CN105004775A - 二硫化物点/纳米片复合物dna电化学探针的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及二硫化物点/纳米片复合物DNA电化学探针的制备方法。该方法具体包括以下步骤：1)将过渡金属二硫化物粉末超声剥离，高温电磁搅拌后制得过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物，于硫堇与离子液体的分散液中超声，制得硫堇功能化的复合物；2)将制得的复合物分散于有机溶剂中，制成悬浮液滴涂到电极上，干燥后得到复合物修饰电极；3)将上述制备电极构成的三电极体系，在缓冲溶液中进行电化学测试，注入不同浓度的DNA溶液进行测试，记录电极表面电化学信号变化，构建DNA电化学探针体系。本发明探针具有灵敏度高、稳定性好、线性范围宽、检测极限低等优点，可用于血清中DNA的检测，在生物分析和临床诊断领域具有广阔的应用前景。

Description

二硫化物点/纳米片复合物DNA电化学探针的制备方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及二硫化物点/纳米片复合物DNA电化学探针的制备方法。

背景技术

脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，缩写DNA)是所有生物的基本遗传物质，DNA检测在医学诊断、生物工程及环境保护等领域扮演者至关重要的角色。DNA电化学生物探针作为一种新型的检测手段，具有所需仪器简单、检测快速且灵敏等诸多优点，相关技术发展十分迅速。近年来，纳米科学与技术的发展日新月异，这为发展新型、高灵敏度、高稳定性、低成本及安全性好的生物探针提供了新的有效途径。目前，基于金纳米粒子、碳纳米管、石墨烯等纳米材料的DNA生物探针已有文献报道。

二维层状结构过渡金属二硫化物具有优异的物理和化学性质，已在晶体管、催化、光检测器、锂离子电池和能量存储等领域得到应用。过渡金属二硫化物独特的电化学性能，较大的比表面积，以及潜在的表面修饰，预示了在生物传感和检测领域中巨大的应用潜力。通过物理或化学剪切二维层状结构过渡金属二硫化物的方法，可制得零维过渡金属二硫化物量子点。与纳米片相比，过渡金属二硫化物量子点具有更高的比表面积和更多的边缘活性位点，在电化学传感及催化方面具有广泛的应用前景。此外，量子点的发光特性可能使过渡金属二硫属化物成为在生物医学和光成像领域有前景的材料。

专利(申请公布号CN 101846648A)公开了一种石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器及其制备方法，电极上修饰单链DNA与目标单链DNA之间互补配对作用，可引起显著的电化学信号变化，便能起到快速检测目标单链DNA的目的。专利(申请公布号CN 104201357A)公开了一种石墨烯量子点-石墨烯复合材料及其制备方法与用途，制备在高于大气压的反应压力下和有机溶剂中进行，所制得的石墨烯量子点-石墨烯复合材料制成的氧还原电极具有优异的电化学性能，可应用于燃料电池领域。

Hua Zhang等通过锂离子插层法制备过渡金属二硫化物纳米片，采用制得的MoS₂，TiS₂和TaS₂纳米片作为传感平台，来灵敏地和选择性地检测DNA。染料标记的单链DNA探针通过范德华力吸附在纳米片的基面上，造成染料的荧光淬灭。与此相反，在单链DNA探针与其互补的靶DNA复合后，形成双链DNA，由于该双链DNA带负电荷的磷酸盐骨架的密集有效地屏蔽了碱基。因此，形成的双链DNA和纳米片之间的作用力变弱，染料标记的探针离开纳米片表面，从而导致染料的荧光恢复。其结果是，通过探针的荧光强度来定量检测靶DNA。(Ying Zhang,Bing Zheng,Changfeng Zhu,Xiao Zhang,ChaoliangTan,Hai Li,Bo Chen,JianYang,Junze Chen,Ying Huang,Lianhui Wang,*and Hua Zhang*,Single-Layer Transition MetalDichalcogenide Nanosheet-Based Nanosensors for Rapid,Sensitive,and Multiplexed Detection ofDNA,Adv.Mater.,2015,27(5):935-9.)。

石墨烯、石墨烯量子点、过渡金属二硫化钼(或二硫化钨)纳米片及其量子点的制备，石墨烯量子点生物探针、过渡金属二硫化物纳米片及其量子点在催化及燃料电池领域的应用已有报道。截至目前，过渡金属二硫化物量子点(尤其是二硫化钛和二硫化钽)在生物传感领域的研究还比较少，同时根据调查发现，过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物作为生物电化学探针尚未见有国内外文献和相关专利的报道。

发明内容

为解决上述问题，利用过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物活性位点丰富且比表面积大，通过静电吸附，硫堇可作为连接该复合物与DNA的桥梁，进而构建新颖的DNA电化学探针。基于此，本发明公开了一种过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物DNA电化学探针及其制备方法。

本发明的目的在于提供一种工艺简单、产率高、生产成本低、绿色环保、易于操作和控制的一种过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物DNA电化学探针及其制备方法。

本发明的机理：在离子液体的作用下，过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物的负电硫边缘与硫堇的正电中心相结合，为硫堇提供电子，引起二硫化物和硫堇之间的相互作用，修饰电极产生较强的氧还原信号；而带正电的硫堇可以与带负电的双链DNA、单链DNA通过静电相互作用相结合，加入DNA后，造成硫堇的氧还原信号降低。因此，可以通过电信号的变化来检测DNA。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现，该方法具体包括以下步骤：

一种二硫化物点/纳米片复合物DNA电化学探针的制备方法，在离子液体的作用下，将过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物溶解于硫堇醋酸盐溶液中，分离提取后，即得硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物，然后以该复合物为电极表面修饰材料，有机溶剂为分散剂，制得DNA电化学探针。

上述方法中，硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物采用如下方法制备：

a)将过渡金属二硫化物粉末溶于有机溶剂中，于20～60℃下超声剥离2～24h，上层液即为过渡金属二硫化物的纳米片分散液；

b)将制备的纳米片分散液于100～150℃下，电磁搅拌5～8h，加入挥发性溶剂静置、分离、干燥，或者直接离心干燥，即得过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物；

c)将该复合物溶于硫堇醋酸盐与离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的混合液中，超声后，与b)相同的方法提取，即得硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物。

优选的是，步骤a)中，所述二硫化物与有机溶剂的质量比为5:1～20:1。

优选的是，步骤a)中，所述过渡金属二硫化物为二硫化钼、二硫化钨、二硫化钛或二硫化钽，有机溶剂为N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇或二甲基亚砜。

优选的是，步骤b)中，所述挥发性溶剂为氯仿、丙酮、环己烷或正己烷。

优选的是，步骤c)中，所述混合液中硫堇醋酸盐与离子液体质量比为5:1～20:1，复合物与硫堇醋酸盐的质量比0.5:1～2:1。作为一种阳离子吩噻嗪染料，硫堇具有优异的电化学活性。它可以通过静电相互作用与DNA(双链DNA、单链DNA)稳定地结合，导致其自身的氧化还原信号降低。更重要的是，在离子液体作为分散剂的作用下，过渡金属二硫化物零维量子点及其二维纳米片的负电硫边缘能够同时与硫堇的正电中心稳定地结合，为硫堇提供电子。此外，硫堇可以与过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物结合，然后用制得的结合物来修饰电极，以构建DNA电化学探针体系。所述方法中，DNA电化学探针的制备步骤为：

将硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物分散于有机溶剂中，制成一定浓度的溶液，采用滴涂法，制得修饰电极，构建三电极体系，即DNA电化学探针。所述的复合物溶液的浓度为1～10mg·mL^-1；滴涂到电极所需复合物溶液用量为3～20μL，电极为玻碳电极。

优选的是，三电极体系中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，所述的修饰电极为表面修饰有1～6层硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物的玻碳电极。

上述方法制备的二硫化物点/纳米片复合物DNA电化学探针可用于检测DNA浓度。

具体方法如下：将上述制备的修饰电极构成的三电极体系，在N₂饱和的PBS缓冲溶液中进行电化学测试，将不同浓度的DNA溶液分别注射入上述缓冲溶液中，进行电化学测试，拟合电极表面电化学信号变化与DNA浓度间的关系。其中，DNA为双链DNA(dsDNA)或单链(ssDNA)。

与现有技术项目相比，本发明的优点在于：

实现了过渡金属二硫属化物量子点/纳米片复合物在生物传感领域中的应用，基于该复合物建立的DNA电化学探针具有灵敏度高、稳定性好、线性范围宽、检测极限低等优点，可用于人体血清中DNA的高效检测，在生物分析和临床诊断领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1.硫堇功能化过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物及其DNA电化学探针的制备过程示意图

图2.过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物及量子点的紫外吸收光谱表征谱图

图3.铁氰化钾溶液中过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物在的循环伏安曲线性能表征谱图

具体实施方式

硫堇功能化过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物及其DNA电化学探针的制备过程及基理如图1所示，以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。

实施例1

称取200mg二硫化钼粉末分散于10mL有机溶剂N-甲基吡咯烷酮中，超声剥离3h后，将分散液静置10min，收集上层大部分分散液，除去底部未剥离完全的大颗粒，得到单层或几层的二硫化钼纳米片分散液。将此分散液于135℃下剧烈搅拌7h，得到二硫化钼量子点/纳米片的复合物溶液，将丙酮加入到上述复合物溶液中，复合物聚集到溶液顶层，分离、室温干燥，即得二硫化钼量子点/纳米片的复合物。取100mg上述制备的二硫化钼量子点/纳米片的复合物溶于10mg·mL^-1的硫堇醋酸盐与离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的混合液中，在室温下将上述混合物超声3h，采用上述相同的方法进行提纯，即得硫堇功能化的二硫化钼量子点/纳米片的复合物。

将硫堇功能化的二硫化钼量子点/纳米片的复合物分散于N-甲基吡咯烷酮溶液中，制成2mg·mL^-1的溶液，用移液枪移取上述溶液约3.5μL，滴涂到玻碳电极上，空气中干燥；将上述修饰电极与铂电极和饱和甘汞电极一起形成三电极体系，在N₂饱和的0.1mol·L^-1的PBS(0.1mol·L^-1，pH＝7.4)缓冲溶液中进行电化学测试，将不同浓度的dsDNA溶液分射入上述缓冲溶液中，测定电化学响应，拟合电极表面电化学信号的变化与DNA浓度间的关系，构建基于此复合物的DNA电化学探针。

对量子点/纳米片的复合物及量子点进行紫外吸收光谱表征，发现复合物于610nm，670nm处出现由于布里渊区K带引起的激发峰，395nm，450nm处出现由深价带到导带的直接电子转移引起的吸收峰；而量子点在这几处的吸收峰消失，在近紫外区(小于300nm)观察到吸收峰，证明二硫化钼量子点/纳米片复合物已成功制得。对量子点/纳米片复合物修饰电极于铁氰化钾溶液中(0.1mol·L^-1KCl、5.0mmol·L^-1[Fe(CN)₆]^3-/4-)进行了循环伏安曲线性能表征，分析发现，复合物修饰电极的氧还原峰电流明显高于铂碳电极的氧还原峰电流，这是由于剥离的二硫化物纳米片随机堆叠在电极表面增加了电子转移效率，且复合物具有丰富的活性位点和比表面积进一步提升其电化学活性；

通过SWV曲线测定电化学响应性，拟合电极表面电化学信号的变化与DNA浓度间的关系，对线性部分进行分析得到回归方程：i_p(μA)＝8.43-0.31C_DNA(ng·mL^-1)(R＝0.995)，线性范围为0.7ng·mL^-1～4.8ng·mL^-1，灵敏度0.31μA·mL·ng^-1。同时对该电化学探针的实际应用进行了验证，在上述条件不变的情况下，在1μg·mL^-1牛血清蛋白(BSA)存在的情况下，检测dsDNA的浓度从0.7ng·mL^-1到4.8ng·mL^-1，峰电流的变化情况，结果发现灵敏度与没有BSA存在情况下相比，变化并不明显，为0.28μA·mL·ng^-1，牛血清蛋白的干扰不明显。说明本发明探针具有线性范围宽，灵敏度高等优异性能。

实施例2

称取200mg二硫化钛粉末分散于10mL有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，超声剥离6h后，将分散液静置10min，收集上层大部分分散液，除去底部未剥离完全的大颗粒，得到单层或几层的二硫化钛纳米片分散液。将此分散液于125℃下剧烈搅拌8h，得到二硫化钛量子点/纳米片的复合物溶液，将氯仿加入到上述复合物溶液中，复合物聚集到溶液顶层，分离、室温干燥，即得二硫化钛量子点/纳米片的复合物。取200mg上述制备的二硫化钛量子点/纳米片的复合物溶于10mg·mL^-1的硫堇醋酸盐与离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的混合液中，在室温下将上述混合物超声3h，采用上述相同的方法进行提纯，即得硫堇功能化的二硫化钛量子点/纳米片的复合物。

将硫堇功能化的二硫化钛量子点/纳米片的复合物分散于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，制成5mg·mL^-1的溶液，用移液枪移取上述溶液约5μL，滴涂到玻碳电极上，空气中干燥；将上述修饰电极与铂电极和饱和甘汞电极一起形成三电极体系，在N₂饱和的0.1mol·L^-1的PBS(0.1mol·L^-1，pH＝7.4)缓冲溶液中进行电化学测试，将不同浓度的dsDNA溶液分射入上述缓冲溶液中，测定电化学响应，拟合电极表面电化学信号的变化与DNA浓度间的关系，构建基于此复合物的DNA电化学探针。

具体表征及性能测试过程同实施例1。

实施例3

称取200mg二硫化钽粉末分散于10mL有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，超声剥离9h后，将分散液静置10min，收集上层大部分分散液，除去底部未剥离完全的大颗粒，得到单层或几层的二硫化钼纳米片分散液。将此分散液于140℃下剧烈搅拌6h，得到二硫化钽量子点/纳米片的复合物溶液，在转速为8000rpm的离心机中离心6min，室温干燥，即得二硫化钽量子点/纳米片的复合物。取100mg上述制备的二硫化钽量子点/纳米片的复合物溶于10mg·mL^-1的硫堇醋酸盐与离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的混合液中，在室温下将上述混合物超声2h，采用上述相同的方法进行提纯，即得硫堇功能化的二硫化钽量子点/纳米片的复合物；

将硫堇功能化的二硫化钽量子点/纳米片的复合物分散于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，制成2mg·mL^-1的溶液，用移液枪移取上述溶液约5μL，滴涂到玻碳电极上，空气中干燥；将上述修饰电极与铂电极和饱和甘汞电极一起形成三电极体系，在N₂饱和的0.1mol·L^-1的PBS(0.1mol·L^-1，pH＝7.4)缓冲溶液中进行电化学测试，将不同浓度的ssDNA溶液分射入上述缓冲溶液中，测定电化学响应，拟合电极表面电化学信号的变化与DNA浓度间的关系，构建基于此复合物的DNA电化学探针。

具体表征及性能测试过程同实施例1。

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种二硫化物点/纳米片复合物DNA电化学探针的制备方法，其特征在于，在离子液体的作用下，将过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物溶解于硫堇醋酸盐溶液中，分离提取后，即得硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物，然后以该复合物为电极表面修饰材料，有机溶剂为分散剂，制得DNA电化学探针。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物采用如下方法制备：

a)将过渡金属二硫化物粉末溶于有机溶剂中，于20～60℃下超声剥离2～24h，上层液即为过渡金属二硫化物的纳米片分散液；

b)将制备的纳米片分散液于100～150℃下，电磁搅拌5～8h，加入挥发性溶剂静置、分离、干燥，或者直接离心干燥，即得过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物；

c)将该复合物溶于硫堇醋酸盐与离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的混合液中，超声后，与b)相同的方法提取，即得硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述二硫化物与有机溶剂的质量比为5:1～20:1。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述过渡金属二硫化物为二硫化钼、二硫化钨、二硫化钛或二硫化钽，有机溶剂为N-甲基吡咯烷酮、N,N二甲基甲酰胺、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇或二甲基亚砜。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述挥发性溶剂为氯仿、丙酮、环己烷或正己烷。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述硫堇醋酸盐与离子液体的质量比为5:1～20:1，复合物与硫堇醋酸盐的质量比0.5:1～2:1。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA电化学探针的制备步骤为：

将硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片的复合物分散于有机溶剂中，制成一定浓度的溶液，采用滴涂法，制备修饰电极，构建三电极体系，即DNA电化学探针。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，三电极体系中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，所述的修饰电极为表面修饰有1～6层硫堇功能化的过渡金属二硫化物量子点/纳米片复合物的玻碳电极。

9.如权利要求1-8任一所述方法制备的二硫化物点/纳米片复合物DNA电化学探针。

10.权利要求9所述的二硫化物点/纳米片复合物DNA电化学探针在检测DNA浓度中的应用。