CN106854676A - 一种基于酶切检测snp的方法 - Google Patents

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邓泽斌
夏妮
时海霞
张春霞
陈克平
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]

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Abstract

本发明属于生物医学领域中的核酸检测方法，涉及一种基于酶Hpa II处理的MoS2传感器检测SNP的方法。包括：(1)使用SYBR Green I对两种双链DNA进行染色；(2)使用MoS2对DNA进行淬灭，测荧光强度；(3)向猝灭后的DNA中加入Hpa II，37下℃温育4h，测荧光强度；(4)比较酶切前后两种DNA的比值变化，进行SNP鉴定。本发明充分利用结合SYBR GreenI的两种DNA被酶Hpa II酶处理，Hpa II酶能特异性切割…C↓CGG….…GGC↑C…。完全配对的DNA会被切割成两段更短的双链DNA，错配的DNA虽然不被切割，仍为一条双链，但会受到一定的损伤，两者荧光强度会有不同程度的降低。完全配对的DNA与错配DNA单个碱基的差别会由于配对DNA链变短而更加明显，从而加大了对SNP的精确程度，提高了检测的灵敏性。

Description

一种基于酶切检测SNP的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域中的核酸检测方法，基于二硫化钼纳米材料(MoS2)，物理性吸附双链DNA后(已被SYBR Green I染色)，再通过酶切(Hpa II)来检测DNA的单核苷酸多态性(SNP)。
背景技术
单核苷酸多态性(SNPs)是核酸序列上单个碱基的差异性变化。辨别及定量检测基因组样本中的单核苷酸多态性，已经成为是DNA分析中最具有挑战性实验之一。是基因组多态性最为丰富的形式，被视为基因定位、识别遗传性疾病以及发展候选药物高分别率的基因组标志(Seung Yun Yang,Sejin Son,Sangsin Jang Hyunwoo Kim,Gumhye Jeon,WonJong Kim,Jin Kon Kim,DNA-Functionalized Nanochannels for SNP Detection,NanoLett.2011,11,1032–1035.)。例如，2型糖尿病具有家族遗传倾向，是一种高异质性的多基因遗传病。有研究表明，染色体20q13区域发生的SNP与该型糖尿病的发生相关，通过检测SNP有利于该型糖尿病的早期诊断与治疗。
MoS2制备简单，成本比较低。SYBR Green I染料是一种能特异性结合双链DNA，二硫化钼结合DNA后，使得结合到DNA中的SYBR Green I的荧光强度淬灭。使用酶Hpa II对两种DNA进行酶处理，Hpa II能特异性切割…C↓CGG…
.…GGC↑C…。完全配对的DNA会被切割成两段更短的双链DNA，而错配的DNA虽然不被切割，仍为一条双链，但会受到一定的损伤，两者荧光强度会有不同程度的降低。完全配对的DNA与错配DNA单个碱基的差别会由于配对DNA链变短而更加明显，从而加大了对SNP的辨别度，在一定程度上提高了检测的灵敏性。
发明内容
一种基于二硫化钼(MoS2)酶切的传感器检测SNP的方法，包括如下步骤：
(1)使用SYBR Green I对两类双链DNA进行染色：向10nM的两类DNA，即配对DNA与错配DNA中，分别加入SYBR Green I，测量其荧光强度A1；
(2)用MoS2对DNA进行淬灭：15分钟后，加入MoS2，反应20分钟，再次测量荧光强度A2；
(3)酶切：向步骤(2)淬灭后的DNA中加入Hpa II酶进行处理，37℃下温育4小时；测量其荧光强度A3；
(4)SNP检测：分别统计两类DNA，即配对DNA与错配DNA，在染色前后的荧光强度，被MoS2淬灭前后的荧光强度，以及两种DNA被酶处理后的荧光强度，通过计算配对DNA与错配DNA荧光强度在上述三种状态下(染色、淬灭、酶切)比值的变化来鉴定SNP。
步骤(1)中，所述染料SYBR Green I的终浓度为0.5X。
步骤(2)中，MoS2的终浓度为2.5μg/mL。
步骤(3)中，所述加入的酶Hpa II的终浓度为0.02U/μL。
本发明充分利用结合SYBR Green I的两种DNA被酶Hpa II酶处理，Hpa II能特异性切割…C↓CGG….
…GGC↑C…。完全配对的DNA会被切割成两段更短的双链DNA，而错配的DNA虽然不被切割，仍为一条双链，但会受到一定的损伤，两者荧光强度会有不同程度的降低。完全配对的DNA与错配DNA单个碱基的差别会由于配对DNA链变短而更加明显，从而加大了对SNP的精确程度，在一定程度上提高了检测的灵敏性。
本发明具有以下优点：
(1)本发明中MoS2纳米材料易于获得，方法简单、成本低，利用MoS2对结合有SYBRGreen I染料的DNA进行淬灭，Hpa II对双链配对的DNA具有切割效应，对错配的DNA具有一定的损伤作用，使得荧光呈现不同程度的降低，进而对SNP进行鉴定。
(2)本发明利用基于MoS2传感器淬灭DNA荧光强度，再进行酶处理，能有效提高SNP检测的信噪比，而且实现快速、低成本检测。
附图说明
图1向配对以及错配的DNA中加入SYBR Green I(终浓度0.5X)后的荧光强度；
图2加入MoS2(2.5μg/mL)后，配对DNA与错配DNA的荧光强度；
图3酶切后，配对DNA与错配DNA的荧光强度；
图4加入SYBR Green I、MoS2以及酶切后配对DNA与错配DNA的比值变化；其中，a-P2T配对DNA，b-P1MT错配DNA。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。
实施例：
(1)合成特异的DNA序列：T:A GCA TCT TAT CCG GGT
P2:ACC CGG ATAAGA TGC T
1M:ACC GGG ATA AGA TGC T(下划线表示错配位点)
进行双链DNA合成，P2T(配对)与P1MT(单个碱基错配)；
(2)向600μL 10nM的两种DNA中加入SYBR Green I(终浓度0.5X)，15分钟后加入MoS2(终浓度2.5μg/mL)，反应20分钟，测量各自的荧光强度；
(3)向上述体系中加入酶Hpa II(终浓度0.02U/μL)，37℃下温育4小时，测量荧光强度；
(4)比较酶切前后配对DNA与错配DNA荧光强度的比值，对SNP进行鉴定。

Claims (4)

1.一种基于酶切检测SNP的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使用SYBR Green I对两类双链DNA进行染色：向10nM的两类DNA，即配对DNA与错配DNA中，分别加入SYBR Green I，测量其荧光强度A1；
(2)用MoS2对DNA进行淬灭：15分钟后，加入MoS2，反应20分钟，再次测量荧光强度A2；
(3)酶切：向步骤(2)淬灭后的DNA中加入Hpa II酶进行处理，37℃下温育4小时；测量其荧光强度A3；
(4)SNP检测：分别统计两类DNA，即配对DNA与错配DNA，在染色前后的荧光强度，被MoS2淬灭前后的荧光强度，以及两种DNA被酶处理后的荧光强度，通过计算配对DNA与错配DNA荧光强度在上述三种状态下，即染色、淬灭、酶切，比值的变化来鉴定SNP。
2.根据权利要求1所述的一种基于酶切检测SNP的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述染料SYBR Green I的终浓度为0.5X。
3.根据权利要求1所述的一种基于酶切检测SNP的方法，其特征在于，步骤(2)中，MoS2的终浓度为2.5μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种基于酶切检测SNP的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加入的酶Hpa II的终浓度为0.02U/μL。
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