KR20030005652A

KR20030005652A - 실리케이트의 코팅 방법

Info

Publication number: KR20030005652A
Application number: KR1020010041025A
Authority: KR
Inventors: 유상구
Original assignee: 유상구
Priority date: 2001-07-09
Filing date: 2001-07-09
Publication date: 2003-01-23

Abstract

본 발명은 실리케이트 표면으로 고밀도 고분지의 다중 아미노에틸 분자층을 형성함으로써 기질의 표면을 코팅하는 방법/ 이렇게 코팅 처리한 기질 그 자체/ 및 이들 기질을 사용하여 DNA나 올리고뉴클리오티드와 같은 핵산, 효소나 항체와 같은 단백질, 생리활성 억제제나 촉진제와 같은 각종 생리활성 분자, 다양한 이화학적 기능을 촉진하는 촉매, 각종 센서나 화면표시 기능을 담당하는 액정분자 등 다양한 기능성 분자 등을 고정하는 방법을 제공하는 것이다. 기질 표면의 코팅 방법에 대해서 보다 상세하게 설명하면, 실리케이트 표면에 돌출된 수산기를 아지리딘 혹은 그 유도체와 반응시킴으로써 기질의 표면으로 고밀도 고분지의 다중 아미노에틸 분자층을 형성하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 말하는 실리케이트로는 유리판(glass plate), 박막(membrane), 튜브(tube), 비드(bead), 다공성 필터, 구형, 미세 분말 등 다양한 형태로 성형한 것들을 통칭하는 것이다.

또한, 본 발명의 코팅방법으로 준비한 기질 표면으로 생분자를 고정하기 위해서 이중기능성 링커(Bifunctional linker) 분자를 이용하기도 하는데, 본 발명에서 준비한 기질을 사용하여 생분자를 고정하는 경우에는 기질 표면의 이화학적 성질을 획기적으로 개선할 수 있을 뿐만 아니라 DNA 칩을 비롯한 각종 바이오 칩을 제조하는 데 필요요건 단계로 간주되어 온 하이브리다이제이션 과정에 선행하는 잔여 표면의 보호 과정(Blocking Process)을 생략하는 등 공정을 간소화할 수 있는다양한 이점을 기대할 수 있다.

Description

실리케이트의 코팅 방법{Coating method on silicate}

오늘날 일반적으로 사용되고 있는 DNA 칩이나 단백질 칩과 같은 각종 바이오 칩의 경우에는 핵산이나 단백질과 같은 생분자를 주로 유리나 플라스틱과 같은 기질의 표면에 고정시키는 것을 시작으로 다양한 분야에 활용한다. 하지만 유리나 플라스틱과 같은 기질의 표면에는 화학적 결합을 유도할 수 있는 특별한 화학적 작용기가 없기 때문에 기질의 표면으로 이들 생분자의 활성을 그대로 유지하면서 이들을 효과적으로 고정시키는데는 많은 문제점이 수반된다. 이런 문제를 극복하기 위해서 이들 생분자를 유리나 플라스틱과 같은 기질 표면에 안전하게 고정하기 위한다양한 연구가 폭넓게 진행되고 있다.

본 발명은 이러한 문제점을 극복하기 위한 효과적인 방안으로써 실리케이트를 사용하여 아지리딘 혹은 그 유도체와의 연쇄 반응을 유도함으로써 이들 기질의 표면에서 다중 아미노에틸 분자층을 형성하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 기질을 사용하여 각종 분자들을 기질의 표면에 안전하게 고정시키는 분자 고정화 기술을 제공함으로써 각종 바이오 칩을 비롯한 생물학 분야는 물론이고 나아가 다양한 분야에 폭넓게 활용할 수 있는 기술적 기반을 제공하는데도 그 목적이 있다.

지금까지 기질 표면의 이화학적 특성을 임의로 변화시킬 수 있는 다양한 방법(기질 표면의 코팅기술)이 개발되어왔다. 이들 코팅 방법 중에서 널리 사용되고 있는 방법 중에는 "그래프팅(Grafting) 방법"이 있다. 즉, 우리 일반적으로 사용하는 기초 재료의 표면에는 화학적 반응에 필요한 작용기가 전혀 없거나 극히 소량으로만 존재할 뿐만 아니라 화학 반응에 필요한 접촉면적도 대단히 제한 적이어서 화학적 코팅을 위한 반응성이 떨어질 수밖에 없다. 이런 이유로 기질의 표면에서 화학적 반응을 통해서 코팅을 하려는 경우에는 많은 제약이 따를 수밖에 없다. 이런 문제를 극복하기 위한 방편으로써 우선 반응성이 대단히 뛰어난 물질을 사용하여 기질의 표면을 1차로 코팅하고 다시 이를 이용하여 원래 원하는 화학반응을 이끌어내는 방법이 개발되었는데, 이것이 바로 "그래프팅(Grafting) 방법"이다.

일례로, 아브라함 울만(Abraham Ulman) 등은 히드록시 혹은 할로겐 등과 같은 작용기를 포함한 티올 사슬(Thiol Chains)을 사용하여 금(Au) 표면 위로SAM(Self Assembled Mono-Layer)을 형성하고, 이를 이용하여 양이온적 혹은 음이온적 중합반응을 일으키게 함으로써 금과 같은 금속 기질의 표면으로 새로운 특성을 도입할 수 있음을 보여주었다(J. Am. Chem. Soc. 1998,120,2432;J. Am. Chem. Soc. 1999, 121 , 1016).

이와 유사한 방법으로써 박준원 등은 앞서 언급한 아브라함 울만 교수의 "그래프팅(Grafting) 방법"을 약간 변형시켜 적용했는데, 유리 표면으로 아미노프로필디알콕시알킬 실란이나 아미노프로필트리알콕시 실란 등을 사용한 실란화반응을 통해서 유리 표면으로 일종의 SAM(Self Assembled Mono-Layer)을 형성하였고, 이들 SAM에 붙어 있는 아민기를 사용하여 아지리딘과의 연쇄 반응을 이끌어냄으로써 유리 표면으로 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 형성하는 방법을 보고하고 있다(Journal of Colloid and Interface Science 2000, 227 , 247).

그러나 실란화 그래프팅 방법의 경우에는 유리 표면에서 실란화 중합반응을 유도한 것이기 때문에 실란화 반응의 진행 정도를 정확하게 조절하기 어려울 뿐만 아니라 형성된 SAM의 내구성도도 떨어지기 때문에 실제로 사용하는데는 많은 어려움이 따른다. 또한, 기질의 표면을 코팅한다는 관점에서 보면 그래프팅 과정도 또 한번의 코팅 과정이기 때문에 그래프팅 방법에 의한 코팅 기술은 궁극적으로 2단계 코팅 과정을 필요로 하는 번거로운 작업일 수밖에 없다. 이런 이유로 본 발명에서는 실란화 그래프팅 과정을 생략한 채 실리케이트 표면의 수산기를 직접 아지리딘과 반응하도록 유도함으로써 실리케이트 표면을 보다 쉽고 편리하게 코팅할 수 있는 새로운 방법을 개발하고자 노력하였다.

한편, 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층이 형성된 기질의 표면으로 DNA나 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산, 각종 효소나 항원과 같은 단백질, 지질분자 등 다양한 생분자를 고정하는 경우에는 카르복실아미드, 카바메이트, 유레아, 설폰아미드, 티오카바메이트, 티오유레아, 이민, 엔아민 등과 같은 결합을 유도함으로써 기질 표면의 아민과 직접 연결하여 고정할 수도 있지만, 다양한 화학적 기능을 담당하는 분자들을 고정하는 경우에는 이중 기능성 링커(bifunctional linker)를 사용함으로써 보다 좋은 결과를 얻을 수 있다. 이러한 방법에 관해서는 이미 다양한 연구("Bioconjugation", Mohammed Aslam and Alastair Dent, Academic Press, 1996; "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson, Academic Press, 1998; "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", Shan S. Wong, CRC Press, 1993)를 통해서 잘 알려져 있다. 따라서 본 발명의 경우에는 기질의 표면으로 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 형성시켰기 때문에 이들 기질 표면의 아민기와 고정하려는 분자의 이화학적 특성을 고려하여 효과적인 방법을 선별적으로 활용할 수 있다.

본 발명은 실리케이트 표면에 돌출해 있는 수산기를 아지리딘 혹은 그 유도체와 직접 반응시킴으로써 실란화 과정과 같은 특별한 그래프팅(Grafting) 과정 없이 직접 고밀도 고분지의 다중 아미노에틸 분자층을 형성하는 방법을 제공하는데 있다. 이때의 반응에서 특이한 점은 우선 기질 표면에 돌출해 있는 친핵성 작용기가 아지리딘 혹은 그 유도체와 반응하면서 1차 아민을 생성하게 되는데 이는 또 다른 아지리딘 분자와 2번의 반응이 가능하기 때문에 결과적으로 이 과정이 연쇄적으로 반복되면서 기질 표면의 아민 밀도는 점점 증가한다.

또한, 이렇게 해서 기질의 표면으로 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 형성하면 기질의 표면은 이전과는 전혀 다른 이화학적 특성을 띄게 되므로 다양한 장점을 얻을 수 있다. 첫째, 기질 표면에 고밀도 고분지의 다중 아미노에틸 분자층을 형성하였기 때문에 기질의 표면은 실리케이트와는 전혀 다른 이화학적 특성을 띄게 된다. 둘째, 기질의 표면에 형성된 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 이용하여 효소나 항체와 같은 각종 단백질, DNA나 RNA 등과 같은 각종 핵산, 각종 기능성 화학 촉매, 빛을 전기나 열로 전화시키는 기능성 분자, 각종 센서나 디스플레이의 핵심요소인 액정(液晶) 분자 등을 안전하고 효과적으로 고정시킬 수 있다. 이처럼 본 발명에서는 기질 표면의 이화학적 특성을 새롭게 부가함으로써 기질의 표면으로 다양한 기능성 물질들을 자유롭고 안정적으로 고정시킬 수 있는 기술적 토대를 제공하는데 그 목적이 있다.

한편, 기질 표면에 기능성 물질들을 안전하게 고정시키는 기술의 중요성은 갈수록 중요하게 부각되고 있다. 특히, 생분자를 기질의 표면에 고정하는 기술의 경우에는 더욱 그러하다. 즉, 효소나 항체와 같은 단백질의 경우에는 체내에서의 효과적인 운송방법, in vitro 상에서의 효율적인 생반응 공정기 제작, 활성이나 특이성을 연구 또는 진단하기 위한 단백질 칩, 면역센서 등을 구성하기 위하여 다양한 생분자를 효과적으로 고정화하기 위한 기술이 중요하게 부각되고 있으며, 핵산의 경우에도 DNA 하이브리다이제이(Hybridization) 방법에 의한 DNA 어레이 칩을사용하여 유전적 돌연변이 분석, 미지의 DNA 염기서열 분석, SNP(single nucleotide polymorphism)의 연구 등에서 그 중요성이 더해가고 있다. 이들 기능성 분자를 안전하게 고정화하기 위한 기술의 핵심은 생분자를 기질의 표면으로 보다 쉽게 고정하는 것은 물론이고 고정시킨 분자와 상보적인 관계의 분자나 리간드가 효과적으로 접근할 수 있는 환경을 개발하는데 있다. 특히, DNA 칩의 경우에 보다 명확한 정보를 얻기 위해서는 가급적 많은 DNA probe를 기질의 표면으로 집적하고, 하이브리다이제이션 과정을 통해서 극미량의 농도에서도 측정의 신뢰도를 높게 유지할 수 있어야 하는데, 본 발명의 경우에 이러한 문제점을 효과적으로 극복할 수 있는 재료를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 준하여 실리케이트 표면의 수산기를 아지리딘과 반응함으로써 기질의 표면으로 형성된 고밀도 고분지의 다중 아미노에틸 분자층을 나타낸 도면이다.

도 2는 본 발명의 방법에 준하여 준비한 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층 위로 이중 기능성 링커를 사용하여 핵산 올리고머를 고정하는 과정을 나타낸 도면이다.

본 발명은 실리케이트 표면으로 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 형성하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 실리케이트 표면에 돌출해있는 수산기를 아지리딘 혹은 그 유도체와 직접 반응시킴으로써 기질 표면으로 고밀도 고분지의 다중 아미노에틸 분자층을 형성하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이렇게 형성된 기질 표면의 고밀도 고분지의 아미노에틸 분자층을 사용하여 생분자를 비롯한 다양한 기능성 분자를 고정하여 시키는 방법에 관한 것이다.

그러므로, 본 발명의 첫 번째 목적은 실리케이트 표면에서 아지리딘 혹은 그 유도체와의 직접적인 중합반응을 일으킴으로써 기질의 표면으로 고밀도, 고분지의 다중 아미노에틸 분자층을 형성하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서 말하는 기질의 물리적 형태로는 일반 유리판(glass plate), 박막(membrane), 튜브(tube),비드(bead), 다공성 필터, 구형, 미세 분말 등 어떠한 형태도 무방하기 때문에 여기서 말하는 형태에만 특별히 한정되는 것은 물론 아니다.

본 발명에서 실리케이트 표면에 돌출된 수산기와 중합반응을 일으키는 아지리딘 혹은 그 유도체는 하기의 [화학식 1]로 표시되는 할로알킬아민 유도체나 그 화학적 동등체(Equivalents)를 강염기성 수용액에 녹인 다음 가열하다가 이를 증류함으로써 정제했는데, 이렇게 정제했을 때는 상당량의 수분을 함유하고 있기 때문에 무수황산마그네슘이나 무수황산나트륨 등과 같은 탈수제를 사용하여 수분을 제거한 후 분별 증류함으로써 순수한 상태의 아지리딘 및 그 유도체를 정제하여 사용하였다.

[화학식 1]

본 발명에 따라 기질의 표면으로 고밀도의 아민기를 가진 분자층을 형성하는 방법에 대해서 설명하기로 하자. 먼저, 실리케이트 표면을 깨끗이 세척하여 진공 건조함으로써 기질의 표면을 활성화한다. 이렇게 준비한 기질을 3% 아지리딘 용액을 50∼250℃에서 0.1∼30시간 정도 처리한다. 이때, 반응 온도가 너무 낮으면 반응이 일어나지 않으며, 너무 높으면 코팅 품질이 떨어진다. 특히, 아지리딘을 사용하여 실리케이트 표면을 효과적으로 코팅하기 위해서는 용매의 선정이 중요한데, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라클로로메탄, 트리클로로에탄, 에틸아세테이트, 아세토니트릴, 아세톤, 부탄온, 헥산온, DMSO, DMF, 헥산, 옥탄, 에틸 에테르, THF, 1,4-디옥산(1,4-dioxane), 디에톡시메탄, 에틸렌 글리콜 디에틸 에테르(ethylene glycol diethyl ether), 디부틸에테르 등과 같은 비알콜계용매(aprotic solvent) 혹은 이들을 조합한 혼합 용매면 무방하지만, 에틸 에테르, THF, 디부틸 에테르, 1,4-디옥산, 디에톡시메탄, 에틸렌 글리콜 디에틸 에테르 등과 같은 에테르계 용매가 특히 바람직하다. 이러한 결과는 현미경용 유리(slide glass)를 사용한 실험에서 유리 표면에 형성된 아민의 밀도(표 1) 및 AFM 측정 결과(도 3)를 통해서 유리 표면에서의 코팅 상태를 확인했다. 이때, 필요한 경우에는 반응을 촉진하기 위한 촉매로 산(Acid)을 소량 가하기도 하는데 일반적으로는 아세트산, 트리플루오르아세트산, p-톨루엔 설폰산 등이 바람직하다. 이렇게 하여 반응 용액에 기질을 담근 채 일정 시간 동안 가열하여 실리케이트 표면으로 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 도입한 후에 용매를 사용하여 기질의 표면을 깨끗하게 세척하고 진공 건조한다. 이러한 과정을 따름으로써 도 1에 나타나 있듯이 고밀도의 다중 아미노에틸기를 도입함으로써 원래의 실리케이트 표면과는 이화학적 조건이 전혀 다른 새로운 기질을 얻을 수 있다.

이와 같은 방법으로 실리케이트 표면으로 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 도입하면 기질의 표면은 이전과는 전혀 다른 여러 가지 장점을 지니게된다.

첫째, 기질의 표면이 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층으로 코팅되었기 때문에 원래의 기질과는 전혀 다른 이화학적 특성을 보여준다. 둘째, 기질의 표면으로 고밀도의 아미노에틸 분자층을 형성했기 때문에 기질의 표면으로 효소나 항체와 같은 단백질, DNA나 올리고뉴클리오티드와 같은 핵산, 각종 기능성 화학 분자 등을 균일하게 고정시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 중요한 두 번째 목적은 기질 표면에 형성된 다중의 아미노에틸 분자층을 사용하여 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 터펜(terpene), 알칼로이드 등과 같은 생분자를 포함하여 각종 촉매를 비롯한 기능성 분자를 쉽고 안전하게 고정시키는 방법을 제공하는데 있다. 보다 상세하게는 다중 아미노에틸 분자층이 형성되어 있는 기질의 표면의 아민기(-NH₂)와 기질 표면으로 고정하려는 기능성 분자에 존재하는 카르복실산기(-CO₂H)나 포밀(-CHO)기를 카르복실아미드(carboxylamide)나 이민(imine)결합을 통해서 연결함으로써 원하는 기능성 분자를 안정적으로 고정할 수 있다. 그러나 일반적인 경우에 있어서 올리고뉴클레오티드나 DNA와 같은 핵산, 각종 단백질, 지질 분자 등과 같은 생분자를 고정하는 경우에는 이들 생분자에서 쉽게 안전하게 활용할 수 있는 카르복실산기나 포밀기를 갖고 있지 않은 경우가 많을 뿐만 아니라 기질의 표면과 고정시키고자 하는 분자와의 간격을 어느 정도 유지할 필요가 있다. 이런 문제를 종합적으로 해결하기 위해서 이중기능성 링커(Bifunctional cross-linker)를 매개로 하여 고정화하는 방법이 효과적으로 활용할 수 있다. 앞서 설명했듯이, 이러한 방법에 관해서는이미 다양한 연구("Bioconjugation", Mohammed Aslam and Alastair Dent, Academic Press, 1996; "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson, Academic Press, 1998; "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", Shan S. Wong, CRC Press, 1993)를 통해서 잘 알려져 있기 때문에 본 발명의 경우에는 이중기능성 링커를 사용하여 다양한 생분자를 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 형성시킨 기질 위로 이들 일반적인 이중기능성 링커를 사용하여 생분자 고정화하는 방법과 그 활용 용도를 제공하는 것에도 그 목적이 있다.

이들 방법들의 경우에는 고정화 과정에 사용하는 생분자의 작용기에 따라서 서로 다른 이중기능성 링커(Bifunctional Linker)를 필요로 하는데, 이때 사용할 수 있는 작용기로는 아민기(-NH₂), 티올기(-SH), 수산기(-OH), 알데히드기(-CHO), 카르복실산기(-CO₂H) 등이 있다. 이들 작용기의 종류에 따라 본 발명의 아미노에틸 분자층과 결합할 때 사용할 수 있는 이중기능성 링커(Bifunctional Linker)들을 유형별로 정리하면 (표 2)와 다음과 같다.

다음은 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 실시예이다. 하지만 본 발명은 이들 실시예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1(고밀도 아미노에틸 분자층의 형성-1)

먼저, 7.5cmx 2.5cm 크기의 현미경용 유리판(slide glass plate)의 표면을 깨끗하게 세척한 다음 진공 건조했다. 유리판을 3% 아지리딘을 함유한 무수 1,4-디옥산(1,4-dioxane) 용액에 담근 상태로 10시간 동안 80℃로 유지한다. 유리판을 톨루엔과 메탄올을 사용하여 10분간 초음파 처리함으로써 기질의 표면을 깨끗하게 세정하여 진공 건조하였다.

실시예 2(고밀도 아미노에틸 분자층의 형성-2)

먼저, 200∼400 메쉬 크기의 크로마토그래피용 실리카겔 분말 10g을 3% 아지리딘을 함유한 200㎖ 무수 THF 용액에 담근 상태로 세차게 교반하면서 10시간 동안 환류시킨다. 실리카겔 분말을 톨루엔과 메탄올을 사용하여 10분간 초음파 처리함으로써 기질의 표면을 깨끗하게 세정하여 진공 건조하였다.

실시예 3(고밀도 아미노에틸 분자층의 형성-4)

8∼12 메쉬 크기의 모레큘러 시브(Molecular Sieves) 10g을 3% 아지리딘을 함유한 300㎖ 무수 THF 용액에 담근 상태로 10시간 동안 환류시킨다. 모레큘러 시브를 톨루엔과 메탄올을 사용하여 10분간 초음파 처리함으로써 기질의 표면을 깨끗하게 세정하여 진공 건조하였다.

실시예 4(기질 표면에 형성된 아민기의 확인)

실시예 1, 2, 3에서 준비한 기질의 표면에 아민 분자층이 형성된 것을 확인하기 위한 방법으로써 4-니트로 벤자알데히드를 이용하였다. 즉, 위에서 준비한 기질을 무수 에탄올에 넣고 미량의 아세트산을 촉매로 사용하여 4-니트로 벤자알데히드와 반응시켜 기질의 표면 위로 이민을 형성하였다. 이렇게 이민을 형성한 기질을 에탄올에서 꺼내어 깨끗이 세척하여 진공 건조한 다음, 이를 다시 증류수에 담그고 60℃에서 6시간 방치함으로써 이민을 형성하면서 소모되었던 4-니트로 벤자알데히드가 다시 가수분해되어 나오게 하였다. 이렇게 준비한 수용액을 자외선 분광기를 활용하여 4-니트로 벤자알데히드의 흡광도를 측정함으로써 기질 표면에 형성되어 있는 1차 아민의 존재를 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 1의 경우에는 흡광도의 세기로부터 기질 표면에 형성된 아민의 밀도를 환산함으로써 아민의 밀도가 25∼27개/100Å2에 달할 정도로 기질 표면에서의 아민기의 밀도가 높은 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5(이중기능성 링커에 의한 올리고뉴클레오티드의 고정화 및 DNA 하이브리다이제이션-1)

560mg의 N-숙시닐이미딜-4-말레이미도 부티레이트(GMBS)를 100㎖의 DMF에 녹이고 50mM의 NaHCO₃수용액을 사용하여 용액을 10배로 묽힌 후에,실시예1에서 준비한 고밀도의 아미노에틸 분자층을 형성한 유리판을 담가서 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음 기질을 꺼내어 증류수로 깨끗이 씻고 진공 건조한다. 3'-SH-23mer-5'을 spotting 용액(10mM HEPES, 5 mM EDTA, PH 6.6)에 녹인 후, DMSO(40%(v/v))을 첨가한다. 3'-SH-23mer-5' 용액을 마이크로 에레이(micro-array)용 핀을 사용하여기질 위로 접종한 다음 습도를 70∼75% 수준으로 일정하게 유지하면서 상온에서 3시간 방치한다. 기질을 하이브리다이제이션(Hybridization) 용액으로 2번, 증류수로 2번 반복해서 씻어주고 진공건조한다. 3'-SH-23mer-5'의 염기서열과 정확하게 상보적인 올리고뉴클리오타이드(3'-SH-23mer-Cy3-5')를 하이브리다이제이션(Hybridization) 용액에 녹인 후에 하이브리다이제이션 스테이션(Hybridization Station: GeneTac^TM, Genomic Solution)을 이용하여 20℃에서 3시간 동안 하이브리다이제이션 반응을 진행한다. 기질을 꺼내어 하이브리다이제이션(Hybridization) 용액으로 2번, 증류수로 2번 씻은 다음 진공 건조한다. 이렇게 준비한 기질을 초점조정용 레이저 스캐너(confocal laser scanner)를 사용하여 형광발광도(fluorescence)를 측정했다. 또한, 위에서 사용한 올리고뉴클리오타이드(3'-SH-23mer-Cy3-5')의 전체 염기서열중에서 단 한 개만 서로 다른 올리고뉴클리오타이드에 대해서도 똑같은 과정을 통해서 처리한 다음 형광발광도(fluorescence)를 측정했다. 이렇게 하여 얻은 형광발광도(Fluorescence)를 서로 비교함으로써 올리고뉴클리오타이드의 염기 서열이 정확히 일치하는 경우와 그렇지 않은 경우에 대한 변별능력이 얼마나 뛰어난지를 비교해보았으며, 실제로 서로 다른 두 경우에 대해서 명확한 변별이 가능함으로 확인할 수 있었다.

(실험에 사용한 올리고뉴클리오타이드)

① TTAATAGCCCTAGCCTTAACCCT: completely matched(3'-SH-23mer-Cy3-5')

② TTAATGGCCCTAGCCTTAACCCT: one base mismatched

③ TTAATAGCCCTAGCCCTAACCCT: one base mismatched

실시예 6(이중기능성 링커에 의한 올리고뉴클레오티드의 고정화 및 DNA 하이브리다이제이션-2)

실시예 6의 방법에 준해서 실험을 진행하되 올리고뉴클리오타이드의 염기서열만을 달리했다. 또한, 전체 염기 서열(3'-SH-29mer-Cy3-5') 중에서 1∼2개의 염기서열을 변형한 위치도 서로 달리하였다.

(실험에 사용한 올리고뉴클리오타이드)

④ CTTCTACCACTAATGCCAACTGTAGCTAT: matched (3'-SH-29mer-Cy3-5')

⑤ CTCCTACCACTAATGCCAACTGTAGCTAT: one base mismatched

⑥ CTTCTACCACTAATGCCAACTGTGGCAAT: two bases mismatched

⑦ CTTCTACCACTAATGCCAACCGTAGCTAT: one base mismatched

본 발명에 따르면 실리케이트 표면으로 고밀도의 아미노에틸 분자층을 형성할 수 있다. 이와 같이 기질의 표면에 아민기의 밀도를 높게 형성하면, 이전과는 전혀 다른 다양한 특성이 부여할 수 있다. 첫째, 기질의 표면으로 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 도입함으로써 이전과는 전혀 다른 이화학적 특성을 보여준다. 둘째, 기질의 표면으로 아민기를 촘촘히 도입했기 때문에 효소와 같은 단백질, DNA나 항체 등과 같은 생분자, 각종 촉매분자, 빛을 전기나 열로 전화시켜주는 다양한 기능성 분자 등을 균일하게 고정시킬 수 있다.

또한, 바이오칩을 구성하는 위해서 기질의 표면으로 생분자 고정하는 과정에서 링커분자를 사용함으로써 전체 공정을 획기적으로 개선할 수 있다. 즉, 올리고뉴클레오티드와 같은 생분자를 기질의 표면으로 고정하기 위해서 이중기능성 링커 분자를 사용함으로써 기존의 DNA 칩을 비롯한 각종 바이오칩을 제조하는데 필수 과정으로 간주되는 하이브리다이제이션 과정에 선행되는 잔여표면의 보호처리 과정(blocking process)을 생략할 수 있다.

Claims

실리케이트를 아지리딘 혹은 그 유도체와 직접 반응시킴으로써 실리케이트 기질의 표면으로 고밀도 고분지의 다중 아미노에틸 분자층을 형성하는 방법
제 1 항에 있어서, 기질의 형태가 유리판(glass plate), 박막(membrane), 튜브(tube), 비드(bead), 다공성 필터, 구형, 미세 분말 등의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 실리케이트 표면에 존재하는 수산기를 직접 이용하여 아지리딘 혹은 그 유도체와 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 아지리딘 혹은 그 유도체와의 반응이 에테르, 에스테르 등과 같은 비알콜계 극성 용매를 사용하여 50℃ 이상으로 가열하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 아지리딘 혹은 그 유도체와의 반응이 산 촉매 조건에서 촉진되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 방법에 준하여 실리케이트 표면에 조성한 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층 위로 링커 분자를 매개체로 하여 생분자를 고정시키는 방법.
제 6 항에 있어서, 링커 분자가 이중기능성 링커(bifunctional linking agents)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 이중기능성 링커가 N-succinimidyl chloroacetate, N-succinimidyl bromoacetate, N-succinimidyl iodoacetate

N-succinimidyl-2-N-maleimidoacetate,

N-succinimidyl-4-(N-maleimido)butyrate,

N-succinimidyl-6-(N-maleimido)hexanoate,

N-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,

N-succinimidyl-m-(N-maleimido)benzoate,

N-succinimidyl-p-(N-maleimidomethyl)benzoate,

N-sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,

N-sulfosuccinimidyl-m-(N-maleimido)benzoate,

N-sulfosuccinimidyl-p-(N-maleimidomethyl)-4-butyrate 등과 같은 N-succinimidyl haloacetate 혹은 N-succinimidyl (N-maleimido)carboxylate의 일반적인 구조를 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 이중기능성 링커가 N-succinimidyl succinate, N-succinimidyl glutarate, N-succinimidyl adipate, N-succinimidyl pemelate, N-succinimidyl suberate, N-succinimidyl azelate, N-succinimidyl sebacate, N-succinimidyl dodecanoate 등과 같은 N-succinimidyl dicaboxylate의 일반적인 구조를 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 이중 기능성 링커가 1,3-phenylene diisocyanate, 1,4-phenylene diisocyanate, 4,4'-oxybis(phenylisocyanate), 1,3-phenylene diisothiocyanate, 1,4-phenylene diisothiocyanate, 4,4'-oxybis(phenylisothiocyanate), 1,3-benzenesulfonyl imidazole, 1,4-benzenesulfonyl imidazole, 4,4-biphenyldisulfonyl imidazole, 1,3-benzenesulfonyl chloride, 1,4-benzenesulfonyl chloride, 4,4-biphenyldisulfonyl chloride 등과 같은 diisocyanate, diisothiocyanate, disulfonyl imidazole, disulfonyl chloride 등의 일반적인 구조를 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서 카르복실산기를 함유한 각종 효소나 항원과 같은 단백질 혹은 촉매로 작용하는 각종 기능성 분자를 고정시키는 경우에 1,3-dicyclohexylcarbodiimide, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, 1,1'-carbonyldiimidazole, 1,1'-thiocarbonyldiimidazole 등과 같은 탈수용 시약을 링커로 사용하는 방법.
제 6항에 있어서 알데히드기(포밀기)를 함유한 각종 효소나 항원과 같은 단백질 혹은 다양한 촉매로 작용하는 각종 기능성 분자를 고정하는 경우에 직접적인 이민 결합을 통한 고정화 방법.
제 6항 내지 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 기질 표면의 아민기가 제 1 항에 따라 생성된 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층의 아민인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 따라 생성된 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 사용하여 바이오칩을 생산하는 방법.
제 6항 내지 13항의 방법을 이용하여 바이오칩을 생산하는 방법.
제 1 항에 따라 생성된 고밀도의 다중 아미노에틸 분자층을 사용하여 특정한 화학적 작용기의 도입을 필요로 하는 각종 촉매 분자나 기능성 분자 등을 고정시키는 방법.