JP4849552B2

JP4849552B2 - 蛍光誘導体物質の固体基板表面への固定化方法

Info

Publication number: JP4849552B2
Application number: JP2007006366A
Authority: JP
Inventors: 伸子福田; 洋史牛島
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2007-01-15
Filing date: 2007-01-15
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2027-01-15
Also published as: JP2008170399A

Description

本発明は、蛍光誘導体物質の固定基板表面への固定化方法に関し、特に、特定物質の検出用バイオチップとして有用な固体基板を得るための、蛍光誘導体物質の固定化方法に関する。

生体内で分泌される物質のうち、カテコールアミン類やヒドロキシインドールアミン類などの、その構造中に芳香環又は環状炭化水素と1級又は２級アミンを有する化学物質（生理活性アミン）の検出は、検体を蛍光誘導体化物質などで蛍光誘導化した後に液体クロマトグラフィーや電気泳動などで分離し、蛍光によって物質を特定することにより行われている（非特許文献１〜３，特許文献１等参照）。
しかしながら、従来のこれらの方法は、蛍光誘導体化物質と検体中の特定物質との反応を行った後、液体クロマトグラフィーや電気泳動を用いるため、検出に時間が掛かるばかりでなく、一度に測定できる数に限りがあるという課題がある。

また、蛋白質等の特定物質を検出する方法としては、その検出すべき特定物質と特異的に結合する物質、例えば抗原、抗体等を、固体基板表面に直接又は間接に固定化することがおこなわれている。（特許文献２〜４参照）。
しかしながら、これらの方法では、特定物質を検出するには、別途、検体を蛍光物質で標識する等の工程を必要とするものであり、センサーを用いて直ちに検出することはできないという問題がある。

一方、特許文献５には、特定の蛍光物質を、多孔性フィルタ内に分散、固定化させて、蛍光発生層とすることが記載されている。しかし、該技術は、光励起により発する蛍光が、存在する酸素の濃度に応じてその強度を減ずる「蛍光消失現象」を利用した酸素濃度測定用素子に関するものである。
"Fluorescentproducts of the reaction for the determination of catecholamines with1,2-diphenylethylenediamine", H. Nohta et al., Anal. Chem. 1992, 267, 137-139. "Aromaticglycinonitriles and methylamines as pre-column fluorescence derivatizationreagents for catecholamines", H. Nohta et al., Anal. Chim. Acta 1997, 344,233-240. "Simultaneousdetermination of urinary catecholamines and 5-hidroxyindoleamines byhigh-performance liquid chromatography with fluorescence detection", M.Yamaguchi et al., Analyst 1998, 123, 307-311. 特開平５−２２３８１３号公報特開２００５−２４１３８９号公報特開２００１−２４７５８０号公報国際公開第２００２／０１２８９１号パンフレット特開２００１−１９４３０４号公報公報

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであって、その上に検体を流すだけで、蛍光物質による標識処理を必要とせずに高速度で、高精度に特定物質を検出しうる固体基板を提供することを目的とするものである。

発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意研究を重ねた結果、検出波長では蛍光を発しないが、検体中の特定物質との縮合反応により検出波長の蛍光を有する物質を形成する蛍光誘導体化物質を、固体基板表面に化学的に固定化することにより、特定物質を検出対象とするバイオケミカルチップの作成が容易となり、検出システムの簡素化を行うことができることを見いだした。すなわち、蛍光誘導体化物質が化学的に固定化された固体基板表面には、検出すべき検体と該蛍光誘導体化物質との縮合反応により、蛍光を発する物質が形成され、その蛍光を検出することで、検体中の特定物質を高速かつ高精度で検出することが可能となるという知見を得た。

本発明は、これらの知見に基づいて完成に至ったものであり、以下のとおりのものである。
（１）検体中の特定物質と縮合反応して検出波長の蛍光を有する物質を形成する蛍光誘導体化物質を、固体基板表面と接続分子との化学結合を介して接続分子との化学結合（但し、疎水的相互作用による結合を除く）により、固定化することを特徴とする蛍光体誘導体化物質の固体基板表面への固定化方法。
（２）前記接続分子は、固体基板表面と化学結合が可能であり且つ前記蛍光誘導体化物質と化学結合ができる、あるいは前記固体基板表面と化学結合が可能であり且つ他の接続分子と化学結合ができる、あるいは他の接続分子と化学結合が可能であり且つ前記蛍光誘導体化物質と化学結合ができる、あるいは、他の接続分子と化学結合が可能であり且つ別の接続分子と化学結合ができることを特徴とする上記（１）の固定化方法。
（３）前記特定物質は、カテコールアミン類、又はヒドロキシインドール類であって、酸化剤あるいは酸素の存在下で前記蛍光誘導体化物質と化学結合することを特徴とする上記（１）又は（２）の固定化方法。
（４）前記蛍光誘導体化物質は、ベンジルアミン誘導体、フェニルグリシノニトリル誘導体、又はジフェニルエチレンジアミン誘導体のいずれかであり、酸化剤あるいは酸素の存在下で前記特定物質と化学結合して蛍光体を形成することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかの固定化方法。
（５）前記固体基板は、ガラス又はプラスチック又は金属又は金属酸化物又は珪素を主成分として形成されていることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の固定化方法。
（６）前記特定物質が固体基板表面上に固定化された前記蛍光誘導体化物質と化学結合する前は検出波長において蛍光性を示さず、化学結合後に蛍光性を示すことを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の固定化方法。

従来の蛍光検出法では、検出前処理と液体クロマトグラフィーや電気泳動などの検出時間を合わせて、２０〜６０分を要するが、本発明の方法に得られた固体基板を用いることにより、その表面に検体を流すだけで５分以内に蛍光検出が可能となる。

本発明における固体基板は、ケミカルバイオセンサに求められる機械的強度を確保するための支持体としての役割を果たす。
基板の形状は、とくに限定されるものではないが、カード状又はディスク状に形成されているのが好ましい。
固体基板を形成するための材料は、蛍光検出型ケミカルバイオセンサの支持体として機能することができれば、とくに限定されるものではなく、例えば、ガラス、石英、セラミックス、プラスチックス、金属、金属酸化物又は珪素を主成分とするものなどによって形成することができる。プラスチックスとしては、ポリカーボネート樹脂、オレフィン樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、シリコン樹脂、フッ素系樹脂、ＡＢＳ樹脂、ウレタン樹脂、フェノール樹脂、ポリメチルメタクリレート樹脂、ポリイソブチルメタクリレート樹脂、ポリイミド樹脂などが挙げられる。

本発明において用いられる蛍光誘導体化物質とは、それ自体は検出波長で蛍光を発しないが、検体中の特定物質と縮合反応して、検出波長で蛍光を有する物質を形成するものである。このような蛍光誘導体化物質は、前述の従来の液体クロマトグラフィーや電気泳動を用いたカテコールアミン等の検出において既によく知られているものが用いられるが、特に、ベンジルアミン誘導体、フェニルグリシノニトリル誘導体、又はジフェニルエチレンジアミン誘導体のような、酸化剤あるいは酸素の存在下で特定物質と化学結合して蛍光体を形成するものが好ましく用いられる。以下にその例を示す。

本発明においては、前記蛍光誘導体化物質を、直接的な固体基板表面への化学結合、あるいは、固体基板表面と接続分子との化学結合を介して、接続分子との化学結合により固定化される。
本発明において用いられる接続分子は、（Ｉ）固体基板表面と化学結合が可能であり且つ前記蛍光誘導体化物質と化学結合ができるもの、あるいは（II）前記固体基板表面と化学結合が可能であり且つ他の接続分子と化学結合ができるもの、あるいは（III）他の接続分子と化学結合が可能であり且つ前記蛍光誘導体化物質と化学結合ができるもの、あるいは、（IV）他の接続分子と化学結合が可能であり且つ別の接続分子と化学結合ができるもの、から選ばれる。
以下に、これらの例を記載する。

（Ｉ）固体基板表面と化学結合が可能であり、且つ前記蛍光誘導体化物質と化学結合ができるものの例
「ジ（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（ＤＳＣ）」

ガラスなどの表面に化学結合し、且つ前記蛍光誘導体化物質であるベンジルアミン誘導体の上記（化３）で示されるｐ−キシリレンジアミン（ｐＸＤＡ）と化学結合する。
「４−メルカプト安息香酸」

メルカプト基が化学反応によって金・銀などの表面に化学結合し、且つ他方末端のカルボキシル基が前記蛍光誘導体化物質であるベンジルアミン誘導体のｐＸＤＡのアミノ基と化学結合する。

（II）前記固体基板表面と化学結合が可能であり且つ他の接続分子と化学結合ができるものの例
「３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）」

「３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン」

これらの（化７）及び（化８）は、一方の末端（アルコキシル基）がガラス基板表面へ化学結合し、他方の末端（アミノ基）がカルボキシル基、スクシンイミジル基あるいはイソチオシアネート基を有する他の接続分子と化学結合する。
「Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミドブチラート」

「Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドヘキサノエート」

これらの（化９）及び（化１０）は、一方の末端（スクシンイミジル基）がガラス基板表面へ化学結合し、他方の末端（マレイミド基）がメルカプト基を有する他の接続分子と化学結合する。

（III）他の接続分子と化学結合が可能であり且つ前記蛍光誘導体化物質と化学結合ができるものの例
「１，４−フェニレンヂイソチオシアネート（ＰＤＩＣ）」

一方の末端（イソチオシアネート基）が他の接続分子のアミノ基と化学結合し、他方の末端（イソチオシアネート基）が蛍光誘導体化物質のベンジルアミン誘導体であるＸＤＡのアミノ基と化学結合する。
「上記（化６）で示される４−メルカプト安息香酸」
一方の末端（メルカプト基）が他の接続分子のマレイミド基と化学結合し、他方の末端（カルボキシル基）が蛍光誘導体化物質のベンジルアミン誘導体であるＸＤＡのアミノ基と化学結合する。
「テレフタル酸」

「アジピン酸」

これらの（化１２）及び（化１３）は、一方の末端（カルボキシル基）が他の接続分子のアミノ基と化学結合し、他方の末端（カルボキシル基）が蛍光誘導体化物質のベンジルアミン誘導体であるＸＤＡのアミノ基と化学結合する。

（IV）他の接続分子と化学結合が可能であり且つ別の接続分子と化学結合ができるものの例
「１，４−ジアミノブタン」

一方の末端（アミノ基）が他の接続分子のカルボキシル基、イソチオシアネート基あるいはスクシンイミジル基と化学結合し、他方の末端（アミノ基）が別の接続分子のカルボキシル基、イソチオシアネート基あるいはスクシンイミジル基と化学結合する。
「上記（化１２）で示されるテレフタル酸」又は「上記（化１３）で示されるアジピン酸」
「上記（化１１）で示されるＰＤＩＣ」

本発明の蛍光誘導体化物質を固定化した固体基板を用いて検出しうる特定物質としては、上記蛍光誘導化物質との縮合反応により、検出波長で蛍光を有する物質を形成するものであればいずれのものでも用いることができ、具体的には、体内で分泌される物質であり、その構造中に芳香環又は環状炭化水素と1級又は２級アミンを有するものである。前述のとおり、こうした特徴を有する特定物質は既に知られているところであるが、特に、カテコールアミン類、又はヒドロキシインドール類のように、酸化剤あるいは酸素の存在下で前記蛍光誘導体化物質と化学結合するものが好ましく用いられる。以下にその例を示す。

５−ヒドロキシインドール−３−酢酸

次に、本発明の方法により得られた固体基板を用いた検出方法について説明する。
本発明の方法により得られた、蛍光誘導体化物質を固定化した固体基板上に、検体液を流し、該検体中の特定物質と前記蛍光誘導体化物質との縮合反応により検出波長の蛍光を有する物質を形成させ、その蛍光を検出することにより、検体中の特定物質の有無を検出することができる。
前記検体液は、検出すべき特定物質を充分に溶解しうる溶媒を用いて溶液とするとともに、緩衝液を用いてｐＨが８前後となるようにして調製される。こうして調製された検体液を前記固体基板上に流した後、しばらく静置して該検体中の特定物質と前記蛍光誘導体化物質との縮合反応を充分に行わせ、その後蒸留水でセンサー表面をリンスし、乾燥させる。

本発明の方法により蛍光誘導体化物質が固定化された固体基板表面に励起光を照射して、該検体中の特定物質と前記蛍光誘導体化物質との縮合反応により形成された物質から発生される蛍光を検出する。
例えば、蛍光誘導体化物質としてベンジルアミン誘導体としてｐ−キシレリンジアミン（ｐＸＤＡ）を用いてエピネフェリンを検出する場合には、励起光として３７５ｎｍの光を照射し、４７０ｎｍ付近にピークを有する蛍光の有無を検出する。

上記検出方法において、蛍光検出を行うために用いられる励起光は、前記固体基板上の前記蛍光誘導体化物質が固定化された面に照射されても、あるいはその側面に照射されてもよく、また、前記固体基板が励起光を透過する材質である場合には、その反対側の面に照射されても良い。
また、前記蛍光の検出は、透過光、反射光、迷光などの影響がもっとも少ないことから、該入射光に対して直角方向から行われることが好ましい。
さらに、本発明の方法により蛍光誘導体化物質がその表面に固定化された固体基板を用いた場合、検体中の前記特定物質と前記蛍光誘導体化物質との縮合反応により形成される物質の蛍光スペクトルから、検体中に存在する特定物質の種類を特定することができる。

次に本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
以下のようにして、合成石英基板表面に、蛍光誘導体化物質を固定化した。図１ないし図３は、その手順を模式的に示すものである。
水、エタノール等で洗浄した合成石英基板を真空乾燥後、オゾン照射処理をすることによって、表面を親水化し、次に、接続分子である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）（前記（化７））１０ｍＭを含むエタノール溶液中に、上記合成石英基板を５０℃で１５時間浸漬した。その後基板を取り出して、エタノールで基板表面をリンスし、乾燥後、１００℃１時間放置することによってＡＰＳを合成石英基板表面に化学結合させた。（図１）。

次に、該基板を、接続分子である１，４−フェニレンヂイソチオシアネート（ＰＤＩＣ）（前記（化１１））５０ｍＭを含むトルエン溶液中に、５０℃で２時間浸漬し、トルエンで表面をリンスし乾燥した（図２）。
さらに蛍光誘導体化物質ベンジルアミン誘導体であるｐ−キシリレンジアミン（ＸＤＡ）（前記（化３））５０ｍＭを含む、５０ｍＭほう酸バッファー溶液（ｐＨ８．５）中に室温で２時間浸漬し、蛍光誘導体化物質ベンジルアミンの部位が末端に出るように化学結合させた（図３）。

化学的に基板表面へ固定化された蛍光誘導体化基質ベンジルアミンがカテコールアミン類と結合し蛍光体を形成するかどうかを調べるため、カテコールアミン類の一種であるエピネフェリン（前記（化１５））５００μＭを含む、５０ｍＭほう酸バッファー溶液と５０ｍＭフェリシアン化鉄（III）カリウム溶液の混合溶液中に、表面にベンジルアミン部位が化学的に固定化された合成石英基板を５０℃で５分間浸漬した。

これを用いて、３７５ｎｍを励起光とした蛍光スペクトル測定を行ったところ、４７０ｎｍ付近に、センサー表面のベンジルアミンとエピネフェリンとの反応により生成された蛍光に起因する蛍光ピークが確認された。図４は、蛍光スペクトルを示す図である。図において、点線は、エピネフェリン反応前のスぺクトル、実線はエピネフェリン反応後のスペクトルを、それぞれ表している。
この結果から、エピネフェリンは図５に模式的に示すように固体基板表面上に化学的に固定化されたベンジルアミン部位によって蛍光誘導体化されたものと推測できる。

（実施例２）
以下のようにして、合成石英基板表面に、蛍光誘導体化物質を固定化した。図６及び図７は、その手順を模式的に示すものである。
水、エタノール等で洗浄した合成石英基板を真空乾燥後、オゾン照射処理をすることによって、表面を親水化し、次に、接続分子であるジ（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（ＤＳＣ）（前記（化５）参照）５ｍＭを含むアセトン溶液１５ｍｌを調製し、ここに１．２５ｍｌのトリエチルアミンを含むピリジン溶液１５ｍｌを混合した。この混合溶液中に親水化した合成石英基板を室温で１５時間浸漬することによってＤＳＣを合成石英基板表面に化学結合させた（図６）。
次に、エタノールで基板表面をリンスし乾燥後、蛍光誘導体化物質ベンジルアミン誘導体であるＸＤＡ１ｍＭを含む、１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を３０ｍｌ調製し、この中に室温で２時間浸漬し、ベンジルアミン部位が末端に出るように化学結合させた（図７）。

（実施例３）
以下のようにして、合成石英基板表面に、蛍光誘導体化物質を固定化した。図１及び図８は、その手順を模式的に示すものである。
水、エタノール等で洗浄した合成石英基板を真空乾燥後、オゾン照射処理をすることによって、表面を親水化し、次に、接続分子である３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）１０ｍＭを含むエタノール溶液中に、合成石英基板を５０℃で１５時間浸漬した。取り出して、エタノールで基板表面をリンスし乾燥後、１００℃１時間放置することによってＡＰＳを合成石英基板表面に化学結合させた（図１）。
次に、４−アミノメチル安息香酸（前記（化４））５００μＭを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌと５００μＭの１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌを混合した溶液を調製し、ＡＰＳが表面に結合した基板を室温で１時間浸漬することによって末端にベンジルアミン部位を化学的に固定化させた（図８）。

本発明の方法により、固体基板表面に蛍光誘導体化物質の化学的な固定化を行うことにより、特定物質、特に、ストレス等負荷により分泌される神経伝達物質のカテコールアミン類を主な対象とした蛍光検出用バイオケミカルチップとして用いることができるため、予防医療、環境等の分野においての活用が期待でき、また、ユビキタス医療（誰でもいつでもどこでも享受できる医療）に用いられるデバイスへの応用も期待できる。

親水処理された合成石英基板表面に、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）を結合させた様子を模式的に示す図。表面がアミノ基で活性になった基板に、チオ尿素結合を介して１，４−フェニレン−ジイソチオシアネート（ＰＤＩＣ）を結合させた様子を模式的に示す図。チオ尿素結合を介してｐ−キシリレンジアミン（ｐＸＤＡ）を結合させることにより、末端にベンジルアミンが存在する合成石英基板表面が作製された様子を模式的に示す図。ベンジルアミンとエピネフェリンとの反応により生成された蛍光体の蛍光スペクトルを示す図。合成石英基板上に、ベンジルアミンとエピネフェリンとの反応により生成された蛍光体を模式的に示す図。親水処理された合成石英基板表面に、ジ（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネート（ＤＳＣ）を結合させた様子を模式的に示す図。ｐ−キシリレンジアミン（ｐＸＤＡ）を結合させることにより、末端にベンジルアミンが存在する合成石英基板表面が作製された様子を模式的に示す図。末端にベンジルアミンが存在する合成石英基板表面が作製された様子を模式的に示す図。

Claims

検体中の特定物質と縮合反応して検出波長の蛍光を有する物質を形成する蛍光誘導体化物質を、固体基板表面と接続分子との化学結合を介して接続分子との化学結合（但し、疎水的相互作用による結合を除く）により、固定化することを特徴とする蛍光体誘導体化物質の固体基板表面への固定化方法。
前記接続分子は、固体基板表面と化学結合が可能であり且つ前記蛍光誘導体化物質と化学結合ができる、あるいは前記固体基板表面と化学結合が可能であり且つ他の接続分子と化学結合ができる、あるいは他の接続分子と化学結合が可能であり且つ前記蛍光誘導体化物質と化学結合ができる、あるいは、他の接続分子と化学結合が可能であり且つ別の接続分子と化学結合ができることを特徴とする請求項１に記載の固定化方法。
前記特定物質は、カテコールアミン類、又はヒドロキシインドール類であって、酸化剤あるいは酸素の存在下で前記蛍光誘導体化物質と化学結合することを特徴とする請求項１又は２に記載の固定化方法。
前記蛍光誘導体化物質は、ベンジルアミン誘導体、フェニルグリシノニトリル誘導体、又はジフェニルエチレンジアミン誘導体のいずれかであり、酸化剤あるいは酸素の存在下で前記特定物質と化学結合して蛍光体を形成することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の固定化方法。
前記固体基板は、ガラス又はプラスチック又は金属又は金属酸化物又は珪素を主成分として形成されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の固定化方法。
前記特定物質が固体基板表面上に固定化された前記蛍光誘導体化物質と化学結合する前は検出波長において蛍光性を示さず、化学結合後に蛍光性を示すことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の固定化方法。