CN105137064B - 一种小分子有机物修饰生物传感元件的方法 - Google Patents

一种小分子有机物修饰生物传感元件的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小分子有机物修饰生物传感元件的方法。包括如下步骤：1)生物传感元件的表面羟基化；2)表面羟基化的生物传感元件的硅烷化；3)硅烷化后的生物传感元件表面连接双功能基团；4)连接双功能基团的生物传感元件表面连接高分子聚合物；5)连接高分子聚合物的生物传感元件表面连接小分子有机物，得到表面修饰有小分子有机物的生物传感元件。该方法采用富含氨基的聚醚酰亚胺，能够为小分子有机物提供充足的结合位点，使小分子有机物能定向排列，形成单分子结构，且结构致密，避免了非特异性吸附，相应的增强了特异性吸附。

Description

一种小分子有机物修饰生物传感元件的方法
技术领域
本发明属于生物传感元件修饰领域，具体涉及一种小分子有机物直接修饰生物传感元件的方法。
背景技术
生物传感元件是生物传感器的核心部件。生物传感器由于其具有灵敏度高、生物特异性强；操作简单，测量速度快；可以对生物反应的动态过程进行监测；整机可以小型化等特点，在生物医学研究、食品检测、环境监测、生物战剂探测领域得到了广泛的应用。所有生物传感器面临的最为关键、最为复杂的步骤就是需要在生物传感元件表面固定生物识别分子，从而制备敏感功能膜。传感敏感功能膜的制备方法包括物理吸附法和共价键法等。物理吸附法是将抗体等生物识别分子固定到传感元件上最简单的方法，缺点是修饰的生物识别分子量少且易脱落以及生物识别分子不定向吸附导致活性损失。共价键法是采用化学键合的方式将抗体、DNA等生物识别分子修饰到传感元件上，优点是结合比较牢固、再生性能良好，缺点是生物分子活性会因化学键合而降低，同样地，生物识别分子不定向修饰到传感器会使得活性损失，降低传感器的灵敏度。当有机污染物分子量较小时(如<1000)，直接将该物质固定在传感器表面非常困难。当采用固定生物识别分子(如抗体等)时，由于再生条件往往比较苛刻，对其活性影响很大，最终影响生物传感分析系统的稳定性和再现性。
如何在小分子风险污染物上引入合适的功能基团并将其组装到生物传感元件表面，制备出生物识别分子活性高、均匀性与一致性好、载量大、非特异性吸附弱、再生性能好的生物传感元件敏感功能膜至关重要。目前，制备小分子有机物的生物传感元件大多是将小分子物质偶联在惰性蛋白上，形成包被抗原，再修饰到生物传感元件表面，但是该种方法，过程繁琐，且不能保证生物传感元件的长期使用，使用期限有限，因此，如何将小分子化合物直接固定到探头表面已经成为表面修饰领域中的一个研究难点。
发明内容
本发明的目的是提供一种小分子有机物修饰生物传感元件的方法。
本发明所提供的方法，包括如下步骤：
1)表面羟基化的生物传感元件的硅烷化：将表面羟基化的生物传感元件浸渍于硅烷化试剂中反应，得到硅烷化后的生物传感元件，其中，所述硅烷化试剂为带氨基的硅烷化试剂；
2)硅烷化后的生物传感元件表面连接双功能基团：将硅烷化后的生物传感元件浸渍于N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的甲苯溶液中反应，得到表面连接双功能基团的生物传感元件；
3)连接双功能基团的生物传感元件表面连接高分子聚合物：将表面连接双功能基团的生物传感元件浸渍于聚醚酰亚胺(PEI)的水溶液中进行反应，得到表面连接高分子聚合物的生物传感元件；
4)连接高分子聚合物的生物传感元件表面连接小分子有机物：在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在下，将表面连接高分子聚合物的生物传感元件和带有羧基的小分子有机物进行缩合反应，得到表面修饰有小分子有机物的生物传感元件。
上述方法中，步骤1)中，所述表面羟基化的生物传感元件是通过如下方法制备得到：将生物传感元件浸渍于Piranha溶液中，得到表面羟基化的生物传感元件，
其中，所述生物传感元件具体可为生物芯片或光纤传感器，所述生物芯片可为石英玻璃片，所述光纤传感器可为石英光纤。
所述Piranha溶液为浓硫酸和双氧水按体积比3：1混合后得到的混合物。
所述浸渍的温度为20～30℃，时间为20～40min。
步骤1)中，还包括对所述表面羟基化的生物传感元件进行如下处理的步骤：将其于去离子水中超声洗涤，直至超声洗涤后所得溶液的pH为中性，最后，于室温下，用氮气吹干，保存于真空干燥箱中备用。
上述方法中，步骤1)中，所述带氨基的硅烷化试剂具体可为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTS)，所述(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷是以无水甲苯溶液的形式存在，所述(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水甲苯溶液中(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的体积分数为1～5％。该硅烷化试剂带氨基，可使得光纤传感器带活性基团氨基，用于后续的生物分子固定。
所述反应的反应温度为20-30℃，具体可为室温(25℃)，反应时间为0.5-2h，具体可为1h。
步骤1)中，还包括对所述硅烷化后的生物传感元件进行如下处理：对其用无水甲苯溶液进行清洗，充分去除反应副产物，并用氮气吹干，再于150-250℃下烘烤10-60min，具体可在200℃下烘烤60min。
上述方法中，步骤2)中，所述N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和N,N-二异丙基乙胺的甲苯溶液中N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的浓度为(0.005-0.015)mg/ml；N,N-二异丙基乙胺的体积分数为3-3.5％，具体可为3.3％。
所述反应的反应温度为20-30℃，反应时间为1～3h。
上述方法中，步骤3)中，所述聚醚酰亚胺的平均分子量为5000～15000。
所述聚醚酰亚胺的水溶液中聚醚酰亚胺的体积分数为2～5％。
所述反应的反应温度为20-30℃，反应时间为0.5-1.5h。
上述方法中，步骤4)中，所述带有羧基的小分子有机物具体可为双酚酸(该物质分子式中既含有一个羧基，同时又含有双酚A的结构)
所述缩合反应的反应温度为20-30℃，反应时间为10～15h。
所述缩合反应具体可按如下步骤进行：将NHS、EDC和双酚酸溶于水中，得到混合液，再将连接高分子聚合物的生物传感元件浸渍于所述混合液中进行缩合反应，得到表面修饰有小分子有机物的生物传感元件，
其中，NHS、EDC和双酚酸的质量比为(8-12)：(8-12)：1。
所述缩合反应的反应温度为20-30℃，反应时间为10～15h。
通过缩合反应将所述连接高分子聚合物的生物传感元件表面的氨基和小分子有机物上的羧基反应，脱水缩合形成酰胺键，将需要修饰的小分子有机物直接以共价键的形式连接在生物传感元件表面。所述EDC/NHS可用于活化表面带有羧基的小分子有机物。
本发明所制备得到的表面修饰有小分子有机物的生物传感元件也属于本发明的保护范围。
本发明利用高分子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)富含氨基，能够为生物分子或小分子配基的固定提供充足的结合位点等特点，实现了小分子有机物直接固定到生物传感元件表面，本发明方法修饰的传感元件由于小分子有机物能定向排列，形成完美的单分子结构，且结构致密，其小分子有机物本身不会对蛋白产生吸附，因此不会产生非特异性吸附。同时，小分子有机物在传感元件表面能够形成一层保护膜，阻断蛋白与底层硅烷化试剂的接触，则这种传感元件的非特异性吸附性质完全不受硅烷化试剂的影响。聚乙烯亚胺(PEI)对蛋白质的吸附很弱，所以由其修饰的基片也对蛋白吸附亦很弱，当蛋白的浓度很低时，非特异性吸附可以忽略。
附图说明
图1为实施例1和实施例2中生物传感元件表面修饰过程示意图。
图2为实施例3中光纤传感器的特异性反应和非特异性吸附的信号响应曲线。
图3为实施例4中生物芯片的特异性反应和非特异性吸附的响应信号。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、将小分子化合物4,4-双(4-羟苯基)戊酸(亦称双酚酸)直接固定在光纤传感器表面：
按图1所示的生物传感元件表面修饰过程示意图进行如下实验：
1)光纤传感器是利用购买的芯径为600μm，数值孔径为0.22的石英光纤制备而成。具体制备方法如下：将石英光纤截成3cm的光纤段，然后将长为3cm的光纤段的光纤包层去除，放入氢氟酸中腐蚀5min后，用清水清洗干净，得到光纤传感器，即可用于生物分子的固定；
2)用Piranha溶液(浓H2SO4：H2O2＝体积比为3：1)于25℃下清洗光纤传感器表面30min，用于去除其表面的有机物，并使其表面羟基化；然后再将其放入超声波清洗仪中洗涤，并用超纯水进行充分清洗，直到清洗液的pH值为中性，最后在室温下用氮气吹干，保存于真空干燥箱中备用；
3)将清洁干净的表面羟基化的光纤传感器放入体积分数为2％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTS)的无水甲苯溶液中，于25℃下反应1h，再用甲苯溶液进行多次冲洗，充分去除反应副产物，氮气吹干，200℃下烘烤1h；通过硅烷化作用，将硅烷基引入到表面羟基化的光纤传感器表面；
4)在硅烷化后的光纤传感器表面连接双功能基团，具体步骤如下：将1.5mg N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)和5mL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶于145mL无水甲苯中，并将硅烷化后的光纤传感器放入其中，于25℃下反应2h，之后，取出并用甲苯冲洗干净；DSC可与硅烷化试剂上的氨基反应，同时产生NHS-酯基团，可偶联高分子聚合物上的氨基，得到连有双功能基团的光纤传感器；
5)将连有双功能基团的光纤传感器放入具有多氨基的分子量为10000的聚醚酰亚胺(PEI)的水溶液中(其体积分数为2％，可通过超纯水配制)，于25℃下反应1h，用超纯水清洗数次，得到表面连有高分子聚合物的光纤传感器；
6)利用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)将连有高分子聚合物的光纤传感器表面的氨基和小分子化合物上的羧基偶联，从而使得小分子化合物直接固定于光纤传感器表面，用于小分子有机物的免疫分析，具体方法如下：在1mL浓度为10mg/mL的NHS水溶液中加入10μL浓度为1mg/μL EDC水溶液，混合均匀后，加入1mL浓度为1mg/mL的双酚酸水溶液，将连有高分子聚合物的光纤传感器放入其中，于25℃下反应12h，超纯水冲洗数次，氮气吹干，得到表面固定有双酚A的光纤传感器，置于4℃冰箱存放。
实施例2、将小分子化合物4,4-双(4-羟苯基)戊酸(亦称双酚酸)直接固定在生物芯片表面：
按图1所示的生物传感元件表面修饰过程示意图进行如下实验：
1)首先用Piranha溶液(浓H2SO4：H2O2＝体积比为3：1)于25℃下清洗生物芯片(市面上的石英玻璃片均可，尺寸为1cm*1cm)表面30min，用于去除其表面的有机物，并使其表面羟基化；然后再将其放入超声波清洗仪中洗涤，并用超纯水进行充分清洗，直到清洗液的pH值为中性，最后在室温下用氮气吹干，保存于真空干燥箱中备用；
2)将清洁干净的表面羟基化的生物芯片放入体积分数为2％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTS)的无水甲苯溶液中，于25℃下反应1h，再用甲苯溶液进行多次冲洗，充分去除反应副产物，氮气吹干，200℃下烘烤30min；通过硅烷化作用，将硅烷基引入到表面羟基化的生物芯片表面；
3)在硅烷化后的生物芯片表面连接双功能基团，具体步骤如下：将1.5mg N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)和5mL N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶于145mL无水甲苯中，并将硅烷化后的生物芯片放入其中，于25℃下反应2h，之后，取出并用甲苯冲洗干净；DSC可与硅烷化试剂上的氨基反应，同时产生NHS-酯基团，可偶联高分子聚合物上的氨基，得到连有双功能基团的光生物芯片；
4)将连有双功能基团的生物芯片放入具有多氨基的的分子量为15000的聚醚酰亚胺(PEI)的水溶液中(其体积分数为2％，可通过超纯水配制)，于25℃下反应1h，用超纯水清洗数次，得到表面连有高分子聚合物的生物芯片；
5)利用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)将连有高分子聚合物的生物芯片表面的氨基和小分子化合物上的羧基偶联，从而使得小分子化合物直接固定于生物芯片表面，用于小分子有机物的免疫分析，具体方法如下：在1mL浓度为10mg/mL的NHS水溶液中加入10μL浓度为1mg/μL EDC水溶液，混合均匀后，加入1mL浓度为1mg/mL的双酚酸水溶液，将连有高分子聚合物的生物芯片放入其中，于25℃下反应12h，超纯水冲洗数次，氮气吹干，得到表面固定有双酚A的生物芯片，置于4℃冰箱存放。
实施例3、光纤传感器修饰4,4-双(4-羟苯基)戊酸(亦称双酚酸)有效性的验证：
为验证本发明方法是否可行，且是否具有特异性，将0.4μg/ml荧光标记的双酚酸抗体(BAP抗体)通入样品池中，荧光标记的双酚酸抗体与实施例1中制备的光纤传感器表面的双酚酸反应，用倏逝波全光纤免疫传感器记录其随时间的响应信号值，主要原理如下：荧光标记的双酚酸抗体结合到表面修饰了双酚酸的生物传感器上，通过激光激发双酚酸抗体上的荧光染料，产生荧光，通过信号转化器，将光信号转化为电信号输出。
为了做对比，我们做了如下三组对比试验，检测结果如图2所示，具体过程如下：
首先，将0.4μg/ml荧光标记的双酚酸抗体泵入样品池，可以检测到明显的荧光信号，信噪比(最大荧光值与基线值比)可以达到10以上。
而当0.2ml的0.4μg/ml荧光标记的双酚酸抗体与0.2ml的30μg/ml双酚酸混合反应5min后，再加入样品池，系统可以检测到明显的荧光信号，但最大荧光值明显小于未加双酚酸的荧光信号值，说明部分荧光标记抗体已与双酚酸结合，从而减少了含有自由位的荧光标记双酚酸抗体浓度，因此系统检测到的荧光信号小。
最后，将1μg/ml荧光标记抗微囊藻毒素-LR抗体泵入样品池，系统检测到的荧光信号非常小，表明荧光标记抗微囊藻毒素-LR抗体不会非特异性吸附到光纤传感器表面，同时，游离的荧光染料对系统检测的荧光信号的贡献也非常少。
综上可知：本发明制备得到的光纤传感器会与双酚酸产生特异性反应，光纤传感器不仅可以高效检测到抗体抗原之间特异性亲和反应，具有活性高、载量大的特点；而且非特异吸附弱，进而对其他荧光标记的物质的响应信号极低，从图2亦能看出，所述制备得到的光纤传感器具有良好的再生特性。
实施例4、生物芯片修饰BPA的有效性验证：
为验证本发明方法是否可行，且是否具有特异性，将0.4μg/ml荧光标记的双酚酸抗体(BAP抗体)通入样品池中，荧光标记的双酚酸抗体与实施例2中制备的生物芯片表面的双酚酸反应，用倏逝波全光纤免疫传感器记录其随时间的响应信号值，
为了做对比，我们做了如下三组对比试验，检测结果如图3所示，具体过程如下：
首先，将0.4μg/ml荧光标记的双酚酸抗体泵入样品池，可以检测到明显的荧光信号，净荧光信号接近300。
而当0.2ml的0.4μg/ml荧光标记的双酚酸抗体与0.2ml的100μg/ml双酚酸混合反应5min后，再加入样品池，系统可以检测到明显的荧光信号，但最大荧光值明显小于未加双酚酸的荧光信号值，说明部分荧光标记抗体已与双酚酸结合，从而减少了含有自由位的荧光标记双酚酸抗体浓度，因此系统检测到的荧光信号小。
最后，将1μg/ml荧光标记抗微囊藻毒素-LR抗体泵入样品池，系统检测到的荧光信号非常小，表明荧光标记抗微囊藻毒素-LR抗体不会非特异性吸附到生物芯片表面，同时，游离的荧光染料对系统检测的荧光信号的贡献也非常少。
综上可知：本发明制备得到的生物芯片会与双酚酸产生特异性反应，生物芯片不仅可以高效检测到抗体抗原之间特异性亲和反应，具有活性高、载量大的特点；而且非特异吸附弱，进而对其他荧光标记的物质的响应信号极低。

Claims (8)

1.一种小分子有机物修饰生物传感元件的方法，包括如下步骤：
1)表面羟基化的生物传感元件的硅烷化：将表面羟基化的生物传感元件浸渍于硅烷化试剂中反应，得到硅烷化后的生物传感元件，其中，所述硅烷化试剂为带氨基的硅烷化试剂；
2)硅烷化后的生物传感元件表面连接双功能基团：将硅烷化后的生物传感元件浸渍于N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和N,N-二异丙基乙胺的甲苯溶液中反应，得到表面连接双功能基团的生物传感元件；
3)连接双功能基团的生物传感元件表面连接高分子聚合物：将表面连接双功能基团的生物传感元件浸渍于聚醚酰亚胺的水溶液中进行反应，得到表面连接高分子聚合物的生物传感元件；
4)连接高分子聚合物的生物传感元件表面连接小分子有机物：在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在下，将表面连接高分子聚合物的生物传感元件和带有羧基的小分子有机物进行缩合反应，得到表面修饰有小分子有机物的生物传感元件。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述表面羟基化的生物传感元件是通过如下方法制备得到：将生物传感元件浸渍于Piranha溶液中，得到表面羟基化的生物传感元件；
其中，所述生物传感元件为生物芯片或光纤传感器；
所述Piranha溶液为浓硫酸和双氧水按体积比3:1混合后得到的混合物；
所述浸渍的温度为20～30℃，时间为20～40min；
步骤1)中，还包括对所述表面羟基化的生物传感元件进行如下处理的步骤：将其于去离子水中超声洗涤，直至超声洗涤后所得溶液的pH为中性，最后，于室温下，用氮气吹干，保存于真空干燥箱中备用。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述带氨基的硅烷化试剂为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，所述(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷是以无水甲苯溶液的形式存在，所述(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水甲苯溶液中(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的体积分数为1～5％；
所述反应的反应温度为20-30℃，反应时间为0.5-2h；
步骤1)中，还包括对所述硅烷化后的生物传感元件进行如下处理：对其用无水甲苯溶液进行清洗，充分去除反应副产物，并用氮气吹干，再于150-250℃下烘烤10-60min。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和N,N-二异丙基乙胺的甲苯溶液中N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的浓度为0.005-0.015mg/ml，N,N-二异丙基乙胺的体积分数为3-3.5％；
所述反应的反应温度为20-30℃，反应时间为1～3h。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述聚醚酰亚胺的分子量为5000～15000；
所述聚醚酰亚胺的水溶液中聚醚酰亚胺的体积分数为2～5％；
所述反应的反应温度为20-30℃，反应时间为0.5-1.5h。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述带有羧基的小分子有机物为双酚酸；
所述缩合反应的反应温度为20-30℃，反应时间为10～15h。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述缩合反应按如下步骤进行：将所述N-羟基琥珀酰亚胺、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和双酚酸溶于水中，得到混合液，再将连接高分子聚合物的生物传感元件浸渍于所述混合液中进行缩合反应，得到表面修饰有小分子有机物的生物传感元件；
其中，所述N-羟基琥珀酰亚胺、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和双酚酸的质量比为(8-12)：(8-12)：1；
所述缩合反应的反应温度为20-30℃，反应时间为10～15h。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法得到的表面修饰有小分子有机物的生物传感元件。
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