CN104698055A - Dna与石墨烯有序组装在金电极表面的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种将DNA与石墨烯量子点通过化学键结合从而在金电极表面有序组装的生物传感器新方法，属于电化学生物传感器领域。其特征在于，电极的修饰过程中利用GQDs表面含有羧基官能团的性质，将DNA末端修饰的氨基与GQDs边缘的羧基通过EDC、NHS发生加成反应，从而产生DNA-GQDs-DNA的堆叠结构。本发明修饰的DNA/GQDs/DNA/Au电极相较于原先的DNA/Au电极，其具有良好的导电性能以及电化学性能，能够有效的用于测定Micro RNA等特定序列的基因片段。而且该电极的修饰方法也具有制作流程简单，制作成本低，在空气中可较长时间保存的优点，便于研究及实际检测中的使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种将DNA与石墨烯量子点通过化学键结合从而在金电极表面有序组装的生物传感器新方法，属于电化学生物传感器领域。
背景技术
石墨烯作为一种由碳原子以sp2杂化轨道组成的六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜的单层片状结构的新型材料，由于其本身具有的独特的理化性质，自发现以来一直是人们研究的热点。因为石墨烯的导热性能优良，电子传递速率高，因而其成为了电极表面的理想修饰材料。近年来，出现随着电化学检测技术的发展，也涌现出很多石墨烯及其衍生物修饰电极的方法，如电化学还原氧化石墨烯修饰玻碳电极、羧基化石墨烯修饰玻碳电极，碳纳米管-石墨烯纳米片复合膜修饰金电极等，但是使用的石墨烯衍生物仍以氧化石墨烯为主，对于利用石墨烯量子点(GQDs)与DNA层层组装修饰电极的方法一直未见报道。本发明主要是利用石墨烯量子点粒径小，厚度薄的特点，使通过Au-S键竖立在Au电极表面的DNA能够稳固的支撑住GQDs，又利用石墨烯量子点边缘含有的羧基基团，将氨基修饰的DNA通过羧基和氨基的加成反应均匀地固定在GQDs表面，从而制备生成DNA/GQDs/DNA/Au电化学生物传感器。
发明内容
本发明旨在提供一种在金电极表面有序组装DNA和石墨烯量子点的电化学生物传感器的制备方法。
本发明的技术方案在于，电极的修饰过程中利用GQDs表面含有羧基官能团的性质，将DNA末端修饰的氨基与GQDs边缘的羧基通过EDC、NHS发生加成反应，从而产生DNA-GQDs-DNA的堆叠结构。
DNA与石墨烯有序组装在金电极表面的方法，其特征在于步骤如下：
1)、EDC溶液的配制：将乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐粉末溶于二次水中，用二次水稀释得0.1mol/L EDC溶液；
2)、NHS溶液的配制：将N-羟基琥珀酰亚胺粉末溶于二次水中，用二次水稀释得0.04mol/L NHS溶液；
3)、PBS的配制：取0.2328g十二水合磷酸氢二钠，0.0897g二水合磷酸二氢钠，0.58g氯化钠于250ml容量瓶中，用二次水稀释得5mM PBS缓冲溶液；
4)、双链DNA溶液的配置：首先将4条不同序列的单链DNA粉末在离心机中于6000rpm下离心5min，其中ssDNA-1在5’端由巯基修饰，ssDNA-2、ssDNA-3、ssDNA-4在5’端由氨基修饰，再用5mM PBS分别稀释得到50mMssDNA溶液，将互补的ssDNA溶液等体积混合并同氮气除氧，之后将混合好的溶液于90度下水浴加热5min，最后冷却至室温生成两种双链DNA溶液，其中ssDNA-1、ssDNA-2合成的dsDNA-1，ssDNA-3、ssDNA-4合成dsDNA-2；
5)、六氨基合钌溶液的配置：将氯化六氨合钌颗粒溶于5mM PBS溶液中生成1mM/L的六氨基合钌溶液；
6)、金电极在绒布上打磨至电极表面光滑成镜面，在二次水中超声5分钟去除电极表面的无机物，在乙醇中超声5分钟去除表面的有机物，最后用二次水冲洗，氮气吹干备用；
7)、将已处理完毕的金电极浸入dsDNA-1溶液中，并放置14-18个小时，之后将修饰完dsDNA-1的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-1，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/Au；
8)、在100μl 1mg/ml的石墨烯量子点溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将修饰了dsDNA-1的金电极浸入其中并放置6-8小时，之后用二次水冲洗修饰完毕的金电极表面以去除游离的GQDs，氮气吹干备用，此时电极表面状态为GQDs/DNA/Au；
9)、在100μl的dsDNA-2溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将先后修饰了dsDNA-1和石墨烯量子点的金电极浸入其中并放置6-8小时，之后用二次水冲洗修饰完毕的金电极表面以去除游离的dsDNA-2，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/GQDs/DNA/Au。
本发明的优点在于，修饰的DNA/GQDs/DNA/Au电极相较于原先的DNA/Au电极，其具有良好的导电性能以及电化学性能，能够有效的用于测定Micro RNA等特定序列的基因片段。而且该电极的修饰方法也具有制作流程简单，制作成本低，在空气中可较长时间保存的优点，便于研究及实际检测中的使用。
附图说明
图1为实施例1和实施例2所制备电极的循环伏安曲线；
曲线a对应实施例1、曲线b对应实施例2；
图2为实施例1和实施例3所制备电极的循环伏安曲线；
曲线a对应实施例1、曲线d对应实施例3；
图3为实施例1和实施例4所制备电极的循环伏安曲线；
曲线a对应实施例1、曲线e对应对比例4；
图4为实施例1和实施例5所制备电极的循环伏安曲线；
曲线a对应实施例1、曲线e对应对比例5；
图5为实施例1和实施例5所制备电极的循环伏安曲线；
曲线a对应实施例1、曲线d对应对比例6；
图中，电流/A为电流信号，电位/V为相对于Ag/AgCl参比电极的电压。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。
实施例1：
1)、乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液的配制：将EDC粉末溶于二次水中，用二次水稀释得0.1mol/L EDC溶液。
2)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液的配制：将NHS粉末溶于二次水中，用二次水稀释得0.04mol/L NHS溶液；
3)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制：取0.2328g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，0.0897g二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)，0.58g氯化钠(NaCl)于250ml容量瓶中，用二次水稀释得5mM PBS缓冲溶液；
4)、双链DNA(dsDNA)溶液的配置：将4条不同序列的单链DNA(ssDNA-1在5’端由巯基修饰；ssDNA-2、ssDNA-3、ssDNA-4在5’端由氨基修饰)粉末在离心机中于6000rpm下离心5min，再用5mM PBS分别稀释得到50mMssDNA溶液，将互补的ssDNA(ssDNA-1和ssDNA-2互补；ssDNA-3和ssDNA-4互补)溶液等体积混合并同氮气除氧，之后将混合好的溶液于90度下水浴加热5min，最后冷却至室温生成两种双链DNA(ssDNA-1、ssDNA-2合成的dsDNA-1；ssDNA-3、ssDNA-4合成dsDNA-2)；
5)、六氨基合钌溶液的配置：将氯化六氨合钌颗粒溶于5mM PBS溶液中生成1mM/L的六氨基合钌溶液；
6)、金电极在绒布上打磨至电极表面光滑成镜面，在二次水中超声5分钟去除电极表面的无机物，在乙醇中超声5分钟去除表面的有机物，最后用二次水冲洗，氮气吹干备用。
7)、将已处理完毕的金电极浸入dsDNA-1溶液中，并浸泡16个小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-1，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/Au；
8)、在100μl 1mg/ml的石墨烯量子点溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将修饰了dsDNA-1的金电极浸入其中并浸泡6小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的GQDs，氮气吹干备用，此时电极表面状态为GQDs/DNA/Au；
9)、在100μl的dsDNA-2溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将先后修饰了dsDNA-1和石墨烯量子点的金电极浸入其中并浸泡6小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-2，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/GQDs/DNA/Au；
10)、将DNA/GQDs/DNA/Au电极冲洗干净，置于1mM六氨基合钌溶液中，以铂丝为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极进行循环伏安扫描。电位扫描范围为0.1V～-0.5V，扫描速度为100mV/s。所得的电化学信号见图1中曲线a。
实施例2：
步骤1)到6)同实施例1。
7)、将已处理完毕的金电极浸入dsDNA-1溶液中，并浸泡14个小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-1，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/Au；
8)、在100μl 1mg/ml的石墨烯量子点溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将修饰了dsDNA-1的金电极浸入其中并浸泡6小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的GQDs，氮气吹干备用，此时电极表面状态为GQDs/DNA/Au；
9)、在100μl的dsDNA-2溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将先后修饰了dsDNA-1和石墨烯量子点的金电极浸入其中并浸泡6小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-2，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/GQDs/DNA/Au；
10)、将DNA/GQDs/DNA/Au电极冲洗干净，置于1mM六氨基合钌溶液中，以铂丝为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极进行循环伏安扫描。电位扫描范围为0.1V～-0.5V，扫描速度为100mV/s。所得的电化学信号见图1中曲线b。
实施例3：
步骤1)到6)同实施例1。
7)、将已处理完毕的金电极浸入dsDNA-1溶液中，并浸泡18个小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-1，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/Au；
8)、在100μl 1mg/ml的石墨烯量子点溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将修饰了dsDNA-1的金电极浸入其中并浸泡6小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的GQDs，氮气吹干备用，此时电极表面状态为GQDs/DNA/Au；
9)、在100μl的dsDNA-2溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将先后修饰了dsDNA-1和石墨烯量子点的金电极浸入其中并浸泡6小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-2，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/GQDs/DNA/Au；
10)、将DNA/GQDs/DNA/Au电极冲洗干净，置于1mM六氨基合钌溶液中，以铂丝为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极进行循环伏安扫描。电位扫描范围为0.1V～-0.5V，扫描速度为100mV/s。所得的电化学信号见图2中曲线c。
实施例4：
步骤1)到7)同实施例1。
8)、在100μl 1mg/ml的石墨烯量子点溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将修饰了dsDNA-1的金电极浸入其中并浸泡8小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的GQDs，氮气吹干备用，此时电极表面状态为GQDs/DNA/Au；
9)、在100μl的dsDNA-2溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将先后修饰了dsDNA-1和石墨烯量子点的金电极浸入其中并浸泡6小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-2，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/GQDs/DNA/Au；
10)、将DNA/GQDs/DNA/Au电极冲洗干净，置于1mM六氨基合钌溶液中，以铂丝为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极进行循环伏安扫描。电位扫描范围为0.1V～-0.5V，扫描速度为100mV/s。所得的电化学信号见图3中曲线d。
实施例5：
步骤1)到8)同实施例1。
9)、在100μl的dsDNA-2溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将先后修饰了dsDNA-1和石墨烯量子点的金电极浸入其中并浸泡8小时，之后将修饰完的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-2，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/GQDs/DNA/Au；
10)、将DNA/GQDs/DNA/Au电极冲洗干净，置于1mM六氨基合钌溶液中，以铂丝为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极进行循环伏安扫描。电位扫描范围为0.1V～-0.5V，扫描速度为100mV/s。所得的电化学信号见图4中曲线e。
实施例6：
步骤1)到9)同实施例1。
10)、将DNA/GQDs/DNA/Au电极放置30天后，置于1mM六氨基合钌溶液中，以铂丝为对电极，以Ag/AgCl电极为参比电极进行循环伏安扫描。电位扫描范围为0.1V～-0.5V，扫描速度为100mV/s。所得的电化学信号见图5中曲线d。
Claims (1)
1.DNA与石墨烯有序组装在金电极表面的方法，其特征在于步骤如下：
1)、EDC溶液的配制：将乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐粉末溶于二次水中，用二次水稀释得0.1mol/L EDC溶液；
2)、NHS溶液的配制：将N-羟基琥珀酰亚胺粉末溶于二次水中，用二次水稀释得0.04mol/L NHS溶液；
3)、PBS的配制：取0.2328g十二水合磷酸氢二钠，0.0897g二水合磷酸二氢钠，0.58g氯化钠于250ml容量瓶中，用二次水稀释得5mM PBS缓冲溶液；
4)、双链DNA溶液的配置：首先将4条不同序列的单链DNA粉末在离心机中于6000rpm下离心5min，其中ssDNA-1在5’端由巯基修饰，ssDNA-2、ssDNA-3、ssDNA-4在5’端由氨基修饰，再用5mM PBS分别稀释得到50mM ssDNA溶液，将互补的ssDNA溶液等体积混合并同氮气除氧，之后将混合好的溶液于90度下水浴加热5min，最后冷却至室温生成两种双链DNA溶液，其中ssDNA-1、ssDNA-2合成的dsDNA-1，ssDNA-3、ssDNA-4合成dsDNA-2；
5)、六氨基合钌溶液的配置：将氯化六氨合钌颗粒溶于5mM PBS溶液中生成1mM/L的六氨基合钌溶液；
6)、金电极在绒布上打磨至电极表面光滑成镜面，在二次水中超声5分钟去除电极表面的无机物，在乙醇中超声5分钟去除表面的有机物，最后用二次水冲洗，氮气吹干备用；
7)、将已处理完毕的金电极浸入dsDNA-1溶液中，并放置14-18个小时，之后将修饰完dsDNA-1的金电极表面用二次水冲洗以去除游离的dsDNA-1，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/Au；
8)、在100μl 1mg/ml的石墨烯量子点溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将修饰了dsDNA-1的金电极浸入其中并放置6-8小时，之后用二次水冲洗修饰完毕的金电极表面以去除游离的GQDs，氮气吹干备用，此时电极表面状态为GQDs/DNA/Au；
9)、在100μl的dsDNA-2溶液中加入10μl EDC和5μl NHS，随后将先后修饰了dsDNA-1和石墨烯量子点的金电极浸入其中并放置6-8小时，之后用二次水冲洗修饰完毕的金电极表面以去除游离的dsDNA-2，氮气吹干备用，此时电极表面状态为DNA/GQDs/DNA/Au。
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