CN110441184B - 一种固相印迹聚合物修饰qcm-d传感器的制备方法 - Google Patents

一种固相印迹聚合物修饰qcm-d传感器的制备方法 Download PDF

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    • G01N5/02Analysing materials by weighing, e.g. weighing small particles separated from a gas or liquid by absorbing or adsorbing components of a material and determining change of weight of the adsorbent, e.g. determining moisture content

Abstract

一种固相印迹聚合物修饰QCM‑D传感器的制备方法,本方法首先将模板分子固定在磁性四氧化三铁颗粒上,并在分子印迹聚合物的制备过程中引入该固相基质作为模板,从而得固相印迹聚合物,然后采用制备得到的印迹聚合物修饰石英晶体微天平传感器,最后将其成功应用于四环素的特异性识别中。本发明的优点是:采用固相印迹技术制备得到的分子印迹聚合物模板易洗脱,同时将大量印迹位点聚集于表面达到提升印迹聚合物识别能力的目的。采用固相印迹聚合物修饰的QCM‑D传感器,可以选择性地识别低浓度的目标物分子(例如50‑300ng/mL的四环素)。

Description

一种固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器的制备方法
技术领域
本发明属于基于QCM-D的分子检测技术领域,涉及一种基于固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器的制备方法。
背景技术
石英晶体微天平(QCM)是一种根据其石英晶体所产生的压电效应而制成的质量检测装置,其可将QCM芯片的质量变化变为频率变化,从而达到高精度检测质量和浓度等变化的目的,其精度可达纳克级。QCM-D与传统QCM的区别在于其在监测频率变化的同时监测耗散因子的变化,因此可以更加全面地分析QCM芯片表面的变化情况。但其与传统QCM技术一样,由于QCM芯片表面缺乏选择性,导致其在定量检测领域的应用受到限制。分子印迹聚合物是针对特定目标物而制备得到的具有高特异性和选择性的人工抗体,已被广泛应用于分离、检测等领域。基于分子印迹技术修饰的QCM传感器,将QCM的高灵敏性与分子印迹聚合物的高选择性相结合,目前已被应用于小分子以及生物大分子的检测中。然而,对于结构较复杂/可反应官能团较多的目标物分子,采用传统的分子印迹技术将导致模板不易洗脱、大量印迹位点包裹于印迹聚合物内部等缺点。固相印迹技术首先将模板分子进行固定,再与功能单体、交联剂、引发剂等混合制备得到印迹聚合物,可以在一定程度上解决传统分子印迹技术在结构较复杂/可反应官能团较多的目标物分子识别领域存在的问题。
本发明采用固相印迹技术制备的QCM-D传感器,以磁性四氧化三铁作为固相基质,通过对其进行一定修饰之后将特定的模板分子固定在表面,之后以此作为模板制备得到分子印迹聚合物,并修饰在QCM-D芯片上,采用此方法制备得到的QCM-D传感器可以选择性地、灵敏地定量检测结构较复杂/可反应官能团较多的目标物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为结构较复杂目标物的QCM-D检测提供一种新的一种基于固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器的制备方法。
解决上述技术问题所采取的技术方案是:
一种固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器的制备方法,采用固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器,可以选择性地识别低浓度的目标物分子(例如50-300ng/mL的四环素)。制备方法包括以下步骤:
第一步,模板分子的固相固定:将用于制备分子印迹聚合物的模板分子固定在二氧化硅修饰的四氧化三铁上。
①通过多元醇法制备得到四氧化三铁,然后采用原硅酸四乙基酯(TEOS)对其进行修饰,制备得到二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒;
②称取二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒超声分散于乙醇中,之后搅拌条件下向上述溶液中加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES),室温搅拌反应8~16h,反应产物采用乙醇和超纯水清洗后,干燥待用。所述m(二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒质量,mg):V(乙醇体积,mL):V(APTES,mL)在100~300:40:1之间;
③将步骤②中得到的产物超声分散于含有戊二醛的PBS溶液中,室温反应2h后用乙醇和超纯水清洗产物,干燥待用;所述的PBS溶液pH=7.4,浓度为10mmol/L。
④将步骤③中得到的产物超声分散于PBS溶液中,依次加入一定量的模板分子,室温搅拌反应12h之后,用乙醇和超纯水清洗产物,即可得到已被固定在四氧化三铁上的模板分子。所述的PBS溶液pH=7.4,浓度为10mmol/L。
所述的步骤②中APTES、步骤③中戊二醛、步骤④中模板分子的物质的量之比为1:1~2:1。
第二步,制备固相印迹聚合物
将第一步制备得到的模板分子超声分散于乙醇溶液中,并向其中依次加入甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)以及适量偶氮二异丁腈(AIBN),室温搅拌30min之后,在N2保护下,于60~80℃反应6~24h,最后采用体积比为9:1的甲醇乙酸溶液洗脱产物,产物磁性分离后对上清液进行离心,沉淀即为制备得到的固相印迹聚合物。
所述m(四氧化三铁固定的模板分子,mg):n(MAA,mmol):n(EGDMA,mmol)=50~150:0.2~0.6:20。
所述的AIBN的摩尔量为单体摩尔总量的1%。
第三步,修饰QCM-D传感器
将第二步制备得到的固相印迹聚合物超声分散于含有一定浓度PVC的四氢呋喃溶液中,取10μL上述溶液滴于清洁的QCM-D芯片上(电极面积为1.13cm2),室温静置1~2h,即可得到固定印迹聚合物修饰的QCM-D传感器。
所述的每1ml四氢呋喃溶液中对应加入1.0~2.0mg固相印迹聚合物。
所述的四氢呋喃溶液中PVC浓度0.3~0.6mg/mL。
本发明的有益效果:QCM-D检测的原理为传感器表面和目标分子之间的相互作用将导致的传感器的频率、耗散因子等发生改变,从而达到检测的目的,针对其相互作用发生在传感器表面这一特点,本发明采用固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器,提升其对目标物的选择性和特异性。本发明首先将用于制备分子印迹聚合物的模板分子进行部分固相固定,并以此作为模板制备印迹聚合物。模板分子的固定可以使得结构较复杂/可反应官能团数量多的模板分子变得相对简单,从而达到印迹聚合物的大量印迹位点位于表面的目的,同时也利于模板分子的快速洗脱,这将将为分子印迹聚合物修饰QCM-D传感器提供一种新的思路。同时由于在分子印迹聚合物制备的过程中引入了具有磁性的四氧化三铁作为固定模板的基质,使得实验操作过程中可以使用磁性对产物进行分离,简化了实验的操作过程。
附图说明
图1是以四环素作为模板时制备该固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器的原子力显微镜图。
图2是以四环素作为模板时制备该固相印迹聚合物(MIP1)与传统印迹聚合物(MIP2)的吸附结果对比图。
图3是以四环素作为模板时制备该固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器(A)与非印迹聚合物修饰QCM-D传感器(B)对四环素分子测定的结果图。
图4是以四环素作为模板时制备该固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器对四环素以及其干扰物的测定结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器的制备方法,以四环素作为目标分子,首先将四环素固定在实验室制备得到的磁性四氧化三铁颗粒上,然后将此固相基质作为模板分子,与功能单体、交联剂、引发剂混合制备得到固相印迹聚合物,并将其修饰到QCM-D芯片表面,得到固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器,具体包括如下步骤:
1)固相基质的制备:本发明中采用的固相基质为二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒。其中四氧化三铁通过多元醇法制备得到,具体制备方法如下:将1.3g的六水合氯化铁溶于40mL乙二醇中,超声分散后向其中依次加入3.2g无水乙酸钠和2.0g聚乙二醇(Mw=10000),磁力搅拌30min,将上述溶液转移至反应釜中,200℃反应8h。冷却至室温后,采用乙醇和超纯水清洗产物,干燥后待用。二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒按照如下步骤获得:称取200mg的四氧化三铁颗粒,将其超声分散于异丙醇(50mL)和超纯水(4mL)的混合溶液中,之后向上述溶液中加入氨水,接下来向其中逐滴添加2mL的四乙基硅氧烷,室温搅拌12h,最后将反应产物用乙醇和超纯水清洗后干燥,即可得到二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒。
2)模板分子的固定:该步骤的目的为将用于制备分子印迹聚合物的模板分子固定在二氧化硅修饰的四氧化三铁上,①将200mg二氧化硅修饰的四氧化三铁超声分散于40mL乙醇中,之后搅拌条件下向上述溶液中加入1mLAPTES,室温搅拌反应12h,反应产物采用乙醇和超纯水清洗后,干燥待用;②将步骤①中得到的产物超声分散于含有戊二醛(与步骤①中的APTES等摩尔质量)的PBS溶液,室温反应2h后用乙醇和超纯水清洗产物,干燥待用;③将步骤②中得到的产物超声分散于PBS溶液中,加入与APTES等摩尔质量的四环素,室温搅拌反应12h之后,用乙醇和超纯水清洗产物,即可得到已被固定在四氧化三铁上的模板分子。所述PBS溶液pH=7.4,浓度为10mmol/L。
3)固相印迹聚合物的制备:首先100mg已采用四氧化三铁固定的模板分子,超声分散于10mL乙醇溶液中,并向其中依次加入0.4mmol的MAA、20mmol的EGDMA以及适量AIBN,室温搅拌30min之后,在氮气保护下65℃反应12h,最后采用9:1的甲醇乙酸溶液洗脱产物,产物磁性分离后对上清液进行离心,沉淀即为制备得到的固相印迹聚合物。
4)QCM-D传感器的修饰:将1.5mg制备得到的固相印迹聚合物超声分散于1mL含有一定浓度PVC(0.5mg/mL)的四氢呋喃溶液中,取10μL上述溶液滴于清洁的QCM-D芯片上,室温静置1.5h,即可得到固定印迹聚合物修饰的QCM-D传感器。
实验制得的固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器对四环素的测定步骤为:将浓度为50-600ppb(ng/mL)的四环素溶液分别通入已装载有固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器的仪器中,获取吸附过程中QCM-D传感器的频率变化,通过公式拟合得到吸附质量m。所采用的石英晶体微天平为瑞典百欧林的QCM-D E4。非印迹聚合物修饰QCM-D传感器对四环素的测定步骤与此相同。
图1为该固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器的原子力显微镜图,如图所示,QCM-D传感器已被均匀修饰上固相印迹聚合物,最大高度为93nm。
图3为该固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器与非印迹聚合物修饰QCM-D传感器对四环素分子测定的结果图。如图A显示,固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器对四环素的识别能力更强,且最大印迹因子高达10,具有优异的特异性。同时从图B可知,在50-300ppb范围内,传感器吸附质量变化与四环素浓度呈线性相关,因此可在此范围内对四环素进行检测。
图4为该固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器对四环素以及其干扰物的测定结果图。选用的干扰物为4-硝基酚(4-NP)、诺氟沙星(NOF)、磺胺二甲基嘧啶(SMT)、金霉素(OTC)、土霉素(CTC),如图所示,该固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器对四环素具有最强的识别能力,说明其具有优异的选择性。
实施例2
一种固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器的制备方法,以四环素作为目标分子,首先将四环素固定在实验室制备得到的磁性四氧化三铁颗粒上,然后将此固相基质作为模板分子,与功能单体、交联剂、引发剂混合制备得到固相印迹聚合物,并将其修饰到QCM-D芯片表面,得到固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器,具体包括如下步骤:
1)固相基质的制备:本发明中采用的固相基质为二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒。其中四氧化三铁通过多元醇法制备得到,之后采用原硅酸四乙酯对其进行二氧化硅修饰,即可得到二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒,具体制备方法同实施例1。
2)模板分子的固定:该步骤的目的为将用于制备分子印迹聚合物的模板分子固定在二氧化硅修饰的四氧化三铁上,①将100mg二氧化硅修饰的四氧化三铁超声分散于40mL乙醇中,之后搅拌条件下向上述溶液中加入1mLAPTES,室温搅拌反应8h,反应产物采用乙醇和超纯水清洗后,干燥待用;②将步骤①中得到的产物超声分散于含有戊二醛(与步骤①中的APTES等摩尔质量)的PBS溶液,室温反应2h后用乙醇和超纯水清洗产物,干燥待用;③将步骤②中得到的产物超声分散于PBS溶液中,加入与步骤①APTES等摩尔质量的四环素,室温搅拌反应12h之后,用乙醇和超纯水清洗产物,即可得到已被固定在四氧化三铁上的模板分子。所述PBS溶液pH=7.4,浓度为10mmol/L。
3)固相印迹聚合物的制备:首先称取50mg已采用四氧化三铁固定的模板分子,超声分散于10mL乙醇溶液中,并向其中依次加入0.2mmol的MAA、20mmol的EGDMA以及适量AIBN,室温搅拌30min之后,在氮气保护下60℃反应24h,最后采用9:1的甲醇乙酸溶液洗脱产物,产物磁性分离后对上清液进行离心,沉淀即为制备得到的固相印迹聚合物。
4)QCM-D传感器的修饰:将1.0mg制备得到的固相印迹聚合物超声分散于1mL含有一定浓度PVC(0.3mg/mL)的四氢呋喃溶液中,取10μL上述溶液滴于清洁的QCM-D芯片上,室温静置1h,即可得到固定印迹聚合物修饰的QCM-D传感器。
实施例3
一种固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器的制备方法,以四环素作为目标分子,首先将四环素固定在实验室制备得到的磁性四氧化三铁颗粒上,然后将此固相基质作为模板分子,与功能单体、交联剂、引发剂混合制备得到固相印迹聚合物,并将其修饰到QCM-D芯片表面,得到固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器,具体包括如下步骤:
1)固相基质的制备:本发明中采用的固相基质为二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒。其中四氧化三铁通过多元醇法制备得到,之后采用原硅酸四乙酯对其进行二氧化硅修饰,即可得到二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒,具体制备方法同实施例1。
2)模板分子的固定:该步骤的目的为将用于制备分子印迹聚合物的模板分子固定在二氧化硅修饰的四氧化三铁上,①将300mg二氧化硅修饰的四氧化三铁超声分散于40mL乙醇中,之后搅拌条件下向上述溶液中加入1mLAPTES,室温搅拌反应16h,反应产物采用乙醇和超纯水清洗后,干燥待用;②将步骤①中得到的产物超声分散于含有戊二醛(摩尔质量为步骤①中APTES的两倍)的PBS溶液,室温反应2h后用乙醇和超纯水清洗产物,干燥待用;③将步骤②中得到的产物超声分散于PBS溶液中,加入与步骤①APTES等摩尔质量的四环素,室温搅拌反应12h之后,用乙醇和超纯水清洗产物,即可得到已被固定在四氧化三铁上的模板分子。所述PBS溶液pH=7.4,浓度为10mmol/L。
3)固相印迹聚合物的制备:首先称取150mg已采用四氧化三铁固定的模板分子,超声分散于10mL乙醇溶液中,并向其中依次加入0.6mmol的MAA、20mmol的EGDMA以及适量AIBN,室温搅拌30min之后,在氮气保护下80℃反应6h,最后采用9:1的甲醇乙酸溶液洗脱产物,产物磁性分离后对上清液进行离心,沉淀即为制备得到的固相印迹聚合物。
4)QCM-D传感器的修饰:将2.0mg制备得到的固相印迹聚合物超声分散于1mL含有一定浓度PVC(0.6mg/mL)的四氢呋喃溶液中,取10μL上述溶液滴于清洁的QCM-D芯片上,室温静置2h,即可得到固定印迹聚合物修饰的QCM-D传感器。
对比例1
一种固相印迹聚合物的制备方法与实施例1相同,区别在于在本实施例中无须将固相印迹聚合物修饰到QCM-D芯片上,传统的分子印迹聚合物的制备方法如下:
称取27.5mg四环素,溶于10mL乙醇溶液中,之后向其中加入0.4mmol(34μL)MAA,搅拌条件下室温预聚合30min后,向上述溶液中依次加入20mmol(377μL)交联剂EGDMA和200mg引发剂AIBN,待完全溶解后通入氮气,并在氮气保护下65℃反应12h,最后采用9:1的甲醇乙酸溶液洗脱模板,并用紫外分光光度计检测洗脱液中四环素的含量,直到上清液中检测不到四环素,停止洗脱过程,离心后即可得到相应分子印迹聚合物。
固相印迹聚合物(MIP1)与传统分子印迹聚合物(MIP2)的动态吸附实验步骤如下:分别称取5mg MIP1和MIP2于15mL的离心管中,并分别加入15mL四环素溶液(10mg/L)。每2h取2mL样品用紫外分光光度计(360nm)进行检测,利用朗伯比尔定律计算此时溶液浓度,并计算出吸附量。
图2是以四环素作为模板时制备的固相印迹聚合物(MIP1)与传统印迹聚合物(MIP2)的吸附结果对比图,图中显示:固相印迹聚合具有更大的吸附容量,即吸附能力更强。
以上所述实施例仅表达本发明的实施方式,但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制,应当指出,对于本领域的技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
第一步,模板分子的固相固定:将用于制备分子印迹聚合物的模板分子固定在二氧化硅修饰的四氧化三铁上;
①通过多元醇法制备得到四氧化三铁,然后采用原硅酸四乙基酯TEOS对其进行修饰,制备得到二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒;
②称取二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒超声分散于乙醇中,向分散有二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒的乙醇溶液中加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷APTES,室温搅拌反应8~16h,反应产物采用乙醇和超纯水清洗后,干燥待用;每1mL所述的APTES,对应加入100~300mg二氧化硅修饰的四氧化三铁颗粒,对应40mL乙醇;
③将步骤②中得到的产物超声分散于含有戊二醛的PBS溶液中,室温反应2h后用乙醇和超纯水清洗产物,干燥待用;
④将步骤③中得到的产物超声分散于PBS溶液中,加入模板分子,室温搅拌反应12h之后,用乙醇和超纯水清洗产物,得到已被固定在四氧化三铁上的模板分子;
所述的步骤②中APTES、步骤③中戊二醛、步骤④中模板分子的物质的量之比为1:1~2:1;
第二步,制备固相印迹聚合物
将第一步制备得到的模板分子超声分散于乙醇溶液中,并向其中依次加入甲基丙烯酸MAA、乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA以及适量偶氮二异丁腈AIBN,室温搅拌30min之后,在N2保护下,于60~80℃反应6~24h,最后采用甲醇乙酸溶液洗脱产物,产物磁性分离后对上清液进行离心,沉淀即为制备得到的固相印迹聚合物;四氧化三铁固定的模板分子的质量与MAA物质的量及EGDMA物质的量之间的比例关系为50~150:0.2~0.6:20,其中四氧化三铁固定的模板分子的质量的单位为mg,EGDMA物质的量和MAA物质的量的单位都为mmol;
第三步,修饰QCM-D传感器
将第二步制备得到的固相印迹聚合物超声分散于含有PVC的四氢呋喃溶液中,得到含有固相印迹聚合物的溶液,将上述含有固相印迹聚合物的溶液滴于清洁的QCM-D芯片上,室温静置1~2h,得到固相印迹聚合物修饰的QCM-D传感器;每1ml所述的四氢呋喃溶液中对应加入1.0~2.0mg固相印迹聚合物;所述的四氢呋喃溶液中PVC浓度0.3~0.6mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器的制备方法,其特征在于,所述的第一步步骤③和步骤④中,PBS溶液pH=7.4,浓度为10mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器的制备方法,其特征在于,所述的第二步中甲醇乙酸溶液中,甲醇与乙酸的体积比为9:1。
4.根据权利要求1或2所述的一种固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器的制备方法,其特征在于,每1.13cm2QCM-D芯片电极上对应滴加10μL所述含有固相印迹聚合物的溶液。
5.根据权利要求3所述的一种固相印迹聚合物修饰QCM-D传感器的制备方法,其特征在于,每1.13cm2QCM-D芯片电极上对应滴加10μL所述含有固相印迹聚合物的溶液。
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