KR20110126940A - 전자전달 매개체로 코팅된 나노 입자를 이용한 트롬빈 검출용 센서 및 그 제조 방법 - Google Patents

전자전달 매개체로 코팅된 나노 입자를 이용한 트롬빈 검출용 센서 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전자 전달 매개체로 코팅된 나노 입자를 이용한 트롬빈 검출용 센서 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 트롬빈과 선택적 결합이 가능한 압타머가 전극 표면에 고정되고, 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 포함하는 트롬빈 검출용 센서 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 이용할 경우, 기존에 사용되던 단백질보다 안정성이 우수하여 트롬빈 농도 분석 과정이 용이할 뿐만 아니라, 항체에 비하여 압타머의 경우 전극 표면과의 거리가 가까우므로 전자 전달이 더욱 용이해져서 트롬빈 농도에 따른 감도가 매우 우수하고, 전기 화학적 방법을 선택하여 분석 기기를 소형화할 수 있는 효과가 있으며, 측정 과정과 측정 기기가 단순화되어 경제적이고, 의약품 산업상 매우 유용할 것이다.

Description

전자전달 매개체로 코팅된 나노 입자를 이용한 트롬빈 검출용 센서 및 그 제조 방법{Thrombin Sensor Using Nanoparticles Coated with Electron Transfer Mediator and Method for Preparing the Same}
본 발명은 전자 전달 매개체로 코팅된 나노 입자를 이용한 트롬빈 검출용 센서 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 트롬빈과 선택적 결합이 가능한 압타머가 전극 표면에 고정되고, 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 적용하여 트롬빈을 검출하는 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
트롬빈은 혈액 내에 존재하는 단백질로서 혈액 응고 기작에서 작용하는 중요 단백질이다. 혈중 정상적으로 존재하는 트롬빈의 농도를 벗어난 경우 초래되는 질병의 사례가 보고되어 있고(J. Bichler, J. A. Heit, W. G. Owen, Thromb. Res. 84 (1996) 289-294), 이에 용이한 농도 측정법이 요구되는 바이다.
기존의 트롬빈 농도 측정을 위해서는 트롬빈에 정량적으로 1:1 반응하는 히루딘 펩타이드를 이용한 면역 측정법이 사용되었다. 이 때 형성된 트롬빈-히루딘 복합체를 ELISA 검사법이나 친화 크로마토그래피를 통해 트롬빈의 농도를 검출할 수 있다. 이 방법은 히루딘의 경우, 생체 외에서 다른 단백질과 공유결합한 트롬빈과는 결합할 수 없다는 단점이 있다.
또한, 이를 전기화학적 트롬빈 센서에 적용하고자 할 때, 트롬빈 항체의 경우 크기가 10 nm로 트롬빈과 상보적 결합을 통해서 생성된 전자가 전극 표면에 전달되는데 효율이 떨어진다는 단점이 있다.
한편, 현재 생체 시료 내의 단백질 농도 측정을 위해 주로 사용되는 기술인 면역반응에 기초를 둔 ELISA 검사법의 경우 안정성이 떨어지는 단백질을 사용하기때문에 센서 적용할 경우 보관에 특별한 주의가 요구될 뿐 아니라 광학적 분석에 기반을 두고 있으므로 분석 장비가 매우 고가라는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 전자 전달 매개체로 코팅된 나노 입자를 이용할 경우, 이전에 사용되던 단백질보다 안정성이 우수하여 트롬빈 농도 분석 과정이 용이할 뿐만 아니라, 항체에 비하여 압타머의 경우 전극 표면과의 거리가 가까우므로 전자 전달이 더욱 용이해져서 트롬빈 농도에 따른 감도가 매우 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 트롬빈의 농도를 용이하게 측정할 수 있으며, 안정성이 우수한, 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 이용한 트롬빈 검출용 센서, 그 제조 방법 및 상기 센서를 이용한 트롬빈 검출 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전자 전달 매개체로 코팅된 나노입자를 이용한 트롬빈 검출용 센서, 구체적으로는, 트롬빈과 선택적 결합이 가능한 압타머가 전극 표면에 고정되고, 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 적용하여 트롬빈을 검출하는 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서를 제공한다.
본 발명은 또한, 전극 위에 트롬빈 결합 압타머를 고정하는 단계를 포함하는 트롬빈 검출용 센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 전극 위에 트롬빈 결합 압타머를 고정하는 단계; 및 (b) 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 상기 트롬빈 결합 압타머에 결합시키는 단계를 포함하는 트롬빈 검출용 센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 전극 위에 트롬빈 압타머를 고정하는 단계; (b) 상기 고정된 트롬빈 압타머에 시료 내 트롬빈을 고정시키는 단계; 및 (c) 상기 고정된 트롬빈-압타머 복합체를 이용하여 트롬빈의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 트롬빈을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 전극 위에 트롬빈 압타머를 고정하는 단계; (b) 상기 압타머에 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 결합시키는 단계; 및 (c) 상기 고정된 트롬빈 압타머에 시료 내 트롬빈을 고정시키는 단계; 및 (d) 상기 고정된 트롬빈-압타머 복합체를 이용하여 트롬빈의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 트롬빈을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 이용할 경우, 기존에 사용되던 단백질보다 안정성이 우수하여 트롬빈 농도 분석 과정이 용이할 뿐만 아니라, 항체에 비하여 압타머의 경우 전극 표면과의 거리가 가까우므로 전자 전달이 더욱 용이해져서 트롬빈 농도에 따른 감도가 매우 우수하고, 전기 화학적 방법을 선택하여 분석 기기를 소형화할 수 있는 효과가 있으며, 측정 과정과 측정 기기가 단순화되어 경제적이고, 의약품 산업상 매우 유용할 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 이용한 트롬빈 센서의 제조 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 이용한 트롬빈 센서에 대한 분석 그래프이다[(a) 폴리에틸렌글리콜 코팅 전후의 UV-VIS 흡수 스펙트럼, (b) 페로센으로 코팅된 금 나노 입자 표면에 폴리 에틸렌 글리콜 함량에 따른 페로센의 산화 환원 전류 값].
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 이용한 트롬빈 센서의 투과전자현미경사진이다[(a) 폴리에틸렌 글리콜 코팅 전 (b) 폴리에틴렌 글리콜 코팅 후].
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 센서의 제작과정 및 트롬빈 검출 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 트롬빈 농도 센서의 트롬빈 농도에 대한 Differential Pulse Voltamogram 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 트롬빈의 농도 측정 과정에서 이용할 수 있다는 것을 확인함으로써, 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 바이오 센서에 적용하고자 하였다.
본 발명에서는, 특히, 금 나노 입자를 페로센으로 코팅하여 트롬빈 농도의 측정에 사용하였다. 기존에 트롬빈 항체의 경우 크기가 10nm로 트롬빈과 상보적 결합을 통해서 생성된 전자가 전극 표면에 전달되는데 효율이 떨어지는 단점이 있어, 이를 보완하고자, 트롬빈 특이적인 압타머를 이용함으로써, 트롬빈과 결합할 수 있는 구조체를 형성할 경우 3nm 정도의 크기를 가지게 되어, 항체에 비해 전극 표면과의 거리가 가까우므로 전자 전달이 더욱 용이해지므로 트롬빈 농도에 따른 감도가 더욱 높고, 입자의 안정성이 우수하다는 장점이 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명은 일 관점에서, 트롬빈과 선택적 결합이 가능한 압타머가 전극 표면에 고정되고, 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 적용하여 트롬빈을 검출하는 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는, 음전하를 띤 트롬빈 결합 압타머가 전극 표면에 고정되어 있고, 시료 내 트롬빈이 존재할 경우 트롬빈과 복합체를 형성하게 되면, 전기적 상호작용으로 결합이 가능한 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자의 경우, 상기 압타머에 결합하는 나노입자의 양이 줄어듬에 의해 감소되는 산화 환원 전류값을 측정함으로써 트롬빈의 농도를 측정하는 센서에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 트롬빈 검출용 센서는 상기 트롬빈과 선택적 결합이 가능한 트롬빈 결합 압타머가 전극 표면에 고정되어 있는 것일 수 있으며, 또는, 상기 트롬빈 결합 압터마가 전극 표면에 고정되어 있고, 여기에, 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 상기 압타머에 결합시킨 트롬빈 검출용 센서일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 트롬빈 결합 압타머는 트롬빈 단백질과 선택적으로 결합하는 DNA, RNA 서열이라면 무엇이든지 가능하며, 예컨대, 서열번호 1의 기재된 서열을 가질 수 있으며, 트롬빈과의 결합 효율을 높이기 위해, 탄소 6개를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전자 전달 매개체는 페로센, 퀴논, 코발트, 니켈, 루세니움, 페리시아나이드, 로듐, 파라듐, 오스뮴, 이리듐, 백금, 헥사아민루테늄(III), 전이 금속 등의 산화 환원 전류를 생성하는 분자라면 모두 가능하다.
본 발명에 있어서, 페로센은 2개의 유기 고리계가 금속 원자와 대칭적으로 결합되어 있는 전이금속의 유도체를 일컫는 샌드위치 화합물 중에서 가장 일찍부터 널리 알려진 화합물로 분자식은 (C5H5)2Fe이며, 디시클로펜타디엔일철(dicyclopentadienyliron)이라고도 한다. 녹는점은 174℃이며, 매우 안정한 주황색 결정으로 벤젠이라 다른 방향족 화합물의 화학적 성질과 비슷하므로 치환반응이 잘 일어난다. 본 발명에 있어서, 전극 활성 물질이며 전자 전단 매개체인 페로센을 사용함으로써 트롬빈 농도 리포터, 양전하 부여라는 두 가지 기능을 동시에 구현하여 비표지 센서를 만들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자는 일 예로써, 금 나노입자를 실시예에서 예시하고 있으나, 이것 이외에도, 유기 나노입자, 무기, 금속 나노입자 등의 비유기 나노입자 또한 모두 적용이 가능할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 전자 전달 매개체로 코팅된 나노입자는 안정성 유지를 위하여, 수용액 상에 분산 안정제로써 기능하는 것이며, 이를 위해서, 수용성 고분자를 사용할 수 있고, 수용성 고분자로는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌옥사이드, 카르복시 메틸셀룰로스, 히드록시 메틸 셀룰로오스, 2-히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 폴리비닐피놀리돈, 폴리풀루오르화비닐리덴, 폴리메틸메타크릴레이트, 스티레부틸고무 등 다양한 수용성 고분자들이 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 전극은 단일, 또는 2개 이상일 수 있으며, 예컨대, 3전극 시스템의 경우는, 작업 전극으로 금, 은, 구리, 백금 탄소, ITO (인듐틴옥사이드, Indium Tin Oxide) 또는 알루미늄 등의 전극을 사용하고, 대조전극으로는 금, 은, 구리, 백금, 알루미늄, 또는 백금 와이어 등을 사용할 수 있고, 기준 전극으로는, 염화은전극, 칼로멜전극, 황산수은(I)전극 을 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 전극 위에 트롬빈 결합 압타머를 고정하는 단계를 포함하는 트롬빈 검출용 센서의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 제조된 센서는 전자 전달 매개체로 코팅된 나노입자를 적용할 수 있는데, 여기서 전자 전달 매개체로 코팅된 나노입자는 페로센으로 코딩된 금 나노입자일 수 있으며, 이 경우, 하기의 단계를 포함하여 제조될 수 있다: (i) AuCl4의 수용액과 Oct4NBr 톨루엔 용액을 혼합하여 교반하는 단계; (ii) 상기 혼합물에 6-ferrocenyl hexanethiol를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (iii) 상기 혼합물에서 유기 용매를 제거하여 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 분리하는 단계.
본 발명에 따른 트롬빈 검출용 센서는 (a) 전극 위에 트롬빈 결합 압타머를 고정하는 단계; 및 (b) 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 상기 압타머에 결합하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수도 있다.
상기 전자 전달 매개체로 코팅된 나노입자는 페로센으로 코팅된 금 나노입자일 수 있으며, 이 경우, 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다: (i) AuCl4의 수용액과 Oct4NBr 톨루엔 용액을 혼합하여 교반하는 단계; (ii) 상기 혼합물에 6-ferrocenyl hexanethiol를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (iii) 상기 혼합물에서 유기 용매를 제거하여 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 분리하는 단계.
또한, 상기 금 나노입자는 분산 안정성을 높이기 위해서, 수용성 고분자를 이용하여 상기 금 나노 입자를 증류수에 분산하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (i)단계의 교반은 50~100mM AuCl4의 수용액과 20~60mM Oct4NBr 톨루엔 용액을 1:2의 부피 비로 혼합하여, 수용액에 존재하던 금 원자가 톨루엔 상으로 완전히 넘어가서 오렌지색으로 변할 때 까지 20~60분 정도 교반하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (ii) 단계의 반응은 상기 (i) 단계의 혼합물에서 유기 용매 상만 따로 분리하여 6-ferrocenyl hexanethiol을 금 원자 몰수의 두 배로 첨가한 후 교반하면서 용액을 0℃로 식힌 뒤, 냉각 과정이 완료되면, 8~12 M의 NaBH4 수용액을 1/10의 부피로 첨가하면서 0℃에서 1시간 동안 격렬하게 교반하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (iii) 단계의 분리는 상온에서 증류 농축 장치 (Rotary evaporator)를 이용하여 유기용매를 제거하고, 검은색 침전물에 2~5배 부피의 아세토나이트릴 용액 첨가한 후 4~8시간 교반한 뒤, 유기용매용 멤브레인 필터를 사용하여 반응물을 수득하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (iii) 단계 이후에, 유기용매용 멤브레인 필터를 사용하여 반응물을 얻은 후, 싸이올(thiol)기를 가지고 분자량이 5,000 인 메틸렌 클로라이드를 이용하여 침전물을 녹여낼 수 있으며, 수용성 고분자인 메톡시 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 녹여낸 페로센 코팅된 금 나노 입자를 트롬빈과 트롬빈 압타머와의 반응을 위해서 증류수에 분산시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 페로센으로 코팅된 금 나노 입자에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예로써, 금 나노 입자를 이용한 트롬빈 검출용 센서는 전기화학적으로 산화전류, 환원 전류를 생성하는 페로센 분자가 고정된 금 나노 입자인 것을 특징으로 하며, 금 나노 입자는 1~2 nm 정도의 크기를 가지고 양전하를 띄고 있으므로 트롬빈 압타머에 정전기적 상호작용을 통한 결합이 가능하다. 트롬빈 존재 하에서는 위의 결합이 방해받게 되므로 전류값의 감소가 관찰되는데 이를 이용하여 트롬빈 농도 측정이 가능한 센서 구현이 가능하다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 전극 위에 트롬빈 압타머를 고정하는 단계; (b) 상기 고정된 트롬빈 압타머에 시료 내 트롬빈을 고정시키는 단계; 및 (c) 상기 고정된 트롬빈-압타머 복합체를 이용하여 트롬빈의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 트롬빈을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 트롬빈의 농도 측정은 전극 표면에 트롬빈과 선택적 결합이 가능한 트롬빈 압타머를 고정하고 이와 전기적 상호작용으로 결합이 가능한 페로센 코팅된 금 나노 입자를 결합시켰을 때, 페로센에 의하여 형성된 산화 환원 전류를 측정함으로 트롬빈 농도를 알리는 표지자가 되어, 트롬빈이 존재할 경우, 트롬빈과 트롬빈 압타머 복합체가 형성될 경우 줄어드는 전기적 신호를 통해 트롬빈 농도를 모니터링하는 과정을 통하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 검출방법의 (a)단계의 금 전극 위에 트롬빈 결합 압타머의 고정시에, 상기 트롬빈 결합 압타머의 서열은 트롬빈 단백질과 선택적으로 결합하는 압타마 서열이라면 무엇이든 가능하며, 일 실시예로써, DNA 서열을 Xenotech에서 합성하였고, 별도의 처리없이 사용하였다.
또한, 금 전극 표면에 고정을 위하여 트롬빈 압타머 5'의 말단에 싸이올(Thiol)기를 추가할 수 있으며, 트롬빈과의 결합 효율을 높이기 위해 탄소 6개를 첨가 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 상기 고정된 트롬빈 압타머에로의 트롬빈의 고정은 다음과 같은 방법을 통해 수행할 수 있다. 트롬빈 결합을 위해 사용된 완충용액의 조성은 100~200 mM NaCl, 5~15 mM sodium phosphate, 0.5~1.5 mM EDTA, 0.01~0.05 % Polyvinylpyrrolidone, 20~40 % Foramide, NaOH를 이용하여 pH 8~9로 맞춘다. 위의 완충용액에 트롬빈의 농도를 50~150 nM부터 순차적으로 희석하여 사용하였다. 이 용액을 트롬빈이 고정된 금 전극 위에 떨어뜨린 후 상온에서 20~40분간 반응시켰다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 상기 고정된 트롬빈-트롬빈 압타이머를 이용한 트롬빈의 농도의 측정은, 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 이용하는 것을 의미하며, 상기 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 트롬빈-압타머 복합체에 적용시켜 압타머에 결합한 금 나노입자를 산화 환원 전류의 측정을 통해 분석하는 것을 의미한다. 상기 산화 환원 전류 측정에는, Cyclic voltamogram과 Differnrial pulse voltamogram을 이용할 수 있다. 이를 통해, 상기 복합체에 의해 감소되는 산화 환원 전류를 측정함으로써, 시료 내 트롬빈의 검출 또는 농도 측정이 가능한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 전극 위에 트롬빈 압타머를 고정하는 단계; (b) 상기 압타머에 전자 전달 매개체가 코팅된 나노입자를 결합시키는 단계; 및 (c) 상기 고정된 트롬빈 압타머에 시료 내 트롬빈을 고정시키는 단계; 및 (d) 상기 고정된 트롬빈-압타머 복합체를 이용하여 트롬빈의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 트롬빈을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 검출방법의 (a)단계의 금 전극 위에 트롬빈 결합 압타머의 고정시에, 상기 트롬빈 결합 압타머의 서열은 트롬빈 단백질과 선택적으로 결합하는 압타마 서열이라면 무엇이든 가능하며, 일 실시예로써, DNA 서열을 Xenotech에서 합성하였고, 별도의 처리없이 사용하였다.
또한, 금 전극 표면에 고정을 위하여 트롬빈 압타머 5'의 말단에 싸이올(Thiol)기를 추가할 수 있으며, 트롬빈과의 결합 효율을 높이기 위해 탄소 6개를 첨가 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 상기 고정된 트롬빈 압타머에로의 트롬빈의 고정은 다음과 같은 방법을 통해 수행할 수 있다. 트롬빈 결합을 위해 사용된 완충용액의 조성은 100~200 mM NaCl, 5~15 mM sodium phosphate, 0.5~1.5 mM EDTA, 0.01~0.05 % Polyvinylpyrrolidone, 20~40 % Foramide, NaOH를 이용하여 pH 8~9로 맞춘다. 위의 완충용액에 트롬빈의 농도를 50~150 nM부터 순차적으로 희석하여 사용하였다. 이 용액을 트롬빈이 고정된 금 전극 위에 떨어뜨린 후 상온에서 20~40분간 반응시켰다.
본 발명에 있어서, 상기 (d)단계의 상기 고정된 트롬빈-트롬빈 압타이머를 이용한 트롬빈의 농도의 측정은, 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 이용하는 것을 의미하며, 상기 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 트롬빈-압타머 복합체에 적용시켜 압타머에 결합한 금 나노입자를 산화 환원 전류의 측정을 통해 분석하는 것을 의미한다. 상기 산화 환원 전류 측정에는, Cyclic voltamogram과 Differnrial pulse voltamogram을 이용할 수 있다. 이를 통해, 상기 복합체에 의해 감소되는 산화 환원 전류를 측정함으로써, 시료 내 트롬빈의 검출 또는 농도 측정이 가능한 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
페로센 코팅된 금 나노 입자의 제조
80 mM HAuCl4의 수용액과 47 mM Oct4NBr 톨루엔 용액을 1:2 부피 비로 섞은 후, 수용액에 존재하던 금 원자가 톨루엔 상으로 완전히 넘어가서 오렌지색으로 변할 때까지 30분 정도 교반하였다. 유기 용매 상만 따로 분리하여 6-ferrocenyl hexanethiol을 금 원자 몰수의 두 배를 넣고, 6-ferrocenyl hexanethiol 첨가후 교반해주면서 용액을 0℃ 로 식힌 후, 10 M의 NaBH4 수용액을 1/10의 부피로 첨가하는 중 격렬하게 교반하면서 0℃ 에서 1 시간동안 반응시켰다. 상온에서 증류 농축 장치(Rotary evaporator)를 이용하여 유기용매를 제거하고, 검은색 침천 물을 4배 부피의 아세토나이트릴 용액에서 6시간 동안 교반하였다. 유기용매용 멤브레인 필터를 사용하여 반응물을 얻고 메틸렌 클로라이드를 이용하여 침전물을 녹여내어, 페로센 코팅된 금 나노 입자를 증류수에 분산시켰다. 상기 방법에 따른 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 이용한 트롬빈 센서의 제조 방법에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다.
실시예 1에서 제조된 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 UV-VIS 흡수 분광기, CH Instruments를 이용하여 분석한 결과를 도 2에 나타내었으며, 투과전자현미경을 이용하여 측정한 사진을 도 3에 나타내었다.
금 전극 위에 트롬빈 압타머 고정
트롬빈 단백질과 선택적으로 결합하는 DNA 서열은 Xenotech에서 합성하였고, 별도의 처리없이 사용하였다. 전극 위에 고정을 위해서 인산염 완충용액 (pH 7.2)를 이용하여 트롬빈 압타머의 농도가 1 μM이 되도록 희석하고, 5 mM EDTA를 첨가하여 2시간 동안 전극 위에 고정시켰다. 금 전극 표면에 고정을 위하여 트롬빈 압타머 5의 말단에 싸이올(Thiol)기를 추가하였고, 트롬빈과의 결합 효율을 높이기 위해 탄소 6개를 첨가하였다. 증류수와 5 mM Tris, 20mM NaCl 용액으로 세척하였다.
트롬빈 센서를 이용한 트롬빈 농도 측정
상기 실시예 2에서 금 전극 위에 고정시킨 트롬빈 압타에 트롬빈을 고정시키는 과정은 다음과 같다. 트롬빈 결합을 위해 사용된 완충용액의 조성은 150 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, 1 mM EDTA, 0.03 % Polyvinylpyrrolidone, 30 % Foramide, NaOH를 이용하여 pH 8.5로 맞추었다. 위의 완충용액에 트롬빈의 농도를 100 nM부터 순차적으로 희석하여 사용하였다. 이 용액을 트롬빈이 고정된 금 전극 위에 떨어뜨린 후 상온에서 30분 반응시켰다. 전기화학적 측정을 위해서 3전극 시스템을 사용하였으며, 작업 전극으로 금 전극을, 대조전극으로는 백금 와이어 (0.5 mm×10 cm)를 사용하였고 기준 전극으로는 Ag/AgCl를 사용하였다. 또한, 전해질 용액으로 20분 정도 Ar가스 퍼징(purging)을 통해서 산소를 제거한 100 mM LiClO4 용액을 사용하였다.
실시예 1에서 합성한 금 나노 입자를 트롬빈까지 결합시킨 트롬빈 압타머에 상온에서 30분 결합시킨 후, 증류수로 세척하고 질소 드라이 후 CH Instruments를 이용하여 Cyclic voltamogram과 Differnrial pulse voltamogram으로 압타머에 결합한 금 나노 입자를 분석하였다. 실시예 3의 트롬빈 농도 측정을 위한 실험 과정을 도 4에 나타내었다.
상기 실험을 수행한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 제작된 트롬빈 압타머 센서는 138 nM부터 2 nM 까지의 트롬빈 농도에 직선성을 가지고 응답하는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 첨가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 트롬빈과 선택적 결합하는 압타머가 전극 표면에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서.
  2. 트롬빈과 선택적 결합하는 압타머가 전극 표면에 고정되어 있고, 상기 고정된 압타머에 전자전달 매개체로 코팅된 나노입자가 결합되어 있는 트롬빈 검출용 센서.
  3. 제1항에 있어서, 상기 트롬빈과 선택적으로 결합하는 압타머는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서.
  4. 제3항에 있어서, 상기 트롬빈과 선택적으로 결합하는 압타머는 서열번호 1의 DNA 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서.
  5. 제1항에 있어서, 상기 전자 전달 매개체는 페로센, 퀴논, 코발트, 니켈, 루세니움, 페리시아나이드, 로듐, 파라듐, 오스뮴, 이리듐, 백금 및 헥사아민루테늄(III)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서.
  6. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 유기 나노입자 또는 비유기 나노입자인 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서.
  7. 제6항에 있어서, 상기 나노입자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌옥사이드, 카르복시 메틸셀룰로스, 히드록시 메틸 셀룰로오스, 2-히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 폴리비닐피놀리돈, 폴리풀루오르화비닐리덴, 폴리메틸메타크릴레이트 및 스티레부틸고무로 구성된 군에서 선택되는 수용성 고분자로 코팅하여 안정성을 유지하는 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서.
  8. 제1항에 있어서, 상기 전극은 작업전극, 대조전극, 및 기준전극으로 구성된 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서.
  9. 제8항에 있어서, 상기 작업 전극은 금, 은, 구리, 백금탄소, ITO(Indium Tin Oxide) 및 알루미늄으로 구성된 군에서 선택되고, 대조전극은 금, 은, 구리, 백금, 알루미늄 및 백금 와이어로 구성된 군에서 선택되며, 기준 전극은 염화은전극, 칼로멜전극 및 황산수은(I)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서.
  10. 다음 단계를 포함하는 트롬빈 검출용 센서의 제조방법:
    (a) 전극 위에 트롬빈과 선택적으로 결합하는 압타머를 고정하는 단계; 및
    (b) 상기 고정된 압타머에 전자 전달 매개체로 코팅된 나노입자를 결합하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 전기전달 매개체로 코팅된 나노입자는 페로센으로 코팅된 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 트롬빈 검출용 센서의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 페로센으로 코팅된 금 나노입자는 다음의 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) AuCl4의 수용액 및 Oct4NBr 톨루엔 용액을 혼합하여 교반하는 단계;
    (b) 상기 혼합물에 6-페로세닐 헥산디올 (6-ferrocenyl hexanethiol)를 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    (c) 상기 혼합물에서 유기 용매를 제거하여 페로센으로 코팅된 금 나노 입자를 분리하는 단계.
  13. 다음 단계를 포함하는 트롬빈을 검출하는 방법:
    (a) 전극 위에 트롬빈에 선택적으로 결합하는 압타머를 고정시키는 단계;
    (b) 상기 고정된 압타머에 시료를 적용하여, 시료 내 트롬빈을 상기 압타머와 결합시키는 단계; 및
    (c) 상기 결합된 트롬빈-압타머 복합체에 전자전달 매개체로 코팅된 나노입자를 처리하고, 산화-환원 전류를 측정함으로써 시료 내 트롬빈을 검출하는 단계.
  14. 다음 단계를 포함하는 트롬빈을 검출하는 방법:
    (a) 전극 위에 트롬빈에 선택적으로 결합하는 압타머를 고정시키는 단계;
    (b) 상기 압타머에 전자 전달 매개체로 코팅된 나노입자를 결합시키는 단계; 및
    (c) 상기 전자 전달 매개체로 코팅된 나노입자가 결합된 압타머에 시료를 적용하여 시료 내 트롬빈을 상기 압타머와 결합시키고, 산화-환원 전류를 측정함으로써 시료 내 트롬빈을 검출하는 단계.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 전기전달 매개체로 코팅된 나노입자는 페로센으로 코팅된 금 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
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