CN105486737B - 一种中空硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器及其制备方法与应用 - Google Patents

一种中空硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种中空硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器及其制备方法与应用，玻碳电极表面涂有敏感膜为中空的硫化钼立方体纳米材料和金纳米材料。采用的检测底液为含有三羧基甲基磷脂和二茂铁甲醇的混合溶液。本发明制备得到的中空的硫化钼立方体纳米材料，具有比表面积大、分散性好等优点，电沉积纳米金后，结合两者的优点，可显著提高电极的有效面积、导电性和稳定性，是一种优良的生物传感器的电极材料，结合信号放大技术检测miRNA具有灵敏度高、选择性好、重现性好以及绿色环保等优点。利于该传感器用于miRNA检测，检出限可达0.16 fmol/L（S/N=3）。

Description

一种中空硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器及其制 备方法与应用
技术领域
本发明涉及材料科学和分析化学领域，具体为一种中空的硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器及其制备方法和在MicroRNA检测方面的应用。
背景技术
电化学生物传感器是以生物活性物质为敏感基元，以电化学电极为信号转换器，对检测前后电势、电流或电容的变化加以测量的传感器。电化学生物传感技术因操作简单、选择性好、灵敏度高等优点而受到生物界和化学界研究者的广泛关注。
MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸，它在基因表达调控过程中起着重要的作用。近年来研究发现，一些重大疾病如癌症、病毒感染、肿瘤等都与miRNA有关。由于miRNA是小分子蛋白质，因此提高miRNA的检测灵敏度、选择性和稳定性研究仍然是一个很棘手的问题。
近年来，类石墨的层状过渡金属二硫化物纳米材料逐渐引起了人们的注意。硫化钼（MoS2）是过渡金属二硫化物的典型代表，具有和石墨类似的结构，由三个原子层（S-Mo-S）通过范德华力堆积而成，具有比表面积大、分散性好等特点。MoS2暴露在晶体表面的硫原子对金属尤其是一些贵金属具有很强的吸附作用。中空的立方体纳米材料MoS2具有比片层MoS2更大的比表面积，因此，中空的立方体纳米材料MoS2用于新型的电化学生物传感器的构建有望显著提高其灵敏度。金纳米粒子（AuNPs）具有比表面积大，导电性好、生物兼容性好等特点，在电化学生物传感器的应用中起到了重要的作用。
因此，结合中空的MoS2立方体纳米材料大的比面积与AuNPs优良的导电性能构建新型的电化学生物传感器，结合信号放大技术用于miRNA的灵敏检测，在疾病的临床诊断等方面具有较好的应用前景。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足，本发明提供了一种能高灵敏、高选择性的检测miRNA的电化学生物传感器的制备方法，使用中空的硫化钼立方体纳米材料和金纳米为电极敏感材料。
本发明的目的是这样实现的：
一种中空硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器，玻碳电极表面涂有敏感膜为中空的硫化钼立方体纳米材料和金纳米材料；
所述的中空的硫化钼立方体纳米材的制备方法，具体步骤如下：
（1）将5~10 mM MnSO4 . H2O、50~100 mM乙醇加入500~1000 mL三次蒸馏水中经超声分散得到混合分散液；
（2）将80~100 mM NH4HCO3加入500~1000 mL三次蒸馏水中经超声分散得到NH4HCO3分散液，随后加到上述步骤（1）的混合液中，在30~60℃下加热搅拌5~10 h；溶液自然冷却到室温，将得到的白色MnCO3沉淀离心、洗涤、干燥；
（3）称取0.1~0.5 g MnCO3分散在20~70 mL的三次蒸馏水中，并超声20~60 min；
（4）称取0.5~1.0 g Na2MoO4 . 2H2O加入上述步骤（4）的混合液中，并超声5~10min，随后加入2.1~3.0 g的L-半胱氨酸，再超声5~10 min，用三次蒸馏水稀释到80 mL，转移至反应釜中进行水热反应，反应温度为150~200 ℃，反应时间为12~30 h。反应结束后，自然冷却到室温，离心、洗涤、干燥，得到黑色的MnS@MoS2固体；
（5）称取40~100 mg 的MnS@MoS2固体分散在20~50 mL（0.5~1 mol/L）的盐酸溶液中，在室温下搅拌12~48 h去除MnS，经离心、洗涤、干燥，得到黑色的MoS2固体。
所述步骤（1）（2）（4）中超声的频率为53 kHz。
所述步骤（2）（5）中洗涤为分别用三次蒸馏水和乙醇洗涤三次。
所述步骤（2）（5）中干燥为真空干燥，温度为50~80 ℃，干燥时间为12~24 h。
所述的以中空的硫化钼立方体纳米材料为电极敏感材料制备信号放大型生物传感器检测miRNA的方法，具体步骤如下：
（1）称取0.5~1.5 mg MoS2超声分散于1~2.5 mL 水中，取4~10 µL该溶液涂滴于打磨好的玻碳电极表面，自然晾干；
（2）将修饰好的电极于0.1 %~1% HAuCl4 (含0.1~0.5 mol/L KNO3) 溶液中电沉积纳米金20~60 s；
（3）取4~10 µL 5.0 × 10-9 mol/L 巯基修饰的一端带有生物素的probe DNA 涂滴于电极表面，室温反应6~12 h，将其通过Au-S键固定于电极表面；
（4）用三次蒸馏水冲洗掉电极表面过量的probe DNA，将4~8 µL 0.5~1.5 m mol/L的巯基己醇（MCH）和 4~8 µL 0.5%~2 % 的牛血清白蛋白（BSA）分别涂滴于电极表面，放置15~35 min，用于除去非特异性吸附；
（5）用三次蒸馏水冲洗电极表面，随后，于电极表面滴加不同浓度的MiRNA，50~80℃水浴中孵育40~75 min；
（6）用三次蒸馏水冲洗电极表面，然后将电极浸入20 µL （5~10 m mol/L）的 Tris缓冲溶液（含0.1~0.8 m mol/L抗坏血酸磷酸酯和 0.5~1.5 mmol/L MgCl2）中20~60 min；
（7）在电极表面滴加4~10 µL，0.5~1.5 mg/mL的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素（SA-ALP）放置15~50 min，最后将电极置于含有2.5~5 mmol/L三羧基甲基磷脂（TCEP）和0.5~3 mmol/L的二茂铁甲醇溶液中检测电化学信号。
所述步骤（1）中超声的频率为53 kHz。
积极有益效果：
（1）本发明采用的中空的硫化钼立方体纳米材料和纳米金相结合作为电极的敏感材料，显著提高了电极的有效面积和导电性能，可有效提高传感器的灵敏度和降低方法的检出限；（2）制备材料为全固态的，不含对人体有毒的、污染环境的无机纳米材料；（3）本发明的方法制备得到的生物传感器结合信号放大技术检测miRNA，具有灵敏度高和选择性好的优点；（4）本发明制备的传感器具有灵敏度高、选择性好、稳定性好、成本低廉、绿色环保等优点。
附图说明
图1 为制备的MnCO3立方体的扫描电镜（SEM）图；
图2为制备的中空的硫化钼立方体纳米材料的SEM图；
图3 A是Q-t的线性图；B是Q-t1/2线性方程的斜率，其中a为裸玻碳电极（GCE），b为GCE上修饰了硫化钼和金纳米；
图4为不同浓度miRNA的差分脉冲伏安图。从a到j对应的miRNA的浓度分别是0，1.0×10-16，1.0×10-15，1.0×10-14，5.0×10-13，1.0×10-13， 5.0×10-12，1.0×10-12，1.0×10-11，1.0×10-10 mol/L，插图是峰电流和miRNA的浓度的负对数之间的线性关系。
具体实施方式
下面结合附图具体实施例，对本发明做进一步的说明：
一种中空硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器，玻碳电极表面涂有敏感膜为中空的硫化钼立方体纳米材料和金纳米材料；
所述的中空的硫化钼立方体纳米材的制备方法，具体步骤如下：
（1）将5~10 mM MnSO4 . H2O、50~100 mM乙醇加入500~1000 mL三次蒸馏水中经超声分散得到混合分散液；
（2）将80~100 mM NH4HCO3加入500~1000 mL三次蒸馏水中经超声分散得到NH4HCO3分散液，随后加到上述步骤（1）的混合液中，在30~60℃下加热搅拌5~10 h；
（3）溶液自然冷却到室温，将得到的白色MnCO3沉淀离心、洗涤、干燥；
（4）称取0.1~0.5 g MnCO3分散在20~70 mL的三次蒸馏水中，并超声20~60 min；
（5）称取0.5~1.0 g Na2MoO4 . 2H2O加入上述步骤（4）的混合液中，并超声5~10min，随后加入2.1~3.0 g的L-半胱氨酸，再超声5~10 min，用三次蒸馏水稀释到80 mL，转移至反应釜中进行水热反应，反应温度为150~200 ℃，反应时间为12~30 h。反应结束后，自然冷却到室温，离心、洗涤、干燥，得到黑色的MnS@MoS2固体；
（6）称取40~100 mg 的MnS@MoS2固体分散在20~50 mL（0.5~1 mol/L）的盐酸溶液中，在室温下搅拌12~48 h去除MnS，经离心、洗涤、干燥，得到黑色的MoS2固体。
所述步骤（1）（2）（4）中超声的频率为53 kHz。
所述步骤（2）（5）中洗涤为分别用三次蒸馏水和乙醇洗涤三次。
所述步骤（2）（5）中干燥为真空干燥，温度为50~80 ℃，干燥时间为12~24 h。
所述的以中空的硫化钼立方体纳米材料为电极敏感材料制备信号放大型生物传感器检测miRNA的方法，具体步骤如下：
（1）称取0.5~1.5 mg MoS2超声分散于1~2.5 mL 水中，取4~10 µL该溶液涂滴于打磨好的玻碳电极表面，自然晾干；
（2）将修饰好的电极于0.1 %~1% HAuCl4 (含0.1~0.5 mol/L KNO3) 溶液中电沉积纳米金20~60 s；
（3）取4~10 µL 5.0 × 10-9 mol/L 巯基修饰的一端带有生物素的probe DNA 涂滴于电极表面，室温反应6~12 h，将其通过Au-S键固定于电极表面；
（4）用三次蒸馏水冲洗掉电极表面过量的probe DNA，将4~8 µL 0.5~1.5 m mol/L的巯基己醇（MCH）和 4~8 µL 0.5%~2 % 的牛血清白蛋白（BSA）分别涂滴于电极表面，放置15~35 min，用于除去非特异性吸附；
（5）用三次蒸馏水冲洗电极表面，随后，于电极表面滴加不同浓度的MiRNA，50~80℃水浴中孵育40~75 min；
（6）用三次蒸馏水冲洗电极表面，然后将电极浸入20 µL （5~10 m mol/L）的 Tris缓冲溶液（含0.1~0.8 m mol/L抗坏血酸磷酸酯和 0.5~1.5 mmol/L MgCl2）中20~60 min；
（7）在电极表面滴加4~10 µL，0.5~1.5 mg/mL的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素（SA-ALP）放置15~50 min，最后将电极置于含有2.5~5 mmol/L三羧基甲基磷脂（TCEP）和0.5~3 mmol/L的二茂铁甲醇溶液中检测电化学信号。
所述步骤（1）中超声的频率为53 kHz。
实施例1
（1）制备中空的硫化钼立方体纳米材料
称取6 mmol/L MnSO4 . H2O、80 mL乙醇加入600 mL三次蒸馏水中经超声分散得到混合分散液；将90 mmol/L NH4HCO3加入600 mL三次蒸馏水中经超声分散得到NH4HCO3分散液，随后加入上述的混合液中，在40℃下搅拌加热6 h；然后自然冷却到室温，将得到的白色MnCO3沉淀离心、洗涤、干燥。称取0.2 g MnCO3分散在30 mL的三次蒸馏水中，并超声50 min，加入0.8 gNa2MoO4 . 2H2O，并超声6 min，随后加入2.8 g的L-半胱氨酸，再超声5 min，用三次蒸馏水稀释到80 mL，转移至反应釜中进行水热反应，反应温度为150 ℃，反应时间为12h。反应结束后，自然冷却到室温，离心、洗涤、干燥，得到黑色的MnS@MoS2固体。称取40 mg的MnS@MoS2固体分散在20 mL、0.5 mol/L的HCl中，在室温下搅拌12 h去除MnS，经离心、洗涤、干燥，得到黑色的MoS2固体。
（2）制备以中空的硫化钼立方体和金纳米为电极敏感材料的电化学生物传感器及结合信号放大技术建立检测miRNA的方法。
称取0.5 mg MoS2超声分散于1 mL 水中，取4 µL该溶液涂滴于打磨好的玻碳电极表面，自然晾干；将修饰好的电极于0.5 % HAuCl4 (含0.4 mol/L KNO3) 溶液中电沉积纳米金30 s；取5 µL 5.0 × 10-9 mol/L 巯基修饰的一端带有生物素的probe DNA 涂滴于电极表面，室温反应8 h，将其通过Au-S键固定于电极表面；用三次蒸馏水冲洗掉电极表面过量的probe DNA，将4 µL，0.6 mmol/L的MCH和 7 µL 0.5%的BSA分别涂滴于电极表面20 min，用于除去非特异性吸附；用三次蒸馏水冲洗掉电极表面，随后，于电极表面滴加不同浓度的MiRNA，55℃水浴中孵育45 min；用三次蒸馏水冲洗电极表面，然后将电极浸入20 µL，6mmol/L的Tris缓冲溶液（含0.2 mmol/L抗坏血酸磷酸酯和 0.6 mmol/L MgCl2）中20 min；随后在电极表面滴加4 µL，0.8 mg/mL的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素（SA-ALP）20 min,最后在含有3 mmol/L三羧基甲基磷脂（TCEP）和0.6 mmol/L二茂铁甲醇溶液的底液中检测电化学信号。
如图1所示，制得均匀的MnCO3立方体纳米材料。
如图2所示，制得中空的MoS2立方体纳米材料。
如图3所示，修饰中空的MoS2立方体后的电极，由于比表面积增大，可固定更多的纳米金，进而固定更多的信号物质，显著提高了电化学响应信号，从而提高了传感器的灵敏度。
如图4所示，为该传感器对不同浓度的miRNA的DPV响应，在（a~j） 0~1.0×10-16mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为 0.16 fmol/L（S/N=3）。
实施例2
（1）制备中空的硫化钼立方体纳米材料
称取9 mmol/L MnSO4 . H2O、50 mL乙醇加入800 mL三次蒸馏水中经超声分散得到混合分散液；将80 mmol/L NH4HCO3加入500 mL三次蒸馏水中经超声分散得到NH4HCO3分散液，随后加入上述的混合液中，在50℃下搅拌加热7 h；待反应结束后，自然冷却到室温，将白色MnCO3沉淀离心、洗涤、干燥。称取0.3 g MnCO3分散在50 mL的三次蒸馏水中，并超声40min，加入0.85 g Na2MoO4 . 2H2O，并超声7 min，随后加入2.1 g的L-半胱氨酸，再超声6min，用三次蒸馏水稀释到80 mL，转移至反应釜中进行水热反应，反应温度为170 ℃，反应时间为20 h。反应结束后，自然冷却到室温，离心、洗涤、干燥，得到黑色的MnS@MoS2固体。称取55 mg 的MnS@MoS2固体分散在30 mL，1.2 mol/L的HCl中，在室温下搅拌20 h去除MnS，经离心、洗涤、干燥，得到黑色的MoS2固体。
（2）制备以中空的硫化钼立方体和金纳米为电极敏感材料的电化学生物传感器及结合信号放大技术建立检测miRNA的方法。
称取1 mg MoS2超声分散于1.5 mL 水中，取5 µL该溶液涂滴于打磨好的玻碳电极表面，自然晾干；将修饰好的电极于0.8 % HAuCl4 (含0.2 mol/L KNO3) 溶液中电沉积纳米金40 s；取7 µL 5.0 × 10-9 mol/L 巯基修饰的一端带有生物素的probe DNA 涂滴于电极表面，室温反应10 h，将其通过Au-S键固定于电极表面；用三次蒸馏水冲洗电极表面过量的probe DNA，将4 µL，0.8 mmol/L的MCH和 6 µL 0.8%的BSA分别涂滴于电极表面25 min，用于除去非特异性吸附；用三次蒸馏水冲洗掉电极表面，随后，于电极表面滴加不同浓度的MiRNA，50℃水浴中孵育55 min；用三次蒸馏水冲洗电极表面，然后将电极浸入20 µL，7mmol/L的Tris缓冲溶液（含0.3 mmol/L抗坏血酸磷酸酯和 0.7 mmol/L MgCl2）中40 min；随后在电极表面滴加5 µL，0.9 mg/mL的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素（SA-ALP）并放置30min，最后在含有3.2 mmol/L三羧基甲基磷脂（TCEP）和1.5 mmol/L的二茂铁甲醇溶液的底液中检测电化学信号。
实施例3
（1）制备中空的硫化钼立方体纳米材料
称取8 mmol/L MnSO4 . H2O、85 mmol/L乙醇加入650 mL三次蒸馏水中经超声分散得到混合分散液；将90 mmol/L NH4HCO3加入950 mL三次蒸馏水中经超声分散得到NH4HCO3分散液，随后加入上述的混合液中，在45℃下搅拌加热7 h；待反应结束后，自然冷却到室温，将白色MnCO3沉淀离心、洗涤、干燥。称取0.25 g MnCO3分散在35 mL的三次蒸馏水中，并超声55 min，加入0.75 gNa2MoO4 . 2H2O，并超声9 min，随后加入2.4 g的L-半胱氨酸，再超声6 min，用三次蒸馏水稀释到80 mL，转移至反应釜中进行水热反应，反应温度为165 ℃，反应时间为26 h。反应结束后，自然冷却到室温，离心、洗涤、干燥，得到黑色的MnS@MoS2固体。称取60 mg 的MnS@MoS2固体分散在35 mL，0.9 mol/L的HCl中，在室温下搅拌18 h去除MnS，经离心、洗涤、干燥，得到黑色的MoS2固体。
（2）制备以中空的硫化钼立方体和金纳米为电极敏感材料的电化学生物传感器及结合信号放大技术建立检测miRNA的方法。
称取1 mg MoS2超声分散于2 mL 水中，取8 µL该溶液涂滴于打磨好的玻碳电极表面，自然晾干；将修饰好的电极于0.8 % HAuCl4 (含0.6 mol/L KNO3) 溶液中电沉积纳米金35 s；取5 µL 5.0 × 10-9 mol/L 巯基修饰的一端带有生物素的probe DNA 涂滴于电极表面，室温反应10 h，将其通过Au-S键固定于电极表面；用三次蒸馏水冲洗电极表面过量的probe DNA，将7 µL，0.55 mmol/L的MCH和 5 µL 0.6%的BSA分别涂滴于电极表面24 min，用于除去非特异性吸附；用三次蒸馏水冲洗掉电极表面，随后，于电极表面滴加不同浓度的MiRNA，70℃水浴中孵育60 min；用三次蒸馏水冲洗电极表面，然后将电极浸入20 µL，6.5mmol/L的Tris缓冲溶液（含0.6 mmol/L抗坏血酸磷酸酯和 0.55 mmol/L MgCl2）中30 min；随后在电极表面滴加6 µL，0.75 mg/mL的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素（SA-ALP）并放置25min,最后在含有3.6 mmol/L三羧基甲基磷脂（TCEP）和1.5 mmol/L的二茂铁甲醇溶液的底液中检测电化学信号。
本发明首先以MnSO4 . H2O和NH4HCO3为原料制备MnCO3立方体模板，随后加入L-半胱氨酸进行水热反应制备MnS@MoS2固体，用HCl去除MnS后制得中空硫化钼立方体。再将MoS2分散液涂滴于玻碳电极表面，电沉积上纳米金，再修饰上probe DNA和碱性磷酸酶后制得电化学传感器。采用的检测底液为含有三羧基甲基磷脂和二茂铁甲醇的混合溶液。制备得到的中空的硫化钼立方体纳米材料，具有比表面积大、分散性好等优点，电沉积纳米金后，结合两者的优点，可显著提高电极的有效面积、导电性和稳定性，是一种优良的生物传感器的电极材料；本发明制备得到的生物传感器结合信号放大技术检测miRNA具有灵敏度高、选择性好等优点，有望用于一些重大疾病的检测；本发明的制备方法简单快速、灵敏度高、选择性好、成本低廉、绿色环保。
上述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。值得注意的是，在阅读了本发明的内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一种中空硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器，其特征在于：玻碳电极表面涂有敏感膜为中空的硫化钼立方体纳米材料和金纳米材料；
所述的中空的硫化钼立方体纳米材料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将5~10 mmol/L MnSO4 . H2O和50~100 mmol/乙醇加入500~1000 mL三次蒸馏水中经超声分散得到混合分散液；
（2）将80~100 mmol/L NH4HCO3加入500~1000 mL三次蒸馏水中经超声分散得到NH4HCO3分散液，随后加入上述步骤（1）的混合液中，在30~60℃下搅拌加热5~10 h；待反应结束后，自然冷却到室温，将白色MnCO3沉淀离心、洗涤、干燥；
（3）称取0.1~0.5 g MnCO3分散在20~70 mL的三次蒸馏水中，并超声20~60 min；
（4）称取0.5~1.0 g Na2MoO4 . 2H2O加入上述步骤（3）的混合液中，并超声5~10 min，随后加入2.1~3.0 g的L-半胱氨酸，超声5~10 min，用三次蒸馏水稀释到80 mL，转移至反应釜中进行水热反应，反应温度为150~200 ℃，反应时间为12~30 h，反应结束后，自然冷却到室温，离心、洗涤、干燥，得到黑色的MnS@MoS2固体；
（5）称取40~100 mg 的MnS@MoS2固体分散在20~50 mL，0.5~1.0 mol/L的HCl中，在室温下搅拌12~48 h去除MnS，经离心、洗涤、干燥，得到黑色的MoS2固体。
2.根据权利要求1一种中空硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器，其特征在于：
所述步骤（1）、步骤（2）和步骤（4）中超声的频率为53 kHz；
所述步骤（2）和步骤（5）中洗涤为分别用三次蒸馏水和乙醇洗涤三次；
所述步骤（2）和步骤（5）中干燥为真空干燥，温度为50~80 ℃，干燥时间为12~24 h。
3.如权利要求1所述的一种中空硫化钼立方体纳米电化学信号放大型传感器用于miRNA检测的方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）取0.5~1.5 mg MoS2超声分散于1~2.5 mL 水中，取4~10 µL该溶液涂滴于打磨好的玻碳电极表面，自然晾干；
（2）将修饰好的电极于含0.1~0.5 M KNO3点0.1 %~1% HAuCl4溶液中电沉积纳米金20~60s；
（3）取4~10 µL 5.0 × 10-9 mol/L巯基修饰的一端带有生物素的probe DNA 涂滴于电极表面，室温反应6~12 h；
（4）用三次蒸馏水冲洗电极表面过量的probe DNA，将4~8 µL，0.5~1.5 mmol/L的MCH和4~8 µL 0.5%~2 % 的BSA分别涂滴于电极表面15~35 min，用于除去非特异性吸附；
（5）用三次蒸馏水冲洗电极表面，随后，于电极表面滴加不同浓度的MiRNA，50~80 ℃水浴中孵育40~75 min；
（6）用三次蒸馏水冲洗电极表面，然后将电极浸入20 µL，5~10mmol/L的Tris缓冲溶液中20~60 min；所述的Tris缓冲溶液含0.1~0.8 mmol/L抗坏血酸磷酸酯和 0.5~1.5 mmol/LMgCl2；
（7）在电极表面滴加4~10 µL，0.5~1.5 mg/mL的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素（SA-ALP）并放置15~50 min，最后在含有2.5~5 mmol/L的三羧基甲基磷脂（TCEP）和0.5~3 mmol/L的二茂铁甲醇溶液的底液中检测电化学信号。
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