抗原(MC-LR-OVA)为例，微囊藻毒素-LR包被抗原购自Sigma-al(中国)，按图1所示的生物芯片表面固定过程示意图进行如下实验：
1)首先用Piranha溶液(浓H2SO4和H2O2的体积比为3：1)于25℃下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸为1cm×1cm)表面30min，用于去除其表面的有机物，并使其表面羟基化；然后再将其放入超声波清洗仪中洗涤，并用超纯水进行充分清洗，直到清洗液的pH值为中性，最后在室温下用氮气吹干，放入105℃干燥箱干燥2h，之后保存于真空干燥箱中备用；
2)将洁净的表面羟基化的生物芯片放入体积分数为2％的二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮(TEPSA)的无水丙酮溶液中，于25℃下反应1h，再用无水丙酮溶液进行多次冲洗，冲洗时间为10min，充分去除反应副产物，氮气吹干，200℃下烘烤1h；通过硅烷化作用，将硅烷基引入到表面羟基化的生物芯片表面；
3)硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团，具体步骤如下：硅烷化后的生物芯片用无水甲苯或丙酮冲洗三遍，用水冲洗三遍，然后放入超纯水中，硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团；所述反应的反应温度为25℃，反应时间为4h；
4)利用EDC和NHS将固定硅烷化试剂的生物芯片表面的羧基活化，具体方法如下：在1mL浓度为10mg/mL的NHS的水溶液中加入10mgEDC，混合均匀后，将羧基化的生物芯片入其中，所述反应的反应温度为25℃，反应时间为2h；然后用超纯水清洗干净备用；
5)将活化后的生物芯片放入微囊藻毒素-LR的包被抗原(MC-LR-OVA)溶液中，从而使得活化后的羧基与包被抗原的氨基偶联，从而使得包被抗原直接固定于生物芯片表面，用于微囊藻毒素-LR的分析。所述的包被抗原浓度为1μg/mL，所述缩合反应的反应温度为25℃，反应时间为12h。最后用超纯水冲洗数次，氮气吹干，得到表面固定有MC-LR-OVA的生物芯片，置于4℃冰箱存放。
实施例2将抗体直接固定在生物芯片表面：
本实例以双酚A抗体为例，双酚A抗体购自北京金达清创环境科技有限公司，按图1所示的生物芯片表面固定过程示意图进行如下实验：
1)首先用Piranha溶液(浓H2SO4和H2O2的体积比为3：1)于25℃下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸为1cm×1cm)表面30min，用于去除其表面的有机物，并使其表面羟基化；然后再将其放入超声波清洗仪中洗涤，并用超纯水进行充分清洗，直到清洗液的pH值为中性，最后在室温下用氮气吹干，放入105℃的干燥箱干燥4h，保存于真空干燥箱中备用；
2)将洁净的表面羟基化的生物芯片放入体积分数为2％的二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮(TEPSA)的无水丙酮溶液中，于25℃下反应1h，再用丙酮溶液进行多次冲洗，充分去除反应副产物，氮气吹干，200℃下烘烤1h；通过硅烷化作用，将硅烷基引入到表面羟基化的生物芯片表面；
3)硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团，具体步骤如下：硅烷化后的生物芯片用无水甲苯或丙酮冲洗三遍，用水冲洗三遍，然后放入纯水中，硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团；所述反应的反应温度为25℃，反应时间为4h；
4)利用EDC和NHS将固定硅烷化试剂的生物芯片表面的羧基活化，具体方法如下：在1mL浓度为10mg/mL的NHS水溶液中加入10mg EDC，混合均匀后，将羧基化的圆形波导放入其中，所述反应的反应温度为25℃，反应时间为2h；然后用超纯水清洗干净备用；
5)将活化后的生物芯片放入双酚A抗体溶液中，从而使得活化后的羧基与包被抗原的氨基偶联，从而使得双酚A抗体直接固定于生物芯片表面，用于双酚A的分析。所述的双酚A浓度为1μg/mL，所述缩合反应的反应温度为25℃，反应时间为12h。最后用超纯水冲洗数次，氮气吹干，得到表面固定有双酚A的生物芯片，置于4℃冰箱存放。
实施例3将DNA片段直接固定在生物芯片表面：
所述DNA片段为：5’-NH2-TTTTTTTTT-3’(由生工生物工程(上海)股份有限公司)，按图1所示的生物芯片表面固定过程示意图进行如下实验：
1)首先用Piranha溶液(浓H2SO4和H2O2的体积比为3：1)于25℃下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸为1cm×1cm)表面30min，用于去除其表面的有机物，并使其表面羟基化；然后再将其放入超声波清洗仪中洗涤，并用超纯水进行充分清洗，直到清洗液的pH值为中性，最后在室温下用氮气吹干，放入105℃的干燥箱干燥3h，保存于真空干燥箱中备用；
2)将洁净的表面羟基化的生物芯片放入体积分数为2％的二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮(TEPSA)的无水丙酮溶液中，于25℃下反应1h，再用丙酮溶液进行多次冲洗，充分去除反应副产物，氮气吹干，200℃下烘烤1h；通过硅烷化作用，将硅烷基引入到表面羟基化的生物芯片表面；
3)硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团，具体步骤如下：硅烷化后的生物芯片用无水甲苯或丙酮冲洗三遍，用水冲洗三遍，然后放入纯水中，硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团；所述反应的反应温度为25℃，反应时间为4h；
4)利用EDC和NHS将固定硅烷化试剂的生物芯片表面的羧基活化，具体方法如下：在1mL浓度为10mg/mL的NHS水溶液中加入10mg EDC，混合均匀后，将羧基化的圆形波导放入其中，所述反应的反应温度为25℃，反应时间为2h；然后用超纯水清洗干净备用；
5)将活化后的生物芯片放入DNA溶液中，从而使得活化后的羧基与DNA的氨基偶联，从而使得DNA直接固定于生物芯片表面，用于DNA的杂交分析。所述的DNA浓度为1μg/mL，所述缩合反应的反应温度为25℃，反应时间为12h。最后用超纯水冲洗数次，氮气吹干，得到表面固定有DNA片段的生物芯片，置于4℃冰箱存放。
实施例4
所述DNA片段为：5’-NH2-TTTTTTTTT-3’(由生工生物工程(上海)股份有限公司)，按图1所示的生物芯片表面固定过程示意图进行如下实验：
1)首先用Piranha溶液(浓H2SO4和H2O2的体积比为2：1)于15℃下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸为1cm×1cm)表面60min，用于去除其表面的有机物，并使其表面羟基化；然后再将其放入超声波清洗仪中洗涤，并用超纯水进行充分清洗，直到清洗液的pH值为中性，最后在室温下用氮气吹干，放入105℃的干燥箱干燥3h，保存于真空干燥箱中备用；
2)将洁净的表面羟基化的生物芯片放入体积分数为10％的二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮(TEPSA)的无水丙酮溶液中，于10℃下反应4h，再用丙酮溶液进行多次冲洗，充分去除反应副产物，氮气吹干，150℃下烘烤55min；通过硅烷化作用，将硅烷基引入到表面羟基化的生物芯片表面；
3)硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团，具体步骤如下：硅烷化后的生物芯片用无水甲苯或丙酮冲洗三遍，用水冲洗三遍，然后放入纯水中，硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团；所述反应的反应温度为10℃，反应时间为8h；
4)利用EDC和NHS将固定硅烷化试剂的生物芯片表面的羧基活化，具体方法如下：在1mL浓度为10mg/mL的NHS水溶液中加入10mg EDC，混合均匀后，将羧基化的圆形波导放入其中，所述反应的反应温度为10℃，反应时间为4h；然后用超纯水清洗干净备用；
5)将活化后的生物芯片放入DNA溶液中，从而使得活化后的羧基与DNA的氨基偶联，从而使得DNA直接固定于生物芯片表面，用于DNA的杂交分析。所述的DNA浓度为0.5μg/mL，所述缩合反应的反应温度为10℃，反应时间为15h。最后用超纯水冲洗数次，氮气吹干，得到表面固定有DNA片段的生物芯片，置于4℃冰箱存放。
实施例5
所述DNA片段为：5’-NH2-TTTTTTTTT-3’(由生工生物工程(上海)股份有限公司)，按图1所示的生物芯片表面固定过程示意图进行如下实验：
1)首先用Piranha溶液(浓H2SO4和H2O2的体积比为2.5：1)于35℃下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸为1cm×1cm)表面25min，用于去除其表面的有机物，并使其表面羟基化；然后再将其放入超声波清洗仪中洗涤，并用超纯水进行充分清洗，直到清洗液的pH值为中性，最后在室温下用氮气吹干，放入105℃的干燥箱干燥3h，保存于真空干燥箱中备用；
2)将洁净的表面羟基化的生物芯片放入体积分数为8％的二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮(TEPSA)的无水丙酮溶液中，于40℃下反应0.5h，再用丙酮溶液进行多次冲洗，充分去除反应副产物，氮气吹干，250℃下烘烤10min；通过硅烷化作用，将硅烷基引入到表面羟基化的生物芯片表面；
3)硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团，具体步骤如下：硅烷化后的生物芯片用无水甲苯或丙酮冲洗三遍，用水冲洗三遍，然后放入纯水中，硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团；所述反应的反应温度为40℃，反应时间为2h；
4)利用EDC和NHS将固定硅烷化试剂的生物芯片表面的羧基活化，具体方法如下：在1mL浓度为10mg/mL的NHS水溶液中加入10mg EDC，混合均匀后，将羧基化的圆形波导放入其中，所述反应的反应温度为40℃，反应时间为0.5h；然后用超纯水清洗干净备用；
5)将活化后的生物芯片放入DNA溶液中，从而使得活化后的羧基与DNA的氨基偶联，从而使得DNA直接固定于生物芯片表面，用于DNA的杂交分析。所述的DNA浓度为3μg/mL，所述缩合反应的反应温度为40℃，反应时间为8h。最后用超纯水冲洗数次，氮气吹干，得到表面固定有DNA片段的生物芯片，置于4℃冰箱存放。
实验效果例1生物芯片修饰微囊遭毒素-LR包被抗原的有效性验证
为验证本发明方法是否可行，且是否具有特异性，将0.4μg/mL荧光标记的微囊藻毒素抗体(购自自北京金达清创科技有限公司)通入样品池中，荧光标记的微囊藻毒素与实施例1中制备的生物芯片表面的包被抗原反应，用荧光检测仪记录其随时间的响应信号值，
为了做对比，做了如下三组对比试验，检测结果如图3所示，具体过程如下：
首先，将0.4μg/mL荧光标记的微囊藻毒素抗体泵入样品池，可以检测到明显的荧光信号，净荧光信号接近4500。
而当0.2mL的0.4μg/mL荧光标记的微囊藻毒素抗体与0.2mL的100μg/mL微囊藻毒素-LR混合反应5min后，再加入样品池，系统可以检测到明显的荧光信号，但最大荧光值明显小于未加微囊藻毒素-LR的荧光信号值，说明部分荧光标记抗体已与微囊藻毒素-LR结合，从而减少了含有自由位的荧光标记微囊藻毒素-LR抗体浓度，因此系统检测到的荧光信号小。
最后，将1μg/mL荧光标记抗阿特拉津抗体(来自北京金达清创科技有限公司)泵入样品池，系统检测到的荧光信号非常小，表明荧光标记阿特拉津抗体不会非特异性吸附到生物芯片表面，同时，游离的荧光染料对系统检测的荧光信号的贡献也非常少。
综上可知：本发明制备得到的生物芯片会与微囊藻毒素-LR抗体产生特异性反应，生物芯片不仅可以高效检测到抗体抗原之间特异性亲和反应，具有活性高、载量大的特点；而且非特异吸附弱，进而对其他荧光标记的物质的响应信号极低。
发明人又进一步调整了实施例1中的包被抗原的浓度，包被抗原的浓度分别为3μg/mL，步骤5)的缩合反应的温度为20℃，其余均与实施例1相同，经过试验验证，结果与实施例1的结果类似。
发明人又进一步调整了实施例1中的包被抗原的浓度，包被抗原的浓度为5μg/mL，步骤5)的缩合反应温度为30℃，其余均与实施例1相同，经过试验验证，结果与实施例1的结果类似。
实验效果例2生物芯片修饰双酚A抗体的有效性验证
为验证本发明方法是否可行，且是否具有特异性，将0.1μg/mL荧光标记的双酚A通入样品池中，荧光标记的双酚A与实施例1中制备的生物芯片表面的双酚A抗体反应，用荧光检测仪记录其随时间的响应信号值，
同样，为了做对比，做了如下三组对比试验，检测结果如图4所示，具体过程如下：
首先，将0.1μg/mL荧光标记的双酚A泵入样品池，可以检测到明显的荧光信号，净荧光信号接近4350。
而当0.2mL的0.1μg/mL荧光标记的双酚A与0.2mL的100μg/mL双酚A混合反应5min后，再加入样品池，系统可以检测到荧光信号很小，说明未标记的双酚A抑制了荧光标记抗体与双酚A抗体结合，因此系统检测到的荧光信号小。
最后，将1μg/mL荧光阿特拉津泵入样品池，系统检测到的荧光信号非常小，表明荧光标记阿特拉津不会非特异性吸附到生物芯片表面，同时，游离的荧光染料对系统检测的荧光信号的贡献也非常少。
发明人又进一步调整了实施例2的抗体的浓度，抗体的浓度分别为0.5μg/mL和5μg/mL，其余操作与实施例2的操作相同，经过试验验证，与实施例2的结果一致。
综上可知：本发明制备得到的生物芯片会与双酚A产生特异性反应，生物芯片不仅可以高效检测到抗体抗原之间特异性亲和反应，具有活性高、载量大的特点；而且非特异吸附弱，进而对其他荧光标记的物质的响应信号极低。
实验效果例3生物芯片修饰DNA片段的有效性验证
为验证本发明方法是否可行，且是否具有特异性，将0.1μg/mL荧光标记的互补DNA片段(序列为：5’-AAAAAAAAA-dyelight680-3’)通入样品池中，荧光标记的互补DNA片段与实施例3中制备的生物芯片表面的生物识别DNA分子杂交，用荧光检测仪记录其随时间的响应信号值。
同样，为了做对比，做了如下两组对比试验，检测结果如图4所示，具体过程如下：
将0.1μg/mL荧光标记的互补DNA片段(序列为5’-AAAAAAAAA-dyelight680-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)泵入样品池，可以检测到明显的荧光信号，净荧光信号接近3680。
而当0.1μg/mL荧光标记的非互补DNA片段(序列为5’-CCCGCATAC-dyelight680-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)加入样品池，系统可以检测到荧光信号很小，表明荧光标记非互补的DNA片段不会杂交到生物芯片上，也不会非特异性吸附到生物芯片表面，同时，游离的荧光染料对系统检测的荧光信号的贡献也非常少。
实施例4和实施例5得到的结果也与实施例3验证的结果一一致。
综上可知：本发明制备得到的生物芯片会与互补DNA片段产生特异性反应，生物芯片不仅可以高效检测到DNA杂交反应，具有活性高、载量大的特点；而且非特异吸附弱，进而对其他荧光标记的非互补DNA片段的响应信号极低。
发明人还进行核酸适体与生物芯片固定的实验，步骤5)中核酸适体的浓度分别为0.5μg/mL、2μg/mL和3μg/mL，经过试验验证，本发明具有很好的特异性、活性高和载量大等优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)生物芯片的羟基化：将生物芯片浸渍于羟基化试剂中，得到清洁的表面羟基化的生物芯片，之后进行干燥；
2)生物芯片的硅烷化：将步骤1)干燥后的羟基化的生物芯片浸渍于带有琥珀酸酐基团的硅烷化试剂中，进行硅烷化反应，得到硅烷化的生物芯片；
3)生物芯片的羧基化：将步骤2)得到的硅烷化的的生物芯片冲洗干净后置于水中，进行羧基化反应，得到羧基化的生物芯片；
4)将步骤3)得到的羧基化生物芯片放入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，进行活化羧基反应；
5)将步骤4)得到的活化羧基反应后的生物芯片放入生物识别分子的溶液中，进行缩合反应，得到表面固定有生物识别分子的生物芯片；所述生物识别分子具有氨基。
2.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤1)中，所述羟基化试剂为浓硫酸和双氧水按体积比2∶1至3∶1混合后得到的混合物；所述浸渍的温度为15-35℃，时间为25-60min。
3.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤2)中，所述硅烷化试剂为二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮的无水丙酮溶液，该溶液中，二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮的体积分数为2％-10％。
4.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤2)中，所述硅烷化反应反应温度为10-40℃，反应时间为0.5-4h。
5.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤2)中，所述硅烷化反应反应温度为25℃，反应时间为为1h。
6.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤3)中，所述羧基化反应的反应温度为10-40℃，反应时间为2-8h。
7.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤4)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1∶1。
8.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤4)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，所述N-羟基琥珀酰亚胺的体积分数为3％。
9.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤4)中，活化羧基反应的反应温度为10-40℃，反应时间为0.5-4h。
10.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤5)中，所述生物识别分子为带氨基的DNA片段、包被抗原、抗体或核酸适体；DNA片段的浓度为0.5-3μg/mL、包被抗原的浓度为1-5μg/mL、抗体的浓度为0.5-5μg/mL、核酸适体的浓度为0.5-3μg/mL；所述缩合反应的反应温度为10-40℃，反应时间为8-15h。
11.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤5)中，所述缩合反应的反应温度为20-30℃，反应时间为10-15h。
12.根据权利要求1所述一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，其特征在于，步骤1)中，得到清洁的表面羟基化的生物芯片之后且在干燥之前，还包括以下步骤：将得到清洁的表面羟基化的生物芯片于超纯水中超声洗涤，直至超声洗涤后所得溶液的pH为中性，然后用氮气吹干；
步骤1)中，所述干燥的方法为：在105℃的干燥箱干燥2-4h；
步骤2)中，得到硅烷化后的生物芯片后还包括以下步骤：将硅烷化后的生物芯片用无水丙酮溶液进行清洗，并用氮气吹干，于150-250℃下烘烤10-60min；
步骤3)中，硅烷化后的生物芯片用无水甲苯或丙酮冲洗三遍，用水冲洗三遍，然后放入超纯水中，硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团；所述生物芯片的材质为石英玻璃。
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