CN108535207A - 基于二硫化钨纳米片的免标记生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于二硫化钨纳米片的免标记生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)制备二硫化钨纳米片在水中的混悬液；(2)向二硫化钨纳米片的混悬液中加入ssDNA探针，混合均匀；(3)向步骤(2)中得到的混悬液中加入可溶性金属盐，混合均匀，得到第一状态的免标记生物传感器；(4)向步骤(3)中得到的混悬液中加入目标ssDNA，反应，得到第二状态的免标记生物传感器；所述的ssDNA探针为目标ssDNA的互补链。本发明还公开了该免标记生物传感器在检测ssDNA浓度中的应用。采用该免标记光学传感器检测核酸的成本较低，并且操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及光学生物传感器技术领域，尤其涉及一种基于二硫化钨纳米片的免标记生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
二硫化钨是以硫-钨-硫为每一层基础结构的层状化合物。每层结构都是两层硫原子夹一层钨原子，层与层之间不存在悬挂键，仅仅依靠弱的范德华作用力结合起来，易沿着层面滑动。这种结构使得块体二硫化钨可以剥离得到二维层状二硫化钨纳米片。由于二硫化钨纳米片层有消光性，在溶剂里面分散的时候也有着丁达尔效应，根据其对光线的吸收，绘制二硫化钨纳米片的紫外-可见吸收光谱图，可以看到其在波长为410nm、625nm处都有吸收峰，其中，在625nm处的吸收峰，与二硫化钨纳米片的大小及厚度相关。
二硫化钨纳米片由于具有较大的比表面积，其表面会产生相对较大的静电吸引力，同时又由于钨原子和硫原子电子云分布一个倾向于在中间，一个倾向于在两端，就造成了二硫化钨纳米片层表面带上了一定的负电荷，对于单链核酸而言，由于其碱基暴露在外而易于被二硫化钨纳米片层所吸附，而对于双链核酸，由于其带负电的磷酸骨架，因为双螺旋结构而暴露在外，会对带负电表面的二硫化钨纳米片层产生较大的排斥，远远的大于吸附的静电引力，所以不能被吸附。利用二硫化钨纳米片对单链核酸及双链核酸吸附作用不同这一性质，可构建基于二硫化钨纳米片检测单链核酸的传感方法。
现有的传感方法中，较为普遍的是基于荧光共振能量原理检测单链核酸。其主要原理是：在与被测单链核酸互补配对的核酸一端修饰荧光基团，当目标核酸不存在时，修饰了荧光基团的核酸吸附在二硫化钨纳米片表面，荧光基团的荧光被猝灭。当目标核酸存在时，被吸附上去的荧光被猝灭了的单链核酸便会与其互补核酸结合，形成核酸双链，脱离二硫化钨纳米片表面，因为脱离了二硫化钨纳米片，原来的荧光基团又恢复了荧光信号，体系的荧光强度又会发生改变，这样记录各次荧光强度的改变并进行分析，就可以得出被检测单链核酸的含量。
但是，这种方法需要在单链核酸的一端修饰荧光基团，这样既增加了成本，也提高了实验的繁琐性。因此，开发免标记的新型传感方法检测单链核酸势在必行。
发明内容
针对现有荧光传感器检测核酸的成本高、操作繁琐等不足，本发明提供了一种基于二硫化钨纳米片的免标记光学传感器，采用该免标记光学传感器检测核酸的成本较低，并且操作简单。
本发明提供了如下技术方案：
一种基于二硫化钨纳米片的免标记生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备二硫化钨纳米片在水中的混悬液；
(2)向二硫化钨纳米片的混悬液中加入ssDNA探针，混合均匀；
(3)向步骤(2)中得到的混悬液中加入可溶性金属盐，混合均匀，得到第一状态的免标记生物传感器；
(4)向步骤(3)中得到的混悬液中加入目标ssDNA，反应，得到第二状态的免标记生物传感器；
所述的ssDNA探针为目标ssDNA的互补链。
由于二硫化钨纳米片表面带一定程度的负电荷，在二硫化钨纳米片的混悬液中，片和片之间有一定的排斥作用，当加入金属阳离子的时候，由于电荷中和作用，金属阳离子会部分的游离在片与片之间，这样会削弱片与片之间的排斥作用而使得二硫化钨纳米片之间的静电吸附起了主导作用，使得片与片的堆叠和沉积变得相对较容易；当有ssDNA存在时，由于ssDNA可以吸附在二硫化钨纳米片的表面，可以保护二硫化钨纳米片在高盐浓度下也不会堆叠和沉积；当有与目标ssDNA互补的ssDNA探针存在时，目标ssDNA与ssDNA探针发生互补配对，形成双链核酸，由于双链核酸具有刚性结构，与二硫化钨纳米片之间的吸附力很弱，在高盐浓度的环境下，二硫化钨纳米片会发生堆叠和沉积。本发明利用这种性质，构建了由ssDNA探针、目标ssDNA和金属阳离子调节二硫化钨纳米片沉降程度的免标记生物传感器，实现对目标ssDNA浓度的检测。
步骤(1)中，二硫化钨纳米片混悬液可采用现有技术进行制备。
优选的，采用剪切法剥离得到二硫化钨纳米片混悬液；
具体方法如下：
(1-1)将二硫化钨粉末和胆酸钠粉末加入超纯水中，10000～15000rpm的转速下间歇搅拌；
(1-2)搅拌完成后，在1000～1500rpm的转速下离心，取上清液；
(1-3)将步骤(1-2)中的上清液在10000～15000rpm的转速下离心，取沉淀，向沉淀中加入超纯水使沉淀溶解，得到二硫化钨纳米片混悬液。
步骤(2)中，向二硫化钨纳米片的混悬液中加入ssDNA探针，室温下反应10～60min。
步骤(2)中，ssDNA探针吸附在二硫化钨纳米片表面上，减弱二硫化钨纳米片与片之间的作用力，防止二硫化钨纳米片沉降。
金属阳离子的量以金属阳离子所带的正电荷的量计，步骤(2)得到的混悬液中，二硫化钨纳米片与金属阳离子的比例为1g∶0.05～1mol。
金属阳离子的加入量过少时，不能有效促使二硫化钨纳米片沉降，金属阳离子的加入量达到一定值时，随着金属阳离子的加入量增加，二硫化钨纳米片沉降效果变化不大。
优选的，步骤(3)得到的混悬液中，二硫化钨纳米片与金属阳离子的比例为1g∶0.5～1mol。
进一步优选的，所述的可溶性金属盐为NaCl。
二硫化钨纳米片表面带负电荷，由于电荷中和作用，金属阳离子会弱片与片之间的排斥作用而使得二硫化钨纳米片堆叠和沉积；ssDNA探针可以吸附在二硫化钨纳米片表面，可防止二硫化钨纳米片堆叠和沉积。因此，在整个免标记生物传感器体系中，二硫化钨纳米片、ssDNA探针和金属阳离子的比例需要保持在一定的范围内。
优选的，金属阳离子的量以金属阳离子所带的正电荷的量计，步骤(3)中得到的混悬液中，二硫化钨纳米片、ssDNA探针和金属阳离子的比例为1g∶200～400nmol∶0.05～1mol。
二硫化钨纳米片、ssDNA探针和金属阳离子的比例保持在1g∶200～400nmol∶0.05～1mol时，免标记生物传感器的灵敏度较高。
进一步优选的，步骤(3)中得到的混悬液中，二硫化钨纳米片、ssDNA探针和金属阳离子的比例为1g∶200～400nmol∶1mol。
步骤(4)中，向步骤(3)中得到的混悬液中加入目标ssDNA后，目标ssDNA与ssDNA探针互补配对，是部分二硫化钨纳米片失去ssDNA探针的保护，在金属阳离子的作用下发生沉降，通过二硫化钨纳米片的沉降程度可以计算目标ssDNA的浓度。
优选的，步骤(4)中得到的混悬液中，二硫化钨纳米片的浓度为0.01～1g/L；进一步优选的，二硫化钨纳米片的浓度为0.01～0.1g/L；最优选的，二硫化钨纳米片的浓度为0.05g/L。
免标记生物传感器的第一状态为“关闭”，第二状态为“开启”。
优选的，通过引入核酸外切酶III提高免标记生物传感器的灵敏度；即，步骤(4)之后还包括：向步骤(2)中得到的混悬液中加入核酸外切酶III，反应；所述的ssDNA探针为3’末端的5个碱基被去除的目标ssDNA的互补链。
核酸外切酶III作用于双链核酸，沿3’-5’方向逐步催化去除单核苷酸，核酸外切酶III对单链核酸无活性，因此3’突出末端抗该酶的切割，最适底物是3’凹陷末端或平末端。利用该性质，可以设计基于核酸外切酶III辅助信号循环放大策略检测单链核酸。具体实验原理如下：设计ssDNA探针序列，去除3’末端的5个碱基，使核酸外切酶III可作用于ssDNA探针序列。当目标ssDNA与ssDNA探针配对后，加入核酸外切酶III，与目标ssDNA配对的ssDNA探针序列会被分解，目标ssDNA重新游离，再去结合与其互补的ssDNA探针序列，通过这样的循环，即可实现对目标ssDNA检测的信号放大，提高传感器的检测限。
虽然可以通过加入核酸外切酶III来提高单链核酸的检测限，但是酶不仅价格昂贵，而且对温度敏感，容易失活，为了克服这些不足，优选的，通过引入杂交链式反应提高免标记生物传感器的灵敏度；即，所述的ssDNA探针为发夹结构核酸探针。
本发明还提供了一种基于二硫化钨纳米片的免标记生物传感器，采用上述制备方法制备得到。
本发明还提供了一种基于二硫化钨纳米片的免标记生物传感器在ssDNA浓度检测中的应用，包括以下步骤：
(1)制备一组处于第一状态的免标记生物传感器，向其中分别加入不同浓度的目标ssDNA，检测免标记生物传感器的紫外-可见光吸光度，建立目标ssDNA-吸光度标准曲线；
(2)向处于第一状态的免标记生物传感器中加入待测目标ssDNA，检测免标记生物传感器的紫外-可见光吸光度，根据目标ssDNA-吸光度标准曲线计算待测目标ssDNA的浓度。
优选的，检测免标记生物传感器在630nm处的吸光度。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的免标记生物传感器的作用原理是：基于二硫化钨纳米片具有消光作用，金属阳离子可以中和二硫化钨纳米片表面的负电荷，减弱二硫化钨纳米片之间的斥力，促进二硫化钨纳米片的沉降，而ssDNA探针可以吸附在二硫化钨纳米片防止其沉降，当目标ssDNA与ssDNA探针结合后，ssDNA探针失去对二硫化钨纳米片的保护作用，二硫化钨纳米片在金属阳离子作用下发生沉降，二硫化钨纳米片混悬液的吸光度发生改变，根据吸光度的改变量可以计算目标ssDNA的浓度。
本发明的免标记生物传感器不需要对ssDNA探针进行荧光标记，降低了检测成本，简化了操作步骤。
附图说明
图1为加入0.1M NaCl后20分钟内二硫化钨纳米片混悬液的吸收光谱图；
图2为加入0.1M NaCl后8小时内二硫化钨纳米片混悬液的吸收光谱图；
图3为加入不同浓度的NaCl后二硫化钨纳米片混悬液的吸光度变化曲线图；
图4为加入不同浓度的ssDNA探针后二硫化钨纳米片混悬液的吸光度变化曲线图；
图5为实施例5中的标准曲线图；
图6为实施例7中的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
实施例1
本实施例选用剪切剥离法将块体二硫化钨剥离成二维层状二硫化钨纳米片。具体方法如下：
称取50g块体二硫化钨粉末和5g胆酸钠粉末，将两者混合，并加入500mL超纯水，混合均匀后一起放入家用搅拌机中，在12000rpm的转速下搅拌。为防止过多的泡沫产生，采取间歇性搅拌，即搅拌三分钟，停止三分钟，总搅拌时间为120分钟。
取搅拌后的产物在1500rpm的转速下，离心90分钟，取离心产物上清液的一半，即可得到二硫化钨纳米片的胆酸钠溶液混悬液。
由于得到的二维层状二硫化钨纳米片分散在胆酸钠溶液中，对后续实验存在一定影响，因此需将产物在12000rpm转速下离心20分钟，弃去上清液，取沉淀，向沉淀中加入超纯水使其溶解。重复以上离心步骤三次，即可得到分散在纯水中的二硫化钨纳米片。
实施例2
向实施例1制备的二硫化钨纳米片混悬液中加入NaCl后检测其紫外光吸收峰的变化，具体方法如下：
取200μL实施例1制备的二硫化钨纳米片混悬液于1600μL超纯水中，加入200μL浓度为1M(mol/L)的NaCl溶液，二硫化钨纳米片和NaCl的最终浓度分别为0.05mg/mL和0.1M。
分别测混悬液在0、1、2、4、8、16、20分钟的紫外-可见吸收光谱图，如图1所示。
可以看出，二硫化钨纳米片混悬液的吸收峰从625nm移动到630nm处，说明在钠离子的作用下，分散的二硫化钨纳米片聚集，使其片层的大小及厚度都增加。
当二硫化钨纳米片聚集到一定程度时，会开始沉降。测定加入一定浓度NaCl后，二硫化钨纳米片的沉降程度，具体方法如下：
取8个容量为5mL的瓶子，向其中各加入200μL二硫化钨纳米片溶液，100μL 1M的NaCl溶液，1700μL的超纯水，二硫化钨纳米片和NaCl的最终浓度分别为0.05mg/mL和0.05M。
混匀后静置，每隔一小时，分别取每个瓶子的三分之二上清液，测上清液的紫外-可见吸收光谱，结果如图2所示。
可以看出，随着时间的增加，上清液的吸光度减小，说明沉降的二硫化钨纳米片含量增加。
实施例3
不同浓度的金属阳离子对二硫化钨纳米片的沉降作用不同，因此需要对二硫化钨纳米片与金属阳离子比例进行优化，具体方法如下：
取200μL实施例1制备的二硫化钨纳米片混悬液，与不同体积的NaCl溶液和超纯水混合，使总体积为2mL，NaCl的浓度分别为0M，0.001M，0.025M，0.005M，0.01M，0.25M，0.05M，0.1M。
混匀后静置，每隔一小时，分别取每个瓶子的三分之二上清液，测上清液的紫外-可见吸收光谱，取每个浓度630nm处的吸光度除以空白组(NaCl浓度为0)630nm处的吸光度，将该值设为纵坐标，时间为横坐标，结果如图3所示，选取0.05M的NaCl浓度为最佳浓度。
实施例4
不同浓度的单链核酸探针(ssDNA探针)对二硫化钨纳米片的保护作用不同，因此需要对二硫化钨纳米片与单链核酸探针浓度比例进行优化，具体方法如下：
取100μL实施例1制备的二硫化钨纳米片混悬液，与不同体积的单链核酸探针溶液和超纯水混合，使总体积为1mL，室温下反应20分钟，反应完毕后，加入50μL 1M的NaCl溶液，使其最终浓度为0.05M，单链核酸探针的最终浓度分别为0nM，2nM，5nM，7.5nM，10nM，15nM，20nM，25nM。
将上述混合后的产物于室温静置七小时，分别取每个瓶子的三分之二上清液，测上清液的紫外-可见吸收光谱，取630nm处的吸光度，画吸光度与单链核酸探针浓度的标准曲线，如图4所示。选取20nM的单链核酸探针浓度为最佳浓度。
实施例5
利用高浓度的金属盐离子可以使二硫化钨纳米片沉降，以及单双链核酸对二硫化钨纳米片吸附作用的不同，可以设计基于此性质的传感方法检测单链核酸，具体方法如下：
(1)分别将目标单链核酸(目标ssDNA)以及与其互补的单链核酸探针，于95℃退火5分钟，退火后，将其迅速放入冰水中冷却，使其形成单链核酸；
(2)取8个总体积为2mL的菌种瓶，分别加入单链核酸探针与不同体积的目标单链核酸，混合均匀后于37℃下反应30分钟，将反应后的产物与100μL实施例1制备的二硫化钨纳米片混悬液混合，室温下反应20分钟，反应完毕后，加入50μL 1M的NaCl溶液，上述混合液的总体积为1000μL，混合液中单链核酸探针的最终浓度为15nM，目标单链核酸的最终浓度分别为0nM、2nM、5nM、7.5nM、10nM、15nM和20nM，二硫化钨纳米片的最终浓度为O.05mg/mL，NaCl的最终浓度为0.05M；
(3)将上述混合后的产物于室温静置七小时，分别取每个瓶子的三分之二上清液，测上清液的紫外-可见吸收光谱，取630nm处的吸光度，画吸光度与目标单链核酸浓度的标准曲线，如图5所示，标准曲线的线性范围为2-20nM，检测限为3.12nM。
标准曲线的表达式为：y＝-0.00725x+0.20876。
实施例6
(1)分别将目标单链核酸以及与其互补的单链核酸探针，于95℃退火5分钟，退火后，将其迅速放入冰水中冷却，使其形成单链核酸；
(2)取1个总体积为2mL的菌种瓶，加入单链核酸探针与100μL实施例1制备的二硫化钨纳米片混悬液混合，室温下反应20分钟，反应完毕后，加入50μL 1M的NaCl溶液；
(3)再向混合液中加入目标单链核酸，使混合液的总体积为1000μL，混合液中单链核酸探针的最终浓度为20nM，目标单链核酸的最终浓度为10nM，二硫化钨纳米片的最终浓度为0.05mg/mL，NaCl的最终浓度为0.05M；
(4)将上述混合后的产物于室温静置七小时，分别取每个瓶子的三分之二上清液，测上清液的紫外-可见吸收光谱，取630nm处的吸光度，通过实施例3中的标准曲线计算目标单链核酸的浓度为9.2nM，目标单链核酸的真实浓度10nM，误差为8％。
实施例7
(1)将发夹核酸一(HP1)和发夹核酸二(HP2)于95℃退火10分钟，退火后，缓慢冷却一小时至室温，使其形成发夹结构；
(2)取8个离心管，向其中加入的15μL浓度为10μM的HP1和HP2(最终浓度15nM)，以及不同体积的浓度为10μM的目标单链核酸(最终浓度分别为0nM、0.5nM、1nM、1.5nM、2.0nM、3.5nM、5nM和7.5nM)，再分别加入不同体积的缓冲液(Tris-HCl，50mMNaCl，pH＝7.4)，使反应体系总体积为100μL；
(3)将混合后的样品于37℃下反应4个小时，使目标核酸单链与HP1和HP2充分反应。取反应后的样品10μL，加入100μL实施例1制备的二硫化钨纳米片溶液(最终浓度0.05mg/mL)，以及不同体积的缓冲液(Tris-HCl，pH＝7.4)，室温下反应20分钟；
(4)反应后，再分别加入50μL的NaCl溶液(最终浓度0.05M)，室温下静置7小时。以上反应总体积均为1mL。
(5)分别取每个瓶子的三分之二上清液，测上清液的紫外-可见吸收光谱，取630nm处的吸光度，画吸光度与目标核酸单链浓度的标准曲线，如图6所示，标准曲线的线性范围为0.5-7.5nM，检测限为0.54nM。
标准曲线的表达式为：y＝-0.02016x+0.2193。
与实例5相比，其检测限显著提高。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于二硫化钨纳米片的免标记生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备二硫化钨纳米片在水中的混悬液；
(2)向二硫化钨纳米片的混悬液中加入ssDNA探针，混合均匀；
(3)向步骤(2)中得到的混悬液中加入可溶性金属盐，混合均匀，得到第一状态的免标记生物传感器；
(4)向步骤(3)中得到的混悬液中加入目标ssDNA，反应，得到第二状态的免标记生物传感器；
所述的ssDNA探针为目标ssDNA的互补链。
2.根据权利要求1所述的免标记生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，采用剪切法剥离得到二硫化钨纳米片混悬液。
3.根据权利要求1所述的免标记生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，向二硫化钨纳米片的混悬液中加入ssDNA探针，室温下反应10～60min。
4.根据权利要求1所述的免标记生物传感器的制备方法，其特征在于，金属阳离子的量以金属阳离子所带的正电荷的量计，步骤(2)得到的混悬液中，二硫化钨纳米片与金属阳离子的比例为1g∶0.05～1mol。
5.根据权利要求4所述的免标记生物传感器的制备方法，其特征在于，金属阳离子的量以金属阳离子所带的正电荷的量计，步骤(2)得到的混悬液中，二硫化钨纳米片与金属阳离子的比例为1g∶0.5～1mol。
6.根据权利要求1、4或5任一项所述的免标记生物传感器的制备方法，其特征在于，金属阳离子的量以金属阳离子所带的正电荷的量计，步骤(3)中得到的混悬液中，二硫化钨纳米片、ssDNA探针和金属阳离子的比例为1g∶200～400nmol∶0.05～1mol。
7.根据权利要求6所述的免标记生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中得到的混悬液中，二硫化钨纳米片的浓度为0.01～1g/L。
8.一种基于二硫化钨纳米片的免标记生物传感器，采用权利要求1～7任一项所述的制备方法制备得到。
9.一种基于二硫化钨纳米片的免标记生物传感器在ssDNA浓度检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备一组处于第一状态的免标记生物传感器，向其中分别加入不同浓度的目标ssDNA，检测免标记生物传感器的紫外-可见光吸光度，建立目标ssDNA-吸光度标准曲线；
(2)向处于第一状态的免标记生物传感器中加入待测目标ssDNA，检测免标记生物传感器的紫外-可见光吸光度，根据目标ssDNA-吸光度标准曲线计算待测目标ssDNA的浓度。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测免标记生物传感器在630nm处的吸光度。
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