CN105969865A - 一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法 - Google Patents

一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域中核酸的检测方法，具体涉及一种基于MoS2传感器及其检测SNPs的方法。本发明的技术方案主要包括：1）制备MoS2；2）制备MoS2‑AuNPs复合物；3）把SYBR Green I插入双链DNA后，物理吸附到MoS2或固定化到MoS2‑AuNPs上；4）测量双链DNA前后的荧光变化，鉴定出SNPs。本发明充分利用MoS2和MoS2‑‑AuNPs淬灭荧光的特性，采用SYBR Green I插入到双链DNA中，通过DNA淬灭前后荧光变化，实现无标记、高灵敏度、快速、低成本地检测SNPs。

Description

一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域中核酸的检测方法，具体为基于二硫化钼（MoS2）物理吸附和二硫化钼-纳米金（MoS2-AuNPs）复合材料传感器固定化的方法，来检测DNA的单核苷酸多态性（SNPs）。
背景技术
单核苷酸多态性 (SNPs) 是核酸序列上单个碱基的差异性变化，这普遍是因为细胞分裂期间的复制错误。大多数的SNPs不会影响表型变异，我们能观察到的，仅仅是一小部分的SNP影响表观遗传的变异。但这一小部分的SNPs对于人类健康而言显得尤为重要。SNP是最常见的基因突变，由于其与许多重大疾病密切相关，如癌症，在人类基因组学与基因测试学中发挥重要的作用。SNPs与个体药物反应息息相关，可被用来预测某些药物的潜在副作用。临床上，检测SNPs已经作为许多疾病检测与早期诊断的有效手段，如女性BRCA1和BRCA2基因突变，其患乳腺癌与宫颈癌的风险大大增高。因此，准确地监控SNP对于疾病的预防、早期诊断及治疗是至关重要的。（Jiahao Huang, Zhenyu Wang, Jang-Kyo Kim,Xuefen Su, Zhigang Li, Detecting Arbitrary DNA Mutations Using Graphene Oxideand Ethidium Bromide, Anal. Chem. 2015, 87,12254−12261.)。
MoS2制备简单，成本比较低，从而在生物检测中得到广泛的应用，而且MoS2在与DNA相互作用时，单链DNA通过π－π效应，能吸附到MoS2表面(Ge, J., Ou, E. C., Yu, Q. R.,Chu, X., 2014. J. Mater. Chem. B 2, 625–628 )。完全配对的DNA、含错配碱基的DNA与SYBR Green I的结合能力不同，前者结合后的荧光强度明显高于后者。而且，MoS2结合双链DNA后，由于荧光共振能量转移（FRET），结合于双链DNA上的SYBR Green I的荧光会被淬灭，但由于错配碱基的存在，使错配与配对的双链DNA间有明显的差别。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明发现了物理吸附到MoS2表面的错配DNA会与MoS2表面结合更紧密，导致其淬灭效率高于配对的DNA。同样， MoS2-AuNPs通过巯基（-SH）结合不同DNA后，由于荧光共振能量转移，插入到双链DNA上的SYBR Green I的荧光会被淬灭，共价结合到MoS2-AuNPs表面的错配DNA会更靠近MoS2表面，导致其淬灭效率高于配对的DNA，该方法有效地提高了检测的准确性。
根据SYBR Green I染料插入的不同双链DNA会显示不同的荧光强度；在染料插入的DNA中加入MoS2，或在染料插入的巯基化DNA中加入MoS2-AuNPs后，不同双链DNA荧光会有不同程度的淬灭，根据荧光强度的变化，从而对SNP进行检测。
一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，利用物理吸附方法，MoS2传感器用于检测SNPs的方法，包括如下步骤：
（1）用SYBR Green I染料插入配对及错配的双链DNA，并测量其荧光强度；
（2）MoS2表面物理吸附DNA，由于FRET，配对及错配的双链DNA荧光强度的淬灭程度不同，根据荧光强度变化不同，检测出SNPs。
其中，所述MoS2是参照Eda的方法制备的，使用前，在水溶液中超声分散。
一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，利用MoS2-AuNPs固定方法，MoS2-AuNPs传感器用于检测SNPs的方法，包括如下步骤：
（1）用SYBR Green I染料插入配对及错配的带有巯基的双链DNA，并测量其荧光强度；
（2）Tween80的修饰：加入10%的Tween80，Tween80通过自组装与MoS2-AuNPs表面相结合；能够缩短巯基标记的DNA与二硫化钼复合金纳米的连接时间, 阻止DNA非特异吸附；
（3）在步骤（1）所得产物中加入步骤（2）所得的产物，70℃水浴加热2.5 h, 离心去上清液，加入PBS溶解为初始总体积；MoS2-AuNPs能够有效淬灭双链DNA中的SYBR GreenI的荧光，测其荧光强度，对比前后荧光强度的变化，从而进行检测SNPs。
其中，步骤（3）中，所述带有巯基的双链DNA的浓度为10 nM；所述MoS2-AuNPs的浓度为20-70 µg/mL。
所述MoS2-AuNPs传感器是通过以下步骤制备的：
（1）制备MoS2：参照Eda的方法制备的，使用前，在水溶液中超声分散；
（2）制备AuNPs：采用经典Frens法制备金纳米颗粒，平均粒径15.7nm，浓度为1.2* 1018 M-3；
（3）制备MoS2-AuNPs：将步骤（1）分散好的MoS2 溶液与步骤（2）制备好的金纳米，搅半均匀，加入乙二醇，在90℃反应5小时，10000r 离心15min，然后将沉淀分散于超纯水中，避光保存。
本发明具有以下优点：
（1）本发明中MoS2和MoS2-AuNPs易于获得，方法简单、成本低，充分利用MoS2和MoS2-AuNPs淬灭不同双链DNA（MoS2-AuNPs所结合DNA必须巯基标记）的荧光程度不同，而对DNA进行鉴定。
（2）本发明采用非传统的荧光标记DNA的方法，用SYBR Green I能有效地结合到双链DNA的中，作为检测荧光信号的来源，是一种无标记的检测方法，具有高灵敏性。
附图说明
图1：本发明的检测流程图；
图2：是MoS2-AuNPs固定化检测流程图；
图3：是SYBR Green I对双链DNA进行标记时的荧光强度图，其中DNA浓度为10nM，加入SYBR Green I染料（5.0 X），染料最终为0.5 X；
图4：基于MoS2传感器对SNPs检测图，图中DNA浓度是10nM；
图5：基于MoS2传感器对SNPs分析鉴定图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
实施例1：
（1）制备MoS2纳米材料：
氩气氛围下，将3 g 天然MoS2 晶体浸泡入装有3mL 1.6M正丁基锂烧瓶中2 天进行锂插入。然后，用正己烷过滤以及冲洗产生的 Li x MoS2 除去杂质。Li x MoS2 在超纯水中通过超声1h，悬浮液通过离心以及用水冲洗后，用混合纤维素酯膜过滤后，获得沉淀物于氩气保护的手套箱内300℃变性1小时，获得的MoS2溶于水，超声2h，制得MoS2溶液备用。
（2）合成特异的DNA序列：T: A GCA TCT TAT CCG GGT
P: ACC CGG ATA AGA TGC T
M1: ACC GGG ATA AGA TGC T
M2：ACTGGG ATA AGA TGC T
M3：ACTGGG ATA AGA TCC T
该序列在生工生物工程（上海）股份有限公司合成；
（3）基于MoS2传感器对SNP进行检测：
取等量10μM的P1M、P2M、P3M、P2分别与等量的10μM的T置于95℃下5分钟，室温下冷却两小时以上，再加入PBS(1.0 X,PH=7.4）将双链DNA稀释到1μM。分别取534µL PBS与6μL的P1MT、P2MT、P3MT、P2T、T混合于避光的EP管中，之后分别加入SYBR Green I 60µL（5.0 X），混匀，总体积600μL。10分钟后测量其荧光强度。
如图3所示，加入SYBR GreenI染料后，配对DNA的荧光强度明显高于错配DNA。
向不同的DNA中加入等量的MoS2（终浓度2.5ug/mL），混匀，20分钟后再次测量其荧光强度，如图4，淬灭后的配对DNA荧光强度仍然高于其他DNA荧光强度。
图5是配对DNA与错配DNA淬灭前后的荧光强度对比，可以看出DNA间荧光强度差距在增大，由此可以鉴定出SNPs。
其中图1为本案例的检测流程图。错配DNA与配对DNA相比，与染料结合能力弱，但与MoS2结合能力较强。MoS2对错配DNA中SYBR Green I具有较强的淬灭效应，通过加入MoS2前后的荧光强度变化来分析鉴定出SNPs。
实施例2：
步骤（1）和（2）同实施例1中。
（3）：取等量10μM的P1M、P2M、P3M、P2分别与等量的10μM的T置于95℃下5分钟，室温下冷却两小时以上，再加入PBS(1.0 X,PH=7.4）将双链DNA稀释到1μM。分别取534μL PBS与6µl的P1MT、P2MT、P3MT、P2T、T混合于避光的EP管中，之后分别加入SYBR Green I 60μL（5.0X），混匀，总体积600μL。10分钟后测量其荧光强度。加入MoS2-AuNPs溶液，同时加入10μL 10%Tween80，70℃水浴加热2.5 h。离心去上清液，加入PBS到600μL。再次检测DNA的荧光强度。
其中图2为本案例的检测流程图。MoS2-AuNPs通过-SH固定化DNA，错配DNA与染料结合能力弱，但更靠近MoS2-AuNPs表面，从而通过荧光强度的变化检测出SNPs。

Claims (5)

1.一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，MoS2传感器用于检测SNPs的方法，包括如下步骤：
（1）用SYBR Green I染料插入配对及错配的双链DNA，并测量其荧光强度；
（2）MoS2表面物理吸附DNA，由于FRET，配对及错配的双链DNA荧光强度的淬灭程度不同，根据荧光强度变化不同，检测出SNPs。
2.根据权利要求1所述的一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，所述MoS2是参照Eda的方法制备的，使用前，在水溶液中超声分散。
3.一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，MoS2-AuNPs传感器用于检测SNPs的方法，包括如下步骤：
（1）用SYBR Green I染料插入配对及错配的带有巯基的双链DNA，并测量其荧光强度；
（2）Tween80的修饰：加入10%的Tween80，Tween80通过自组装与MoS2-AuNPs表面相结合；
（3）在步骤（1）所得产物中加入步骤（2）所得的产物，70℃水浴加热2.5 h, 离心去上清液，加入PBS溶解为初始总体积；MoS2-AuNPs能够有效淬灭双链DNA中的SYBR GreenI的荧光，测其荧光强度，对比前后荧光强度的变化，从而进行检测SNPs。
4.根据权利要求3所述的一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述带有巯基的双链DNA的浓度为10 nM；MoS2-AuNPs的浓度为20-70 µg/mL。
5.根据权利要求3所述一种基于二硫化钼的传感器检测SNPs的方法，其特征在于，所述MoS2-AuNPs传感器是通过以下步骤制备的：
（1）制备MoS2：参照Eda的方法制备的，使用前，在水溶液中超声分散；
（2）制备AuNPs：采用经典Frens法制备金纳米颗粒，平均粒径15.7nm，浓度为1.2* 1018 M-3；
（3）制备MoS2-AuNPs：将步骤（1）分散好的MoS2 溶液与步骤（2）制备好的金纳米，搅半均匀，加入乙二醇，在90℃反应5小时，10000r 离心15min，然后将沉淀分散于超纯水中，避光保存。
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