CN104897756B - 一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其制备方法,该电化学传感器制备的主要过程是:在二硫化钼纳米片表面依次吸附硫堇、AuSiO2、富G结构的DNA链S1,通过加入Hemin形成MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme纳米复合材料;在金电极表面修饰TS前体,利用端粒酶延长DNA链形成S2,并与S1互补螺旋,最终通过检测催化过氧化氢氧化ABTS的电化学信号强弱来实现对端粒酶活性的直接检测。本发明制备的电化学传感器操作简单,灵敏度高,稳定性强,对于检测癌变细胞具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其制备方法,具体的是一种基于G-四联体/DNAzyme的检测端粒酶活性的电化学传感器及其制备方法,属于生物检测技术领域。
背景技术
目前,由于人口的老龄化、生态环境的破坏、不健康的生活方式等多方面因素导致癌症发病率呈逐年上升的趋势,而我国癌症患者的五年存活率仅为30%左右,最根本的原因是患者确诊为癌症的时候已经处于中晚期,从而耽误了最佳治疗时间。因此,快速、有效地早期灵敏诊断对于及时发现细胞癌变具有重要意义。
端粒酶在细胞衰老过程中的作用主要有两个方面:一方面,由于大多数正常的人体细胞中都没有端粒酶活性,因此,端粒的长度将随着细胞的分裂逐渐缩短,使得细胞最终走向衰老;另一方面,当端粒酶被激活,可以阻止端粒进一步缩短,增加细胞的传代次数。端粒酶的表达会间接影响细胞的衰老,直接影响细胞走向衰老的是端粒长度的缩短。研究发现85%~95%的肿瘤细胞中都可以检测到端粒酶活性,如乳腺癌,结肠癌,淋巴癌,肺癌,卵巢癌,急性白血病等等,都可以检测到端粒酶活性。因此,端粒酶可以作为一种判断肿瘤细胞的标识物。目前,检测端粒酶活性最常用的方法是基于PCR扩增技术的TRAP法,发明专利“一种检测端粒酶活性的方法”(专利号02116466.5)基于PCR技术、通过人类端粒酶逆转录酶某段结构域的检测来判断端粒酶活性,检测信号稳定性好、可同时对大量样品进行可重复性操作,但过程复杂,灵敏度低;发明专利“一种快速检测端粒酶活性的试剂盒及其应用”(专利号201210190716.3)利用核酸外切酶Ⅲ可以逐步移除双链DNA3’平末端或3’缩进末端单个核苷酸的特性来测量端粒酶的活性,该方法避免了PCR技术易出现假阳性或假阴性结果的缺陷,但对端粒酶浓度要求比较高,无法实现对极少量具有端粒酶活性的癌细胞的检测。
目前我国癌症的诊断主要通过实验室免疫学酶学检测、影像学检测等实现,但昂贵的检查费用使其在一般健康体检过程中无法普及。而电化学传感器具有操作简单、成本低廉、灵敏度高和响应速度快等优点,对于癌细胞的早期诊断是一个理想的选择。因此,以端粒酶为诊断标识物,提供一种用于端粒酶活性检测的电化学传感器对于癌细胞的诊断具有重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明的目的是提供一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其制备方法,有效利用肿瘤细胞中端粒酶被激活的特性,通过电化学工作站对生物传感器的电信号进行检测,实现了对端粒酶活性的快速、灵敏检测。
为实现上述目的,本发明采用下述技术方案:
一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)将二硫化钼(MoS2)粉末溶于有机溶剂中,超声剥离后静置,收集上层分散液,得到单层或几层的二硫化钼的纳米片分散液,取二硫化钼纳米片分散液与硫堇溶液(Thi)混合,超声,制得硫堇功能化二硫化钼(MoS2-Thi);
(2)超声条件下将胶体金溶液逐滴滴入二氧化硅溶液中反应10-20分钟,得到AuSiO2纳米复合材料溶液;
(3)将步骤(1)的MoS2-Thi纳米复合材料加入到步骤(2)的AuSiO2纳米复合材料溶液中,室温搅拌反应20-28小时,制得MoS2-Thi-AuSiO2纳米复合材料;
(4)设计一条临近5’端富含鸟嘌呤脱氧核苷酸的DNA链S1,并将5’端硫醇化,使得S1通过金-硫键修饰到MoS2-Thi-AuSiO2表面;加入氯高铁血红素(Hemin),使得富G部分形成G-四联体/DNAzyme,最终制得S1/MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme纳米复合材料;
(5)将金电极打磨抛光,并将TS前体(端粒酶引物)通过金-硫键修饰到金电极表面,利用端粒酶将其延伸成富G结构的DNA链S2,并与S1临近3’端非富G部分互补结合;
(6)将步骤(5)处理过的金电极作为工作电极,与参比电极、对比电极连接到电化学工作站,共同构成能检测端粒酶活性的电化学传感器。
步骤(1)中,所述有机溶剂为N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N-乙基-2-吡咯烷酮(NVP)、异丙醇(IPA)、二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF);二硫化钼的纳米片分散液的质量浓度为20mg·L-1,硫堇溶液的摩尔浓度为1mmol·L-1;二硫化钼的纳米片分散液与硫堇溶液加入量的体积比为1:1。
步骤(2)中,所述胶体金溶液中金粒子的粒径为13nm,制备方法为柠檬酸三钠还原氯金酸法,具体步骤为:将去离子水与1%(W/V)HAuCl4溶液按99:1的体积比加入三口烧瓶中,密封,剧烈搅拌下回流加热,在105℃左右时煮沸,迅速加入2.5倍去离子水体积的1%(W/V)柠檬酸三钠溶液,1min左右时,溶液颜色由淡黄变为深红色,继续回流加热,20min后停止加热,室温下(23-25℃)搅拌冷却,制得胶体金溶液;
步骤(2)中,所述胶体金溶液与二氧化硅溶液的体积比为1:7;
步骤(2)中,二氧化硅溶液的制备方法:将正硅酸乙酯(TEOS)、乙醇、去离子水混合搅拌10分钟,缓慢加入氨水,保持温度在30℃,不断搅拌,直到形成淡白色溶液,调节pH到7.0-7.5,其中TEOS、乙醇、去离子水、氨水的体积比为1:10:5:3。
步骤(3)中,所述MoS2-Thi纳米复合材料与AuSiO2纳米复合材料加入的体积比为1:10。
步骤(4)中,所述DNA链S1的碱基序列为:
5’-TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCCCTAACCCTAACCCTAA-3’(如序列表中SEQIDNO.1所示);
所述DNA链S1的浓度为1μmol·L-1。
步骤(5)中,所述金电极打磨抛光,具体为:将金电极先后用0.5μm和0.03μm的Al2O3粉末打磨成镜面,然后用去离子水清洗,再依次置于去离子水和乙醇中超声30-60s;处理完成后,用0.5mol·L-1的浓硫酸对电极进行循环伏安法活化,直到产生稳定的循环伏安扫描图,扫描电压为0.20-1.65V,扫速为0.1V/s;最后用去离子水冲洗,室温晾干。
步骤(5)中,所述TS前体的碱基序列为:
SH-5’-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3’(如序列表中SEQIDNO.2所示);
所述TS前体浓度为1μmol·L-1。
步骤(5)中,所述DNA链S2的碱基序列为:
5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’(如序列表中SEQIDNO.3所示)。
步骤(6)中,所述参比电极为甘汞电极,所述对比电极为Pt电极。
采用本发明的电化学传感器进行端粒酶活性检测的方法,步骤为:
(1)分别将1、5、10、50、100、200、500、1000、2000、5000个人早幼粒白血病细胞离心(10000rpm,5min)、用5mLPBS溶液清洗两次,加入200μL细胞裂解液,冰浴1h,4℃离心(20000rpm,15min),取上清液,-80℃保存;取4μL该上清液与6μL的DNA链延长原料缓冲液混合,并用移液枪吸取滴到电化学传感器的金电极表面,30℃下反应2h,形成S2,用pH=8.3的Tris–HCl清洗液冲洗,晾干;
(2)用移液枪吸取4μL的S1/MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme溶液滴到步骤(1)的金电极表面,30℃下静置12h,然后用PBS溶液冲洗,晾干;
(3)将步骤(2)处理过的金电极作为工作电极,与甘汞参比电极、Pt对比电极连接到电化学工作站,并将工作电极浸入30-50μL催化反应溶液中(含有3.2mmol·mL-1ABTS、3.2mmol·mL-1H2O2,0.1MTris-HCl,pH=8.3,20mmol·mL-1MgCl2),用循环伏安法测其电流响应,并根据不同细胞数量绘制工作曲线;
(4)提取待测癌细胞样品的端粒酶,与DNA链延长原料缓冲液混合,并用移液枪吸取滴到电化学传感器的金电极表面,30℃下反应2h,形成S2,用pH=8.3的Tris–HCl清洗液冲洗,晾干;用移液枪吸取4μL的S1/MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme溶液滴到金电极表面,30℃下静置12h,然后用PBS溶液冲洗,晾干;将处理过的金电极作为工作电极,与甘汞参比电极、Pt对比电极连接到电化学工作站,并将工作电极浸入30-50μL催化反应溶液中(含有3.2mmol·mL-1ABTS、3.2mmol·mL-1H2O2,0.1MTris-HCl,pH=8.3,20mmol·mL-1MgCl2),用循环伏安法测其电流响应,根据绘制的标准曲线确定癌细胞的含量。
本发明的有益效果:
(1)本发明的电化学传感器制备方法简单,易操控,反应条件温和。
(2)本发明首次将MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme纳米复合材料与端粒酶合成的富G的端粒DNA链结合,实现了对端粒酶活性快速、有效地检测。
(3)本发明的电化学传感器基于G-四联体/DNAzyme灵敏地催化H2O2氧化ABTS,对癌细胞的检测限度可低至1个/200μL,灵敏度高。
附图说明
图1为本发明的电化学传感器的制备原理图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,应该说明的是,下述说明仅是为了解释本发明,并不对其内容进行限定。
实验中所使用的仪器及试剂为:(1)仪器:CHI650电化学工作站(上海辰华仪器有限公司);采用饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝电极为对电极;(2)试剂:二硫化钼(阿拉丁试剂(上海)有限公司),分析纯;硫堇(国药集团化学试剂有限公司),分析纯;人早幼粒白血病细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心);脱氧核苷酸链(生工生物工程(上海)有限公司)。
其他试剂均为分析纯,实验用水为去离子水。
实施例1:
(1)取20mg二硫化钼粉末溶于1mL有机溶剂N-甲基-2-吡咯烷酮中,超声剥离2-3h后,将分散液静置15-20min,收集上层大部分分散液,除去底部未剥离完全的大颗粒,得到单层或几层的二硫化钼纳米片分散液,取1mL分散液与1ml、1mmol·mL-1的Thi溶液在室温下混合超声3h,丢弃上层清液,得到MoS2-Thi纳米复合材料,倒入1mL水中;将99mL去离子水与1mL1%(W/V)HAuCl4溶液加入三口烧瓶中,密封,剧烈搅拌下回流加热,在105℃左右时煮沸,迅速加入2.5mL1%(W/V)柠檬酸三钠溶液,1min左右时,溶液颜色由淡黄变为深红色,继续回流加热,20min后停止加热,室温下(23-25℃)搅拌冷却,制得13nm粒径的Au粒子;将1mLTEOS、10mL乙醇、5mL去离子水混合搅拌10分钟,缓慢加入2-3mL25%(W/V)的氨水,保持温度在30℃,不断搅拌,直到形成淡白色溶液,立即用1mol·L-1HCl与1mol·L-1NaOH调节pH到7.0-7.5;超声条件下将10mL以上制备的胶体金溶液逐滴滴入二氧化硅溶液中反应15分钟后离心(10000rpm,5min)、冲洗(以去除未结合的纳米金粒子),放入PBS溶液(pH=7.4)中备用,得到AuSiO2纳米复合材料;将MoS2-Thi复合材料倒入20mL制备的AuSiO2中,室温下搅拌24h,制得MoS2-Thi-AuSiO2纳米复合材料,然后离心,用PBS溶液冲洗,最后放入1mLPBS溶液中,4℃储存备用。
(2)将40μL、1μM硫醇化富G结构S1(碱基序列为5’-TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCCCTAACCCTAACCCTAA-3’,如序列表中SEQIDNO.1所示)加入1mLMoS2-Thi-AuSiO2中,室温下静置16h,然后离心(10,000rpm,30min,4℃)去掉未结合的DNA链;在悬浮液中加入过量Hemin,黑暗条件、4℃下反应1.5h,形成G-四联体/DNAzyme;然后离心(10,000rpm,30min,4℃),去除未结合的Hemin,最终制得S1/MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme纳米复合材料;将得到的上述材料放入1mL、0.10mol·L-1、pH=7.4、含有0.1mol·L-1KCl的PBS溶液中,黑暗条件、4℃储存备用。
(3)将金电极先后用0.5μm和0.03μm的Al2O3粉末打磨成镜面,然后用去离子水清洗,再依次置于去离子水和乙醇中超声40s;处理完成后,用0.5mol·L-1的浓硫酸对电极进行循环伏安法活化,直到产生稳定的循环伏安扫描图,扫描电压为0.30V,扫速为0.1Vmol·s-1;最后用去离子水冲洗,室温晾干;用移液枪取4μL、1μmol·L-1的TS前体(碱基序列为SH-5’-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3’,如序列表中SEQIDNO.2所示)滴到金电极表面,室温静置一夜,然后用PBS溶液冲洗,最后室温干燥。
(4)分别将1、5、10、50、100、200、500、1000、2000、5000个人早幼粒白血病细胞离心(10000rpm,5min)、用5mLPBS溶液清洗两次,加入200μL细胞裂解液(10mmol·L-1、pH=7.5的Tris–HCl,1mmol·L-1MgCl2溶液,1mmol·L-1EGTA,0.1mmol·L-1苯甲脒,5mmol·L-1β-巯基乙醇,0.5%CHAPS,10%甘油),冰浴1h,4℃离心(20000rpm,15min),取上清液,-80℃保存;取4μL该上清液与6μLDNA链延长原料缓冲液(20mmol·L-1、pH=8.3的Tris–HCl,1.5mmol·L-1MgCl2溶液,1mmol·L-1EGTA,63mmol·L-1KCl溶液,0.05%Tween20,0.2mmol·L-1dATP,0.2mmol·L-1dGTP,0.2mmol·L-1dTTP)混合,并用移液枪吸取滴到金电极表面,30℃下反应2h,形成S2(碱基序列为5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’,如序列表中SEQIDNO.3所示),用pH=8.3的Tris–HCl清洗液冲洗,晾干;同时做对比试验,将端粒酶提取液在95℃灭活10min,其余步骤同前。
(5)用移液枪吸取4μLS1/MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme溶液滴到以上处理过的金电极表面,30℃下静置12h,然后用PBS溶液冲洗,晾干。
(6)将以上步骤处理过的金电极作为工作电极,与甘汞参比电极、Pt对比电极连接到电化学工作站,共同构成能检测端粒酶活性的电化学传感器。并将工作电极浸入35μL催化反应溶液中(含有3.2mmol·L-1ABTS、3.2mmol·L-1H2O2,0.1mol·L-1Tris-HCl,pH=8.3,20mmol·L-1MgCl2),用循环伏安法测其电流响应,并根据不同细胞数量绘制工作曲线。
对端粒酶活性检测结果显示,该电化学传感器的线性方程为y=8.641×10-11x+7.956×10-8,其中,y代表电流响应值,x代表细胞数量。最低可检测到1个/200μL人早幼粒白血病细胞,且响应速度快。因此可确定本发明对基于G-四联体/DNAzyme的检测端粒酶活性的电化学传感器的检测性能灵敏、快速、有效。
实施例2:实际样品的测定
(1)电化学传感器的制备和工作曲线的绘制同实施例1.
(2)取一定量的Hela细胞(人类宫颈癌细胞)样品进行离心(10000rpm,5min)、用5mLPBS溶液清洗两次,加入200μL细胞裂解液(10mmol·L-1、pH=7.5的Tris–HCl,1mmol·L-1MgCl2溶液,1mmol·L-1EGTA,0.1mmol·L-1苯甲脒,5mmol·L-1β-巯基乙醇,0.5%CHAPS,10%甘油),冰浴1h,4℃离心(20000rpm,15min),取上清液,-80℃保存;取4μL该上清液与6μLDNA链延长原料缓冲液(20mmol·L-1、pH=8.3的Tris–HCl,1.5mmol·L-1MgCl2溶液,1mmol·L-1EGTA,63mmol·L-1KCl溶液,0.05%Tween20,0.2mmol·L-1dATP,0.2mmol·L-1dGTP,0.2mmol·L-1dTTP)混合,并用移液枪吸取滴到金电极表面,30℃下反应2h,形成S2(碱基序列为5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’,如序列表中SEQIDNO.3所示),用pH=8.3的Tris–HCl清洗液冲洗,晾干。
(3)用移液枪吸取4μLS1/MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme溶液滴到以上处理过的金电极表面,30℃下静置12h,然后用PBS溶液冲洗,晾干。
(4)将以上步骤处理过的金电极作为工作电极,与甘汞参比电极、Pt对比电极连接到电化学工作站,将工作电极浸入35μL催化反应溶液中(含有3.2mmol·L-1ABTS、3.2mmol·L-1H2O2,0.1mol·L-1Tris-HCl,pH=8.3,20mmol·L-1MgCl2),用循环伏安法测其电流响应,并根据实施例1绘制的工作曲线确定癌细胞含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将二硫化钼粉末溶于有机溶剂中,超声剥离后静置,收集上层分散液,得到MoS2的纳米片分散液,取MoS2纳米片分散液与硫堇溶液混合,超声,制得MoS2-Thi纳米复合材料;
(2)超声条件下将胶体金溶液逐滴滴入二氧化硅溶液中反应10-20分钟,得到AuSiO2纳米复合材料溶液;
(3)将步骤(1)的MoS2-Thi纳米复合材料加入到步骤(2)的AuSiO2纳米复合材料溶液中,室温搅拌反应20-28小时,制得MoS2-Thi-AuSiO2纳米复合材料;
(4)设计一条临近5’端富含鸟嘌呤脱氧核苷酸的DNA链S1,并将5’端硫醇化,使得DNA链S1通过金-硫键修饰到MoS2-Thi-AuSiO2表面;加入Hemin,使得富G部分形成G-四联体/DNAzyme,制得S1/MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme纳米复合材料;
(5)将金电极打磨抛光,并将TS前体通过金-硫键修饰到金电极表面,利用端粒酶将其延伸成富G结构的DNA链S2,并与S1临近3’端非富G部分互补结合;
(6)将步骤(5)处理过的金电极作为工作电极,与甘汞参比电极、Pt对比电极连接到电化学工作站,共同构成能检测端粒酶活性的电化学传感器。
2.如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述有机溶剂为N-甲基-2-吡咯烷酮、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇、二甲基亚砜、或二甲基甲酰胺。
3.如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,MoS2的纳米片分散液的质量浓度为20mg·L-1,硫堇溶液的摩尔浓度为1mmol·L-1;MoS2的纳米片分散液与硫堇溶液加入量的体积比为1:1。
4.如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述胶体金溶液与二氧化硅溶液的体积比为1:7。
5.如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述MoS2-Thi纳米复合材料与AuSiO2纳米复合材料加入的体积比为1:10。
6.如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,所述DNA链S1的碱基序列为:
5’-TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCCCTAACCCTAACCCTAA-3’;
所述DNA链S1的浓度为1μmol·L-1。
7.如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,所述TS前体的碱基序列为:
SH-5’-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3’;
所述TS前体浓度为1μmol/L。
8.如权利要求1所述的用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(5)中,所述DNA链S2的碱基序列为:
5’-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’。
9.权利要求1至8任一项的制备方法制备得到的用于检测端粒酶活性的电化学传感器。
10.采用权利要求9所述的电化学传感器检测端粒酶活性的方法,其特征在于,步骤为:取待测癌细胞样品,提取端粒酶,与DNA链延长原料缓冲液混合,滴到电化学传感器的金电极表面,30℃下反应2h,形成S2,冲洗,晾干;吸取S1/MoS2-Thi-AuSiO2/DNAzyme溶液滴到金电极表面,静置,冲洗,晾干;将处理过的金电极作为工作电极,与甘汞参比电极、Pt对比电极连接到电化学工作站,并将工作电极浸入催化反应溶液中,用循环伏安法测其电流响应,根据绘制的标准曲线确定癌细胞的含量。
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WO2003011768A2 (en) * | 2001-08-01 | 2003-02-13 | Datascope Investment Corp. | Microfluidic device for molecular analysis |
CN102260739A (zh) * | 2011-06-30 | 2011-11-30 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种端粒酶活性的检测方法 |
CN102443631A (zh) * | 2011-11-13 | 2012-05-09 | 浙江理工大学 | 植物端粒酶活性的检测方法 |
CN104263725A (zh) * | 2014-09-19 | 2015-01-07 | 上海市计量测试技术研究院 | 塔尖四面体dna纳米结构探针及端粒酶电化学检测 |
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- 2015-06-19 CN CN201510346698.7A patent/CN104897756B/zh active Active
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