CN103898194A - 光交联功能化的基因芯片及其制备方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种光交联功能化的基因芯片，该光交联功能化的基因芯片包括支撑层、设置于支撑层上的引发剂层、共价结合于引发剂层上的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层、连接于聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层侧链末端的光交联剂及固定于光交联剂上的DNA探针。上述光交联功能化的基因芯片具有固定效率高和抗蛋白质非特异性吸附能力好的特性。此外，本发明还提供一种光交联功能化的基因芯片的制备方法、以及含光交联功能化的基因芯片的检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种光交联功能化的基因芯片及其制备方法及检测试剂盒。
背景技术
食源性致病微生物是影响食品质量和安全的主要因素之一，据不完全统计发达国家每年有三分之一以上的人群感染食源性疾病。近年来，我国的广东、北京、上海等地相继出现食源性致病微生物中毒事件，引起其社会和我国政府部门的高度关注和重视。其中，在微生物性食物中毒事件中常见的重要致病菌为：沙门氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌、李斯特单核细胞增生菌、大肠杆菌O157:H7、霍乱弧菌、空肠弯曲菌等。屡次出现食源性致病微生物中毒事件，除了管理上的问题外，食源性致病微生物的检测的限制也是一个重要的因素。因此，建立和完善食品中致病微生物快速定量检测技术具有重要的现实意义。
国内外对于食源性致病微生物的检测“金标准”是培养法，该方法需要经过分离培养、生化鉴定等步骤，其过程较为繁琐、耗时，而且需要具备较高的实验室标准。难以满足在应对突发性食品安全公共事件上快速诊断的需要。随着分子生物学的飞速发展，对食源性致病微生物的检测鉴定已不再局限于对其外部形态及生理特性等常规检验上，而是从分子生物学水平上对食源性致病微生物的直接鉴定。
基因芯片技术是随着“人类基因组计划”的进展而发展起来的分子生物学领域一项里程碑式的重大技术革新。其基本原理是利用机械化的点样技术将大量的DNA探针按照一定的阵列模式固定于芯片的特定位置，然后与待测的标记样品按碱基配对原理杂交，借助共聚焦荧光检测系统或者表面等离子共振的非标记检测系统，获取分析物的基因序列信息。目前，国内大量医疗机构，生物研究机构以及高校等相关的科研单位已经展开我国关于基因芯片的研究工作，取得了一批重要的研究成果。虽然基因芯片技术在微生物检测方面有很多独特的优势，但还有不少问题和缺陷亟待解决。
传统的基因芯片技术中的DNA探针固定方法通常需要对DNA探针进行氨基、巯基等功能化标记。另外每条探针链通常只有一个功能基团，位点少导致固定效率较低，从而进一步影响检测信号。而且传统的基因载体芯片存在抗蛋白质非特异性吸附能力差的问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种固定效率较高且抗蛋白质非特异性吸附能力好的光交联功能化的基因芯片及其制备方法。
一种光交联功能化的基因芯片，包括支撑层、设置于所述支撑层上的引发剂层、共价结合于所述引发剂层上的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层、连接于所述聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层侧链末端的光交联剂及固定于光交联剂上的DNA探针；所述DNA探针为
序列为SEQ ID NO:1的金黄色葡萄球菌探针、
序列为SEQ ID NO:2的大肠杆菌O157:H7探针、
序列为SEQ ID NO:3的副溶血弧菌探针、
序列为SEQ ID NO:4的志贺氏菌探针、
序列为SEQ ID NO:5的单胞李斯特菌探针、
序列为SEQ ID NO:6的腊样芽胞杆菌探针、
序列为SEQ ID NO:7的荚膜产气杆菌探针、
序列为SEQ ID NO:8的霍乱弧菌探针、
序列为SEQ ID NO:9的空肠弯曲菌探针、
序列为SEQ ID NO:10的沙门氏菌探针以及
序列为SEQ ID NO:11的小肠结肠炎耶尔森菌探针中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述支撑物层为表面镀有金膜或银膜的玻璃基片。
在其中一个实施例中，所述引发剂层包括稀释剂和含聚乙二醇的引发剂，所述含聚乙二醇的引发剂与所述稀释剂的摩尔比为1:1000～5:100；其中，
所述稀释剂的结构式为：
所述含聚乙二醇的引发剂的结构式为：
在其中一个实施例中，所述聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层在干的状态下的厚度为5～20nm。
在其中一个实施例中，所述光交联剂为苯基叠氮类化合物、吖丙啶类化合物或二苯甲酮类化合物。
上述光交联功能化的基因芯片中的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层中含有聚乙二醇层，该层与水分子结合形成活化水层，可以降低蛋白质的非特异性吸附，从而使得上述光交联功能化的基因芯片具有较好的抗蛋白质非特异性吸附能力，在复杂的PCR产物溶液中，非特异性吸附量低于仪器的检测量，与传统的基因芯片相比具有低的背景噪音和高的信噪比。而连接于聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层侧链末端的光交联剂，使得上述光交联功能化的基因芯片能通过光交联技术固定DNA探针，由于光交联剂在紫外光照射下转化为反应活性较高的中间体，中间体能以多种方式结合DNA探针，无需DNA探针带有特定功能基团；传统的DNA探针固定方法，通常需要依赖于DNA探针带有的特定功能基团进行固定，而一般一条DNA探针只有一个功能基团，位点少，导致固定效率低，并进一步影响检测信号。因此，上述光交联功能化的基因芯片具有固定效率高和抗蛋白质非特异性吸附能力好的特性。此外，上述光交联功能化的基因芯片可以同时固定多种DNA探针，从而实现对目标的高通量检测。例如，可以根据需要，固定一种或同时固定多种食源性致病菌的DNA探针，实现对食源性致病菌的高通量检测。
一种光交联功能化的基因芯片的制备方法，包括如下步骤：
利用自组装技术将引发剂自组装于支撑物层的表面上形成引发剂层；
将得到的表面覆盖有引发剂层的支撑物层浸泡在含单体的反应溶液中，并于保护气体氛围下反应，得到共价结合于引发剂层上的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层，其中，所述含有单体的反应溶液由2-2’联吡啶、卤化亚铜、抗坏血酸、寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯及体积比为1:1的甲醇水溶液配制而成，所述单体为寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸羟乙酯；
在所述聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层的侧链末端引入光交联剂；
将DNA探针点样于光交联剂上，于室温下干燥后，在紫外光条件下进行交联固定DNA探针，得到所述光交联功能化的基因芯片，其中，所述DNA探针为序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:11中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯的结构式为：
其中，n为6、8、10或12。
在其中一个实施例中，所述光交联剂为苯基叠氮类化合物。
上述光交联功能化的基因芯片的制备方法使用表面引发聚合反应技术制备聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层，使得光交联功能化的基因芯片具有较好的抗蛋白质非特异性吸附能力，同时采用光交联技术固定DNA探针，实现了DNA探针的高效固定。上述制备方法的反应条件温和，易于控制，适合工业化生产。
在进行紫外光照射固定DNA探针时，根据光交联剂的类别选择合适的波长进行照射。例如，当光交联剂为苯基叠氮类化合物时，选择波长365nm，能量为4J/cm2的紫外光照射固定DNA探针。
一种含光交联功能化的基因芯片的检测试剂盒。
在其中一个实施例中，含光交联功能化的基因芯片的检测试剂盒还包括与检测试剂盒中的DNA探针对应的引物，其中：
与序列为SEQ ID NO:1的金黄色葡萄球菌探针对应的两条引物的序列为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；
与序列为SEQ ID NO:2的大肠杆菌O157:H7探针对应的两条引物的序列为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；
与序列为SEQ ID NO:3的副溶血弧菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17；
与序列为SEQ ID NO:4的志贺氏菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19；
与序列为SEQ ID NO:5的单胞李斯特菌探针对应的两条引物的序列为SEQID NO:20和SEQ ID NO:21；
与序列为SEQ ID NO:6的腊样芽胞杆菌探针对应的两条引物的序列为SEQID NO:22和SEQ ID NO:23；
与序列为SEQ ID NO:7的荚膜产气杆菌探针对应的两条引物的序列为SEQID NO:24和SEQ ID NO:25；
与序列为SEQ ID NO:8的霍乱弧菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:27；
与序列为SEQ ID NO:9的空肠弯曲菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29；
与序列为SEQ ID NO:10的沙门氏菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31；
与序列为SEQ ID NO:11的小肠结肠炎耶尔森菌探针对应的两条引物的序列为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。
上述检测试剂盒中的DNA探针设计合理，能与目的DNA进行稳定的杂交，进而进行高通量的PCR扩增，实现对食源性致病菌的高通量高灵敏的检测，可以同时检测11种常见的食源性致病菌的检测。
附图说明
图1为一实施方式的光交联功能化的基因芯片的结构示意图；
图2为采用表面等离子共振检测通入模型蛋白链霉亲和素的信号响应，验证DNA探针固定效率的表征图；
图3为志贺氏菌样品的实时检测曲线图；
图4为霍乱弧菌样品的实时检测曲线图；
图5为荚膜产气杆菌样品的实时检测曲线图；
图6为金黄色葡萄球菌样品的实时检测曲线图；
图7为腊样芽胞杆菌样品的实时检测曲线图；
图8为大肠杆菌O157:H7样品的实时检测曲线图；
图9为空肠弯曲菌样品的实时检测曲线图；
图10为小肠结肠炎耶尔森菌样品的实时检测曲线。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对光交联功能化的基因芯片及其制备方法及检测试剂盒进行进一步的说明。如图1所示，一实施方式的光交联功能化的基因芯片100，包括支撑层110、引发剂层120、聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层130、光交联剂140及DNA探针150。
其中，引发剂层120设置于支撑层110上；聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层130共价结合于引发剂层120上；光交联剂140连接于聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层130的侧链末端；DNA探针150固定于光交联剂上；
DNA探针为：
序列为SEQ ID NO:1的金黄色葡萄球菌探针、
序列为SEQ ID NO:2的大肠杆菌O157:H7探针、
序列为SEQ ID NO:3的副溶血弧菌探针、
序列为SEQ ID NO:4的志贺氏菌探针、
序列为SEQ ID NO:5的单胞李斯特菌探针、
序列为SEQ ID NO:6的腊样芽胞杆菌探针、
序列为SEQ ID NO:7的荚膜产气杆菌探针、
序列为SEQ ID NO:8的霍乱弧菌探针、
序列为SEQ ID NO:9的空肠弯曲菌探针、
序列为SEQ ID NO:10的沙门氏菌探针以及
序列为SEQ ID NO:11的小肠结肠炎耶尔森菌探针中的至少一种。
在本实施方式中，还提供一种光交联功能化的基因芯片的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110，利用自组装技术将引发剂自组装于支撑物层的表面上形成引发剂层。
步骤S120，将得到的表面覆盖有引发剂层的支撑物层浸泡在含单体的反应溶液中，，并于保护气体氛围下反应，得到共价结合于引发剂层上的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层，其中，含有单体的反应溶液由2-2’联吡啶、卤化亚铜、抗坏血酸、寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯及体积比为1∶1的甲醇水溶液配制而成，单体为寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸羟乙酯。
其中，含有单体的反应溶液中的2-2’联吡啶、卤化亚铜及抗坏血酸为催化剂；寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸羟乙酯为单体，寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸羟乙酯的摩尔比为1:10；体积比为1∶1的甲醇水溶液为溶剂。
步骤S130，在聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层的侧链末端引入光交联剂。
步骤S140，将DNA探针点样于光交联剂上，于室温下干燥后，在紫外光条件下进行交联固定DNA探针，得到光交联功能化的基因芯片，其中，DNA探针为序列为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:111中的至少一种。
在本实施方式中，支撑物层为表面镀有金膜或银膜的玻璃基片。可以理解，支撑物层也可以是其他材质的物质，如硅片、硝酸纤维素膜等。
引发剂层包括稀释剂和含聚乙二醇的引发剂；含聚乙二醇的引发剂与稀释剂的摩尔比为1:1000～5:100，在本实施方式中，含聚乙二醇的引发剂与稀释剂的摩尔比优选为5:1000、1:100及2:100；
稀释剂的结构式为：
含聚乙二醇的引发剂的结构式为：
含有聚乙二醇的引发剂有两个方面的作用：一方面是引发单体发生聚合反应；另一方面是含有聚乙二醇的引发剂使芯片具有一定的抗蛋白质非特异性吸附能力。
稀释剂有两个方面的作用：一方面是调节表面引发剂的比例，即引发剂密度；另一方面稀释剂本身含有聚乙二醇基团，使芯片具有一定的抗蛋白质非特异性吸附能力。
在本实施方式中，利用自组装技术将引发剂自组装于固体支持物的表面上形成引发剂层，固体支撑物构成支撑物层。其具体过程如下：
以乙醇为溶剂，配制总浓度为1mM的稀释剂和含聚乙二醇的引发剂的混合溶液；将经过等离子处理的固体支持物浸泡在上述混合溶液中。
稀释剂和含聚乙二醇的引发剂通过末端巯基与表面镀有金膜或银膜的玻璃基片连接固定。由于稀释剂和含聚乙二醇的引发剂结构设计，引发剂和稀释剂在芯片表面形成有序的自组装单层。
在本实施方式中，寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯的结构式为：
其中，n为6、8、10或12。聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层在干的状态下的厚度为5～20nm。
在本实施方式中，保护气体氛围为氮气氛围，当然也可以是其他惰性气体氛围。
此外，还可以对聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层进行各种功能化，使得聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层带有羧基、环氧基、醛基等基团。功能化的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层能够更好的连接固定光交联剂，如，带有氨基的光交联基团，与带有羧基的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层能很好的结合。因此，在本实施方式中，还包括对聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层进行羧基功能化的步骤，其中，羧基功能化试剂为丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的N，N二甲基甲酰胺的混合溶液。
光交联剂可以为苯基叠氮类化合物、吖丙啶类化合物或二苯甲酮类化合物。光交联剂在紫外光照射下转化为反应活性较高的中间体，中间体能以多种方式结合DNA探针，无需DNA探针带有特定功能基团。以具有如下结构式的苯基叠氮类化合物光交联剂为例，
具有上述结构式的苯基叠氮类化合物光交联剂通过氨基-羧基的化学反应，在聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层的侧链末端引入光交联基团，光交联基团中的叠氮基团在波长为365nm，能量为4J/cm2的紫外光照射下转化为反应活性较高的中间体卡宾，卡宾基团能以多种方式结合DNA探针无需DNA链带有特定功能基团。
上述光交联功能化的基因芯片中的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层中含有聚乙二醇层，该层与水分子结合形成活化水层，可以降低蛋白质的非特异性吸附，从而使得上述光交联功能化的基因芯片具有较好的抗蛋白质非特异性吸附能力，在复杂的PCR产物溶液中，非特异性吸附量低于仪器的检测量，与传统的基因芯片相比具有低的背景噪音和高的信噪比。而连接于聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层侧链末端的光交联剂，使得上述光交联功能化的基因芯片能通过光交联技术固定DNA探针，由于光交联剂在紫外光照射下转化为反应活性较高的中间体，中间体能以多种方式结合DNA探针，无需DNA探针带有特定功能基团；传统的DNA探针固定方法，通常需要依赖于DNA探针带有的特定功能基团进行固定，而一般一条DNA探针只有一个功能基团，位点少，导致固定效率低，并进一步影响检测信号。因此，上述光交联功能化的基因芯片具有固定效率高和抗蛋白质非特异性吸附能力好的特性。此外，上述光交联功能化的基因芯片可以同时固定多种DNA探针，从而实现对目标的高通量检测。例如，可以根据需要，固定一种或同时固定多种食源性致病菌的DNA探针，实现对食源性致病菌的高通量检测。
且上述光交联功能化的基因芯片的制备方法使用表面引发聚合反应技术制备聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层，使得光交联功能化的基因芯片具有较好的抗蛋白质非特异性吸附能力，同时采用光交联技术固定DNA探针，实现了DNA探针的高效固定。上述制备方法的反应条件温和，易于控制，适合工业化生产。
此外，本实施方式还提供一种检测试剂盒。检测试剂盒中含有上述光交联功能化的基因芯片。
在本实施方式中，检测试剂盒中还包括与检测试剂盒中的DNA探针对应的引物，其中：
与序列为SEQ ID NO:1的金黄色葡萄球菌探针对应的两条引物的序列为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；
与序列为SEQ ID NO:2的大肠杆菌O157:H7探针对应的两条引物的序列为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；
与序列为SEQ ID NO:3的副溶血弧菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17；
与序列为SEQ ID NO:4的志贺氏菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19；
与序列为SEQ ID NO:5的单胞李斯特菌探针对应的两条引物的序列为SEQID NO:20和SEQ ID NO:21；
与序列为SEQ ID NO:6的腊样芽胞杆菌探针对应的两条引物的序列为SEQID NO:22和SEQ ID NO:23；
与序列为SEQ ID NO:7的荚膜产气杆菌探针对应的两条引物的序列为SEQID NO:24和SEQ ID NO:25；
与序列为SEQ ID NO:8的霍乱弧菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:27；
与序列为SEQ ID NO:9的空肠弯曲菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29；
与序列为SEQ ID NO:10的沙门氏菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31；
与序列为SEQ ID NO:11的小肠结肠炎耶尔森菌探针对应的两条引物的序列为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。
上述检测试剂盒中的DNA探针设计合理，能与目的DNA进行稳定的杂交，能进行高通量的PCR扩增，实现高灵敏的检测，可以同时检测11种常见的食源性致病菌的检测。
下面结合具体实施例来进一步说明。
实施例1
在洁净的玻璃基片表面蒸镀或磁控溅射厚度为1～2nm的铬膜；然后在铬膜的表面蒸镀或者磁控溅射厚度约为45nm的金膜；用等离子清洗仪清洗上述镀有金膜的玻璃基片，除去其表面的有机污染物；将清洗后的镀有金膜的玻璃基片立即浸泡在含有总浓度为1mM的稀释剂和含聚乙二醇的引发剂的乙醇溶液，其中，含聚乙二醇的引发剂与稀释剂的摩尔比为1:1000，稀释剂和含聚乙二醇的引发剂通过巯基基团自组装于金表面；反应15小时后，玻璃基片表面自组装有单层结构的引发剂层。
将称取的25mg 2,2’-联吡啶、0.526g分子量为526的寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯及1.3g甲基丙烯酸羟乙酯混合，得到混合物；向混合物中加入10mL超纯水和10mL甲醇并搅拌使其溶解，得到混合液；然后向混合液中加入2mL浓度为0.04mM的CuCl2溶液，并通入氮气15min排除氧气；接着利用注射器缓慢注入2mL浓度为0.04mM的抗坏血酸溶液，Cu(II)配合物逐渐被还原为Cu(I)的配合物，反应溶液由通明的淡蓝色变为淡红色，并继续通入氮气15min排除氧气，得到反应溶液。在氮气环境的手套箱中进行表面引发聚合反应，将表面覆盖有引发剂层的玻璃基片浸泡在上述反应溶液中，在室温下反应16小时后，将芯片取出，终止反应，并用甲醇和超纯水清洗干净，氮气吹干，得到共价结合于引发剂层上的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层。按照文献Ma,H.,He,J.,Liu,X.,Gan,J.,Jin,G.,Zhou,J.ACS Applied Materials and Interfaces.2010,2，3223公开的方法测得聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层在干态下的厚度为5nm。
将上述经聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层修饰的玻璃基片浸泡在含有浓度为10mg mL-1的丁二酸酐和浓度为15mg mL-1 4-二甲氨基吡啶(DMAP)的N,N二甲基甲酰胺(DMF)反应溶液中进行羧基功能化；室温下反应12小时后，将经聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层修饰的玻璃基片取出，用DMF和乙醇充分淋洗，氮气吹干。经聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层修饰的玻璃基片表面的羧基经由EDC/NHSS(二氯乙烷/N-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化后，固定光交联试剂苯基叠氮类化合物，得到光交联功能化的芯片。
实施例2
在洁净的玻璃基片表面蒸镀或磁控溅射厚度为1～2nm的铬膜；然后在铬膜的表面蒸镀或者磁控溅射厚度约为45nm的金膜；用等离子清洗仪清洗上述镀有金膜的玻璃基片，除去其表面的有机污染物；将清洗后的镀有金膜的玻璃基片立即浸泡在含有总浓度为1mM的稀释剂和含聚乙二醇的引发剂的乙醇溶液，其中，含聚乙二醇的引发剂与稀释剂的摩尔比为5:100，稀释剂和含聚乙二醇的引发剂通过巯基基团自组装于金表面；反应15小时后，玻璃基片表面自组装有单层结构的引发剂层。
将称取的25mg 2,2’-联吡啶、0.526g分子量为526的寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯及1.3g甲基丙烯酸羟乙酯混合，得到混合物；向混合物中加入10mL超纯水和10mL甲醇并搅拌使其溶解，得到混合液；然后向混合液中加入2mL浓度为0.04mM的CuCl2溶液，并通入氮气15min排除氧气；接着利用注射器缓慢注入2mL浓度为0.04mM的抗坏血酸溶液，Cu(II)配合物逐渐被还原为Cu(I)的配合物，反应溶液由通明的淡蓝色变为淡红色，并继续通入氮气15min排除氧气，得到反应溶液。在氮气环境的手套箱中进行表面引发聚合反应，将表面覆盖有引发剂层的玻璃基片浸泡在上述反应溶液中，在室温下反应16小时后，将芯片取出，终止反应，并用甲醇和超纯水清洗干净，氮气吹干，得到共价结合于引发剂层上的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层。按照文献Ma,H.,He,J.,Liu,X.,Gan,J.,Jin,G.,Zhou,J.ACS Applied Materials and Interfaces.2010,2，3223公开的方法测得聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层在干态下的厚度为20nm。
将上述经聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层修饰的玻璃基片浸泡在含有浓度为10mg mL-1的丁二酸酐和浓度为15mg mL-1 4-二甲氨基吡啶(DMAP)的N,N二甲基甲酰胺(DMF)反应溶液中进行羧基功能化；室温下反应12小时后，将经聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层修饰的玻璃基片取出，用DMF和乙醇充分淋洗，氮气吹干。经聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层修饰的玻璃基片表面的羧基经由EDC/NHSS(二氯乙烷/N-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化后，固定光交联试剂苯基叠氮类化合物，得到光交联功能化的芯片。
实施例3
在洁净的玻璃基片表面蒸镀或磁控溅射厚度为1～2nm的铬膜；然后在铬膜的表面蒸镀或者磁控溅射厚度约为45nm的银膜；用等离子清洗仪清洗上述镀有金膜的玻璃基片，除去其表面的有机污染物；将清洗后的镀有金膜的玻璃基片立即浸泡在含有总浓度为1mM的稀释剂和含聚乙二醇的引发剂的乙醇溶液，其中，含聚乙二醇的引发剂与稀释剂的摩尔比为1∶100，稀释剂和含聚乙二醇的引发剂通过巯基基团自组装于金表面；反应15小时后，玻璃基片表面自组装有单层结构的引发剂层。
将称取的25mg 2,2’-联吡啶、0.526g分子量为526的寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯及1.3g甲基丙烯酸羟乙酯混合，得到混合物；向混合物中加入10mL超纯水和10mL甲醇并搅拌使其溶解，得到混合液；然后向混合液中加入2mL浓度为0.04mM的CuCl2溶液，并通入氮气15min排除氧气；接着利用注射器缓慢注入2mL浓度为0.04mM的抗坏血酸溶液，Cu(II)配合物逐渐被还原为Cu(I)的配合物，反应溶液由通明的淡蓝色变为淡红色，并继续通入氮气15min排除氧气，得到反应溶液。在氮气环境的手套箱中进行表面引发聚合反应，将表面覆盖有引发剂层的玻璃基片浸泡在上述反应溶液中，在室温下反应16小时后，将芯片取出，终止反应，并用甲醇和超纯水清洗干净，氮气吹干，得到共价结合于引发剂层上的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层。按照文献Ma,H.,He,J.,Liu,X.,Gan,J.,Jin,G.,Zhou,J.ACS Applied Materials and Interfaces.2010,2，3223公开的方法测得聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层在干态下的厚度为10nm。
将上述经聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层修饰的玻璃基片浸泡在含有浓度为10mg mL-1的丁二酸酐和浓度为15mg mL-14-二甲氨基吡啶(DMAP)的N,N二甲基甲酰胺(DMF)反应溶液中进行羧基功能化；室温下反应12小时后，将经聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层修饰的玻璃基片取出，用DMF和乙醇充分淋洗，氮气吹干。经聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层修饰的玻璃基片表面的羧基经由EDC/NHSS(二氯乙烷/N-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化后，固定光交联试剂苯基叠氮类化合物，得到光交联功能化的芯片。
实施例4
使用实施例1～3制备得到的光交联功能化的芯片固定DNA探针。具体操作流程如下：将11种食源性微生物的DNA探针溶于磷酸缓冲溶液（PBS buffer，10mM，pH=7.4）中，使得每种DNA探针的浓度都为10μM；将上述配制DNA探针溶液点样于实施例1～3所得到的光交联功能化的芯片表面的光交联剂上，室温下放置干燥后，在紫外光条件下进行交联固定DNA探针，得到综合型食源性致病微生物基因芯片；其中，11种食源性微生物的DNA探针序列为SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:11。
实施例5
表征实验
将实例4得到的高分子厚度为20nm的光交联功能化的芯片按照仪器的操作流程安装在SPR仪器中，其中，SPR成像仪为PlexArrayAnalyzer第一代产品；并以磷酸缓冲溶液（PBS buffer，10mM，pH=7.4）作为流动相，流速设定为2L/s，基线稳定后，通入链霉亲和素（Streptavidin，5g/mL）500秒；如图2所示，由于结合链霉亲和素产生的信号响应为0.75au。而通过氨基和巯基方式固定DNA的信号响应仅为0.1～0.2au。由于通过光交联的方式固定DNA不依赖与DNA的特殊基团，从而突破传统固定方式的位点数量限制的瓶颈，提高的探针的固定效率。
实施例6
实际样品的检测
将实施例4得到的芯片按照仪器的操作流程安装在SPR仪器中，并以磷酸缓冲溶液（PBS buffer，10mM，pH=7.4）作为流动相，流速设定为2L/s；基线稳定后，通入志贺杆菌样品的PCR产物500s，再次通入PBS缓冲溶液获取稳定的基线，获得靶向DNA与探针结合的信号响应为0.5au，最后链霉亲和素（Streptavidin，5g/mL）500s，实现信号的放大，而其他探针则没有显著的信号响应如图3所示，说明本发明的基因芯片具有较大的特异性，以及较好的抗蛋白质非特异性吸附特性。最后通入10mM氢氧化钠溶液500s再生芯片，基线完全恢复到未结合DNA的水平。通入霍乱菌样品的PCR产物500s，再次通入PBS缓冲溶液获取稳定的基线，通过链霉亲和素（Streptavidin，5g/mL）500s实现信号的放大，同时仅仅在霍乱菌探针的位置产生信号响应，其他探针均没有显著的信号变化，如图4所示。采用同样的方法依次检测荚膜产气杆菌，结果如图5所示；腊样芽胞杆菌，结果如图6所示；腊样芽胞杆菌，结果如图7所示；大肠杆菌O157:H7，结果如图8所示；弯曲杆菌，结果如图9所示；小肠结肠炎耶尔森菌，结果如图10所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种光交联功能化的基因芯片，其特征在于，包括支撑层、设置于所述支撑层上的引发剂层、共价结合于所述引发剂层上的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层、连接于所述聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层侧链末端的光交联剂及固定于光交联剂上的DNA探针；所述DNA探针为
序列为SEQ ID NO:1的金黄色葡萄球菌探针、
序列为SEQ ID NO:2的大肠杆菌O157:H7探针、
序列为SEQ ID NO:3的副溶血弧菌探针、
序列为SEQ ID NO:4的志贺氏菌探针、
序列为SEQ ID NO:5的单胞李斯特菌探针、
序列为SEQ ID NO:6的腊样芽胞杆菌探针、
序列为SEQ ID NO:7的荚膜产气杆菌探针、
序列为SEQ ID NO:8的霍乱弧菌探针、
序列为SEQ ID NO:9的空肠弯曲菌探针、
序列为SEQ ID NO:10的沙门氏菌探针以及
序列为SEQ ID NO:11的小肠结肠炎耶尔森菌探针中的至少一种。
2.如权利要求1所述的光交联功能化的基因芯片，其特征在于，所述支撑物层为表面镀有金膜或银膜的玻璃基片。
3.如权利要求1所述的光交联功能化的基因芯片，其特征在于，所述引发剂层包括稀释剂和含聚乙二醇的引发剂，所述含聚乙二醇的引发剂与所述稀释剂的摩尔比为1:1000～5:100；其中，
所述稀释剂的结构式为：
所述含聚乙二醇的引发剂的结构式为：
4.如权利要求1所述的光交联功能化的基因芯片，其特征在于，所述聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层在干的状态下的厚度为5～20nm。
5.如权利要求1所述的光交联功能化的基因芯片，其特征在于，所述光交联剂为苯基叠氮类化合物、吖丙啶类化合物或二苯甲酮类化合物。
6.一种光交联功能化的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用自组装技术将引发剂自组装于支撑物层的表面上形成引发剂层；
将得到的表面覆盖有引发剂层的支撑物层浸泡在含单体的反应溶液中，并于保护气体氛围下反应，得到共价结合于引发剂层上的聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层，其中，所述含有单体的反应溶液由2-2’联吡啶、卤化亚铜、抗坏血酸、寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯及体积比为1:1的甲醇水溶液配制而成，所述单体为寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸羟乙酯；
在所述聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层的侧链末端引入光交联剂；
将DNA探针点样于光交联剂上，于室温下干燥后，在紫外光条件下进行交联固定DNA探针，得到所述光交联功能化的基因芯片，其中，所述DNA探针为序列为SEQ ID NO:1的金黄色葡萄球菌探针、序列为SEQ ID NO:2的大肠杆菌O157:H7探针、序列为SEQ ID NO:3的副溶血弧菌探针、序列为SEQ ID NO:4的志贺氏菌探针、序列为SEQ ID NO:5的单胞李斯特菌探针、序列为SEQ IDNO:6的腊样芽胞杆菌探针、序列为SEQ ID NO:7的荚膜产气杆菌探针、序列为SEQ ID NO:8的霍乱弧菌探针、序列为SEQ ID NO:9的空肠弯曲菌探针、序列为SEQ ID NO:10的沙门氏菌探针以及序列为SEQ ID NO:11的小肠结肠炎耶尔森菌探针中的至少一种。
7.如权利要求6所述的光交联功能化的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯的结构式为：
其中，n为6、8、10或12。
8.如权利要求6所述的光交联功能化的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述光交联剂为苯基叠氮类化合物、吖丙啶类化合物或二苯甲酮类化合物。
9.一种含权利要求1～5任一项所述的光交联功能化的基因芯片的检测试剂盒。
10.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括与检测试剂盒中的DNA探针对应的引物，其中：
与序列为SEQ ID NO:1的金黄色葡萄球菌探针对应的两条引物的序列为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；
与序列为SEQ ID NO:2的大肠杆菌O157:H7探针对应的两条引物的序列为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；
与序列为SEQ ID NO:3的副溶血弧菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17；
与序列为SEQ ID NO:4的志贺氏菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19；
与序列为SEQ ID NO:5的单胞李斯特菌探针对应的两条引物的序列为SEQID NO:20和SEQ ID NO:21；
与序列为SEQ ID NO:6的腊样芽胞杆菌探针对应的两条引物的序列为SEQID NO:22和SEQ ID NO:23；
与序列为SEQ ID NO:7的荚膜产气杆菌探针对应的两条引物的序列为SEQID NO:24和SEQ ID NO:25；
与序列为SEQ ID NO:8的霍乱弧菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:27；
与序列为SEQ ID NO:9的空肠弯曲菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:29；
与序列为SEQ ID NO:10的沙门氏菌探针对应的两条引物的序列为SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31；
与序列为SEQ ID NO:11的小肠结肠炎耶尔森菌探针对应的两条引物的序列为SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。
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