CN109266637B - 以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器 - Google Patents

以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器。以具有三个双键的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）、甲苯、异辛烷、偶氮二异丁腈来制备骨架材料作为胰蛋白酶的固定基质，TRIM骨架表面有剩余的双键存在，能够在常温下与胰蛋白酶表面的自由巯基发生点击反应而将酶键合在整体柱上。本发明制备的酶反应器无需在固定基质上引入功能基，制备更简便；也避免了胰蛋白酶功能化，防止了酶变性失活。本研究为人们研究酶反应器的固定基质提供了一种新思路，所制备的酶反应器可用于蛋白质的高效快速酶解。

Description

以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反 应器
技术领域
本发明涉及一种以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器，通过“巯基-烯”点击反应制备以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）有机整体柱为基质的固定化酶反应器，属于酶反应器技术领域，旨在研究一种新型的酶固定基质，制备的酶反应器用于蛋白质样品的高效、快速酶解。
背景技术
将蛋白水解为肽段是“自下而上”蛋白组学研究的关键步骤。然而，常规溶液酶解具有耗时长、活性低、蛋白酶自溶解、蛋白酶不可重复使用等缺点，因此将酶固定化是一种有效方法解决上述问题。酶固定化有以下优点：缩短酶解时间；提高酶活性；固定化酶可以重复利用，降低实验成本；能减少蛋白酶自溶解对后续质谱检测的干扰等。
整体材料因其制备简便、比表面积大、通透性好、传质速度快等优点，成为酶固定非常好的材料基质。无机整体柱制备复杂、重现性差。相比之下，有机整体柱具有良好的孔隙率、生物相容性和稳定性，而被广泛应用。目前固定酶的主要方法有Staudinger反应、叠氮-炔点击反应、“巯基-烯”点击反应等。然而大多数方法需要在固定基质或蛋白酶上额外引入活性功能基，导致操作繁琐或使蛋白酶变性失活。“巯基-烯”点击反应可以在温和条件下快速进行，且对介质中的水和空气不敏感，不会使蛋白酶变性失活。传统的有机整体柱无残余双键存在，需额外引入双键才能发生反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器。本发明基于TRIM骨架表面有剩余的双键存在，能够在常温下与胰蛋白酶表面的自由巯基发生点击反应而将酶键合在整体柱上。通过巯基桥联反应将胰蛋白酶固定在TRIM有机基质上，无需在固定基质上引入功能基，制备更简便；也避免了胰蛋白酶功能化，防止了酶变性失活。本发明提供了一种新思路，所制备的酶反应器不仅可以高效快速酶解蛋白，还具有良好稳定性，可重复使用。
本发明提供的以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器是将偶氮二异丁腈、甲苯、异辛烷、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）按适当比例混合超声后形成预聚合液注入已处理好的毛细管中，用胶塞封住毛细管两端，置于水浴锅内反应一段时间。胰蛋白酶的固定化是通过“巯基-烯”点击反应实现。通过N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE）向N-苯甲酰-L-精氨酸（BA）的转化率及牛血清白蛋白（BSA）和细胞色素（Cyt-C）的蛋白质消化率来表征酶反应器的性能。
本发明提供的以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器是按下述具体方法步骤制备：
1）有机整体柱的制备：TRIM 200 μL，异辛烷680 μL和甲苯120 μL作为致孔剂，偶氮二异丁腈3.6 mg为引发剂，混合超声后形成预聚合液注入已处理好的毛细管中，用胶塞封住毛细管两端，置于50℃水浴锅内，反24h后取出毛细管，用乙腈冲洗除去未反应的溶液及引发剂。
2）胰蛋白酶二硫键的还原：在pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中分别配制浓度为10 mg/mL胰蛋白酶溶液和浓度为1 mg/mL三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)溶液；然后按TCEP：胰蛋白酶溶液比例为1:10（v/v）混合两种溶液，混合溶液在25ºC反应3 h，使胰蛋白酶中双硫键还原断裂；然后混合液在4ºC以10000 rpm转速离心10 min除去不溶物；待得到的溶液温度恢复到室温后，加入过硫酸铵使其浓度为1 mg/mL；向上述溶液中加入N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（BAA）使其浓度为2 mg/mL，震荡使其充分溶解，制备好的溶液即为酶衍生液。
3）胰蛋白酶的固定：在酶固定化之前，先将TRIM有机整体柱用氮气吹干，然后将上述酶衍生液注入到整体柱中，长度为10 cm；注入酶衍生液的整体柱在25℃反应5 h以充分固定；待反应完成后，酶柱用20 mM的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗1 h除去未反应的物质；酶柱保存于4℃冰箱备用。
上述制备方法，步骤1)整体柱的制备，偶氮二异丁腈在甲苯和异辛烷中超声溶解后，再加入TRIM超声5min左右形成预聚合液。所制备整体柱表面有残余双键存在。通过红外图谱可知（如图1）。步骤1) 所述的整体柱在固定化胰酶中具有广泛的应用。
步骤2）胰蛋白酶二硫键的还原以及步骤3）胰蛋白酶的固定在25℃温度下进行，反应温和，不会使胰蛋白酶变性失活；
本发明提供的以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器用于蛋白质样品的高效、快速酶解过程。
本发明具有以下优点：所制备的有机整体柱制备简便，稳定性及重复性良好；所制备的TRIM有机整体柱基质有残余双键存在，无须额外引入功能基；所采用的酶固定方法“巯基-烯”点击反应，其反应条件温和，不会使蛋白酶变性失活；本发明为人们研究酶反应器的固定基质提供了一种新思路，所制备的酶反应器可以实现蛋白质的高效快速酶解。
附图说明
图1为TRIM有机整体柱基质的红外光图谱。如图所示：2974.11cm-1处明显观察到C-H伸缩振动，1727.87cm-1处为C=C伸缩振动，1150.78cm-1处为C-H弯曲振动，这一结果表明所制备的TRIM有机整体柱有残余双键存在。
图2为缓冲液pH对酶反应器活性的影响。以不同pH（6.5-9）的20 mM的Tris-HCl配置25mM BAEE为底物进行酶解。图2为胰蛋白酶的相对活性（相对于BA峰面积的最大值），8.0为胰蛋白酶酶解的最佳pH值。
图3为5 mM BAEE经酶反应器酶解前后的液相色谱图。
具体实施方式
实施例1
有机整体柱的制备：TRIM 200 μL，异辛烷680 μL和甲苯120 μL作为致孔剂，偶氮二异丁腈3.6 mg为引发剂，混合超声（150 W,10 min）后形成预聚合液注入已处理好的毛细管中，用胶塞封住毛细管两端，置于50℃水浴锅内，反应24 h后取出毛细管，用乙腈冲洗除去未反应的溶液及引发剂。
胰蛋白酶二硫键的还原：用20 mM的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）配制浓度分别为10mg/mL胰蛋白酶溶液和浓度为1 mg/mL三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)溶液。然后按TCEP：胰蛋白酶溶液比例为1:10（v/v）混合两种溶液，混合溶液在25ºC反应3 h使胰蛋白酶中双硫键还原断裂。然后混合液在4ºC以(10000 rpm)转速离心10 min除去不溶物。待得到的溶液温度恢复到室温后，加入过硫酸铵使其浓度为1 mg/mL；向上述溶液中加入N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（BAA）使其浓度为2 mg/mL，震荡使其充分溶解，制备好的溶液即为酶衍生液；
胰蛋白酶的固定：在酶固定化之前，先将TRIM有机整体柱用氮气吹干，然后将上述酶衍生液注入到整体柱中，长度为10 cm。注入酶衍生液的整体柱在25℃反应5 h以充分固定。待反应完成后，酶柱用20 mM的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）冲洗1 h除去未反应的物质。酶柱保存于4℃冰箱备用。
实施例2
酶活性测定：胰蛋白酶活性测定是通过将BAEE酶解为BA来实现的。以5-25mM（在20mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.0）的BAEE为底物，相同条件下经同一根整体柱酶解,流速为1μL/min。酶解产物用EP管收集后经反相高效液相色谱检测。米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）由米氏方程计算得到。使用Linewaver-Burk作图法以1/V对1/[S]作图：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
可得到一条直线。直线在横轴上的截距为-1/Km，纵截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。
高效液相色谱检测条件如下：
流动相：80mM KH2PO4(pH 3.87):甲醇=7:3
流速：1ml/min
柱温：25℃
检测波长：253nm。
图3为5mM BAEE经酶反应器酶解后产物经HPLC-UV分析得到的色谱图，酶解温度为25℃，流速为1μL/min。说明本发明制备的酶反应器可以对小分子底物进行高效、快速酶解。

Claims (4)

1.一种以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器的制备方法，其特征在于经过如下步骤：
1）制备三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯有机整体柱：将基质为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯 200 μL，异辛烷680 μL和甲苯120 μL作为致孔剂，偶氮二异丁腈3.6 mg为引发剂，混合超声，150 W,10 min；形成预聚合液注入已处理好的毛细管中，用胶塞封住毛细管两端，置于50℃水浴锅内，反应24 h后取出毛细管，用乙腈冲洗除去未反应的溶液及引发剂，得到三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱；
2）胰蛋白酶二硫键的还原：用20 mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制浓度分别为10 mg/mL胰蛋白酶溶液和浓度为1 mg/mL三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液，然后按TCEP：胰蛋白酶溶液体积比例为1:10的混合两种溶液，混合溶液在25℃反应3 h使胰蛋白酶中双硫键还原断裂，然后混合液在4℃以10000 rpm转速离心10 min除去不溶物；待得到的溶液温度恢复到室温后，加入过硫酸铵使其浓度为1 mg/mL；向上述溶液中加入N,N'-亚甲基双丙烯酰胺使其浓度为2 mg/mL，震荡使其充分溶解，制备好的溶液即为酶衍生液；
3）胰蛋白酶的固定：在酶固定化之前，先将三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯有机整体柱用氮气吹干，然后将上述酶衍生液注入到整体柱中，长度为10 cm；注入酶衍生液的整体柱在25℃反应5 h以充分固定，待反应完成后，酶柱用20 mMpH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗1 h除去未反应的物质；酶柱保存于4℃冰箱备用。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1) 所述的整体柱的制备中偶氮二异丁腈在甲苯和异辛烷中超声溶解后，再加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯超声5min形成预聚合液。
3.权利要求1-2所述制备方法制备的固定化酶反应器。
4.权利要求3所述的固定化酶反应器在酶解蛋白质样品中的应用。
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