CN110231486A

CN110231486A - 一种葡萄糖的检测方法

Info

Publication number: CN110231486A
Application number: CN201910572101.9A
Authority: CN
Inventors: 宋秀玲; 司晓雪; 唐小飞; 赵超; 王娟; 徐坤; 李卉; 刘玉申; 张惠雯; 何施羽; 金明华
Original assignee: Jilin Faw General Hospital; Jilin University
Current assignee: Jilin Faw General Hospital; Jilin University
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2019-09-13

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖检测方法，二氧化锰纳米粒子MnO2NPs在检测葡萄糖方面的应用；一种葡萄糖检测试剂盒，它包括：葡萄糖氧化酶溶液、碱性水溶液、MnO2NPs和鲁米诺工作液；一种葡萄糖的检测方法，它包括：1）待测样品与浓度为0.8~1.5mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液混合，在30~37℃下反应6~10min；2）取100µl反应后溶液与100μl NaOH水溶液、10μl浓度为0.01~1.0mg•ml‑1MnO2NPs和鲁米诺工作液混合；3）测量CL信号，根据回归方程计算葡萄糖浓度；线性范围为50μM~15.8mM，检测限为44.7μM；检测结果与商品化血糖仪测定结果吻合度较好。

Description

一种葡萄糖的检测方法

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种葡萄糖的检测方法。

背景技术

葡萄糖是人体的重要组成成分之一，也是重要的能量来源。血液中葡萄糖含量必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要，其浓度的变化可以反映人体的健康状况。近年来随着生活水平的提高，糖尿病逐渐年轻化，且发病率不断增加。糖尿病时长期存在的高血糖，可导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍等疾病。因此，建立一种灵敏度高、特异性好、操作稳定的血中葡萄糖的检测方法十分必要。

目前，检测血糖水平的方法有高效液相色谱法、分光光度法、荧光分析法、电化学发光等。虽然能够获得较低的检测限和良好的线性范围，但同时也存在着一些缺点，如仪器设备昂贵、样品处理比较复杂、重复性差和光漂白等。化学发光法(CL)检测具有灵敏度高、线性范围宽、仪器相对简单、操作简便等优点，受到广泛关注。鲁米诺是一种常用的化学荧光分子，在过氧化氢分子存在的条件下可以转变成激发态氨基邻苯二甲酸，发出较强的荧光。在通常情况下鲁米诺与过氧化氢的化学发光反应相当缓慢，但当有某些催化剂存在时反应迅速增加。辣根过氧化物酶是最常用的催化剂，但其易失活，成本高，稳定性差。因此，有必要开发一种稳定性较好的模拟酶。一些纳米材料具有类似生物酶的活性，具有催化功能，如Fe₃O₄纳米颗粒、V₂O₅纳米颗粒和CuO纳米颗粒。然而，这些纳米材料的催化反应通常在酸性溶液中进行，这严重制约了它们在化学发光系统中的应用。基于上述弊端，开发一种具有模拟酶活性，并能在碱性条件下进行催化反应的纳米材料，从而弥补现有技术的不足。

发明内容

本发明目的是为解决现有的葡萄糖检测方法灵敏度不高、检测范围窄、特异性不强等问题，而提供一种灵敏度高、检测范围广、快速简易的葡萄糖的检测方法。二氧化锰纳米粒子MnO2NPs在检测葡萄糖方面的应用。一种葡萄糖检测试剂盒，它包括：葡萄糖氧化酶溶液、碱性水溶液、二氧化锰纳米粒子MnO2NPs和鲁米诺工作液；所述的碱性水溶液为NaOH水溶液。一种葡萄糖的检测方法，它包括： 1）待测样品与浓度为0.8~1.5mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液按体积比5:1混合，在30~37℃下反应6~10min； 2）取100µl步骤1）反应后溶液与100μl pH 11~13的NaOH水溶液、10μl 浓度为0.01~1.0mg•ml-1MnO2NPs和50µl 浓度为0.1~10×10-5M鲁米诺工作液混合； 3）测量CL信号，根据回归方程计算葡萄糖浓度；步骤1）所述的在35℃下反应8min；所述的反应在水浴摇床中进行；步骤2）所述的NaOH水溶液pH为10.5~12.5，MnO2NPs浓度为0.01~0.2 mg•ml-1；步骤2）所述的MnO2NPs，是由下述方法制备的： 1）将0.1g BSA加入至40mL 0.01mol•L−1 PBS缓冲液中搅拌均匀，随后加入400µl 0.1MMnSO4溶液，室温搅拌2min； 2）将400µl 0.5~1.5M NaOH水溶液加入至步骤1）混合液中，剧烈搅拌6~8h；搅拌结束后，在双蒸馏水中透析40~60h；透析完成后使用离心机13000~18000rpm离心25~35min去除未反应离子，得到二氧化锰纳米粒子MnO2NPs。本发明提供了二氧化锰纳米粒子MnO2NPs在检测葡萄糖方面的应用；一种葡萄糖检测试剂盒，它包括：葡萄糖氧化酶溶液、碱性水溶液、二氧化锰纳米粒子MnO2NPs和鲁米诺工作液；一种葡萄糖的检测方法，它包括：1）待测样品与浓度为0.8~1.5mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液混合，在30~37℃下反应6~10min；2）取100µl反应后溶液与100μl NaOH水溶液、10μl 浓度为0.01~1.0mg•ml-1MnO2NPs和鲁米诺工作液混合；3）测量CL信号，根据回归方程计算葡萄糖浓度；线性范围为50μM~15.8mM，检测限为44.7μM；检测结果与商品化血糖仪测定结果吻合度较好。

附图说明

图1 Luminol- H₂O₂-MnO₂NPs体系的化学发光原理图；

图2 基于BSA模板化的MnO₂NPs检测葡萄糖原理图；

图3 luminol−MnO₂−GOD, luminol-Glu-GOD, 和 luminol-MnO₂-Glu-GOD反应的动力学特性；

图4检测体系 luminol 用量的优化；

图5 检测体系PH的优化；

图6 检测体系 MnO₂ 用量的优化；

图7 检测体系GOD作用时间的优化；

图8葡萄糖浓度与发光信号的线性回归方程；

图9检测体系的特异性。

具体实施方式

实施例1 二氧化锰纳米粒子的合成

将0.1g BSA加入至40mL 0.01mol·L⁻¹PBS缓冲液中搅拌均匀，随后加入400µl 0.1MMnSO₄溶液，室温搅拌2min；将400µl 1M NaOH水溶液加入至上述混合液中，进行7h剧烈搅拌；搅拌结束后，在双蒸馏水中透析48h；透析完成后使用离心机15000rpm离心30min去除未反应离子，二氧化锰纳米粒子MnO₂NPs便制备完成；制备好的MnO₂NPs保存在4℃冰箱备用。

实施例2 葡萄糖检测体系的构建

1、构建体系

首先，将100µl不同浓度的葡萄糖溶液（0.05、0.158、0.5、1.58、5、15.8mM）与20µl葡萄糖氧化酶(GOD，1mg·ml^-1)溶液混合，混合液35℃水浴摇床上反应8 min；然后，将上述反应后溶液100μl与100μl NaOH(pH 12)水溶液、10μlMnO₂NPs (0.1mg·ml^-1)和50µl鲁米诺(5×10-⁵M)工作液混合；用全波段多功能酶标仪测量CL信号；所有反应均在不透光的白色Greiner 96孔板中进行。以葡萄糖浓度的对数为横坐标，CL信号为纵坐标，绘制标准曲线。

2、MnO₂NPs的信号放大作用验证实验

为了证明MnO₂NPs对发光信号的显著增强作用，参照实施例2的葡萄糖检测体系，在其他添加物相同的情况下，设置1）含有MnO₂NPs、2）不含MnO₂NPs以及3）不含葡萄糖的三组体系，比较了三种检测体系的动力学曲线；在含有葡萄糖的检测体系中，葡萄糖的浓度为15.8mM；从图中3可以清楚地看出，当体系中没有葡萄糖存在时，发光强度几乎为零：当体系中有葡萄糖、没有MnO₂NPs存在时，发光强度小于1000；而当MnO₂NPs加入时，发光强度大幅度增加；此结果表明MnO₂NPs具有良好的模拟酶活性，可大大提高鲁米诺的化学发光强度，证明其在葡萄糖检测中的进一步应用是可行的。

3、工作条件优化实验

检测介质会对MnO₂NPs的状态产生很大的影响，研究发现MnO₂NPs在纯水中的分散性明显优于PBS溶液，因此我们选择用超纯水重悬MnO₂NPs。为了获得最佳的检测效果，对luminol浓度、反应体系的pH、MnO₂NPs浓度以及酶的反应时间进行了优化；图4显示发光强度与鲁米诺浓度有关，样品发光信号随luminol用量的增加而增大，当luminol的浓度为5x10^-5M时，信噪比最高；根据葡萄糖氧化酶的使用说明，采用35℃为酶的最佳反应温度。考虑到其它因素对背景值影响不大，即采用发光强度作为纵坐标，依次对其它参数进行优化。最佳实验条件为： pH为12.0(图5)，MnO₂NPs浓度为0.1mg·ml^-1(图6)，GOD的反应时间为8min(图7)。

实施例3 检测体系的灵敏度实验

在最优的工作条件下，计算不同浓度的葡萄糖与化学发光强度的线性关系。该线性回归方程为 y=5127.3x-8293.3（其中x为以10为底葡萄糖浓度的对数，y为化学发光强度），相关系数为0.997；此线性范围为50μM~15.8mM（图8），检测限为44.7μM（信噪比S/N=3）。

实施例4 特异性实验

为了验证检测方法的特异性，在超纯水中以葡萄糖类似物（果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖）、电解质（Na⁺、K⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺）、BSA和抗坏血酸（AA）等作为干扰物进行检测，其中标准溶液中葡萄糖的浓度为5mM，其他干扰物质均为50mM。使用本研究构建的体系检测这些干扰物，使用酶标仪记录检测结果。结果如图9所示，从图中看出，虽然葡萄糖类似物(果糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖)和一些干扰离子(金属离子、BSA和AA)的浓度比葡萄糖高10倍，但与葡萄糖相比，它们几乎不能诱导检测信号的产生。结果表明，该检测体系可以用于真实样本(如人血清)中葡萄糖的检测。

实施例5 检测体系重复性验证

我们对6种不同浓度的葡萄糖进行了3次重复测定，并对5mM浓度的葡萄糖进行了日间和日内的9次重复测定，结果如表1所示。从表中可以看出，日内三次重复测量的相对标准偏差(RSDs)在0.37%~3.98%之间。此外，5mm葡萄糖溶液的9次重复测量的相对标准偏差为5.35%。以上结果相对标准偏差均小于10%，说明该检测方法具有较好的重复性。

实施例6 实际样本的检测

收集人血清作为实际样本，验证这该检测方法的可行性；为了减少基质干扰效应，我们对血清样本进行了50倍的稀释；检测方法与上述检测葡萄糖过程相同，并与商品化的血糖仪检测结果进行比较；结果见表2，相对标准偏差在2.26% ~ 4.44%之间，本方法与商品化血糖仪测定结果吻合度较好，表明该方法可用于检测实际血清样本中的葡萄糖。

实施例7 本检测方法与其他方法的比较

本发明所建立的检测方法与其他已报道的方法进行比较，该方法的线性范围较宽，在各种样品中的检测都极富有应用价值；所使用的锰纳米粒子合成简便、价格低廉、效果稳定，并易于推广使用。

。

Claims

1.二氧化锰纳米粒子MnO2NPs在检测葡萄糖方面的应用。

2.一种葡萄糖检测试剂盒，其特征在于：它包括：葡萄糖氧化酶溶液、碱性水溶液、二氧化锰纳米粒子MnO₂NPs和鲁米诺工作液。

3.根据权利要求2所述的一种葡萄糖检测试剂盒，其特征在于：所述的碱性水溶液为NaOH水溶液。

4.一种葡萄糖的检测方法，它包括： 1）待测样品与浓度为0.8~1.5mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液按体积比5:1混合，在30~37℃下反应6~10min； 2）取100µl步骤1）反应后溶液与100μl pH 11~13的NaOH水溶液、10μl 浓度为0.01~1.0mg•ml-1MnO₂NPs和50µl 浓度为0.1~10×10-5M鲁米诺工作液混合； 3）测量CL信号，根据回归方程计算葡萄糖浓度。

5.根据权利要求4所述的一种葡萄糖的检测方法，其特征在于：步骤1）所述的在35℃下反应8min。

6.根据权利要求5所述的一种葡萄糖的检测方法，其特征在于：所述的反应在水浴摇床中进行。

7.根据权利要求6所述的一种葡萄糖的检测方法，其特征在于：步骤2）所述的NaOH水溶液pH为10.5~12.5，MnO₂NPs浓度为0.01~0.2 mg•ml-1。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：步骤2）所述的MnO₂NPs，是由下述方法制备的：

1）将0.1g BSA加入至40mL 0.01mol•L−1 PBS缓冲液中搅拌均匀，随后加入400µl 0.1MMnSO4溶液，室温搅拌2min； 2）将400µl 0.5~1.5M NaOH水溶液加入至步骤1）混合液中，剧烈搅拌6~8h；搅拌结束后，在双蒸馏水中透析40~60h；透析完成后使用离心机13000~18000rpm离心25~35min去除未反应离子，得到二氧化锰纳米粒子MnO₂NPs。