CN111595917A - 一种纳米复合物电化学传感器、构建方法及其在对于葡萄糖的电化学发光法检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的电化学发光（ECL）传感器是用羧基化石墨烯负载的Au@Ag核壳纳米粒子开发的。基于ECL的实验结果，我们发现COOH‑G/@Au@Ag纳米复合材料对葡萄糖具有良好的电催化能力，因此构建了葡萄糖电化学发光（ECL）传感器。当葡萄糖浓度范围在0.005至1500µM之间变化时，ECL强度与葡萄糖浓度之间具有良好的线性响应，检出限为0.02µM。此外，开发的葡萄糖ECL传感器不仅具有良好的稳定性，可重复性和灵敏度，还可以成功地用于人体血清样品中的葡萄糖的监测。

Description

一种纳米复合物电化学传感器、构建方法及其在对于葡萄糖 的电化学发光法检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种纳米复合物电化学传感器、构建方法及其在对于葡萄糖的电化学发光法检测中的应用，属于电化学技术领域。
背景技术
石墨烯是一种由紧密堆积的单层碳原子形成的二维薄层结构，由于其电子迁移速度快，比表面积大(理论比表面积约为～2600m2g-1)，以及优越的化学和机械性能[1]，因此在电化学传感器和生物传感器的研究领域引起了广泛关注。它是具有蜂窝状晶格的二维材料[2]。由于它的高电导率和大的比表面积，使其具有很高的生物分子负荷，这使其在电化学生物传感研究中得到了广泛的探索与应用[3]。然而，简单的石墨烯具有惰性表面，这意味着高的化学稳定性和与介质相对较弱的相互作用。另外，石墨烯片之间具有很强的范德华力和静电力，因此很容易产生聚集[4]。它很难分散在水和普通有机溶剂中，并且具有很强的疏水性，这不仅给石墨烯的进一步研究带来了一定的困难，而且限制了其在许多领域的应用与发展[5]。因此，研究人员对石墨烯的修饰进行了功能化，通过引入了特定的官能团以赋予它们新的功能，同时最大限度地保留了石墨烯本身的优异性能[6]。羧化石墨烯(COOH-G)具有大量极性氧基团，因此在COOH-G层与层之间会产生高化学性和亲水活性，这使得COOH-G具有可以横向拉伸的单原子层结构。另外，增加的亲水性促进了电化学改性，这使COOH-G可用作纳米颗粒的载体材料，并可直接应用于电化学应用[7]。
贵金属纳米晶体材料具有独特而新颖的光学，电学，磁学和催化特性，因此具有很强的吸引力，并且引起了越来越多的关注[8]。通过控制反应条件我们可以调节其尺寸，形态和结构以改善表面催化性能，贵金属纳米颗粒可用于催化剂、传感器、医学检测和成像等领域。诸如金(Au)[9]，铂(Pt)[10]，钯(Pd)[11]和银(Ag)[12]等单一贵金属纳米材料具有很强的导电性和高的催化性能[13]。双贵金属纳米结构充分利用了电子耦合效应和协同催化性能，使其在保持有效识别能力的同时，纳米结构还具有增加的比表面积和增强的灵敏度。然而，由于双贵金属纳米粒子由于较大的表面能而在制备过程中容易形成团聚，因此如何提高稳定性是主要挑战。COOH-G的单层原子结构会在存在褶皱的情况下降低表面自由能。另外，羧基官能团增加了层间距离并因此提高了COOH-G的稳定性。随着COOH-G沟状表面上贵金属纳米颗粒的减少，它不仅保留了复合材料的有效催化和导电性，而且整体稳定性得到了极大的提高，在传感领域具有广阔的应用前景。
众所周知，血清测试已成为监测和诊断各种医学状况的常规方法[14]。葡萄糖是植物和动物中碳水化合物的主要成分，是日常生活中必不可少的物质之一[15]。血液中的葡萄糖水平已被用于诊断糖尿病或低血糖症。除了要求糖尿病患者进行血糖监测外，控制血糖水平对于非糖尿病急诊患者也很重要[16-18]。葡萄糖的检测方法很多，包括3、5-二硝基水杨酸(DNS)，高效液相色谱法(HPLC)，碘量法和电化学法。在这些方法中，电化学发光(ECL)是电化学和化学发光的组合产物，显示出高灵敏度，低背景信号，良好的选择性和空间控制能力。ECL生物传感器作为一种有效的分析工具，可以准确监测实际样品(主要是血液)中的葡萄糖含量[19-21]。用电化学传感器检测目标分子是一种有效而简单的检测方法。作为电化学技术与光谱技术之间的结合，与其他检测系统相比，ECL具有独特的优势，例如化学发光和荧光[22-24]。在ECL实验中，中间体在电极上形成，在反应过程中，这些中间体经历高能电子转移反应，形成激发态并发光[25-26]。特别地，基于鲁米诺的生物传感器在生物分析中起着越来越重要的作用。这是因为重要的生物代谢分子H2O2具有较低的氧化电位和较高的发光量子产率，从而极大地改善了鲁米诺的排放[27-30]。ECL电化学传感器在疾病诊断和治疗领域中发挥着越来越重要的作用。
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发明内容
本发明采用两步还原法来合成载有Au@Ag核壳纳米粒子的COOH-G。纳米复合材料将AuNPs和AgNPs的出色的电催化活性和电导率与石墨烯材料的大比表面积相结合，因此该化合物具有更好的电子电导率，进而提高了在支持电解质溶液中电极表面与分析物之间的电子转移速率。在此基础上，构建了具有COOH-G/Au@Ag纳米复合材料的无酶ECL生物传感器，并将其用于检测葡萄糖。
一种纳米复合物电化学传感器，是指负载有COOH-G/Au@Ag材料的电极。
在一个实施方式中，所述的COOH-G/Au@Ag材料，是指在羧基化石墨烯的表面依次包覆有金和银的纳米粒子。
上述的纳米复合物电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
对玻碳电极表面进行打磨；
配制COOH-G/Au@Ag材料的悬浮液，加至破碳电极的表面，干燥后，即得。
在一个实施方式中，所述的COOH-G/Au@Ag材料的悬浮液的浓度为1mg mL-1。
上述的纳米复合物电化学传感器在用于对含有葡萄糖的溶液的检测中的应用。
在一个实施方式中，所述的检测是指电化学发光法。
在一个实施方式中，所述的溶液中含有1mM的葡萄糖。
在一个实施方式中，检测中的扫描速率25-300nmV s-1。
在一个实施方式中，检测中的鲁米诺含量控制在0.1至0.6mM之间，优选0.1至0.4mM。
有益效果
采用两步还原法合成了一种新型的COOH-G/Au@Ag纳米材料。基于这种纳米材料，制备了一种操作简便，方便，低消耗的新型无酶ECL传感器。大的催化表面积和快速的电子转移速率显示了对葡萄糖非常好的电催化氧化性能。此外，我们的传感器不仅具有良好的可重复性和广泛的线性范围，而且还具有可接受的灵敏度和稳定性。制备的用于检测真实血清中葡萄糖的传感器是可行的，其在临床诊断领域中的应用前景广阔。
附图说明
图1.(A)(B)(C)COOH-G/Au@Ag的SEM图像，(D)COOH-G/Au@Ag的TEM图像
图2.COOH-G/Au@Ag的EDX表征
图3.COOH-G/Au@Ag纳米复合材料的SEM-EDS映射图像
图4.检测过程EIS曲线。其中，(A)有和没有葡萄糖的裸露GCE(a，b)和有和没有葡萄糖的COOH-G/Au@Ag修饰的GCE(c，d)的IECL/E曲线。插图：裸露的GCE(a，b)不含或含葡萄糖，以及COOH-G/Au@Ag修饰的GCE(c，d)不含或含葡萄糖的CV曲线。(B)裸露GCE，COOH-G-GCE，COOH-G/Au@Ag-GCE的EIS曲线
图5.(A)影响COOH-G/Au@Ag量对化学发光的影响；(B)pH条件的影响；(C)鲁米诺浓度对化学发光的影响；(D)扫描速率的影响。
图6.ECL传感器的干扰能力(a-p：葡萄糖，甘氨酸，抗坏血酸，尿素，Na+，Fe3+，Mn2+，Cu2+，I-，Zn2+，SO4 2-，Pb2+，多巴胺，丙氨酸，麦芽糖，果糖)
图7.是检测过程中的性能曲线，其中(A)在不同的葡萄糖浓度下，在COOH-G/Au@Ag修饰的GCE上鲁米诺的IECL/E曲线(a：0.005μM，b：0.01μM，c：0.05μM，d：0.1μM，e：0.5μM，f：1μM，g：3μM，h：5μM，i：8μM，j：10μM，k：30μM，l：50μM，m：100μM，n：500μM，o：800μM，p：1000μM，q：1500μM)插图：在用COOH-G/Au@Ag复合材料修饰的电极上，进行重复的ECL发射以及连续的CV扫描(B)葡萄糖浓度(0.005-1500μM)之间的线性关系。插图：葡萄糖浓度(0.005-10μM)之间的线性关系。
具体实施方式
试剂与仪器
表1试剂
Figure BDA0002440524230000081
表2仪器
Figure BDA0002440524230000082
主要试剂的配置
①PBS缓冲溶液的配制
表3不同pH值PBS缓冲溶液的配置
Figure BDA0002440524230000091
用分析天平称取已计算好质量的不同pH值的磷酸二氢钾和氢氧化钠固体，加入蒸馏水溶解均匀，转移至100mL的容量瓶中，定容，摇匀以制备不同pH的PBS缓冲溶液，具体配置方法如表2-3所示。溶液配置好后贴上标签纸，放入冰箱中备用。
②5.0mmol L-1K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6
用分析天平称取0.7456g KCl，0.2112g K4Fe(CN)6和0.1646g K4Fe(CN)6晶体放入小烧杯，加入适量蒸馏水溶解，转移到100mL容量瓶中，定容，摇匀，贴上标签后放入冰箱中备用。
③0.1mol L-1NaOH
分析天平称取4.000g NaOH，放入小烧杯，使用双蒸水溶解，冷却后转移到100mL的容量瓶中，定容到刻度，摇匀，放入试剂瓶中，备用。
④1mmol L-1C6H12O6
分析天平称取0.19817g C6H12O6，放入小烧杯，使用双蒸水溶解，然后转移到1L的容量瓶中，定容到刻度，摇匀，放入试剂瓶中，备用。
⑤1mmol L-1鲁米诺
分析天平称取0.0177g鲁米诺，放入小烧杯，使用0.2M NaOH溶解，然后转移到100mL的容量瓶中，定容到刻度，摇匀，放入试剂瓶中，备用。
⑥0.1mol·L-1KCl
分析天平称取0.7455g KCl，放入小烧杯，使用双蒸水溶解，然后转移到100mL的容量瓶中，定容到刻度，摇匀，输入试剂瓶中，备用。
电极活化
(1)电极预处理
预处理的目的是将电极表面吸附的杂质清理干净，使玻碳电极光滑无污染，便于修饰材料的吸附和固定，利于电化学发光信号的采集和处理。具体的步骤是：将玻碳电极在砂纸上均匀的打磨，之后用蒸馏水冲洗并超声清洗2分钟。配置1.0、0.3μm的α-Al2O3抛光粉悬浮液，在麂皮上滴上适量分散液，均匀用力地进行打磨3-5min，直到电极表面光滑为止，处理完的电极分别在1:1乙醇，1:1HNO3和蒸馏水中超声清洗3min，直到电极清洗完毕为止。
(2)电极活化及检测
电极清洗完毕后，构建三电极实验体系，电解质溶液用0.5M的H2SO4溶液，设置电势扫描范围-1.0V-1.0V，反复多次进行循环伏安曲线的扫描，直到曲线电流响应达到稳定为止。之后，在含有10mmol L-1K3Fe(CN)6和0.5M KCL溶液中进行循环伏安的扫描，测定氧化峰和还原峰电位之差，电势差小于80mV，即可说明电极打磨干净。
COOH-G@Au@Ag纳米复合材料的制备
COOH-G/Au@Ag纳米复合物是通过两步连续还原法制备出来的。首先，用分析天平称取6mg羧基化石墨烯(COOH-G)放入干净的烧杯中，量取50mL蒸馏水倒入烧杯后用保鲜膜封紧，超声分散6个小时。然后将剥离均匀的羧基化石墨烯悬浮液转移至100mL三井烧瓶中，设置油浴温度100℃，加入200μL 2.94×10-2M氯金酸(HAuCl4)后继续加入0.53mL 3.88×10-2M柠檬酸钠溶液至溶液变为红色，反应30min后，关闭加热，继续搅拌使反应混合物自然冷却至室温。离心分离所得样品并重新溶入30mL蒸馏水中，加入200μL 1.93×10-2M硝酸银，0.3mL 0.1M抗坏血酸(AA)，设置冰浴温度4℃，2h小时后室温静置搅拌2h直至溶液变为深棕色，反应结束后离心分离，真空烘干得到所需COOH-G/Au@Ag纳米复合材料。
修饰电极的制备
用分析天平称量1mgCOOH-G/Au@Ag纳米复合物，配置成1mg mL-1的储备液，用微量注射器移取5μL COOH-G/Au@Ag分散液均匀滴涂到玻碳电极表面，在室温下干燥。
COOH-G/Au@Ag纳米材料的表征
通过SEM和TEM研究了所得纳米复合材料的形貌和结构。图1当中的(A)，(B)和(C)是不同放大倍数的扫描电子显微照片。可以看出，COOH-G的表面表现出大量的皱纹，这是自发的卷曲行为，并且皱纹的形态有助于增加玻璃碳的接触面积。电极的表面积增强了改性电极的催化性能。通过两种连续的还原方法将贵金属Au、Ag纳米粒子修饰到COOH-G的表面上，形成致密的核壳结构，该结构以50nm左右的粒径均匀地吸附在COOH-G的表面上。沟状结构的表面很好地用作载体，并且更容易吸附贵金属纳米颗粒，这大大增强了复合材料的电导率和催化性能。图1当中的(D)是通过TEM检查的表面形态特征，其更清楚地显示了它们的结构。它表明这两个元素已负载在石墨烯表面，并确认了核-壳结构。从透射电子显微照片还可以看出，还原反应后，贵金属Au@Ag核壳纳米粒子规则地吸附在COOH-G的褶表面上，形成的金属球的粒径约为40-50nm，与SEM结果一致。我们进行了EDX测量，以获取纳米材料的化学成分。如图2所示，EDX图像还显示材料主要包含C(62.96％)，O(16.11％)，Au(13.03％)和Ag(7.91％)。SEM-EDS元素图谱分析也证实，即使在整个分析区域内，Au@Ag核壳纳米粒子的分布也很高。通过对合成的纳米复合材料进行ICP表征，COOH-G/Au@Ag纳米复合材料中AuNPs与AgNPs含量的比例约为1：2，这与EDX的表征结果相似，进一步表明Au@Ag核-壳纳米颗粒装载在COOH-G中。SEM，TEM，EDX和ICP图像证明我们已经成功合成了COOH-G/Au@Ag纳米材料。
生物传感器的电化学表征
图4的(A)区域显示了在裸露的GCE和未加1mM葡萄糖(用0.1M，pH＝7.4)制备的COOH-G/Au@Ag修饰的GCE上的鲁米诺的IECL/E曲线。扫描电压范围为-1至1V(vs Ag|AgCl|KClsat)，扫描速率为100mV s-1。没有葡萄糖的COOH-G/Au@Ag修饰的GCE的曲线(c)表明，ECL发射是由鲁米诺的氧化产物产生的。此外，与没有和有葡萄糖的裸露GCE(曲线a，b)相比，COOH-G/Au@Ag修饰的GCE(曲线d)在含1mM葡萄糖的情况下在0.35V左右出现了更高的尖峰。同时，我们还研究了其CVs曲线(图4的A的插图)。从图中可以看出，添加葡萄糖后，COOH-G/Au@Ag修饰电极中出现了明显的氧化峰电流，这进一步证实了COOH-G/Au@Ag纳米材料对葡萄糖具有电催化氧化性能。这与ECL实验的结果一致。
EIS(电化学阻抗谱)作为一种有效的界面分析技术，被广泛用于研究修饰电极与电解质之间的电子电导率。电极表面阻抗的变化可以通过EIS获得。通过EIS研究了不同纳米材料(GCE，COOH-G/Au，COOH-G/Au@Ag)在改性GCE上的界面电子转移阻力(图4的(B))。使用包含5mM K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6的0.1M KCl溶液并将AC电压设置为10mV(200mV的偏置电势，10-1-105Hz)进行EIS实验。图4(B)中的半圆的直径反映了界面电子转移电阻的变化。图中的半圆表示高频区域中的电荷转移过程，其由电解质的离子电阻，改性材料的界面电阻以及改性电极与电解质的界面电阻得出。直线表示低频区域中的扩散控制过程。高频区域中半圆的半径越小，材料的电导率越强。从图4(B)可以看出，高频部分中不同修饰电极的阻抗为纳米材料修饰电极的电子传递阻抗，阻抗值为COOH-G：305Ω，COOH-G/Au@Ag：218Ω。显然，COOH-G/Au@Ag的阻抗值小于COOH-G的阻抗值，因此在COOH-G/Au@Ag修饰的GCE界面上的电子传输速率快于在COOH-G修饰的GCE。所有这些结果表明，COOH-G/Au@Ag纳米材料提供了良好的电子传导途径。
实验条件优化
为了确定葡萄糖传感器的最佳工作环境以改善葡萄糖传感器分析系统的性能，我们研究了可能影响已开发传感器响应的各种因素，例如COOH-G/Au@Ag的量，不同pH值的PBS溶液，鲁米诺浓度和不同的扫描速率。
(1)COOH-G/Au@Ag纳米材料的修饰克数
为了了解实验中COOH-G/Au@Ag含量的影响，我们通过将COOH-G/Au@Ag的量控制在0.01-2mg mL-1范围内，探索了电流响应。如图5的(A)所示，在0.01～0.05mg mL-1的浓度范围内，随着COOH-G/Au@Ag的修饰量的增加，电流强度增加，而当COOH-G/Au@Ag高于0.05mgmL-1，电流响应随浓度增加而开始降低。造成这种现象的一种可能原因是，改性材料的浓度过大，无法在电极表面形成较厚的膜，从而阻碍了电子转移。因此，最佳材料浓度确定为0.05mg mL-1
(2)PBS缓冲液的pH对体系的影响
在图5(B)中，我们研究了pH对系统的影响。缓冲溶液的pH对传感器的灵敏度具有至关重要的影响。因此，我们制备了pH值为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0的PBS缓冲液，并选择了1.0mM葡萄糖在COOH-G/Au@Ag修饰的GCE上响应的最佳pH条件。如图5(B)所示，当pH＝7.4时，ECL强度将达到最大值。根据实验结果，我们最终选择pH＝7.4的PBS缓冲溶液进行下一步测定。
(3)不同浓度鲁米诺对体系的影响
为了确定将给予传感器最大响应的鲁米诺浓度，我们使用PBS(0.1M，pH＝7.4)将鲁米诺含量控制在0.1至0.6mM之间。图5(C)显示了ECL强度随鲁米诺浓度的变化。当鲁米诺浓度从0.1mM增加到0.4mM时，ECL强度随着鲁米诺浓度的增加而增加。但是，当鲁米诺浓度>0.4mM时，由于自猝灭效应，ECL强度将逐渐降低。因此，整个实验过程中0.4mM的Luminol溶液是最佳选择。
(4)不同扫速对发光强度的影响
为了优化传感器的电催化性能，我们研究了将扫描速率从25mV s-1增加到300nmVs-1对COOH-G/Au@Ag修饰的GCE响应的影响。如图5(D)所示，我们可以看到，当扫描速率在25mV s-1至300mV s-1范围内时，ECL强度先升高然后降低。当扫描速率为100mV s-1时，ECL强度显示最大值。因此，在实验中选择100mV s-1作为最佳扫描速率。根据以上实验结果，我们可以得出结论，用COOH-G/Au@Ag修饰的GCE检测葡萄糖的最佳条件是：0.05mg mL-1COOH-G/Au@Ag，PBS(0.1M，pH＝7.4)，100mV s-1的扫描速率和0.4mM鲁米诺储备溶液。
(5)抗干扰性研究
测量样品中的葡萄糖时，样品中共存的物质通常会在一定程度上影响测量结果。为了验证ECL传感器的选择性，研究了各种干扰物质，包括甘氨酸，抗坏血酸，尿素，Na+，Fe3 +，Mn2+，Cu2+，I-，Zn2+，SO4 2-，Pb2+，多巴胺，丙氨酸，麦芽糖和果糖。结果在图6中显示，上述干扰物质对检测的影响可以忽略不计，并且还表明对葡萄糖的更好的选择性。
(6)传感器对葡萄糖的检测
如图7的(A)所示，在最佳条件下，ECL强度随葡萄糖浓度而变化，通过线性拟合可以发现ECL强度与葡萄糖浓度呈线性关系。回归方程为I＝4.27364C+4054.43362(R2＝0.999)，范围为0.005μM至1.5mM。如插图所示，该线性规则在较低的葡萄糖浓度下也会混合。检测极限(S/N＝3)为0.002μM，灵敏度为15μA μM-1cm-2。
同时，还研究了ECL传感器的重现性和稳定性。从图7的(A)(插图)可以看出，连续7次测量1M葡萄糖的单个修饰电极的相对标准偏差(RSD)为0.54％。当测量6个独立的电极时，相对标准偏差为1.83％，表明该传感器具有良好的重现性。表1列出了COOH-G/Au@Ag修饰的GCE的线性范围，检测限和灵敏度与大多数以前的报道的比较[1，10，18，31-34]。提出的ECL葡萄糖生物传感器具有可比或更好的分析性能。因此，对于开发的葡萄糖ECL生物传感器，可实现良好的重复性和可接受的耐久性。
表1各种葡萄糖的线性范围，检出限和灵敏度的比较
Figure BDA0002440524230000131
Figure BDA0002440524230000141
(7)传感器在人体血清中的应用
为了最终将准备好的ECL传感器应用于检测领域，我们需要评估其适用性，因此将其应用于监测人血清样品中的葡萄糖水平。在最佳条件下，我们成功地检测了人血清样品中的葡萄糖，其结果列于表2中，并与当地医院的测定结果进行了比较。回收率在98.36％至101.23％的范围内，表明它有望成为检测人血清样品中葡萄糖的可靠技术。
表2人血清样品中葡萄糖的测定
Figure BDA0002440524230000142
以上实施例并不代表对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种纳米复合物电化学传感器，其特征在于，是指负载有COOH-G/Au@Ag材料的电极。
2.根据权利要求1所述的纳米复合物电化学传感器，其特征在于，在一个实施方式中，所述的COOH-G/Au@Ag材料，是指在羧基化石墨烯的表面依次包覆有金和银的纳米粒子。
3.权利要求1所述的纳米复合物电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
对玻碳电极表面进行打磨；
配制COOH-G/Au@Ag材料的悬浮液，加至破碳电极的表面，干燥后，即得。
4.权利要求1所述的纳米复合物电化学传感器的制备方法，其特征在于，在一个实施方式中，所述的COOH-G/Au@Ag材料的悬浮液的浓度为1 mg mL-1。
5.权利要求1所述的纳米复合物电化学传感器在用于对含有葡萄糖的溶液的检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在一个实施方式中，所述的检测是指电化学发光法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在一个实施方式中，所述的溶液中含有1mM的葡萄糖。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在一个实施方式中，检测中的扫描速率25-300 nmV s-1。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在一个实施方式中，检测中的鲁米诺含量控制在0.1至0.6 mM之间，优选0.1至0.4mM。
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