CN102816693B - 一种固定化l-天冬酰胺酶反应器 - Google Patents

一种固定化l-天冬酰胺酶反应器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型的纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器及其制备方法。所述酶反应器是按照包括下述步骤的方法制备得到的：以柠檬酸钠方法制备的纳米金为酶固定化材料，利用纳米金具有大的比表面积、良好的生物相容性的特点，使酶吸附到纳米金的表面，制备酶-纳米金的聚集体；在毛细管内壁修饰巯基硅烷偶联剂，利用巯基与纳米金的作用，将酶-纳米金聚集体固定于毛细管内壁，实现L-天冬酰胺酶的固定。该固定化酶的方法结合了纳米金大比表面积的特点有效的提高了L-天冬酰胺酶对于L-谷氨酰胺的酶解效率。该固定化酶反应器制备过程简单，提高了酶的利用率及效率，有利于开发L-天冬酰胺酶的新型给药方法并为疾病的诊断和治疗提供研究依据。

Description

一种固定化L-天冬酰胺酶反应器
技术领域
本发明涉及一种固定化L-天冬酰胺酶反应器。
背景技术
L-天冬酰胺酶是一种从Escherichia coli中提取的一种药物，应用于治疗急性淋巴细胞白血病（Krejci O,Starkova J,Otova B,Madzo J,Kalinova M,Hrusak O,Trka J(2004)Leukemia 18:434-441）。自1967年，L-天冬酰胺酶就作为治疗儿童急性淋巴细胞白血病的重要组成药物。这种酶可以水解血清中的L-天冬酰胺导致细胞凋亡和损害蛋白质的合成。但是这种酶作为药物存在严重的副作用，包括肾脏毒性、过敏反应、胰腺炎及中枢神经毒性等，并且会降低凝血因子的合成。为了避免这些副作用，L-天冬酰胺酶可以进行化学修饰，包埋或固定于载体上。其中采用将酶固定于某种材料并且建立体外循环系统（ESS）具有较好的优势。ESS系统是将L-天冬酰胺酶固定于柱体、中空纤维或血液透析膜等（Jackson JA,Halvorson HR,Furlong JW,Lucast KD,Shore,JD(1979)J.Pharmacol.Exp.Ther 209:271-274），然后血液流过酶反应器酶解血清中的L-天冬酰胺再流回体内，实现疾病的治疗。这种方法不需要将药物注入体内，因此可以避免副作用的发生。而为了适应这种方法的发展，需要寻找并建立新的生物相容性良好、低毒性的酶固定化材料。
在过去的几十年中，酶固定方法可以克服游离酶在酶反应过程中的众多缺点，可以快速、高效和高通量的进行酶解研究。许多新发展的材料已经被应用于酶的固定化，比如硅材料(Rao KS,Rani SU,Charyulu DK,Kumarb KN,Lee BK,Lee HY,Kawai T(2006)Anal ChimActa 576:177-183)、纳米颗粒(Mukhopadhyay K,Phadtare S,Vinod VP，Kumar A,Rao M,Chaudhari RV，Sastry M(2003)Langmuir 19:3858-3863)、碳纳米管(Wang S,Chen Z,Yang PY，Chen G(2008)Proteomics 8:1785-1788)及其它表面固定材料已经被应用于酶固定。因此寻找新的生物相容性好的酶固定化材料成为生物传感和生物医药领域的研究热点。
发明内容
针对传统的固定化酶的载体比表面积小，且容易造成酶失活，储存稳定性差等缺点，本发明提供了一种新型的纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器及其制备方法。
本发明所提供的纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器是按照包括下述步骤的方法制备得到的：
1）将纳米金溶液与L-天冬酰胺酶溶液混匀，室温搅拌0.5-5小时（优选1小时），然后置于2-8℃静置反应12-24小时（优选24小时），得到L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液；
2）制备内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱；
3）将所述L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液流经步骤2）处理后的毛细管并与其内壁充分接触，在2-8℃放置反应12-24小时（优选24小时），利用巯基与纳米金的反应使L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体固定于毛细管柱内壁，得到纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器。
其中，步骤1）中所述纳米金溶液中纳米金的平均粒径为13-22nm。本发明中的纳米金可采用柠檬酸三钠法制备得到。
所述L-天冬酰胺酶溶液的浓度为4.5-225.0U/mL。
L-天冬酰胺酶活力测定：在规定条件下，每分钟催化L-天冬酰胺水解释放1μmol氨的酶量定义为1个酶活力单位（U）。
在制备L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体时，需保证L-天冬酰胺酶相对于纳米金是过量的。
当采用如下方法制备纳米金溶液时，所述纳米金溶液与上述L-天冬酰胺酶溶液的体积比可为1:1-1:5。
纳米金溶液制备方法：将氯金酸（1.0mM，10.0mL）煮沸后，快速加入1.0mL新配制的柠檬酸酸三钠（38.8mM）溶液中，加热同时快速搅拌，溶液变为墨绿色，进而变为酒红色，再继续搅拌10分钟，用三蒸水稀释3倍后，即得到待用的纳米金溶液。
步骤2）中制备内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱的具体方法如下：1）将毛细管内壁进行活化；2）将巯基硅烷偶联剂与甲醇按照体积比1:4-1:1进行混合（优选1:4），将混合溶液流经活化后的毛细管并与其内壁充分接触，然后室温放置反应12-24小时（优选12小时），得到内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱。
所述巯基硅烷偶联剂具体可为(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷等。
其中，对毛细管内壁进行活化的方法可按照下述方法进行：将毛细管先依次用氢氧化钠溶液、水进行清洗；再依次用盐酸溶液、水依次进行清洗；最后用有机溶剂如丙酮、甲醇或四氢呋喃冲洗，氮气吹干。
所述氢氧化钠溶液的浓度可为0.1-1.0M，氢氧化钠溶液清洗的时间为0.5-2小时（优选2小时）。
所述盐酸溶液的浓度可为0.1-1.0M（优选1.0M），盐酸溶液清洗的时间为10-30分钟（优选10分钟）。
水清洗的时间可为10-30分钟（优选10分钟）。
所述毛细管的长度可为5-50cm。
上述方法得到的纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器可放置于4℃保存备用。
此外，纳米金作为酶固定化材料在制备固定化L-天冬酰胺酶中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明制备的L-天冬酰胺酶固定化酶的方法结合了纳米金比表面积大、生物相容性良好、方便键合酶的特点，实现了L-天冬酰胺酶在毛细管通道内壁的固定，且有效提高了L-天冬酰胺酶对于L-谷氨酰胺的酶解效率。该固定化酶反应器制备过程简单，提高酶的利用率及效率，有利于开发L-天冬酰胺酶的新型给药方法并为疾病的诊断和治疗提供研究依据。
附图说明
图1为纳米金（A）及酶-纳米金聚集体（B）的透射电镜和酶-纳米金聚集体键合毛细管内壁（C）及其部分放大（D）的扫描电镜表征图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的L-天冬酰胺酶的比活力为225.0U/mg。
实施例中所用的纳米金的制备方法具体如下：将氯金酸（1.0mM，10.0mL）煮沸后，快速加入1.0mL新配制的柠檬酸酸三钠（38.8mM）溶液中，加热同时快速搅拌，溶液变为墨绿色，进而变为酒红色，再继续搅拌10分钟，所得到的纳米金溶液用三蒸水稀释3倍后备用。
所制备的纳米金平均粒径：20nm，最大吸收波长522nm。
将纳米金溶液与L-天冬酰胺酶溶液按照1:1（v/v）混匀，室温搅拌1小时，再放置于4℃冰箱反应24小时，即可得到L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液。
将不同长度的毛细管（5-50cm）进行清洗：用1.0M氢氧化钠溶液进行冲洗2小时，水冲洗10分钟，1.0M盐酸溶液和水依次进行清洗10分钟，有机溶剂丙酮冲洗5分钟后氮气吹干。用(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷与甲醇（体积比1:4）混匀后，溶液负压流过毛细管柱，室温放置12小时后用甲醇和水反复冲洗，备用。
将纳米金溶液-L-天冬酰胺酶溶液聚集体流过毛细管柱并且在4℃放置反应24小时，多余未反应的酶-纳米金聚集体用去离子水冲洗，实现了L-天冬酰胺酶的固定。
用于固定化的酶为：L-天冬酰胺酶。
纳米金的形貌和粒径通过透射电镜和紫外-可见分光光度计进行表征；L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体在毛细管内壁的键合通过扫描电镜进行表征；载酶量通过Bradford方法测定（Ma JF,Liang Z,Qiao XQ,Deng QL,Tao DY，Zhang LH,Zhang YK(2008)AnalChem 80:2949-2953）；酶固定于纳米金上的活性及酶-纳米金聚集体固定于毛细管内壁的活性测定根据（Qiao J,Qi L,Ma H.M,Chen Y,Wang MX,Wang DX(2010)Electrophoresis 31:1565-1571；Qiao J,Qi L,Mu XY，Chen Y(2011)Analyst 136:2077-2083）。
实施例1、制备纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器
1）将纳米金溶液与L-天冬酰胺酶溶液（浓度225.0U/mL）按照1:1（v/v）混匀，室温搅拌1小时，再放置于4℃冰箱反应24小时，得到L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液。
2）将30cm毛细管用1.0M氢氧化钠溶液进行冲洗2小时，水冲洗10分钟，1.0M盐酸溶液和水依次进行清洗10分钟，有机溶剂丙酮冲洗5分钟后氮气吹干。用(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷与甲醇（体积比1:4）混匀后溶液负压流过毛细管柱，室温放置12小时后用甲醇和水反复冲洗，即得到内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱，备用。
3）将纳米金溶液-L-天冬酰胺酶溶液聚集体流过毛细管柱并且在4℃放置反应24小时，多余未反应的酶-纳米金聚集体用去离子水冲洗，实现了L-天冬酰胺酶的固定，于4℃下储存备用。
图1为纳米金（A）及酶-纳米金聚集体（B）的透射电镜和酶-纳米金聚集体键合毛细管内壁（C）及其部分放大（D）的扫描电镜表征图。透射电镜结果表明酶-纳米金聚集体的粒径比纳米金有所增加，酶成功的键合到纳米金表面；扫描电镜结果表明酶-纳米金聚集体也成功的键合到毛细管内壁。
L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体在30cm长毛细管内壁的固载量通过Bradford方法进行测定，结果为0.017μg。
固定化酶的活性通过酶动力学常数来进行表征，酶固定于纳米金上的酶动力学常数：Km=11.3μM，Vmax=428.5μM·min-1·(mg L-Asnase)-1；酶-纳米金聚集体固定于毛细管内壁的酶动力学常数：Km=142.8μM，Vmax＝1294.6μM·min-1·(mg L-Asnase)-1。
实施例2、制备纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器
1）将纳米金溶液与L-天冬酰胺酶溶液（4.5U/mL）按照1:1（v/v）混匀，室温搅拌1小时，然后置于4℃冰箱反应24小时，得到L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液。
2）将5cm毛细管用1.0M氢氧化钠溶液进行冲洗2小时，水冲洗10分钟，1.0M盐酸溶液和水依次进行清洗10分钟，有机溶剂丙酮冲洗5分钟后氮气吹干。用(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷与甲醇（体积比1:4）混匀后溶液负压流过毛细管柱并与其内壁充分接触，室温放置12小时后，用甲醇和水反复冲洗，即得到内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱，备用。
3）将纳米金-L-天冬酰胺酶聚集体溶液流过毛细管柱并且在4℃放置反应24小时，多余未反应的酶-纳米金聚集体用去离子水冲洗，实现了L-天冬酰胺酶的固定，将得到的纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器于4℃下储存备用。
该反应器中固定化L-天冬酰胺酶的活性与实施例1中固定化酶活性基本相同，两者之间无显著性差异。
实施例3、制备纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器
1）将纳米金溶液与L-天冬酰胺酶溶液（11.2U/mL）按照1∶1（v/v）混匀，室温搅拌1小时，再放置于4℃冰箱反应24小时，得到L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液。
2）将10cm毛细管用1.0M氢氧化钠溶液进行冲洗2小时，水冲洗10分钟，1.0M盐酸溶液和水依次进行清洗10分钟，有机溶剂丙酮冲洗5分钟后氮气吹干。用(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷与甲醇（体积比1:4）混匀后溶液负压流过毛细管柱，室温放置12小时后用甲醇和水反复冲洗，即得到内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱，备用。
3）将纳米金溶液-L-天冬酰胺酶溶液聚集体流过毛细管柱并且在4℃放置反应24小时，多余未反应的酶-纳米金聚集体用去离子水冲洗，实现了L-天冬酰胺酶的固定，于4℃下储存备用。
该反应器中固定化L-天冬酰胺酶的活性与实施例1中固定化酶活性基本相同，两者之间无显著性差异。
实施例4、制备纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器
1）将纳米金溶液与L-天冬酰胺酶溶液（浓度56.0U/mL）按照1:1（v/v）混匀，室温搅拌1小时，再放置于4℃冰箱反应24小时，得到L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液。
2）将15cm毛细管用1.0M氢氧化钠溶液进行冲洗2小时，水冲洗10分钟，1.0M盐酸溶液和水依次进行清洗10分钟，有机溶剂丙酮冲洗5分钟后氮气吹干。用(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷与甲醇（体积比1:4）混匀后溶液负压流过毛细管柱，室温放置12小时后用甲醇和水反复冲洗，即得到内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱，备用。
3）将纳米金溶液-L-天冬酰胺酶溶液聚集体流过毛细管柱并且在4℃放置反应24小时，多余未反应的酶-纳米金聚集体用去离子水冲洗，实现了L-天冬酰胺酶的固定，于4℃下储存备用。
该反应器中固定化L-天冬酰胺酶的活性与实施例1中固定化酶活性基本相同，两者之间无显著性差异。
实施例5、制备纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器
1）将纳米金溶液与L-天冬酰胺酶溶液（浓度112.5U/mL）按照1:1（v/v）混匀，室温搅拌1小时，再放置于4℃冰箱反应24小时，得到L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液。
2）将50cm毛细管用1.0M氢氧化钠溶液进行冲洗2小时，水冲洗10分钟，1.0M盐酸溶液和水依次进行清洗10分钟，有机溶剂丙酮冲洗5分钟后氮气吹干。用(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷与甲醇（体积比1:4）混匀后溶液负压流过毛细管柱，室温放置12小时后用甲醇和水反复冲洗，即得到内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱，备用。
3）将纳米金溶液-L-天冬酰胺酶溶液聚集体流过毛细管柱并且在4℃放置反应24小时，多余未反应的酶-纳米金聚集体用去离子水冲洗，实现了L-天冬酰胺酶的固定，于4℃下储存备用。
该反应器中固定化L-天冬酰胺酶的活性与实施例1中固定化酶活性基本相同，两者之间无显著性差异。

Claims (8)

1.一种制备纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器的方法，包括下述步骤：
1）将纳米金溶液与L-天冬酰胺酶溶液混匀，室温搅拌0.5-5小时，然后置于2-8℃静置反应12-24小时，得到L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液；
2）制备内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱；
3）将所述L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体溶液流经步骤2）处理后的毛细管并与其内壁充分接触，在2-8℃放置反应12-24小时，利用巯基与纳米金的反应使L-天冬酰胺酶-纳米金聚集体固定于毛细管柱内壁，得到纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述纳米金溶液中纳米金的平均粒径为13-22nm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述纳米金溶液是采用柠檬酸三钠法制备得到的；所述L-天冬酰胺酶溶液的浓度为4.5-225.0U/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中制备内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱的方法如下：
1）将毛细管内壁进行活化；
2）将巯基硅烷偶联剂与甲醇按照体积比1:4-1:1进行混合，将混合溶液流经活化后的毛细管并与其内壁充分接触，然后室温放置反应12-24小时，得到内壁修饰巯基硅烷偶联剂的毛细管柱。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述将毛细管内壁进行活化的方法如下：将毛细管先依次用氢氧化钠溶液、水进行清洗；再依次用盐酸溶液、水依次进行清洗；最后用有机溶剂冲洗，氮气吹干。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1-1.0M，氢氧化钠溶液清洗的时间为0.5-2小时；
所述盐酸溶液的浓度为0.1-1.0M，所述盐酸溶液的清洗时间为10-30分钟；
所述水的清洗时间为10-30分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述毛细管柱的长度为5-50cm。
8.权利要求1-7中任一项所述方法制备得到的纳米金固定化L-天冬酰胺酶反应器。
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