CN107365759B - 一种高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种高稳定多级孔Zr‑MOF固定化酶反应器及其应用，该固定化酶反应器是以孔径为2.5～17nm的多级孔UiO‑66‑NH2(Zr)为载体，固定氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶，其中以载体计，氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶的固载量为90～150mg/g。本发明固定化酶反应器具有酶固载量高、重复使用率高、在高温条件下稳定等优势，其用于催化降解异丙隆和2,4‑二氯苯酚可以大大简化工业处理步骤、缩短降解时间、提高降解效率，且酶用量小、反应条件温和，表现出非常高效的催化降解环境毒物能力。本发明制备的这两种固定化酶反应器更适合应用于实际降解体系中，在实际应用中效果良好。

Description

一种高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器及其应用
技术领域
本发明属于工业废水的生物酶处理技术领域，具体涉及一种高稳定多级孔金属-有机框架(Zr-MOF)固定化酶反应器及其在催化降解有机毒物中的应用。
背景技术
众所周知，酶是一种高效、绿色的生物催化剂，具有特异性好、反应条件温和、较广泛的来源等优点。然而，由于天然酶的稳定性较差、不能与反应物分离，在高温下或者有机溶剂中容易失活以及酶的纯化和分离技术复杂、代价昂贵等缺点制约了其在工业中的广泛应用。目前为止，通过不同的固定方法，已制备出多种活性和稳定性都较高的固定化酶，并且在固体催化剂中起着重要的作用。与传统催化过程相比，固定化酶的使用可以使反应在常温常压下进行，达到节省投资、降低成本的目的。更重要的是，使用固定化酶可以使催化剂与产物得以分离，实现酶的循环重复使用。含有毒有机污染物废水的降解一直是一个热点话题，有毒有机污染物因其毒性强、种类多等性质，不仅有诱发人类癌症的可能，而且给环境保护造成了极大的威胁，而固定化酶一个最大的用途就是处理废水中的有毒物质，防止水体污染。利用固定化过氧化物酶的催化氧化作用来处理酚类、芳香胺类废水的污染是近年来受到重视的新方法，降解的结果有效地降低了有毒有机污染物的含量和毒性，是一种有效的废水处理方法。
固定化酶技术在20世纪60年代发展起来的。迄今为止，固定化酶已经受到许多学者的关注，无论在理论方面还是在应用研究方面均取得了众多令人瞩目的成果。传统的制备固定化酶的方法主要有吸附法、交联法、共价结合法和包埋法4种。由于固定化酶具有较好的稳定性、专一性高、反应条件温和、无污染、操作简便及绿色环保等特性，因而其在有毒有害的有机废水处理、环境监测和清洁生产等环境领域得到了广泛的关注和应用。高浓度有机废水的处理方法分为物理化学法与生物法。由于物理化学法较生物法具有处理难度大、成本高且用到的药剂可能会对环境造成二次污染等缺陷，生物法在高浓度有机废水处理中的应用日益增加。而作为生物法中重要组成部分固定化酶技术以其显著的优势成为废水处理方法研究领域的热点。
MOFs材料独特的结构特性以及性质的多样性使其成为目前催化、光电、生物等领域研究的热点之一。这种材料在合成后无毒，本身带有的功能基团经修饰后，具有良好的吸附性能，可作为一种理想的固定化酶载体。然而目前报道的大多数MOFs材料都是微孔材料(孔径2nm左右)，很难被用于吸附大分子的蛋白质，在生物和环境方面还有一定的局限。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高酶活性、高稳定性、重复使用性较好的多级孔Zr-MOF固定化酶反应器，并为该固定化酶反应器提供一种应用。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：该固定化酶反应器是以孔径为2.5～17nm的多级孔UiO-66-NH2(Zr)为载体，固定氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶。
上述的固定化酶反应器中，以载体计，氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶的固载量为90～150mg/g。
本发明该固定化酶反应器由下述方法制备得到：将孔径为2.5～17nm的多级孔UiO-66-NH2(Zr)在真空条件下150℃活化12小时后，分散于pH值为3～5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，然后加入氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶，常温振荡至酶固定到多级孔UiO-66-NH2(Zr)上，离心分离、洗涤、干燥，得到高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器。
上述的多级孔UiO-66-NH2(Zr)与氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶的质量比为1:0.10～0.30，所述多级孔UiO-66-NH2(Zr)根据文献“An in situ self-assembly templatestrategy for the preparation of hierarchical-pore metal-organicframeworks.Nature Communications,2015,6:8847DOI:10.1038/ncomms9847”中公开的方法制备而成，以下记作H-UiO-66-NH2(Zr)。
本发明高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器在催化降解异丙隆或2,4-二氯苯酚中的应用，其中固定化酶为氯过氧化物酶时，降解的是异丙隆，固定化酶为辣根过氧化物酶时，降解的是2,4-二氯苯酚，具体降解方法为：在含有异丙隆或2,4-二氯苯酚的废水中加入固定化酶反应器和双氧水，其中异丙隆或2,4-二氯苯酚、固定化酶反应器、双氧水的摩尔比为(4.8×102～1.4×105):(1～1.5):(4.0×104～6.4×104)，在密闭条件下常温搅拌20～30分钟，即可完成催化降解异丙隆或2,4-二氯苯酚。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明固定化酶选用的载体是高稳定H-UiO-66-NH2(Zr)，其是一种性能优异的多孔材料，具有大的比表面积，孔径可调，水溶性及生物相容性良好。利用物理吸附法分别将氯过氧化物酶(CPO)、辣根过氧化物酶(HRP)固定于该载体中，由于载体在水溶液中是高稳定的，所得Zr-MOF固定化酶反应器具有酶固载量高、重复使用率高、在高温条件下稳定等优势，最大程度保留了酶的活性构象，避免了因酶蛋白表面氨基酸构象改变造成的酶活性的损失。
2、以本发明固定化酶反应器作为催化剂来降解有机农药异丙隆和2,4-二氯苯酚，由于载体为多级孔的MOFs材料，其中多级孔结构中较大的孔可以容纳酶分子，而较小的孔可以作为底物和其它溶剂小分子的扩散通道，实现了酶与底物各行其道，更有利于降解反应的进行，具有反应时间较短、酶用量小、反应条件温和(所有的过程都在常温下进行)等优点，以及非常高效的催化降解环境毒物能力，其用于工业废水中有毒物质的处理，相比于常规的以硅球和沸石等无机载体固定化酶，吸附量和酶活的保留都会大大加强，而且对环境没有污染，符合目前提倡的绿色环保理念。
3、本发明固定化酶反应器应用在降解过程中可以大大的简化工业处理步骤、缩短降解时间、提高降解效率，对过氧化物酶(CPO和HRP)应用于有机农药的绿色无公害处理具有重要的意义，为工业上处理农药废水提供新的思路和理论基础，在工业上具有可观的经济效益和广阔的应用前景。
附图说明
图1是H-UiO-66-NH2(Zr)活化前(a)、活化后(b)以及H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO(c)的红外光谱图。
图2是H-UiO-66-NH2(Zr)活化前(a)、活化后(b)以及H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP(c)的红外光谱图。
图3是温度对游离CPO、H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO催化活性的影响。
图4是温度对游离HRP、H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP催化活性的影响。
图5是H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO和H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP的重复使用效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
将10mg H-UiO-66-NH2(Zr)(SBET比表面积为267m2g-1，总孔容为0.67cm3g-1，孔径大小主要集中在2.5nm、9.2nm、16.9nm，平均孔径为13.8nm)在真空条件下150℃活化12小时后，加入到1262μL pH＝3的醋酸-醋酸钠缓冲液中，然后加入238μL含1.5mg CPO的pH＝4.5的PBS缓冲液，置于恒温震荡摇床中震荡2小时，以6000转/分钟的转速离心3分钟，将上清液和固体分离，并用pH＝3的醋酸-醋酸钠缓冲液对固体进行洗涤2～3次，且每次洗涤完后在相同的条件下离心，以除去载体表面未固定的CPO，最后在30℃下真空干燥12小时，得到H-UiO-66-NH2(Zr)固定化CPO反应器，记作H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO，其中CPO的固载量为94.7mg/g。
实施例2
将10mg H-UiO-66-NH2(Zr)(SBET比表面积为267m2g-1，总孔容为0.67cm3g-1，孔径大小主要集中在2.5nm、9.2nm、16.9nm，平均孔径为13.8nm)在真空条件下150℃活化12小时后，加入到1350μL pH＝3的醋酸-醋酸钠缓冲液中，然后加入150μL含2.0mg HRP的pH＝5的醋酸-醋酸钠缓冲液，置于恒温震荡摇床中震荡2小时，以6000转/分钟的转速离心3分钟，将上清液和固体分离，并用醋酸-醋酸钠缓冲溶液对固体进行洗涤2～3次，且每次洗涤完后在相同的条件下离心，以除去载体表面未固定的HRP，最后在30℃下真空干燥12小时，得到H-UiO-66-NH2(Zr)固定化HRP反应器，记作H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP，其中HRP的固载量为140.4mg/g。
从图1和2中可以看出，H-UiO-66-NH2(Zr)活化前后的出峰位置相同，但峰强度发生了改变，而吸附CPO和HRP之后特征峰有明显的减少，从而说明游离CPO和游离HRP很好的固定到了H-UiO-66-NH2(Zr)上。先将游离CPO和游离HRP分别用FITC染色，然后按照上述方法将染色后的游离CPO和HRP分别固定到H-UiO-66-NH2(Zr)上，载体上出现了绿色的荧光，由此可说明游离CPO和游离HRP分别固定到了H-UiO-66-NH2(Zr)上。
发明人对实施例1和2制备的固定化酶反应器进行了酶学性能研究，具体如下：
1、固定化酶反应器的热稳定性
以2-氯-5,5-二甲基-1,3-环己二酮(MCD)为模型反应，测定H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO的热稳定性，以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为模型反应，测定H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP的热稳定性，在20～100℃温度下将游离酶和含有等量酶的固定化酶反应器分别温育1小时，结果见图3和4。由图3和4可见，随温度升高，游离酶和固定化酶反应器的催化活性都成“钟罩型”变化。游离CPO的最佳反应温度在30℃左右，当温度超过50℃之后催化活性明显下降。H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO在40℃左右催化活性最高，并且在较高温度下仍保持了较高的催化活性，甚至在70℃条件下温浴1小时仍能保持接近68.2％的催化活性。游离HRP和H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP的最佳反应温度分别为40℃和50℃。当温度超过60℃之后游离HRP的催化活性明显下降，并且在70℃条件下温浴1小时仅能保持2.7％的催化活性，而相同条件下H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP仍能保持接近55.5％的催化活性。
以上实验结果表明，固定化酶反应器较游离酶热稳定性得到了显著的提高，这是因为H-UiO-66-NH2(Zr)骨架网络具有较高的热稳定性，加热后其结构一般不会被破坏，可为包埋于其中的酶分子提供刚性屏蔽环境，载体材料同时限制了酶的活动区域，限制了酶在高温下的伸展和特异性聚集，避免了酶因三维结构改变导致的变形失活，提高了稳定性。因此，本发明固定化酶反应器可用于一些高温下进行的催化反应。此外，固定化酶反应器随着温度的升高，催化活性的降低速度比游离酶的较缓慢，这也说明了固定化酶可以在广泛的温度范围内使用，提高了游离酶在工业中的应用范围。
2、固定化酶反应器的重复使用性
以MCD为模型反应，测定H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO的重复使用性，以ABTS为模型反应，测定H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP的重复使用性，具体方法如下：
在2mL离心管中依次加入1450μL pH＝5的醋酸-醋酸钠缓冲液、35μL 3mmol·L- 1MCD水溶液、15μL 10mmol·L-1H2O2水溶液、5mg H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO，或者在2mL离心管中依次加入1450μL pH＝5的醋酸-醋酸钠缓冲液、35μL 10mmol·L-1ABTS水溶液、15μL10mmol·L-1H2O2水溶液、5mg H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP，然后在转速为2000转/分钟的恒温培养振荡器中30℃反应20分钟，反应完全后，将反应体系在4℃、600转/分钟离心5分钟，并将H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO和H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP分别继续用于下一次的模型反应体系。对于H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO和H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP的催化活性，将第一次的底物转化率看作是100％，并把以后每一次的转化率与之相比，同样以相对催化活性来表征，结果见图5。
从图5中可以看出，H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO和H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP均展现出较好的重复使用性，在重复使用6次后分别保持78.2％、79.7％的催化活性，H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO在重复使用10次后，仍能保持65.4％的催化活性，而H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP在重复使用12次后，仍能保持70.7％的催化活性。
综上所述，以H-UiO-66-NH2(Zr)为载体制备的固定化CPO和HRP反应器具有良好的重复使用性主要源于两个方面：首先，来源于载体(H-UiO-66-NH2(Zr))自身的特殊性。H-UiO-66-NH2(Zr)属于一种高稳定多级孔MOF材料，此材料被用于酶的固定化除了具有MOFs材料自身的优点外，还具有两大优势，即多级孔结构和水溶液高稳定性。这两大优势的存在使得此MOF材料更适于作为酶的载体，其中多级孔结构中较大的孔可以容纳酶分子，而较小的孔可以作为底物和其它溶剂小分子的扩散通道。
实施例3
实施例1制备的H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO在催化降解异丙隆中的应用，具体降解方法如下：
分别在10mL用铝箔裹住的离心管中加入2450μL pH＝3的醋酸-醋酸钠缓冲液、自来水、人工湖，然后加入500μL 120μmol·L-1异丙隆水溶液和5mgH-UiO-66-NH2@CPO以及50μL 10mmol·L-1H2O2水溶液，形成降解反应体系，室温下搅拌30分钟，用3mL乙酸乙酯萃取3次，每次的时间间隔约为10分钟，将萃取后的上层液移入到100mL蒸馏瓶中进行旋转蒸发，将溶剂蒸干后再向蒸馏瓶中加入1mL乙腈溶解，得到样品。然后用0.22μm的有机相过滤膜将样品进行过滤，滤液用高效液相色谱进行分析测定，根据底物的标准曲线方程以及降解后测得峰面积计算降解率，结果见表1。
实施例4
实施例2制备的H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP在催化降解2,4-二氯苯酚中的应用，具体降解方法如下：
分别在10mL用铝箔裹住的离心管中加入1420μL pH＝3的醋酸-醋酸钠缓冲液、自来水、人工湖，然后加入1500μL 12mmol·L-1 2,4-二氯苯酚水溶液和5mgH-UiO-66-NH2@HRP以及80μL 10mmol·L-1H2O2水溶液，形成降解反应体系，室温下搅拌30分钟，用3mL乙酸乙酯萃取3次，每次的时间间隔约为10分钟，将萃取后的上层液移入到100mL蒸馏瓶中进行旋转蒸发，将溶剂蒸干后再向蒸馏瓶中加入1mL甲醇溶解，得到样品。然后用0.22μm的有机相过滤膜将样品进行过滤，滤液用高效液相色谱进行分析测定，根据底物的标准曲线方程以及降解后测得峰面积计算降解率，结果见表1。
表1固定化酶反应器对水溶性有机毒物的催化降解结果
Figure BDA0001401624340000071
由表1可知，在相同条件下由醋酸-醋酸钠缓冲液组成的反应降解体系计算得到的底物的降解率分别与自来水、人工湖组成的反应降解体系所得底物的降解率相比差异较大。其中，相同浓度的底物异丙隆在醋酸-醋酸钠缓冲液反应体系中的降解率为95.5％，而在其它体系中的降解率均为100％；相同浓度的底物2,4-二氯苯酚在醋酸-醋酸钠缓冲液反应体系中的降解率仅为80.9％，而在其它体系中的降解率接近或达到100％。结果表明，在实际降解体系中H-UiO-66-NH2(Zr)@CPO对异丙隆有良好的降解效果，H-UiO-66-NH2(Zr)@HRP对2,4-二氯苯酚有良好的降解效果。本发明制备的这两种固定化酶反应器更适合应用于实际降解体系中，在实际应用中效果良好。

Claims (5)

1.一种高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器，其特征在于：该固定化酶反应器是以孔径为2.5～17nm的多级孔UiO-66-NH2(Zr)为载体，固定氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶；该固定化酶反应器由下述方法制备得到：
将孔径为2.5～17nm的多级孔UiO-66-NH2(Zr)在真空条件下150℃活化12小时后，分散于pH值为3～5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，然后加入氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶，常温振荡至酶固定到多级孔UiO-66-NH2(Zr)上，离心分离、洗涤、干燥，得到高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器。
2.根据权利要求1所述的高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器，其特征在于：以载体计，所述氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶的固载量为90～150mg/g。
3.根据权利要求1所述的高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器，其特征在于：所述的多级孔UiO-66-NH2(Zr)与氯过氧化物酶或辣根过氧化物酶的质量比为1:0.10～0.30。
4.权利要求1所述的高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器在催化降解异丙隆中的应用，其中固定化酶为氯过氧化物酶。
5.权利要求1所述的高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器在催化降解2,4-二氯苯酚中的应用，其中固定化酶为辣根过氧化物酶。
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Lipase-Supported Metal–Organic Framework Bioreactor CatalyzesWarfarin Synthesis;Wan Ling Liu等;《Chemistry》;20150102;第21卷(第1期);摘要，第115右栏第3段-第116右栏最后一段，第118页右栏，图1 *

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