CN104458729A - 一种荧光石墨烯量子点抑制过氧化物酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种荧光石墨烯量子点抑制过氧化物酶活性的方法，包括1)将碳源加入一定量水配制混合溶液，加热此溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热反应一段时间后将产物溶于水中，用碱液调节体系pH值中性，提纯产物、干燥后得到固体石墨烯量子点。2)将1)所得的量子点分散于二次蒸馏水，取适量量子点溶液、酶溶液加入缓冲溶液中，一段时间后加入显色剂、H2O2，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物最大吸收波长处的吸光值，并作空白样品对照，以此确定酶的相对活性。采用廉价易得的原料制备石墨烯量子点，绿色环保。石墨烯量子点与酶蛋白之间的相互作用可以改变酶的结构，实现酶活性的调节。
Description
技术领域
本发明属于化工领域，特别涉及一种荧光石墨烯量子点抑制过氧化物酶活性的方法。
背景技术
纳米材料是三维中至少有一维处于纳米级别的材料，当处于纳米尺度时，材料所具备的某些性能也随之发生明显的改变，同时会具有一些不同于普通材料的特殊性能，如小尺寸效应、量子限域效应、宏观量子隧道效应，表面效应等。这些特殊的效应赋予纳米材料独特的物理化学、电学、力学及热学性质，已被广泛应用于各个领域。近年来，研究纳米材料在医学领域的应用也受到密切的关注。随着纳米材料在生物医学领域展示出越来越广阔的应用前景，研究纳米材料与生物分子、细胞以及生物体之间的相互作用就显得尤为重要。然而，由于大多数的纳米材料都含有金属元素，在生物学中具有潜在的生物毒性，这限制了它们在生物医学上的使用。而碳元素是人体内最重要的元素之一，因此，碳纳米材料被认定为最有前景的一类纳米材料，各式各样的碳纳米材料也随之产生，其中包括零维的富勒烯、一维的碳纳米管和二位的石墨烯等。尤其是石墨烯的出现(Rao,C.N.R.；Biswas,K.；Subrahmanyam,K.S.；Govindaraj,A.J.Mater.Chem.2009,19,2457-2469.)，引起了诸多研究者的关注，氧化石墨烯除了具有特殊的物理化学性质外，表面还含有大量的富氧基团，如环氧基、羟基、羧基和羰基，这些官能团使得石墨烯具有表现出了优异生物相容性，更为重要的是，通过表面基团可以直接进行物理化学修饰，从而丰富了石墨烯在生物医学领域的应用。然而，二维的石墨烯在常用的溶剂中容易聚集和分散性差，这限制了它的广泛应用。石墨烯量子点(GQDs)的出现弥补了石墨烯分散性差这一缺点。石墨烯量子点(Zhang,Z.；Zhang,J.；Chen,N.；eta1.Energy&Environmental Science，2012，5(10)：8869—8890.)，它的三个维度的尺寸都处于纳米尺度的新型碳纳米材料，其原料丰富廉价易得，具有优异的水溶性，低细胞毒性，除了具有石墨烯的特殊结构和性质外，还具有独特的发光性质。
蛋白质和酶活性的调节在生物体内有着非常重要的作用，如细胞信号转导、DNA复制及新陈代谢，酶功能的紊乱会导致很多疾病的产生，更有甚者会导致死亡的发生。纳米材料具有特殊的物理化学性质，可以通过与酶的相互作用实现对酶结构的调节，从而达到对酶活性调节的目的。
石墨烯及其衍生物可以通过静电吸附、输水作用或π-π吸附和酶相互作用(Tan,X.；Feng,L.；Zhang,J.；Yang,K.；Zhang,S.；Liu,Z.；Peng,R.ACS applied materials&interfaces 2013,1370-1377)，选择性的改变酶的结构，进而改变酶的活性。由于石墨烯量子点具有石墨烯的特殊结构，又因为合成绿色、生物相容性好以及对酶有很好的调节作用，因此，可以代替石墨烯与酶相互作用，实现酶的活性的调节。有很强的抑制酶的活性的纳米材料可以作为酶的抑制剂，用临床上疾病的治疗。加上石墨烯量子点发光的特性，可直接用于生物成像。因此，石墨烯量子点作为酶的调节剂具有很广阔的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的氧化石墨作为酶的调节剂存在分散性差，尺寸在微米级，容易限制酶结构的打开，干扰酶活性的不足，提供一种新的酶调节剂的制备方法及用于对酶活性的调剂。高压反应制备方法原料廉价易得，绿色环保，不会造成环境污染，制备的石墨烯量子点水溶性好，表面具有大量的基团，具有较好的生物相容性，此外还具有较高的荧光强度和荧光稳定性，与酶相互作用后具有抑制酶的活性的作用，且对酶稳定性具有一定程度的提高。
本发明人经过广泛的研究和反复的试验发现，采用碳水化合物为原料、氨基酸类为表面钝化剂，高压反应制备出石墨烯量子点，然后利用该石墨烯量子点与酶间的特殊的相互作用，实现了酶活性的调节。本发明人进一步对石墨烯量子点制备件以及石墨烯量子点与酶相互作用进行优化选择，最终发现石墨烯量子点与酶相互作用后可作为酶的抑制剂抑制酶的活性。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种荧光石墨烯量子点抑制过氧化物酶活性的方法。包括
1)石墨烯量子点的制备：将碳源或碳源和表面钝化剂按一定比例混合，加入一定量水配制混合溶液，加热此混合溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热至一定温度下反应一段时间。在反应结束后，将产物溶于一定体积的水中，用碱液调节体系pH值至中性，用透析袋(截留分子量1000Da)透析后得到均匀溶液，干燥后得到固体石墨烯量子点。
2)将1)所得的石墨烯量子点分散于二次蒸馏水形成浓度为10～10000μg/mL的稳定的石墨烯量子点溶液，取适量此量子点溶液、酶溶液按一定比例加入到缓冲溶液中，室温放置一段时间，加入显色剂、H2O2标准溶液，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物在最大吸收波长处10min时的吸光值，并作空白样品对照，以此确定酶的相对活性。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的碳源是柠檬酸、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘油等碳水化合物中的任何一种。表面钝化剂是赖氨酸、半胱氨酸或甘氨酸中的任何一种。表面钝化剂与碳源的比例为0～1。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的反应温度为180～280℃，反应时间为0.5～3h。所述的碱液为氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化钾中的任何一种。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的酶为辣根过氧化物酶、细胞色素等具有过氧化物酶特性的酶中的任何一种。其浓度为50ng/mL～1000ng/mL。
5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的缓冲溶液的pH值为4-9，石墨烯量子点和酶的反应时间为0～2h。
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤,2)所述的显色剂为四甲基联苯胺、二氨基联苯胺或邻苯二胺中的任何一种。显色剂的浓度为0.1～5mM，H2O2标准溶液的浓度为0.1～1mM。
本发明的一种荧光石墨烯量子点抑制过氧化物酶活性的方法较佳实施例包括以下步骤：
1)石墨烯量子点的制备：将柠檬酸和赖氨酸按2:1混合，加入5mL水配制混合溶液，加热此混合溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热至200℃反应3h。在反应结束后，将产物溶于一定体积的水中，用1M氢氧化钠溶液调节体系pH值值中性，用透析袋(截留分子量1000Da)透析后得到均匀溶液，冷冻干燥后得到固体石墨烯量子点。
2)将1)所得的石墨烯量子点分散于二次蒸馏水形成浓度为10～10000μg/mL的稳定的石墨烯量子点溶液，取适量此量子点溶液、酶溶液按一定比例加入到缓冲溶液中，室温放置10min,，加入显色剂四甲基联苯胺、H2O2标准溶液，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物在最大吸收波长处10min时的吸光值，并作空白样品对照，以此确定酶的相对活性。
在该较佳实施例中，以柠檬酸为碳源、赖氨酸为表面钝化剂高压反应制备石墨烯量子点。冷却后将所得到的量子点用氢氧化钠溶液调节体系的pH值至中性，透析提纯，冷冻干燥收集固体。重新分散于二次蒸馏水中，并加入至一定量辣根过氧化物酶的溶液中，反应10min后用紫外分光光度计在652nm处进行时间扫描。研究表明，所得到的石墨烯量子点对辣根过氧化物酶的催化活性具有一定程度的抑制，且对酶的热稳定性有所提高。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
本发明的各优选方案和互相组合使用。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)采用碳水化合物为原料制备石墨烯量子点，原料廉价易得，，这大大降低了成本，同时也避免了使用有毒物质，制备过程绿色环保，并且能够大量生产。相比于其他的酶活性调节剂，生物毒性小。
(2)石墨烯量子点具有尺寸小，能够深入到酶结构的各个部分，使得两者之间的相互作用更加充分，更有利于酶活性的调节，这有效的解决了氧化石墨因为片层较大束缚酶在反应过程中性能的充分发，使用石墨烯量子点与酶等蛋白质相互作用，解决了石墨烯等较大颗粒容易产生的聚集等缺点，从而使所得到的石墨烯量子点在酶活性调节方面明显优于现有调节剂。
(2)石墨烯量子点具有较强的荧光，可代替其他荧光物质直接用于生物成像方面，而不需要生物分子或细胞与其他成像物质相互作用，可广泛应用于生物医学领域。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”、“常压”是指日常操作间的温度和气压，一般为25℃，一大气压。
下述实施例中，所用的紫外分光光度计为TU-1901紫外可见分光光度计。
实施例1
将4g柠檬酸、1g甘氨酸加入到5mL水配制混合溶液，加热此混合溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热至220℃反应3h。在反应结束后，将产物溶于一定体积的水中，用1M氢氧化钠调节体系pH值至中性，用透析袋(截留分子量1000Da)透析后得到均匀溶液，干燥后得到固体石墨烯量子点。将所得的石墨烯量子点分散于二次蒸馏水形成浓度为750μg/mL的稳定的石墨烯量子点溶液，取200μL此量子点溶液、100μL 200ng/mL辣根过氧化物酶加入到4mL pH值为4的醋酸缓冲溶液中，室温放置30min，加入200μL 5mM显色剂四甲基联苯胺、500μL 1mM H2O2标准溶液，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物在最大吸收波长652nm处10min时的吸光值，并作空白样品对照，得到酶的相对活性是纯酶的65％。
实施例2
将4g柠檬酸、2g赖氨酸加入5mL水配制混合溶液，加热此混合溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热至200℃反应3h。在反应结束后，将产物溶于一定体积的水中，用1M氢氧化钠调节体系pH值至中性，用透析袋(截留分子量1000Da)透析后得到均匀溶液，干燥后得到固体石墨烯量子点。将所得的石墨烯量子点分散于二次蒸馏水形成浓度为200μg/mL的稳定的石墨烯量子点溶液，取200μL此量子点溶液、100μL 500ng/mL辣根过氧化物酶加入到4mL pH值为9的磷酸缓冲溶液中，室温放置2h，加入200μL 0.5mM显色剂四甲基联苯胺、500μL 1mM H2O2标准溶液，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物在最大吸收波长652nm处10min时的吸光值，并作空白样品对照，得到酶的相对活性是纯酶的50％。
实施例3
将2g柠檬酸、1g甘氨酸按加入5mL水配制混合溶液，加热此混合溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热至250℃反应2h。在反应结束后，将产物溶于一定体积的水中，用1M碳酸氢钠调节体系pH值至中性，用透析袋(截留分子量1000Da)透析后得到均匀溶液，干燥后得到固体石墨烯量子点。将所得的石墨烯量子点分散于二次蒸馏水形成浓度为250μg/mL的稳定的石墨烯量子点溶液，取200μL此量子点溶液、100μL 500ng/mL辣根过氧化物酶加入到4mL pH值为4的醋酸缓冲溶液中，室温放置1.5h，加入200μL 5mM显色剂二氨基联苯胺、500μL 0.5mM H2O2标准溶液，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物在最大吸收波长420nm处10min时的吸光值，并作空白样品对照，得到酶的相对活性是纯酶的65％。
实施例4
将10g柠檬酸、5g赖氨酸加入10mL水配制混合溶液，加热此混合溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热至200℃反应2.5h。在反应结束后，将产物溶于一定体积的水中，用1M氢氧化钠调节体系pH值至中性，用透析袋(截留分子量1000Da)透析后得到均匀溶液，干燥后得到固体石墨烯量子点。将所得的石墨烯量子点分散于二次蒸馏水形成浓度为500μg/mL的稳定的石墨烯量子点溶液，取200μL此量子点溶液、100μL 250ng/mL细胞色素加入到4mL pH值为7的磷酸缓冲溶液中，室温放置1h，加入200μL 1mM显色剂四甲基联苯胺、500μL 0.5mM H2O2标准溶液，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物在最大吸收波长652nm处10min时的吸光值，并作空白样品对照，得到酶的相对活性是纯酶的60％。
实施例5
将2g葡萄糖加入5mL水配制混合溶液，加热此混合溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热至180℃反应3h。在反应结束后，将产物溶于一定体积的水中，调节体系pH值至中性，用透析袋(截留分子量1000Da)透析后得到均匀溶液，干燥后得到固体石墨烯量子点。将所得的石墨烯量子点分散于二次蒸馏水形成浓度为1000μg/mL的稳定的石墨烯量子点溶液，取200μL此量子点溶液、100μL 100ng/mL辣根过氧化物酶加入到4mL pH值为6的磷酸缓冲溶液中，室温放置30min，加入200μL 5mM显色剂二氨基联苯胺、500μL 1mM H2O2标准溶液，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物在最大吸收波长420nm处10min时的吸光值，并作空白样品对照，得到酶的相对活性是纯酶的80％。
实施例6
将10g柠檬酸和5g半胱氨酸混合后加入10mL水配制混合溶液，加热此混合溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热至200℃反应3h。在反应结束后，将产物溶于一定体积的水中，用1M碳酸氢钠调节体系pH值至中性，用透析袋(截留分子量1000Da)透析后得到均匀溶液，干燥后得到固体石墨烯量子点。将所得的石墨烯量子点分散于二次蒸馏水形成浓度为10000μg/mL的稳定的石墨烯量子点溶液，取200μL此量子点溶液、100μL 50ng/mL辣根过氧化物酶加入到4mL pH值为4的醋酸缓冲溶液中，室温放置10min，加入200μL 5mM显色剂四甲基联苯胺、500μL 1mM H2O2标准溶液，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物在最大吸收波长652nm处10min时的吸光值，并作空白样品对照，得到酶的相对活性是纯酶的70％。
Claims (6)
1.一种荧光石墨烯量子点抑制过氧化物酶活性的方法，包括
1)石墨烯量子点的制备：将碳源或碳源和表面钝化剂按一定比例混合，加入一定量水配制混合溶液，加热此混合溶液至水分完全蒸发后转移至高压反应釜中，加热至一定温度下反应一段时间。在反应结束后，将产物溶于一定体积的水中，用碱液调节体系pH值至中性，用透析袋(截留分子量1000Da)透析后得到均匀溶液，干燥后得到固体石墨烯量子点。
2)将1)所得的石墨烯量子点分散于二次蒸馏水形成浓度为10～10000μg/mL的稳定的石墨烯量子点溶液，取适量此量子点溶液、酶溶液按一定比例加入到缓冲溶液中，室温放置一段时间，加入显色剂、H2O2标准溶液，将此混合溶液摇匀后迅速加入到比色皿中，在紫外-可见分光光度计上测定产物在最大吸收波长处10min时的吸光值，并作空白样品对照，以此确定酶的相对活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的碳源是柠檬酸、葡萄糖、果糖、蔗糖或甘油等碳水化合物中的任何一种。表面钝化剂是赖氨酸、半胱氨酸或甘氨酸中的任何一种。表面钝化剂与碳源的比例为0～1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的反应温度为180～280℃，反应时间为0.5～3h。所述的碱液为氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化钾中的任何一种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的酶为辣根过氧化物酶、细胞色素等具有过氧化物酶特性的酶中的任何一种。其浓度为50ng/mL～1000ng/mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的缓冲溶液的pH值为4-9，石墨烯量子点和酶的反应时间为0～2h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤,2)所述的显色剂为四甲基联苯胺、二氨基联苯胺或邻苯二胺中的任何一种。显色剂的浓度为0.1～5mM，H2O2标准溶液的浓度为0.1～1mM。
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